Summary
हम immunostaining, बगल में संकरण में प्रतिदीप्ति, पूरे माउंट Arabidopsis thaliana बीजाणु में मात्रात्मक, उच्च संकल्प इमेजिंग द्वारा पीछा डीएनए धुंधला के लिए यहाँ एक कुशल और विश्वसनीय प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. इस पद्धति का सफलतापूर्वक chromatin संशोधन और परमाणु वास्तुकला का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था.
Abstract
फूल पौधों में, दैहिक करने वाली प्रजनन कोशिका भाग्य संक्रमण वयस्क संयंत्र के पुष्प अंगों में बीजाणु मां कोशिकाओं की विशिष्टता (एसएमसी) द्वारा चिह्नित किया गया है. महिला एसएमसी (megaspore मां सेल, एमएमसी) बीजांड उत्स में differentiates और अर्धसूत्रीविभाजन आए. चयनित अगुणित megaspore फिर एक साथ सहायक कोशिकाओं के साथ, युग्मक को जन्म देगा जो बहुकोशिकीय महिला gametophyte, अंडा सेल और केंद्रीय सेल के लिए फार्म का पिंजरे का बँटवारा आए. बीजांड अंदर एमएमसी, meiocyte और महिला gametophyte के सीमित पहुँच कोशिकाविज्ञान के लिए तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है और cytogenetic एकल कोशिका के स्तर पर विश्लेषण करती है. विशेष रूप से, सेलुलर या परमाणु epitopes के प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष immunodetection संयंत्र सेल और एकल कोशिका इमेजिंग अंदर अभिकर्मकों के गरीब प्रवेश द्वारा बिगड़ा हुआ है पूरे माउंट ऊतकों में ऑप्टिकल स्पष्टता के अभाव के कारण पट्टान्तरित है.
इस प्रकार, हम Nucl का विश्लेषण करने के लिए एक कारगर तरीका विकसितपूरे माउंट एम्बेडेड एराबिडोप्सिस बीजाणु में एकल कक्ष के उच्च संकल्प पर कान संगठन और chromatin संशोधन. यह एक सूक्ष्म स्लाइड पर acrylamide जेल की एक पतली परत में विच्छेदन और तय बीजाणु के embedding पर आधारित है. एम्बेडेड बीजाणु immunostaining अभिकर्मकों के लिए ऊतक स्पष्टता और पारगम्यता में सुधार लाने के लक्ष्य रासायनिक और enzymatic उपचार के अधीन हैं. उन उपचार सेलुलर और chromatin संगठन, डीएनए और प्रोटीन epitopes रक्षा करता है. नमूने chromatin immunostaining, सीटू संकरण (मछली) में प्रतिदीप्ति, और हेट्रोक्रोमैटिन विश्लेषण के लिए डीएनए धुंधला सहित विभिन्न डाउनस्ट्रीम कोशिकीय विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. 3D पुनर्निर्माण द्वारा पीछा उच्च संकल्प के साथ लेजर confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग (CLSM) इमेजिंग,, एकल कोशिका प्रस्ताव पर मात्रात्मक मापन के लिए अनुमति देता है.
Introduction
फूल पौधों में, प्रजनन प्रजातियों की स्थापना एसएमसी का भेदभाव, महिला एमएमसी और पुरुष छोटे छोटे छिद्रों वाला कीडा जो दूसरों पर पलता है माँ सेल के साथ शुरू होता है. एमएमसी बीजांड उत्स के बाहर का नोक पर एक उप एपिडर्मल nucellar सेल से विकसित करता है, और छोटे छोटे छिद्रों वाला कीडा जो दूसरों पर पलता है मां सेल गहरी पुष्प अंगों 1 अंदर स्थित हैं जो परागपिटक locule, में sporogenous ऊतक से विकसित करता है. एसएमसी तो पिंजरे का बँटवारा पर gametophytes को जन्म दे जो अगुणित बीजाणुओं, निर्माण करने के लिए अर्धसूत्रीविभाजन से गुजरना. महिला gametophyte, या भ्रूण थैली, एक अंडा सेल, एक केंद्रीय सेल, दो synergids और तीन antipodals के होते हैं. पुरुष gametophyte, या पराग, एक वनस्पति सेल और दो शुक्राणु कोशिकाओं से बना है. पुरुष gametophyte एक अपेक्षाकृत सुलभ वस्तु का अध्ययन बनी हुई है, वहीं महिला gametophyte ही फूल कापेल में संलग्न, बीजांड अंदर एम्बेडेड, और इस प्रकार आणविक और कोशिका संबंधी विश्लेषण के लिए विशिष्ट चुनौती बन गया है. हाल ही में, हालांकि, लेजर की सहायताmicrodissection transcriptomic एमएमसी और महिला gametophytic कोशिकाओं 2-4 में विश्लेषण करती है की अनुमति एक सुरुचिपूर्ण समाधान की पेशकश की. उम्मीदवार जीन अभिव्यक्ति के अलावा कोशिकीय विश्लेषण विशिष्ट प्रत्यक्ष सेलुलर धुंधला या अप्रत्यक्ष