Summary
Wij bieden hier een efficiënt en betrouwbaar protocol voor immunokleuringen, fluorescentie in situ hybridisatie, DNA kleuring gevolgd door kwantitatieve, hoge-resolutie beeldvorming in whole-mount Arabidopsis thaliana eitjes. Deze methode is succesvol gebruikt om chromatine modificaties en nucleaire architectuur te analyseren.
Abstract
In bloeiende planten, is de somatische-to-voortplantingscel lot overgang gekenmerkt door de specificatie van spore moeder cellen (SMC) in floral organen van de volwassen plant. De vrouwelijke SMC (megaspore moeder cel, MMC) onderscheidt in het eitje primordium en ondergaat meiose. De geselecteerde haploïde megaspore ondergaat mitose aan de meercellige vrouwelijke gametofyt, die aanleiding zal geven aan de gameten, de eicel en de centrale cel te vormen, samen met accessoire cellen. De beperkte toegankelijkheid van de MMC, meiocyte en vrouwelijke gametofyt in de eicel is technisch uitdagend voor cytologische en cytogenetische analyses op enkel cel niveau. In het bijzonder wordt direct of indirect immunodetectie van cellulaire of nucleaire epitopen aangetast door slechte penetratie van de reagentia in de plantencel en single-cell imaging wordt demised door het gebrek aan optische helderheid geheel-mount weefsels.
Aldus wordt een efficiënte manier de Nucl analyseren ontwikkelden weoor organisatie en chromatine modificatie op hoge resolutie van enkele cel in whole-mount ingebed Arabidopsis eitjes. Het is gebaseerd op dissectie en inbedding van vaste eicellen in een dunne laag acrylamide gel op een microscopisch preparaat. De ingesloten eitjes worden onderworpen aan chemische en enzymatische behandelingen ter verbetering weefsel duidelijkheid en permeabiliteit voor de immunokleuring reagentia. Die behandelingen behouden cellulaire en chromatine organisatie, DNA en eiwitten epitopen. De monsters kunnen worden gebruikt voor verschillende stroomafwaartse cytologische analyse, waaronder chromatine immunokleuring, fluorescentie in situ hybridisatie (FISH), en DNA kleuring voor heterochromatine analyse. Confocale laser scanning microscopie (CLSM) beeldvorming met hoge resolutie, gevolgd door 3D reconstructie maakt kwantitatieve metingen bij eencellige resolutie.
Introduction
In bloeiende planten, de oprichting van reproductieve geslachten begint met de differentiatie van SMC, MMC vrouwelijke en mannelijke microspore moeder cel. De MMC ontwikkelt zich uit een sub-epidermale nucellar cel aan het distale uiteinde van de eicel primordium, en de microspore moeder cel ontwikkelt zich vanuit sporogenous weefsel in de helmknop locule, die zich diep in de bloemen organen 1. SMC ondergaan meiose tot haploïde sporen, die vervolgens leidt tot de gametofyten bij mitose produceren. Het vrouwtje gametofyt of embryozak, bestaat uit een eicel, een centrale cel, twee synergiden en drie antipodals. De mannelijke gametofyt, of pollen, bestaat uit een vegetatieve cel en twee spermacellen. Terwijl de mannelijke gametofyt blijft een relatief toegankelijke object-van-studie, wordt de vrouwelijke gametofyt ingebed in de eicel, zelf ingesloten in de bloem carpel, en vormt daarmee specifieke uitdagingen aan moleculaire en cytologische analyses. Onlangs echter, laser-geassisteerdemicrodissection bood een elegante oplossing waarmee transcriptomische analyseert in het MMC en vrouwelijke gametofytische cellen 2-4. Naast kandidaat genexpressie-analyses, met behulp van bijvoorbeeld RNA in situ hybridisatie of reportergen assays, cytologische analyses maakt het onderzoek naar de dynamiek van endogene cellulaire componenten met behulp van specifieke, directe cellulaire kleuring of indirecte immunostaining. Bijzonder, cytogenetische kleuring met behulp van FISH en DNA-kleuring, samen met immunokleuring van chromatine modificaties of chromatine onderdelen staan centraal benaderingen van de dynamiek van chromatine en nucleaire organisatie te ontrafelen in Arabidopsis 5. Typisch, meiose houdt specifiek chromosoom dynamiek die is goed bestudeerd in plantencellen mannelijke meiocytes 6,7; verdere grootschalige, cel-specifieke chromatine reorganisatie, waarschijnlijk als gevolg van dynamische epigenetische herprogrammering is beschreven tijdens pollenontwikkeling 8-10. Daarentegen, als gevolgde relatieve ontoegankelijkheid van vrouwelijke meiocyte en gametophyte, deze onderzoeken blijven technisch moeilijk toe te passen en vereisen vaak snijden of handmatige dissectie en enzymatische digestie (zie hieronder). Daarnaast is het heersende gebrek aan optische helderheid in whole-mount is een belemmering voor hoge-resolutie beeldvorming van geslachtscellen in intacte eitjes.
