Summary
Vi ger här ett effektivt och tillförlitligt protokoll för immunfärgning, fluorescens in situ hybridisering, DNA-färgning följt av kvantitativ, högupplöst bildbehandling i hel-mount Arabidopsis thaliana fröämnen. Metoden har framgångsrikt använts för att analysera kromatin ändringar och kärnarkitektur.
Abstract
I blommande växter, är det somatiska-till-reproduktiva cell öde övergång markeras av specifikationen av spor moderceller (SMC) i blom organ i den vuxna växten. Den kvinnliga SMC (megaspore modercell, MMC) skiljer i fröämnet primordium och genomgår meios. Den valda haploid megaspore genomgår sedan mitos att bilda flercelliga kvinnliga gametophyte, vilket kommer att ge upphov till könsceller, äggcellen och central cell, tillsammans med hjälpceller. Den begränsade tillgängligheten av MMC, meiocyte och kvinnliga gametophyte inuti ovule är tekniskt utmanande för cytologisk och cytogenetiska analyser på enskild cellnivå. Speciellt, är direkt eller indirekt immunodetection av cellulära eller nukleära epitoper försämras av dålig penetrering av reagenserna inne i växtcellen och encelliga avbildning demised av bristen på optisk klarhet i hela monterade vävnader.
Därför utvecklade vi en effektiv metod för att analysera Nuclöron organisation och kromatin modifiering med hög upplösning av enskild cell i hela monterade inbäddade Arabidopsis fröämnen. Den är baserad på dissekering och inbäddning av fasta fröämnen i ett tunt skikt av akrylamidgel på ett objektglas. De inbäddade fröämnen utsätts för kemiska och enzymatiska behandlingar som syftar till att förbättra tydligheten vävnad och permeabilitet för immunfärgning reagenser. Dessa behandlingar bevara cellulära och kromatin organisation, DNA-och protein epitoper. De prover som kan användas för olika nedströms cytologiska analyser, inklusive kromatin immunofärgning, fluorescens in situ hybridisering (FISH), och DNA-färgning för heterokromatin analys. Confocal laserskanning mikroskopi (CLSM) imaging, med hög upplösning, följt av 3D-rekonstruktion möjliggör kvantitativa mätningar vid encelliga upplösning.
Introduction
I blommande växter, inrättandet av reproduktiva linjer börjar med differentieringen av SMC, kvinnliga MMC och manliga mikrospor modercell. MMC utvecklas från en sub-epidermal nucellar cell vid den distala spetsen av ovule primordium och mikrospor modercellen utvecklas från sporogena vävnad i ståndarknapp locule, som ligger djupt inne i floral organ 1. SMC genomgå meios för att producera haploida sporer, som sedan ger upphov till gametofyter vid mitos. Den kvinnliga gametophyte eller embryo sac, består av en äggcell, en central cell, två synergids och tre antipodals. Den manliga gametophyte, eller pollen, består av en vegetativ cell och två spermier. Medan den manliga gametophyte fortfarande en relativt tillgänglig objekt av-studien, är den kvinnliga gametophyte inbäddade inuti ovule, själva inneslutna i blomman pistill, och därmed innebär särskilda utmaningar för molekylär och cytologiska analyser. Nyligen dock laser-assistedmicrodissection erbjuds en elegant lösning som gör det möjligt transcriptomic analyser i MMC och kvinnliga gametophytic celler 2-4. Utöver kandidat genuttryck analyser, med hjälp av t ex RNA in situ hybridisering eller reporter gen analyser, cytologiska analyser låter undersöka dynamiken i endogena cellulära komponenter med specifika direkta cellulär färgning eller indirekt immunfärgning. Särskilt cytogenetisk färgning använder FISH och DNA-färgning, tillsammans med immunfärgning av kromatin ändringar eller kromatin komponenter är centrala metoder för att belysa kromatin dynamik och kärnorganisation i Arabidopsis 5. Vanligtvis innebär meios specifika kromosomdynamik som har varit väl undersökta i växt manliga meiocytes 6,7; ytterligare storskaliga, cellspecifika kromatin omorganisation, troligen avspeglar dynamisk epigenetiska omprogrammeringen har beskrivits under pollenutvecklingen 8-10. Däremot, på grund avtill den relativa otillgänglighet av den kvinnliga meiocyte och gametophyte, dessa undersökningar förblir tekniskt svårt att tillämpa, och ofta kräver sektione eller manuell dissektion och enzymatisk nedbrytning (se nedan). Dessutom, den utbredda bristen på optisk klarhet i hela-fäste är ett hinder för högupplöst avbildning av könsceller i intakta fröämnen.