immunostaining का उपयोग अंतर्जात सेलुलर घटकों की गतिशीलता की जांच, सीटू संकरण या पत्रकार जीन assays में जैसे शाही सेना की अनुमति देता है, का उपयोग का विश्लेषण करती है. विशेष रूप से, एक साथ chromatin संशोधन या chromatin घटकों के immunostaining के साथ, मछली और डीएनए धुंधला का उपयोग cytogenetic धुंधला एराबिडोप्सिस 5 में chromatin गतिशीलता और परमाणु संगठन को स्पष्ट करने के लिए केंद्रीय दृष्टिकोण हैं. आमतौर पर, अर्धसूत्रीविभाजन अच्छी तरह 6,7 meiocytes संयंत्र पुरुष में जांच की गई है जो विशिष्ट गुणसूत्र गतिशीलता पर जोर देता; संभावना गतिशील epigenetic reprogramming दर्शाती आगे बड़े पैमाने पर, सेल विशिष्ट chromatin पुनर्गठन, पराग विकास 8-10 दौरान वर्णित किया गया है. इसके विपरीत, कारणमहिला meiocyte और gametophyte के रिश्तेदार पहुंच के लिए, इन जांच को लागू करने के लिए तकनीकी रूप से मुश्किल बने हुए हैं, और अक्सर (नीचे देखें) सेक्शनिंग या मैनुअल विच्छेदन और enzymatic पाचन की आवश्यकता होती है. इसके अलावा, पूरे माउंट में ऑप्टिकल स्पष्टता की प्रचलित कमी बरकरार बीजाणु में प्रजनन कोशिकाओं की उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए एक बाधा है.
पूरे माउंट बीजाणु में गुणसूत्र संगठन की कोशिका संबंधी विश्लेषण के लिए एक शास्त्रीय विधि Feulgen के धुंधला 11-13 का उपयोग करता है. यह प्रोटीन विकृतीकरण में यह परिणाम है और इस प्रकार chromatin संरचना के विनाश का कारण बनता है जो डीएनए की (हाइपोक्लोरस एसिड का उपयोग) एसिड hydrolysis शामिल है. वैकल्पिक रूप से, महिला meiocytes और gametophytic कोशिकाओं में गुणसूत्र संगठन (उदाहरण के लिए 14-18 देखें) अर्द्ध पतली वर्गों या विच्छेदित भ्रूण थैलियों और एमएमसी पर DAPI धुंधला और immunostaining का उपयोग कर देखा जा सकता है. जाहिर है, हालांकि, पुस्तिका विच्छेदन और सेक्शनिंग श्रम गहन हो सकता है और कर सकते हैंchromatin epitopes की एक बड़ी संख्या के गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण पर बाधा उत्पन्न करती है.
यहाँ हम पूरे माउंट में नीचे की ओर कोशिकाविज्ञान धुंधला की एक किस्म के लिए उपयुक्त एराबिडोप्सिस बीजाणु की एक बड़ी संख्या को तैयार करने के लिए एक कुशल प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. संक्षेप में, फूल कलियों एक लगानेवाला समाधान में incubated हैं, बीजाणु की पंक्तियों कापेल से विच्छेदित कर रहे हैं और पराग meiocytes 19,20 के लिए किया जाता के रूप में स्लाइड पर acrylamide में एम्बेडेड. एम्बेडेड बीजाणु आगे मेथनॉल, इथेनॉल, और सेल दीवार पाचन और permeabilization पहले xylene में मंजूरी दे दी है और तय कर रहे हैं. इन कदमों से संभव रूपांतरों चर्चा कर रहे हैं. नमूने तो डीएनए धुंधला हो जाना, immunostaining, और मछली के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. तैयारी मोड कुशल है और (अप करने के लिए 16 स्लाइड्स अलग बहाव के विश्लेषण के लिए एक दिन में तैयार किया जा सकता है) समानांतर प्रयोगात्मक सेट अप के लिए अनुमति देता है. वर्णित उपचार, पूरे माउंट में सजातीय संकेतों सक्षम और अच्छी तरह से ऊतकीय, सेलुलर संरक्षितऔर प्रकार की कोशिकाओं के बीच गुणात्मक और मात्रात्मक तुलना लाभ जो प्रजनन कोशिकाओं और आसपास के nucellar कोशिकाओं में परमाणु संगठन. कैलिब्रेटेड, 3 आयामी पुनर्निर्माण द्वारा पीछा CLSM आधारित उच्च संकल्प इमेजिंग फ्लोरोसेंट संकेतों के सार्थक मात्रात्मक माप सक्षम बनाता है. हम सफलतापूर्वक फर्क एमएमसी 21 और महिला gametophyte 22 को विकसित करने में chromatin गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए इस प्रक्रिया का इस्तेमाल किया; हम यहाँ पूरे माउंट बीजाणु में हेट्रोक्रोमैटिन विश्लेषण, chromatin immunostaining, GFP immunostaining और मछली के प्रतिनिधि परिणाम प्रस्तुत करते हैं. हम आगे हमारे प्रोटोकॉल अन्य संयंत्र के ऊतकों और प्रजातियों के लिए उपयुक्त हो जाएगा.