Een klassieke methode voor cytologische analyse van chromosoom organisatie in zijn geheel-mount ovules gebruikt Feulgen's kleuring 11-13. Het gaat zure hydrolyse (met hypochloorzuur) van het DNA waardoor eiwitdenaturatie en daarmee veroorzaakt vernietiging van de chromatinestructuur. Als alternatief kan chromosoom organisatie in vrouwelijke meiocytes en gametophytic cellen worden waargenomen met behulp van DAPI kleuring en immunostaining op semi-dunne secties of ontleed embryozakken en MMC (zie bijvoorbeeld 14-18). Het is echter duidelijk, handleiding dissectie en snijden kan arbeidsintensief zijn enbelemmert de kwalitatieve en kwantitatieve analyse van een groot aantal epitopen chromatine.
Hier geven we een efficiënt protocol voor een groot aantal Arabidopsis eicellen geschikt voor een verscheidenheid van downstream cytologische kleuring in whole-mount te bereiden. In het kort, zijn bloemknoppen geïncubeerd in een fixeeroplossing, zijn rijen eitjes ontleed uit de carpel en ingebed in acrylamide op dia zoals voor pollen meiocytes 19,20. De ingesloten ovules verder verwijderd en gefixeerd in methanol, ethanol en xyleen voor celwand spijsvertering en permeabilisatie. Mogelijke variaties van deze stappen worden besproken. De monsters kunnen vervolgens worden gebruikt voor DNA-kleuring, immunokleuring en FISH. De bereiding modus is efficiënt en maakt parallelle proefopstelling (maximaal 16 objectglaasjes kunnen worden bereid in een dag voor verschillende stroomafwaartse analyse). De beschreven behandelingen mogelijk te maken homogeen signalen in whole-mount en goed bewaard gebleven histologische, cellulair,en nucleaire organisatie in geslachtscellen en de omliggende nucellar cellen die kwalitatieve en kwantitatieve vergelijkingen tussen celtypen profiteren. Gekalibreerd, CLSM-based high-resolution imaging gevolgd door 3-dimensionale reconstructie maakt zinvolle kwantitatieve metingen van fluorescerende signalen. Wij hebben met succes gebruik gemaakt van deze procedure om de dynamiek van chromatine te analyseren in de differentiërende MMC-21 en het ontwikkelen van vrouwelijke gametofyt 22; We presenteren hier representatieve resultaten van heterochromatin analyse, chromatine immunostaining, GFP immunostaining en FISH in hele-mount eitjes. Verder geloven wij dat ons protocol geschikt voor andere plantaardige weefsels en soorten zullen zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De procedure wordt beschreven in de workflow in figuur 1, en de opstelling voor dissectie en inbedding van weefsels zijn weergegeven in figuur 2.
1. Tissue Fixation
- Verzamel 20-30 carpels in een microfugebuis met vers gemaakte BVO fixatief buffer op ijs.
- Bevestig het weefsel 30 minuten onder zacht schudden bij kamertemperatuur.
- Draai de buisjes met de carpels in fixeermiddel in een tafelmodel microcentrifuge 1 min bij 400 x g.
- Verwijder voorzichtig het fixatief buffer en voeg 1 ml van PBT, plaatst de buizen op ijs.
2. Dissection and Embedding
- Bereid vijf Eppendorf buizen met elk 200 pl van een vers bereide, 5% acrylamide mix.
- Bereid vijf Superfrost dia vooraf gereinigd met 70% ethanol en gelabeld met een potlood.
- Dooi een hoeveelheid van 20% APS en 20% dutjes elk, op ijs.
- Neem 4-5 carpels met een cut-end tip, plaatsze op een schoon objectglas, verwijder de overtollige vloeistof.
- Maak sneetjes die met een fijne naald en verwijder de carpel muren om rijen van eitjes los zoals getoond Figuur 2, voorkomen dat ze uitdrogen door afdekken met PBS (niet meer dan 10 pl).