En klassisk metod för cytologisk analys av kromosomorganisation i hela-mount fröämnen använder Feulgen s färgning 11-13. Det innefattar syrahydrolys (med användning av underklorsyrlighet) av DNA som resulterar i proteindenaturering och därigenom orsakar förstörelse av kromatinstrukturen. Alternativt kan observeras kromosomorganisation i kvinnliga meiocytes och gametophytic celler använder DAPI färgning och immunfärgning på semi-tunna sektioner eller dissekeras embryo säckar och MMC (till exempel se 14-18). Det är emellertid uppenbart, manuell dissektion och sektionering kan vara arbetsintensiv ochhindrar på kvalitativ och kvantitativ analys av ett stort antal kromatin epitoper.
Här ger vi ett effektivt protokoll för att förbereda ett stort antal Arabidopsis fröämnen som lämpar sig för en mängd olika nedströms cytologisk färgning i hela-fäste. I korthet, är blomknoppar inkuberas i en fixeringslösning, är rader av fröämnen dissekeras från pistill och inbäddade i akrylamid på bilden som gjort för pollen meiocytes 19,20. De inbäddade fröämnen vidare rensas och fixerades i metanol, etanol, och xylen före cellväggen matsmältningen och permeabilisering. Möjliga variationer av dessa steg diskuteras. Proverna kan därefter användas för DNA-färgning, immunfärgning, och FISH. Läget preparatet är effektivt och möjliggör parallell försöksuppställningen (upp till 16 diabilder kan beredas i en dag för olika nedströms analys). De behandlingar som beskrivs möjliggör homogena signaler i hela-fäste och välbevarade histologiska, cellulär,och nukleära organisation i könsceller och omgivande nucellar celler som gynnar kvalitativa och kvantitativa jämförelser mellan celltyper. Kalibrerad, CLSM baserade högupplöst avbildning följt av 3-dimensionella rekonstruktion möjliggör meningsfulla kvantitativa mätningar av fluorescenssignaler. Vi använde med framgång denna procedur för att analysera kromatin dynamik i differentiering MMC 21 och utveckla kvinnliga gametophyte 22; Vi presenterar här representativa resultat heterochromatin analys, kromatin immunfärgning, GFP immunfärgning och FISH helt monterade fröämnen. Vi tror också att våra protokoll kommer att vara lämpliga för andra växtvävnader och arter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Förfarandet beskrivs i arbetsflödet i Figur 1, och installationen för dissekering och inbäddning av vävnader presenteras i figur 2.
1. Vävnadsfixering
- Samla 20-30 fruktblad i ett mikrofugrör med nybakade BVO fixativ buffert på is.
- Fixa vävnaden 30 min med försiktig skakning vid rumstemperatur.
- Snurra rören innehåller fruktblad i fixativ i en bänk mikro 1 min vid 400 x g..
- Ta försiktigt fixerings buffert och tillsätt 1 ml av PBT, placera rören på is.
2. Dissection and Embedding
- Förbered fem Eppendorf-rör med vardera 200 l av en nyligen gjord, 5% inblandning akrylamid.
- Förbered fem Superfrost diabilder förväg rengjorda med 70% etanol och märkta med en blyertspenna.
- Tina en alikvot av 20% APS och 20% tupplurar i varje, på is.
- Ta 4-5 fruktblad med en cut-end spets, platsdem på en ren bild, ta bort överskottet av vätska.
- Gör längsgående snitt med en fin nål och lossa Carpel väggarna att släppa rader av fröämnen som visas Figur 2, undvika uttorkning genom att täcka med PBS (högst 10 pl).