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Protocol
प्रक्रिया चित्रा 1 में कार्यप्रवाह में वर्णन किया गया है, और विच्छेदन और ऊतकों के embedding के लिए सेटअप चित्रा 2 में प्रस्तुत कर रहे हैं.
1. ऊतक निर्धारण
- बर्फ पर ताजा बना BVO लगानेवाला बफर युक्त एक microfuge ट्यूब में 20-30 अंडप लीजिए.
- कोमल कमरे के तापमान पर झटकों के साथ ऊतक 30 मिनट ठीक करें.
- 400 x जी पर एक benchtop microcentrifuge 1 मिनट में लगानेवाला में अंडप युक्त ट्यूबों स्पिन.
- ध्यान से लगानेवाला बफर निकालें और पीबीटी के 1 मिलीलीटर जोड़ने, बर्फ पर ट्यूबों रखें.
2. विच्छेदन और एम्बेडिंग
- एक ताजा बना, 5% acrylamide मिश्रण के प्रत्येक 200 μl के साथ पांच Eppendorf ट्यूबों तैयार करें.
- पांच Superfrost स्लाइड्स 70% इथेनॉल के साथ पूर्व साफ किया और एक पेंसिल के साथ लेबल तैयार करें.
- एक 20% ए पी एस के विभाज्य और बर्फ पर 20% naps प्रत्येक पिघलना.
- एक कट अंत टिप, जगह के साथ 4-5 अंडप लोएक साफ स्लाइड पर उन्हें, तरल के अतिरिक्त हटा दें.
- एक ठीक सुई के साथ अनुदैर्ध्य कटौती करने और दिखाया चित्रा 2 के रूप में बीजाणु की पंक्तियों को रिहा करने कापेल दीवारों को अलग, पीबीएस (10 से अधिक नहीं μl) के साथ कवर द्वारा सुखाने से बचें.
- जल्दी 12 μl naps, 200 μl acrylamide मिश्रण का एक विभाज्य के साथ 12 μl ए पी एस और मिश्रण जोड़ें.
- विच्छेदित बीजाणु पर सक्रिय acrylamide का 30 μl जोड़ें.
- एक 20 x 20 मिमी coverslip के साथ कवर, कमरे के तापमान, 45-60 मिनट पर भाजन करते हैं.
- एक रेजर ब्लेड का उपयोग coverslip निकालें. इस स्तर पर, नमूने पीबीएस युक्त एक Coplin जार में 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर रखा जा सकता है.
3. ऊतक प्रसंस्करण
नोट: 3.2.1, 3.2.3, 3.3.2 और 3.4.3 को छोड़कर सभी कदम कमरे के तापमान पर रासायनिक हुड के तहत 80 मिलीलीटर समाधान के साथ Coplin जार में किया जाता है. स्लाइड्स एक फ्लैट टिप संदंश के साथ स्थानांतरित कर रहे हैं.
- ऊतक स्पष्टीकरण औरनिर्धारण:
- मेथनॉल में 5 मिनट सेते हैं.
- इथेनॉल में 5 मिनट सेते हैं.
- Xylene (1:1): इथेनॉल में 30 मिनट सेते हैं.
- इथेनॉल में 5 मिनट सेते हैं.
- मेथनॉल में 5 मिनट सेते हैं.
- 2.5% formaldehyde के साथ पूरित, मेथनॉल और पीबीटी (1:1) में 15 मिनट सेते हैं.
- पीबीटी में 2 एक्स 10 मिनट कुल्ला. इस स्तर पर, स्लाइड्स 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर रखा जा सकता है
- सेल की दीवार पाचन:
- बर्फ पर सेल दीवार पाचन मिश्रण के एक विभाज्य पिघलना.
- एक कागज तौलिया पर खड़ी रखकर तरल से अधिक नाली, Coplin जार से एक स्लाइड ले लो.
- Acrylamide पैड पर सेल दीवार पाचन मिश्रण के 100 μl जोड़ें और एक 23 x 46 मिमी coverslip के साथ कवर किया. अन्य स्लाइड्स के लिए दोहराएँ. (सामग्री में वर्णित है) एक नम कक्ष में 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए सेते हैं.
- पीबीटी में स्लाइड 2 एक्स 5 मिनट धो लें.
- एक उपचार RNase:
- Coplin जार से एक स्लाइड ले लो, वें नालीपहले की तरह तरल का ई अतिरिक्त.
- 1% बीच 20 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक नम चैम्बर में साथ पीबीएस में 100 माइक्रोग्राम / एमएल RNAseA के 100 μl के साथ प्रत्येक स्लाइड सेते हैं.
- पीबीटी में 2 एक्स 5 मिनट के लिए स्लाइड्स धो लें.
- बाद के निर्धारण और permeabilization:
- ताजा बना पीबीटी एफ में 20 मिनट के लिए प्रत्यय.
- पीबीटी में 10 मिनट के लिए स्लाइड कुल्ला.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 2% बीच 20 के साथ पीबीएस में 2 घंटे के लिए Permeabilize
- पीबीटी में 2 एक्स 5 मिनट के लिए स्लाइड कुल्ला.