- Voeg snel en meng 12 pl dutjes, 12 pi APS met een portie van 200 pl acrylamide mix.
- Voeg 30 ul van de geactiveerde acrylamide op de eitjes ontleed.
- Bedek met een dekglaasje 20 mm x 20 Laten polymeriseren bij kamertemperatuur 45-60 min.
- Verwijder het dekglaasje met een scheermesje. In dit stadium kan de monsters overnacht bewaard bij 4 ° C in een Coplin pot met PBS.
3. Weefsel bewerken
OPMERKING: alle stappen behalve 3.2.1, 3.2.3, 3.3.2 en 3.4.3 zijn opgenomen in Coplin potten uitgevoerd met 80 ml oplossing onder de chemische kap bij kamertemperatuur. Dia's worden overgebracht met een flatscreen-tip pincet.
- Tissue verduidelijking enfixatie:
- Incubeer 5 min in methanol.
- Incubeer 5 min in ethanol.
- Incubeer 30 min in ethanol: xyleen (1:1).
- Incubeer 5 min in ethanol.
- Incubeer 5 min in methanol.
- Incubeer 15 min in methanol en PBT (01:01), aangevuld met 2,5% formaldehyde.
- Spoel 2 x 10 min in PBT. In dit stadium kan dia nachts bewaard bij 4 ° C.
- Celwand spijsvertering:
- Dooi een hoeveelheid van de celwand spijsvertering mix op ijs.
- Neem een dia uit de Coplin pot, afvoer van de overtollige vloeistof door het plaatsen van het verticaal op een papieren handdoek.
- Voeg 100 ul van celwand spijsvertering mix over de acrylamide pad en dek af met een 23 x 46 mm dekglaasje. Herhaal dit voor de andere dia's. Incubeer 2 uur bij 37 ° C in een vochtige kamer (beschreven in Materials).
- Was de dia's 2 x 5 min in PBT.
- RNase A behandeling:
- Neem een dia uit de Coplin pot, afvoer the overmaat vloeistof als voorheen.
- Incubeer elk glaasje met 100 ul RNAse bij 100 ug / ml in PBS met 1% Tween-20 gedurende 1 uur bij 37 ° C in een vochtige kamer.
- Was de dia's voor 2 x 5 min in PBT.
- Post-fixatie en permeabilisatie:
- Post-fix voor 20 min in vers gemaakte PBT-F.
- De dia's spoelen gedurende 10 minuten in PBT.
- Doorlaatbaar voor 2 uur in PBS met 2% Tween-20 bij 4 ° C.
- De dia's Spoel voor 2 x 5 min in PBT.
4. Immunokleuring
OPMERKING: Voor deze stap de optimale concentratie van het primaire antilichaam worden getest met behulp van verschillende verdunningen (1:200, 1:500, 1:1000) van de antilichamen.
- Incubeer elke dia met 100 ul van primair antilichaam verdund in PBS met 0,2% Tween-20 gedurende 12-24 uur bij 4 ° C.
- Was de dia's in PBT gedurende 2-4 uur bij kamertemperatuur onder rustig schudden.
- Breng desecundair antilichaam 1:200 in PBS + 0,2% Tween-20 gedurende 24 uur bij 4 ° C.
- Was de glaasjes in PBT gedurende 1 uur bij kamertemperatuur onder rustig schudden.
- Tegenkleuring met 10 ug / ml propidiumjodide in PBS gedurende 15 minuten, spoel dan 15 min in PBS onder voorzichtig schudden bij kamertemperatuur.
- Mount in anti-fading vloeistof inbedmiddel aangevuld met 10 ug / ml propidiumjodide. Laat de montage medium verharden voor 1 uur voor het ophalen van afbeeldingen door CLSM.
5. Quantitative Imaging
- Beeldopname:
- Acquire hoge resolutie beelden met behulp van CLSM, idealiter met een resonantie scan mode, die beter behoud van fluorescerende signalen over langere beeldvorming 23, en een 63X glycerol immersie lens maakt.
- Test de acquisitie parameters zoals laser intensiteit, gain, pinhole, voxelgrootte en zoomfactor aan het begin van het experiment om een standaard procedure voor opname definiëren strikt op te volgen gedurendealle dia's voor een consistente kwantitatieve metingen.
- Controleer de afwezigheid van overspraak tussen fluorochromen. Indien aanwezig, het opzetten van een sequentiële scan. Acquire transmissie beelden afzonderlijk en niet gelijktijdig.