- Snabbt lägga till och blanda 12 | il tupplurar, 12 pl APS med en alikvot av 200 pl mix akrylamid.
- Tillsätt 30 l av den aktiverade akrylamid på de dissekerade fröämnen.
- Täck med en 20 x 20 mm täckglas, låt polymerisera vid rumstemperatur, 45-60 min.
- Ta bort täckglaset med hjälp av ett rakblad. I detta skede kan proverna förvaras över natten vid 4 ° C i ett Coplin-kärl innehållande PBS.
3. Vävnadsbearbetning
OBS: Alla steg utom 3.2.1, 3.2.3, 3.3.2 och 3.4.3 utförs i Coplin-kärl med 80 ml lösning under dragskåp vid rumstemperatur. Diabilder överförs med en platt-tip pincett.
- Vävnads förtydligande ochfixering:
- Inkubera 5 minuter i metanol.
- Inkubera 5 min i etanol.
- Inkubera 30 min i etanol: xylen (1:1).
- Inkubera 5 min i etanol.
- Inkubera 5 minuter i metanol.
- Inkubera 15 minuter i metanol och PBT (1:1), kompletterat med 2,5% formaldehyd.
- Skölj 2 x 10 min i PBT. I detta skede kan diabilder förvaras över natten vid 4 ° C.
- Cellvägg matsmältning:
- Tina en alikvot av cellväggen matsmältningen blandning på is.
- Ta en bild från Coplin-kärlet, dränera överskott av vätska genom att placera den vertikalt på en pappershandduk.
- Addera 100 pl av cellväggsdigere blandning över hela akrylamid dyna och täck med en 23 x 46 mm täckglas. Upprepa för de andra bilderna. Inkubera i 2 h vid 37 ° C i en fuktig kammare (beskrivs i Material).
- Tvätta diabilder 2 x 5 minuter i PBT.
- RNas A-behandling:
- Ta en bild från Coplin burk, dränera the överskott av vätska som tidigare.
- Inkubera varje objektglas med 100 | il av RNasA vid 100 | ig / ml i PBS med 1% Tween-20 under 1 timme vid 37 ° C i en fuktig kammare.
- Tvätta bilderna för 2 x 5 minuter i PBT.
- Post-fixering och permeabilization:
- Post-fix för 20 min i nybakade PBT-F.
- Skölj objektglasen i 10 minuter i PBT.
- Permeabilisering under 2 h i PBS med 2% Tween-20 vid 4 ° C.
- Skölj objektglasen i 2 x 5 minuter i PBT.
4. Immunfärgning
OBSERVERA: I detta steg har den optimala koncentrationen av den primära antikroppen som skall testas med hjälp av olika utspädningar (1:200, 1:500, 1:1000) av antikropparna.
- Inkubera varje objektglas med 100 | il av primär antikropp utspädd i PBS med 0,2% Tween-20 under 12 till 24 h vid 4 ° C.
- Tvätta bilderna i PBT under 2-4 h vid rumstemperatur under försiktig skakning.
- Applicerasekundär antikropp 1:200 i PBS + 0,2% Tween-20 under 24 h vid 4 ° C.
- Tvätta objektglasen i PBT under 1 h vid rumstemperatur under försiktig skakning.
- Motfärg med 10 | ig / ml propidiumjodid i PBS under 15 minuter, därefter sköljning 15 min i PBS under försiktig skakning vid rumstemperatur.
- Mount i Antibleknings vätska monteringsmedel kompletterat med 10 | ig / ml propidiumjodid. Låt monteringsmediet härda i 1 timme innan de har fått bilder från CLSM.
5. Kvantitativ Imaging
- Bild förvärv:
- Förvärva högupplösta bilder med CLSM, helst med hjälp av en resonans scanning, vilket möjliggör bättre bevarande av fluorescerande signaler över längre avbildning 23, och en 63X glycerol nedsänkning lins.
- Testa förvärvet parametrar som laserintensitet, vinst, pinhole, voxel storlek och zoomfaktor i början av försöket att definiera ett standardförvärvsförfarande för att strikt följa helaalla bilder för konsekventa kvantitativa mätningar.