4. Immunostaining
नोट: इस कदम के लिए, प्राथमिक एंटीबॉडी के इष्टतम एकाग्रता अलग dilutions एंटीबॉडी के (1:200, 1:500, 1:1000) का उपयोग कर परीक्षण किया जाना है.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 12-24 घंटे के लिए 0.2% बीच 20 के साथ पीबीएस में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के 100 μl के साथ प्रत्येक स्लाइड सेते
- कोमल झटकों के तहत कमरे के तापमान पर 2-4 घंटे के लिए पीबीटी में स्लाइड्स धो लें.
- लागू करनामें माध्यमिक एंटीबॉडी 1:200 पीबीएस + 0.2% बीच 20 से 24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर
- कोमल झटकों के तहत कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए पीबीटी में स्लाइड्स धो लें.
- 15 मिनट के लिए पीबीएस में 10 माइक्रोग्राम / एमएल propidium आयोडाइड के साथ counterstain, तो कमरे के तापमान पर, कोमल झटकों के तहत पीबीएस में 15 मिनट कुल्ला.
- विरोधी लुप्त होती तरल mountant में माउंट 10 माइक्रोग्राम / एमएल propidium आयोडाइड के साथ पूरक. बढ़ते मध्यम CLSM से छवियों को प्राप्त करने से पहले 1 घंटे के लिए कड़ा करते हैं.
5. मात्रात्मक इमेजिंग
- छवि अधिग्रहण:
- आदर्श रूप में बेहतर लंबे समय तक इमेजिंग 23 से अधिक फ्लोरोसेंट संकेतों के संरक्षण, और एक 63X ग्लिसरॉल विसर्जन लेंस की अनुमति देता है जो एक प्रतिध्वनि स्कैनिंग मोड, का उपयोग कर, CLSM का उपयोग उच्च संकल्प छवियों मोल.
- सख्ती से भर का पालन करने के लिए एक मानक अधिग्रहण प्रक्रिया को परिभाषित करने के लिए इस तरह के प्रयोग की शुरुआत में लेजर तीव्रता, लाभ, पिनहोल, voxel आकार और ज़ूम कारक के रूप में अधिग्रहण मानकों का परीक्षणलगातार मात्रात्मक मापन के लिए सभी स्लाइड्स.
- Fluorochromes के बीच पार से बात की अनुपस्थिति को सत्यापित. अगर मौजूद है, एक अनुक्रमिक स्कैन की स्थापना की. अलग और नहीं एक साथ प्रसारण छवियों मोल.
- एक्स और वाई आयामों में उच्चतम संभव संकल्प के साथ और जेड आयाम (Nyquist शासन) में 2x oversampling के साथ धारावाहिक, तीन आयामी छवि के अधिग्रहण को पूरा करें.
- छवि प्रसंस्करण:
- वाणिज्यिक या खुला स्रोत सॉफ्टवेयर का उपयोग कर तीन आयामों में धारावाहिक छवियों के पुनर्निर्माण.
- 3 डी में ब्याज की प्रत्येक नाभिक (या सेल) के आसपास समोच्च सतहों को परिभाषित करें.
- प्रत्येक वस्तु में पिक्सेल तीव्रता की राशि के रूप में प्रत्येक चैनल में प्रतिदीप्ति यों.
- सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए Excel में डेटा निर्यात. जैसे डीएनए धुंधला संकेतों के खिलाफ एंटीबॉडी संकेत मानक के अनुसार.
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Representative Results
हम पूरे माउंट में कोशिकीय धुंधला के लिए उपयुक्त एराबिडोप्सिस बीजाणु की बड़े पैमाने पर तैयारी और प्रसंस्करण के लिए एक मजबूत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. एम्बेड करने के लिए धन्यवाद, बीजाणु एक 3 आयामी संरचना (चित्रा 3) बरकरार रहती है. इसके अलावा, ऑप्टिकल स्पष्टीकरण सहित ऊतक प्रसंस्करण उच्च संकल्प इमेजिंग subcellular संरचनाओं में सक्षम बनाता है. 4 हेट्रोक्रोमैटिन (कोई deconvolution इस तस्वीर के लिए इस्तेमाल किया गया था) अच्छी तरह से विशिष्ट foci परिभाषित के रूप में उज्ज्वल दिखाई देता है, जहां पूरे माउंट बीजांड primordia में डीएनए धुंधला पता चलता है. इन छवियों एमएमसी और nucellus (चित्रा 4) के 21 में हेट्रोक्रोमैटिन सामग्री का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया.