- Voer seriële drie-dimensionale beeldacquisitie met de hoogst mogelijke resolutie in de x en y afmetingen en met 2x oversampling in de z dimensie (voorschrift Nyquist).
- Beeldverwerking:
- Reconstrueren seriële afbeeldingen in drie dimensies met behulp van commerciële of open source software.
- Definieer contouroppervlakken rond elke kern (of cel) van belang zijn in 3D.
- Kwantificeer fluorescentie in elk kanaal als de som van de pixelintensiteiten in elk object.
- De gegevens te exporteren naar Excel voor statistische analyses. Normaliseren antilichaam signalen tegen bijvoorbeeld DNA vlekken signalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wij bieden een robuust protocol voor grootschalige bereiding en verwerking van Arabidopsis eicellen geschikt zijn voor cytologische kleuring in whole-mount. Door de inbedding, de zaadknoppen behouden van een 3-dimensionale structuur (Figuur 3). Bovendien, het weefsel verwerking, met inbegrip van optische verduidelijking stelt beeldvorming subcellulaire structuren op een hoge resolutie. Figuur 4 toont DNA kleuring in whole-mount eitje primordia waar heterochromatin verschijnt zo helder, goed gedefinieerd opvallende brandpunten (geen deconvolutie werd gebruikt voor deze foto). Deze beelden werden gebruikt voor het analyseren heterochromatine inhoud in de MMC en nucellus (figuur 4) 21.
Daarnaast hebben we met succes gebruikt dit protocol om de dynamiek van chromatine kwantitatief te analyseren door immuunkleuring in megaspore moeder cellen, functionele megaspore, het ontwikkelen van vrouwelijke gametofyten en vroege embryo 21, 22-24. In figuur 5 Arabidopsis eitjes. Figuur 5A toont een voorbeeld van immuundetectie in eitje primordia, waaronder de megaspore moeder cel, van een-euchromatine geassocieerd permissieve mark (H3K4me3) en een-heterochromatin bijbehorende repressieve merk (H3K27me1). Figuur 5B toont een voorbeeld van GFP immunodetectie in een rijpe eicel, zoals de embryozak (in dit geval werd het protocol enigszins gewijzigd volgens de booster GFP antilichaam (zie bespreking). We hebben ook ontdekt natieve chromatine eiwitten zoals H3 en H1 21 waaruit blijkt dat de procedure behoudt chromatine eiwit epitopen. De procedure maakt het ook mogelijk voor reproduceerbare kwantificeringen waardoor vergelijking tussen celtypen (bijv. reproductieve vs somatische, omringende cellen) 21.
Ten slotte hebben we ook met succes deze procedure toegepast voor het uitvoeren van FISH analyses over hele-mount eitje primordia. Een voorbeeld wordt getoond Figuur 6 toont FISH signalen met behulp van een sonde tegen 45S rDNA herhaalt het definiëren van de nucleolair organiserende regio 25. De DNA probe werd direct gelabeld met Alexa 488 met FISH-tag 26, werd hybridisatie hoofdzaak uitgevoerd zoals beschreven 27 met kleine modificaties, terwijl DNA tegenkleuring werd uitgevoerd zoals beschreven in ons protocol.
Figuur 1. Workflow van immunostaining, DNA kleuring en fluorescentie in situ hybridisatie in Arabidopsis eitjes. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Setup voor dissectie en inbedding van vruchtbladen op dia. De vruchtblad muur wordt verwijderd en de carpel wordt ontleed op de dia om rijen van eitjes los (zie close-up van ontleed eitjes in stap 3), en vervolgens het ontleed carpel is ingebed in geactiveerde acrylamide mix, onder 20 x 20 mm dekglaasje. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Het protocol maakt behoud van de 3-dimensionale structuur terwijl optische helderheid en homogene kleuring. De beelden toont een gesplitste gedeelte van het 3D beeld in xy, xz en yz as aangegeven. De beeldgegevens zijn overgenomen doorconfocale laser scanning microscopie en gereconstrueerd in 3 dimensies met behulp van de Imaris software. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4. Whole-mount DNA kleuring door propidiumjodide in eitje primodia zorgt voor nauwkeurige heterochromatin kwantificering. De afbeelding links toont hele-mount DNA kleuring gedurende een eitje primordia. Een MMC kern wordt gekenmerkt door een witte contour en een nucellar kern in rood. Projecties van 3D-gereconstrueerde kernen worden getoond aan de rechterkant. De helderheid van het weefsel zorgt voor een hoge-resolutie beeldvorming van de heterochromatin brandpunten gemarkeerd door een gele contour en kwantificering van de fluorescerende signalen daarin. De grafieken tonen de relatieve heterochromatin fractie 21. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5. Representatieve resultaten van hele-mount immuunkleuring in Arabidopsis eitjes. A) Immunokleuring van chromatine modificaties bij jonge eitje primordia detecteren euchromatin (H3K4me3) en heterochromatine (H3K27me1). Het antilichaam signaal groen, het DNA tegengekleurd met propidiumjodide rood. Een overlay van fluorescerende signalen wordt samen met een foto in de transmissie licht met behulp van differentieel interferentie contrast (grijs) weergegeven. MMCs worden aangegeven door witte contouren. Een close-up van de MMC kern wordt getoond als inzet in het bovenste paneel. De afbeeldingen zijn enkel confocale sectie. B) Immunodetectie van GFP in een rijpe eicel.De GFP werd immunostained behulp van GFP-booster antilichaam en het eitje werd tegengekleurd met DAPI. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6. Whole-mount fluorescentie in situ hybridisatie in Arabidopsis eitjes. Het eitje primordium werd gehybridiseerd met een DNA-probe specifiek voor 45S rDNA herhalende loei en gelabeld met Alexa 488 met behulp van de FISH-Tag-technologie, en tegengekleurd met DAPI 26. De overlay van 45S rDNA met DAPI en imago verworven in de transmissie licht kanaal (grijs) worden ook getoond. Een close-up van de MMC kern wordt getoond als inzet. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding bekijkenUre.
Figuur 7. Invloed van de fixatie, de spijsvertering en kleuringsprocedure op DNA signalen in whole-mount eitjes. A) Mature eitjes werden vastgesteld 30 min, ofwel met 4% paraformaldehyde of BVO fixatief en verwerkt 30 min of 1 uur met celwand verteren enzym mix voor DNA-kleuring met propidium iodide. Voor een bepaalde partij, langere incubatietijd treft meer negatief op het DNA kleuring eitjes die werden vastgesteld met paraformaldehyde dan met BVO. B) Whole-mount DNA kleuring met behulp van de Feulgen reagens na een vereiste zuur-hydrolyse 28 of gebruik propidiumiodide na de niet- denaturering protocol beschreven in de tekst. Het bovenste paneel toont een vlak gedeelte door het embryozak, het onderste paneel toont een vergroting boven de centrale celkern waaruit duidelijk verandering vanchromatine organisatie in Feulgen gebeitst eitjes. CCN, centrale celkern, ECN, ei celkern, syn, synergid kern. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In bloeiende planten, wordt het vrouwelijke reproductieve lineage omgeven door verschillende cellagen waaronder de nucellus en de eicel Zaadhuiden, dus waardoor cytologische kleuring in whole-mount technisch uitdagend. Hier geven we een efficiënt protocol waarvan de bereiding en verwerking van een groot aantal eicellen voor cytologische kleuring als immunokleuring, DNA-kleuring en fluorescentie in situ hybridisatie geheel-mount. Wij hebben met succes gebruikt voor de analyse van het vrouwelijk voortplantingssysteem kiembaan in Arabidopsis 21,22. Deze methode is zeer efficiënt verschillende dia parallel voor verschillende kleuring kan worden behandeld. Het is ook robuust en geeft homogene signaal en laat een reproduceerbare kwantitatieve analyses. In tegenstelling tot klassieke methode zoals Feulgen vlekken die de denaturatie van de chromatine structuur, de ons protocol behoudt chromatine organisatie en nucleaire epitopen. In toe te voegenvulle, weefsel verduidelijking stelt de beeldvorming van de signalen met een hoge resolutie op de single-cell niveau.
Dit protocol kan worden versneld door het weglaten van de stappen 3.1 beschreven als de bloemen werden gefixeerd in 4% paraformaldehyde (in PBS + 1% Tween) in plaats van BVO buffer (1.1). Hoewel deze kortere procedure bleek functioneel enkele immunokleuring 22-24, vonden we dat het verzwakt de robuustheid van de kleuring in monsters, antilichaam en partij celwand digestie enzymmengsel (zie hieronder). Verder waren we niet succesvol voor FISH hybridisatie met deze korte procedure. Voor immunodetectie van GFP met behulp van de booster moleculen zoals figuur 5B, een vergelijkbaar protocol zoals beschreven werd gebruikt met kleine modificaties in stap 1 en 3: carpels werden gefixeerd in 2,5% formaldehyde gedurende 45 min (1.1), de eerste stap van weefselverwerking werd verkort tot 5-10 min methanol behandeling (3.1), was een blokkerende stap geïntroduceerd (30 min in 2% BSA in PBS) vóór toepassing nachts antilichaam beschreven. Geen secundaire antilichaam is nodig met de booster.