इसके अलावा, हम सफलतापूर्वक मात्रात्मक megaspore मां कोशिकाओं, कार्यात्मक megaspore, विकासशील महिला gametophytes और जल्दी भ्रूण 21, 22-24 में immunostaining द्वारा chromatin गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया. चित्रा 5 में एराबिडोप्सिस बीजाणु पर immunostaining के प्रतिनिधि परिणाम दिखाते हैं. चित्रा 5A एक euchromatin जुड़े अनुमोदक मार्क के megaspore मां सेल, (H3K4me3) और एक हेट्रोक्रोमैटिन जुड़े दमनकारी निशान सहित बीजांड primordia, में immunodetection का एक उदाहरण से पता चलता है (H3K27me1). चित्रा 5 ब भ्रूण थैली (इस मामले में, प्रोटोकॉल थोड़ा GFP बूस्टर एंटीबॉडी का उपयोग के लिए संशोधित किया गया था (चर्चा देखें) सहित एक परिपक्व बीजाणु, में GFP immunodetection का एक उदाहरण दिखाता है. हम भी इस तरह के रूप में देशी chromatin प्रोटीन का पता चला H3 और एच 1 21 प्रक्रिया chromatin प्रोटीन epitopes को बरकरार रखता है कि दिखा. प्रक्रिया भी प्रकार की कोशिकाओं (जैसे प्रजनन बनाम दैहिक, आसपास की कोशिकाओं) 21 के बीच तुलना को सक्षम करने प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य quantifications के लिए अनुमति देता है.
अंत में, हम भी सफलतापूर्वक मछली बाहर ले जाने के लिए इस प्रक्रिया को लागू पूरे माउंट बीजांड पी पर विश्लेषण करती हैrimordia. एक उदाहरण nucleolar आयोजन क्षेत्रों में 25 परिभाषित 45S rDNA दोहराता के खिलाफ एक जांच का उपयोग मछली संकेत दिखा रहा है 6 चित्र में दिखाया गया है. मामूली संशोधनों के साथ 27 में वर्णित के रूप में हमारे प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में डीएनए counterstaining किया गया था, जबकि डीएनए जांच सीधे मछली टैग 26 का उपयोग एलेक्सा 488 के साथ चिह्नित किया गया, संकरण, अनिवार्य रूप से किया गया था.
Arabidopsis बीजाणु में स्वस्थानी संकरण में immunostaining, डीएनए धुंधला और प्रतिदीप्ति चित्रा 1. कार्यप्रवाह. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
विच्छेदन और स्लाइड पर अंडप के embedding के लिए चित्रा 2. सेटअप. कापेल दीवार हटा दिया जाता है और कापेल (चरण 3 में करीब विच्छेदित बीजाणु के ऊपर देखें) बीजाणु की पंक्तियों को रिहा करने के लिए स्लाइड पर विच्छेदित कर रहा है, और उसके बाद विच्छेदित कापेल एम्बेडेड है सक्रिय acrylamide मिश्रण में, 20 X 20 मिमी coverslip द्वारा कवर किया. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 3. प्रोटोकॉल ऑप्टिकल स्पष्टता और समरूप धुंधला की अनुमति है जबकि 3 आयामी संरचना के संरक्षण के लिए सक्षम बनाता है. छवियों XY, संकेत के रूप में xz और yz अक्ष में 3 डी छवि का एक विभाजन अनुभाग देखने से पता चलता है. छवि डेटा द्वारा अधिग्रहण किया गया हैलेजर confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग और Imaris सॉफ्टवेयर का उपयोग कर 3 आयामों में खंगाला. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 4. बीजांड primodia में propidium आयोडाइड से डीएनए धुंधला पूरे माउंट सटीक हेट्रोक्रोमैटिन मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है. बाईं ओर छवि एक बीजांड primordia भर में पूरे माउंट डीएनए धुंधला हो जाना दिखाता है. एक एमएमसी नाभिक लाल रंग में एक सफेद समोच्च और एक nucellar नाभिक द्वारा चिह्नित है. 3 डी खंगाला नाभिक के अनुमानों सही पर दिखाया जाता है. ऊतक की स्पष्टता उसमें फ्लोरोसेंट संकेतों के एक पीला समोच्च और मात्रा का ठहराव द्वारा चिह्नित हेट्रोक्रोमैटिन foci के उच्च संकल्प इमेजिंग में सक्षम बनाता है. रेखांकन रिश्तेदार heterochr दिखानेअंश 21 omatin. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 5. एराबिडोप्सिस बीजाणु में पूरे माउंट immunostaining के प्रतिनिधि परिणाम. ए) euchromatin (H3K4me3) और हेट्रोक्रोमैटिन (H3K27me1) का पता लगाने के युवा बीजांड primordia में chromatin संशोधन के immunostaining. एंटीबॉडी संकेत, लाल रंग में propidium आयोडाइड द्वारा counterstained डीएनए हरा है. फ्लोरोसेंट संकेतों के एक ओवरले एक साथ अंतर हस्तक्षेप विपरीत (ग्रे) का उपयोग संचरण प्रकाश में एक तस्वीर के साथ दिखाया गया है. MMCs सफेद आकृति के संकेत हैं. ऊपरी पैनल में इनसेट के रूप में एमएमसी नाभिक का एक बंद हुआ दिखाया गया है. छवियों को एक परिपक्व बीजाणु में) GFP की Immunodetection एकल confocal अनुभाग. बी हैं.GFP GFP-बूस्टर एंटीबॉडी का उपयोग immunostained गया था और बीजांड DAPI साथ counterstained गया था. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 6. एराबिडोप्सिस बीजाणु में स्वस्थानी संकरण में साबुत माउंट प्रतिदीप्ति. बीजांड उत्स 45S rDNA दोहराने स्थलों के लिए विशिष्ट डीएनए जांच के साथ संकरित और मछली टैग प्रौद्योगिकी का उपयोग एलेक्सा 488 के साथ लेबल, और DAPI 26 के साथ counterstained गया था. DAPI और (ग्रे) संचरण प्रकाश चैनल में अधिग्रहण कर लिया छवि के साथ 45S rDNA का आच्छादन भी दिखाए जाते हैं. एमएमसी नाभिक का एक बंद हुआ इनसेट के रूप में दिखाया गया है. इस अंजीर का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंure.