Hieronder bespreken we een aantal kritische stappen:
Tissue Fixatie, dissectie en inbedding.
Immunostaining en DNA kleuring signalen waren constant robuuster en homogeen verdeeld wanneer het weefsel werd bemonsterd uit planten minder dan 5 weken oud (na de overdracht van de zaailing in de bodem). Eventueel, in onze groeiomstandigheden, langdurig kweken kan gepaard gaan met veranderingen in de biochemische samenstelling van de celwand, beïnvloeden beurt de efficiëntie van weefselverwerking. Zo adviseren wij bemonstering weefsel uit relatief jonge planten. Bovendien moet het weefsel worden voorkomen drogen wordt dissectie (anders histologische verandering en geen kleuring signalen leiden) terwijl een overmaat PBS betwist de manipulatie; een zachte afvoer van de overmaat aan solution met de punt rond het weefsel afgezet op slide is dus aanbevolen. Bovendien moet bellen worden vermeden in de acrylamide mengsel en terwijl die met een dekglaasje. Tenslotte worden Superfrost Plus dia's sterk aanbevolen voor adequate acrylamide adhesie (standaardkwaliteit leiden tot broze en onstabiele pads in onze handen), zoals ze superieur aan anderen voor weefsel-en acrylamide hechting.
Fixatie, permeabilisatie en celwand spijsvertering.
Celwand spijsvertering is een cruciale stap van weefselverwerking. Er wordt gedacht dat deze stap vergemakkelijkt een goede penetratie van de kleurstoffen homogeen in het plantenweefsel. We ondervonden variabiliteit in kleuring homogeniteit (van geen signaal, signaal in slechts een deel van het weefsel 100% weefselkleuring) afhankelijk van de spijsvertering tijd en de enzymatische activiteit (batch-specifieke, beschreven door de leverancier). Het wordt aanbevolen om een grote hoeveelheid van de stamoplossinghet enzymmengsel (bijv. 100 ml) en houd 1 ml porties bij -20 ° C. Elke stockoplossing moet eerst worden getest op 1-2 dia's voordat u op grote schaal. Verder hebben we ondervonden dat het type fixatief beïnvloedt de efficiëntie van DNA-kleuring in combinatie met verschillende doorlooptijd voor celwand digest: in 4% paraformaldehyde zaadknoppen werden negatief beïnvloed door langdurige incubatie met de celwand digestie mix, terwijl weefsel vast met de BVO oplossing tolerant langer digestietijden en men betere DNA-kleuring (figuur 7A). Bovendien, een RNAse (DNase) behandeling strikt noodzakelijk wanneer het weefsel tegengekleurd met propidiumjodide als het ook bindt aan RNA-moleculen. Wij adviseren tegen het gebruik 4 ',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) vanwege zijn brede fluorescentie-emissie spectra samenloop met andere fluoroforen, maar ook om achromatische aberraties die kanaalverschuiving correcties noodzakelijk na overname. We hebben ookafraden Feulgen vlekken die een zuur-hydrolyse tijdens weefselverwerking 28 leidt tot chromatine denaturatie met name in de embryozak (figuur 7B) vereist. Alternatieve DNA kleurstoffen kunnen worden gebruikt 29 maar de efficiëntie is niet hier getest.
Immunostaining.
Voor immunostaining van chromatine modificaties, raden wij u aan de specificiteit van het primaire antilichaam te controleren in de open source database http://compbio.med.harvard.edu/antibodies/projects/1 30, zoals sommige commercieel verkrijgbare antilichamen toonden kruisreacties voor andere wijzigingen. Voor stroomafwaartse kwantificering analyses, is het belangrijk om de antilichamen concentratie en incubatietijd signalen in een lineaire relatie met de epitoop meten kalibreren. We raden aan om de verdunning en detectieantilichaam tijd kalibreren met een antilichaam dilution reeks 1:200, 1:500, 1:1000 en 12-24 uur incubatie, respectievelijk aan de voorwaarden om robuuste en homogene signalen te identificeren. De hoogste verdunning en kortste incubatietijd zodat reproduceerbare signalen worden gebruikt voor kwantitatieve analyses. Controles zonder primaire antilichaam worden uitgevoerd om te testen voor de specificiteit. Als immunostaining produceert niet-specifieke kleuring, is het aangeraden om te blokkeren met 5% BSA + 0,1% Tween in PBS gedurende 2 uur bij 4 ° C voordat het primaire antilichaam. Antilichaam signalen kunnen worden gecontroleerd op de dia voor DNA tegenkleuring het succes van het experiment controleren. In onze handen wassen in PBT 2-4 uur na incubatie met het primaire antilichaam en 1 uur na het secundair antilichaam maakt vanaf achtergrondsignalen zelfs zonder blokkering.
Tot slot, dit protocol is waarschijnlijk ook van toepassing op andere plantaardige weefsels (bijv. wortel, blad fragment, bloemen meristeem) en waarschijnlijk tot andere plantensoorten, providing enige aanpassing op de dissectie, celwand verteren en permeabilisatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| BVO Fixation Buffer (based on32) | 2 mM EGTA, pH 7.5, 1% (v/v) formaldehyde, 10% DMSO, 1x PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBT | 1x PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBT-F | 1x PBT, 2.5% (v/v) formaldehyde | ||
| 30% acrylamide:bisacrylamide | 3 g acrylamide, 0.33 g bisacrylamide, 1x PBS (prepare 10 ml, store at 4 °C) | ||
| 200 ml 5% acrylamide mix in PBS | 34 ml 30% acrylamide:bisacrylamide, 166 ml 1x PBS (make fresh from 30% stock) | ||
| 20% ammoniumpersulfte | 0.2 g ammoniumpersulfte, 1 ml sterile water (prepare aliquots with 1 ml and store at -20 °C) | ||
| 20% sodium sulfite | 0.2 g sodium sulfite, 1 ml sterile water (prepare aliquots with 1 ml and store at -20 °C) | ||
| Cell wall enzyme mix | 0.5% (w/v) cellulase, 1% (w/v) driselase, 0.5% (w/v) pectolyase | ||
| Reagents and Materials | |||
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| DMSO | Sigma | D5879 | |
| Tris | Amaresco | 0497 | |
| Ethanol | Schaurlau | ET00102500 | |
| Methanol | Schaurlau | ME03062500 | |
| Xylene | ROTH | 4436.1 | |
| Cellulase | Sigma | 1794 | |
| Driselase | Sigma | D8037 | |
| pectolyase | Sigma | P5936 | |
| Tween-20 | Merck | 8.22184.0500 | |
| EGTA | Sigma | E-4378 | |
| acrylamide | Sigma | A-3553 | |
| bisacrylamide | Sigma | M2022 | toxic |
| ammoniumpersulfate | Sigma | A9164 | |
| Sodium sulfite | Fluka | 71988 | |
| Anti-trimethyl-Histone H3 (Lys4) | Upstate | 07-473 | |
| Anti- monomethyl-Histone H3 (Lys27) | Upstate | 07-448 | |
| Alexa Fluor 488~goat ~anti ~rabbit (H+L) | Molecular Probe | A11008 | |
| ProlongGold | Invitrogen | P36934 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170 | toxic |
| DAPI | Sigma | D9542 | toxic |
| RNAse A | Roche | 10109169001 | |
| Coplin jar | Huber & CO | 10.055 | |
| Forceps | DUMONT BIOLOGY | ||
| Shaker | Heidolph | 543-12310-00-0 | |
| Moist chamber | A plastic box with damp paper towel inside, a plastic support is put into the box for supporting the slides and keep slides from the water. | ||
| Superfrost Plus slide | Thermo Fisher | J1800AMNZ | Menzel-Gläser |
| FISH Tag DNA KIt | Invitrogen | F32947 | |
| GFP booster | Chromotek |
References
- Maheshwari, P. An introduction to the embryology of angiosperms. , McGraw-Hill. New York. (1950).
- Schmidt, A., et al. Transcriptome analysis of the Arabidopsis megaspore mother cell uncovers the importance of RNA helicases for plant germline development. PLoS Biol. 9 (9), (2011).
- Schmidt, M. W., et al. A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA Sequencing. PLoS One. 7 (1), (2012).
- Wuest, S. E., et al. Arabidopsis female gametophyte gene expression map reveals similarities between plant and animal gametes. Curr Biol. 20 (6), 506-512 (2010).
- Koornneef, M., et al. Cytogenetic tools for Arabidopsis thaliana. Chromosome Res. 11 (3), 183-194 (2003).
- Oliver, C., et al. The dynamics of histone H3 modifications is species-specific in plant meiosis. Planta. 238 (1), 23-33 (2013).