पूरे माउंट बीजाणु में डीएनए संकेतों पर निर्धारण, पाचन और धुंधला प्रक्रिया के चित्रा 7. प्रभाव. ए) परिपक्व बीजाणु या तो 4% paraformaldehyde या BVO लगानेवाला के साथ 30 मिनट तय किया गया है और एंजाइम मिश्रण पचाने सेल की दीवार के साथ 30 मिनट या 1 घंटा संसाधित propidium आयोडाइड के साथ डीएनए धुंधला से पहले. एक दिया बैच के लिए, अब ऊष्मायन BVO साथ तुलना paraformaldehyde के साथ तय किया गया कि डीएनए धुंधला बीजाणु पर अधिक नकारात्मक प्रभाव डालता है. बी) साबुत माउंट डीएनए धुंधला हो जाना एक आवश्यक एसिड हाइड्रोलिसिस 28 निम्न या निम्न propidium आयोडाइड का उपयोग Feulgen अभिकर्मक का उपयोग गैर अप्राकृतिकरण प्रोटोकॉल पाठ में वर्णित है. ऊपरी पैनल भ्रूण थैली के माध्यम से एक ही विमान खंड दिखाता है, कम पैनल स्पष्ट रूप से परिवर्तन का दिखा केंद्रीय सेल नाभिक में एक बढ़ाई प्रस्तुत करता हैFeulgen से सना हुआ बीजाणु में chromatin संगठन. CCN, केंद्रीय सेल नाभिक, ईसीएन, अंडा सेल नाभिक, चींटी, synergid नाभिक. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
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Discussion
फूल पौधों में, महिला प्रजनन वंश इस तरह तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण पूरे माउंट में कोशिकीय धुंधला प्रतिपादन, nucellus और बीजांड teguments सहित कई सेल परतों से घिरा हुआ है. यहाँ हम इस तरह पूरे माउंट में स्वस्थानी संकरण में immunostaining, डीएनए धुंधला और प्रतिदीप्ति रूप कोशिकाविज्ञान धुंधला के लिए उपयुक्त बीजाणु की एक बड़ी संख्या को तैयार करने और प्रसंस्करण को सक्षम करने के लिए एक कुशल प्रोटोकॉल उपस्थित थे. हम सफलतापूर्वक एराबिडोप्सिस 21,22 में महिला प्रजनन germline के विश्लेषण के लिए इसका इस्तेमाल किया. कई स्लाइड्स अलग धुंधला के लिए समानांतर में इलाज किया जा सकता है के रूप में इस विधि अत्यधिक कुशल है. यह भी मजबूत है और सजातीय संकेत वितरण देता है और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मात्रात्मक विश्लेषण के लिए अनुमति देता है. ऐसे chromatin संरचना का विकृतीकरण शामिल है जो Feulgen धुंधला के रूप में शास्त्रीय विधि के विपरीत, हमारे प्रोटोकॉल chromatin संगठन और परमाणु epitopes बरकरार रखता है. कार्ट मेंition, ऊतक स्पष्टीकरण एकल कोशिका के स्तर पर उच्च संकल्प पर संकेत इमेजिंग सक्षम बनाता है.
फूल के बजाय BVO बफर (1.1) का 4% paraformaldehyde (पीबीएस + 1% बीच में) में तय किया गया है कि अगर इस प्रोटोकॉल 3.1 में वर्णित चरणों omitting द्वारा तेजी लाई जा सकती है. इस छोटे प्रक्रिया 22-24 immunostaining कई के लिए कार्यात्मक साबित करते हैं, हम इसे (नीचे देखें) के नमूने, एंटीबॉडी और सेल दीवार पाचन एंजाइम मिश्रण के बैच में धुंधला की मजबूती attenuates पाया. इसके अलावा हम इस छोटे प्रक्रिया के साथ मछली संकरण के लिए सफल नहीं थे. अंडप ऊतक प्रसंस्करण के पहले चरण, 45 मिनट (1.1) के लिए 2.5% formaldehyde में तय किया गया: यहाँ वर्णित चरण 1 और 3 में मामूली संशोधनों के साथ इस्तेमाल किया गया था के रूप में GFP का पता चला चित्रा 5 ब, एक समान प्रोटोकॉल के रूप में बूस्टर अणुओं का उपयोग करने का immunodetection के लिए 2% में 5-10 मिनट मेथनॉल उपचार (3.1) को छोटा था, एक अवरुद्ध कदम पेश किया गया था (30 मिनट बीके रूप में वर्णित रातोंरात आवेदन एंटीबॉडी के लिए पूर्व पीबीएस में एसए). कोई माध्यमिक एंटीबॉडी बूस्टर के साथ आवश्यक है.