- Ravi, M., et al. Meiosis-specific loading of the centromere-specific histone CENH3 in Arabidopsis thaliana. PLoS Genet. 7 (6), (2011).
- Borges, F., et al.
- Pandey, P., et al. Chromatin alterations during pollen development in Hordeum vulgare. Cytogenet Genome Res. 141 (1), 50-57 (2013).
- Schoft, V. K., et al. Induction of RNA-directed DNA methylation upon decondensation of constitutive heterochromatin. EMBO Rep. 10 (9), 1015-1021 (2009).
- Barrell, P. J., Grossniklaus, U. Confocal microscopy of whole ovules for analysis of reproductive development: the elongate1 mutant affects meiosis II. Plant J. 43 (2), 309-320 (2005).
- Braselton, J. P., et al. Feulgen staining of intact plant tissues for confocal microscopy. Biotech. Histochem. 71, 84-87 (1996).
- Scott, R. J., et al. Parent-of-origin effects on seed development in Arabidopsis thaliana. Development. 125, 3329-3341 (1998).
- Armstrong, S. J., Jones, G. H. Female meiosis in wild-type Arabidopsis thaliana and in two meiotic mutants. Sex Plant Reprod. 13, 177-183 (2001).
- Grimanelli, D., et al. Heterochronic expression of sexual reproductive programs during apomictic development in Tripsacum. Genetics. 165, 1521-1531 (2003).
- Gutierrez-Marcos, J. F., et al. Maternal gametophytic baseless1 is required for development of the central cell and early endosperm patterning in maize (Zea mays). Genetics. 174 (1), 317-329 (2006).
- Niedojadło, K., et al. Ribosomal RNA of Hyacinthus orientalis L. female gametophyte cells before and after fertilization. Planta. 236, 171-184 (2012).
- Williams, J. H., Friedman, W. E. The four-celled female gametophyte of Illicium (Illiciaceae; Austrobaileyales): Implications for understanding the origin and early evolution of monocots, eumagnoliids, and eudicots. Am J Bot. 91 (3), 332-351 (2004).
- Bass, H. W., et al. Telomeres cluster de novo before the initiation of synapsis: a three-dimensional spatial analysis of telomere positions before and during meiotic prophase. J Cell Biol. 137 (1), 5-18 (1997).
- Howe, E. S., et al. Three-dimensional acrylamide fluorescence in situ hybridization for plant cells. Methods Mol Biol. 990, 53-66 (2013).
- She, W., et al. Chromatin reprogramming during the somatic-to-reproductive cell fate transition in plants. Development. 140 (19), 4008-4019 (2013).
- Pillot, M., et al. Embryo and endosperm inherit distinct chromatin and transcriptional states from the female gametes in Arabidopsis. Plant Cell. 22 (2), 307-320 (2010).
- Borlinghaus, R. T. MRT letter: high speed scanning has the potential to increase fluorescence yield and to reduce photobleaching. Microsc Res Tech. 69 (9), 689-692 (2006).
- Autran, D., et al. Maternal epigenetic pathways control parental contributions to Arabidopsis early embryogenesis. Cell. 145 (5), 707-719 (2011).
- Fransz, P., et al. Interphase chromosomes in Arabidopsis are organized as well defined chromocenters from which euchromatin loops emanate. Proc Natl Acad Sci USA. 99 (22), 14584-14589 (2002).
- Cox, W. G., Singer, V. L. Fluorescent DNA hybridization probe preparation using amine modification and reactive dye coupling. BioTechniques. 36 (1), 114-122 (2004).
- Lysak, M., et al. Cytogenetic analyses of Arabidopsis In Arabidopsis Protocols: Methods in Molecular Biology, 2nd ed. Salinas, J., Sanchez-Serrano, J. J. , Humana Press. Totowa, NJ. 173-186 (2006).
- Chieco, P., Derenzini, M. The Feulgen reaction 75 years on. Histochem Cell Biol. 111 (5), 345-358 (1999).
- Suzuki, T., et al. DNA staining for fluorescence and laser confocal microscopy. J Histochem Cytochem. 45 (1), 49-53 (1997).
- Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
- Bauwens, S., Oostveldt, P. V. Whole mount fluorescence in situ hybridization (FISH) of repetitive DNA sequences on interphase nuclei of the small cruciferous plant Arabidopsis thaliana. Procedures for In Situ Hybridization to Chromosomes, Cells, and Tissue Sections. Nonradioactive in situ hybridization application manual. , 165-171 (1996).