हम कुछ महत्वपूर्ण कदम नीचे चर्चा:
ऊतक निर्धारण, विच्छेदन और एम्बेडिंग.
Immunostaining और डीएनए धुंधला संकेतों लगातार और अधिक मजबूत थे और ऊतक (मिट्टी में अंकुर के स्थानांतरण के बाद) कम से कम 5 सप्ताह पुराने पौधों से नमूना था जब homogenously वितरित की. शायद, हमारे विकास की स्थिति में, खेती की एक लम्बी अवधि के बदले में ऊतक प्रसंस्करण की दक्षता को प्रभावित कोशिका दीवार के जैव रासायनिक संरचना में परिवर्तन, के साथ किया जा सकता है. इस प्रकार हम अपेक्षाकृत युवा पौधों से नमूने ऊतक की सलाह देते हैं. इसके अलावा, ऊतक पीबीएस की एक अतिरिक्त जोड़ - तोड़ को चुनौती दी है, जबकि (अन्यथा ऊतकीय परिवर्तन और धुंधला संकेतों के अभाव के प्रमुख) विच्छेदन के दौरान सुखाने से रोका जाना चाहिए; प से अधिक के एक सज्जन निकासीस्लाइड पर जमा ऊतक के आसपास टिप के साथ ution इस प्रकार की सिफारिश की है. इसके अलावा, बुलबुले acrylamide मिश्रण में परहेज और एक coverslip साथ कवर करते हुए किया जाना चाहिए. वे ऊतक और acrylamide आसंजन के लिए दूसरों से बेहतर दिखाई देते हैं के रूप में अंत में, Superfrost प्लस स्लाइड दृढ़ता, पर्याप्त acrylamide आसंजन (हमारे हाथ में ही कमजोर और अस्थिर पैड को मानक गुणवत्ता का नेतृत्व) के लिए सिफारिश कर रहे हैं.
फिक्सेशन, permeabilisation और सेल दीवार पाचन.
सेल की दीवार पाचन ऊतक प्रसंस्करण का एक महत्वपूर्ण कदम है. यह इस कदम homogenously संयंत्र ऊतक भर धुंधला अभिकर्मकों की एक अच्छी पैठ है कि सुविधा माना जाता है. हम पाचन समय और enzymatic गतिविधि पर निर्भर करता है (ऊतक का ही हिस्सा में कोई संकेत, संकेत, से 100% ऊतक धुंधला को लेकर) धुंधला एकरूपता में परिवर्तनशीलता का अनुभव (बैच विशिष्ट, प्रदाता द्वारा वर्णित). यह स्टॉक समाधान की एक बड़ी राशि का उत्पादन करने के लिए सिफारिश की हैएंजाइम मिश्रण (उदाहरण के लिए 100 मिलीलीटर) की और -20 डिग्री सेल्सियस पर 1 एमएल aliquots रखना प्रत्येक शेयर समाधान पहले बड़े पैमाने पर प्रयोग करने से पहले 1-2 स्लाइड पर परीक्षण किया जाना चाहिए. ऊतक के साथ तय की है, जबकि 4% paraformaldehyde में तय बीजाणु नकारात्मक, सेल दीवार पाचन मिश्रण के साथ लंबे समय तक ऊष्मायन से प्रभावित थे: इसके अलावा, हम लगानेवाला के प्रकार पचाने सेल की दीवार के लिए विभिन्न प्रसंस्करण समय के साथ संयोजन में डीएनए धुंधला की दक्षता को प्रभावित करती है कि अनुभवी BVO समाधान अब पाचन टाइम्स के प्रति सहनशील थे और बेहतर डीएनए धुंधला (चित्रा 7A) की अनुमति दी है. यह भी शाही सेना अणु को बांध के रूप में ऊतक propidium आयोडाइड के साथ counterstained है इसके अलावा, अगर एक RNase (DNase मुक्त) उपचार सख्ती जरूरी है. हम कारण अन्य fluorophores साथ अतिव्यापी इसकी व्यापक फ्लोरोसेंट उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के लिए, लेकिन यह भी अधिग्रहण के बाद चैनल पारी सुधार की जरूरत है कि बिना रंग aberrations के लिए '4 का उपयोग कर के खिलाफ ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) की सलाह है. हम यह भीविशेष रूप से भ्रूण थैली (चित्रा 7B) में chromatin विकृतीकरण के लिए अग्रणी ऊतक प्रसंस्करण 28 के दौरान एक एसिड हाइड्रोलिसिस की आवश्यकता है जो Feulgen धुंधला के खिलाफ सलाह देते हैं. वैकल्पिक डीएनए रंजक भी 29 इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन उनकी दक्षता यहाँ परीक्षण नहीं किया गया.
Immunostaining.
Chromatin संशोधन के immunostaining के लिए, हम खुले स्रोत डेटाबेस में प्राथमिक एंटीबॉडी की विशिष्टता को सत्यापित करने की सिफारिश http://compbio.med.harvard.edu/antibodies/projects/1 कुछ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी पार प्रतिक्रियाओं के लिए दिखाया के रूप में, 30 अन्य संशोधनों. डाउनस्ट्रीम मात्रा का ठहराव विश्लेषण के लिए, यह मिलान के साथ एक रैखिक संबंध में संकेत को मापने के लिए एंटीबॉडी एकाग्रता और ऊष्मायन समय जांचना जरूरी है. हम एक एंटीबॉडी दिल का उपयोग एंटीबॉडी कमजोर पड़ने और पता लगाने के समय जांच करने के लिए सलाह देते हैं1:200, 1:500, 1:1,000 की और 12-24 घंटे ऊष्मायन से ution श्रृंखला, क्रमशः, मजबूत और समरूप संकेत देने की स्थिति की पहचान करने के लिए. प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य संकेत मात्रात्मक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए की अनुमति उच्चतम कमजोर पड़ने और कम से कम ऊष्मायन समय. प्राथमिक एंटीबॉडी के बिना नियंत्रण विशिष्टता के लिए परीक्षण करने के लिए किया जाना चाहिए. Immunostaining unspecific धुंधला पैदा करता है, यह प्राथमिक एंटीबॉडी लागू करने से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए पीबीएस में 5% BSA + 0.1% बीच से ब्लॉक करने के लिए सलाह दी है. डीएनए counterstaining प्रयोग की सफलता को सत्यापित करने से पहले एंटीबॉडी संकेत स्लाइड पर जाँच की जा सकती. हमारे हाथ में, प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन के बाद 2-4 घंटे, और माध्यमिक एंटीबॉडी के बाद 1 घंटे के लिए पीबीटी में कपड़े धोने की भी अवरुद्ध बिना कम पृष्ठभूमि संकेतों के लिए अनुमति देता है.
अंत में, इस प्रोटोकॉल भी अन्य संयंत्र के ऊतकों (जैसे जड़, पत्ती टुकड़ा, पुष्प meristem) पर लागू होने की संभावना है और शायद अन्य प्रजातियों के पौधे के लिए, समर्थक हैविच्छेदन पर कुछ समायोजन viding, सेल दीवार को पचाने और permeabilization.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| BVO Fixation Buffer (based on32) | 2 mM EGTA, pH 7.5, 1% (v/v) formaldehyde, 10% DMSO, 1x PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBT | 1x PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBT-F | 1x PBT, 2.5% (v/v) formaldehyde | ||
| 30% acrylamide:bisacrylamide | 3 g acrylamide, 0.33 g bisacrylamide, 1x PBS (prepare 10 ml, store at 4 °C) | ||
| 200 ml 5% acrylamide mix in PBS | 34 ml 30% acrylamide:bisacrylamide, 166 ml 1x PBS (make fresh from 30% stock) | ||
| 20% ammoniumpersulfte | 0.2 g ammoniumpersulfte, 1 ml sterile water (prepare aliquots with 1 ml and store at -20 °C) | ||
| 20% sodium sulfite | 0.2 g sodium sulfite, 1 ml sterile water (prepare aliquots with 1 ml and store at -20 °C) | ||
| Cell wall enzyme mix | 0.5% (w/v) cellulase, 1% (w/v) driselase, 0.5% (w/v) pectolyase | ||
| Reagents and Materials | |||
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| DMSO | Sigma | D5879 | |
| Tris | Amaresco | 0497 | |
| Ethanol | Schaurlau | ET00102500 | |
| Methanol | Schaurlau | ME03062500 | |
| Xylene | ROTH | 4436.1 | |
| Cellulase | Sigma | 1794 | |
| Driselase | Sigma | D8037 | |
| pectolyase | Sigma | P5936 | |
| Tween-20 | Merck | 8.22184.0500 | |
| EGTA | Sigma | E-4378 | |
| acrylamide | Sigma | A-3553 | |
| bisacrylamide | Sigma | M2022 | toxic |
| ammoniumpersulfate | Sigma | A9164 | |
| Sodium sulfite | Fluka | 71988 | |
| Anti-trimethyl-Histone H3 (Lys4) | Upstate | 07-473 | |
| Anti- monomethyl-Histone H3 (Lys27) | Upstate | 07-448 | |
| Alexa Fluor 488~goat ~anti ~rabbit (H+L) | Molecular Probe | A11008 | |
| ProlongGold | Invitrogen | P36934 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170 | toxic |
| DAPI | Sigma | D9542 | toxic |
| RNAse A | Roche | 10109169001 | |
| Coplin jar | Huber & CO | 10.055 | |
| Forceps | DUMONT BIOLOGY | ||
| Shaker | Heidolph | 543-12310-00-0 | |
| Moist chamber | A plastic box with damp paper towel inside, a plastic support is put into the box for supporting the slides and keep slides from the water. | ||
| Superfrost Plus slide | Thermo Fisher | J1800AMNZ | Menzel-Gläser |
| FISH Tag DNA KIt | Invitrogen | F32947 | |
| GFP booster | Chromotek |
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