- Verifiera frånvaron av överhörning mellan fluorokromer. Om det finns, inrätta en sekventiell avsökning. Förvärva överföringsbilder separat och inte samtidigt.
- Utför serie, tredimensionell bild förvärv med högsta möjliga upplösning i x-och y-mått och med 2x översampling i z-dimensionen (Nyquist styre).
- Bildbehandling:
- Rekonstruera serie bilder i tre dimensioner med hjälp av programvara kommersiell eller öppen källkod.
- Definiera konturytor runt varje kärna (eller cell) av intresse i 3D.
- Kvantifiera fluorescens i varje kanal som summan av pixelintensiteterna i varje objekt.
- Exportera data till Excel för statistiska analyser. Normalisera antikropps signaler mot t.ex. DNA färgningssignaler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi erbjuder en robust protokoll för storskalig bearbetning och beredning av Arabidopsis fröämnen lämpliga för cytologisk färgning i hela-fäste. Tack vare inbäddningen de fröämnen bibehåller en 3-dimensionell struktur (fig 3). Dessutom vävnadsbehandling inklusive optisk förtydligande möjliggör avbildning subcellulära strukturer med hög upplösning. Figur 4 visar DNA-färgning i hela montering ovule primordia där heterokromatin visas som ljusa, väl definierade iögonfallande foci (ingen deconvolution användes för denna bild). Dessa bilder har använts för att analysera heterokromatin innehåll i MMC och nucellus (Figur 4) 21.
Dessutom framgångsrikt använt vi detta protokoll för att kvantitativt analysera kromatin dynamik genom immunfärgning i megaspore moderceller, funktionell megaspore, utveckla kvinnliga gametophytes och tidiga embryot 21, 22-24. I figur 5 Arabidopsis fröämnen. Figur 5A visar ett exempel på immundetektering i ovule primordia, inklusive megaspore modercellen, med en eukromatin associerade permissive märke (H3K4me3) och ett heterokromatin associerade repressiv märke (H3K27me1). Figur 5B visar ett exempel på GFP immunodetektion i en mogen ovule, inklusive embryo sac (i detta fall var det protokoll som något modifierad för att använda GFP booster antikropp (se diskussion). Vi upptäckte också infödda kromatin proteiner såsom H3 och H1 21 visar att förfarandet bevarar kromatin proteinepitoper. Förfarandet möjliggör också reproducerbara kvantifieringar som möjliggör jämförelser mellan celltyper (t.ex. reproduktions vs somatiska, omgivande celler) 21.
Slutligen, vi framgångsrikt tillämpats även denna procedur för att utföra FISH analyser på hel-mount ovule primordia. Ett exempel visas Figur 6 visar FISH-signaler med hjälp av en sond mot 45S rDNA upprepar definiera nukleolära organisera områdena 25. DNA-proben var direkt märkta med Alexa 488 använder FISH-Tag 26 utfördes hybridisering gjordes väsentligen såsom beskrivits 27 med mindre modifieringar, medan DNA motfärgning utfördes enligt beskrivning i våra protokoll.
Figur 1. Arbetsflöde för immunfärgning, DNA-färgning och fluorescens in situ hybridisering i Arabidopsis ovules. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Inställning för dissekering och inbäddning av fruktblad på bilden. Den carpel väggen tas bort och pistill dissekeras på bilden för att frigöra rader av fröämnen (se närbild på dissekerade fröämnen i steg 3), och sedan den dissekerade pistill är inbäddad i mixen aktiverad akrylamid, som täcks av 20 x 20 mm täckglas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Protokollet möjliggör bevarandet av 3-dimensionella strukturen samtidigt som optisk klarhet och homogen färgning. Bilderna visar en uppdelad tvärsnittsvy av 3D-bilden i xy, xz och yz-axeln såsom anges. Bilddata har förvärvats avkonfokal laserskanning mikroskopi och rekonstrueras i tre dimensioner med hjälp av Imaris programvaran. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Whole-mount DNA-färgning av propidiumjodid i ovule primodia möjliggör exakt heterokromatin kvantifiering. Bilden till vänster visar hela-mount-DNA-färgning under en fröämnet primordia. En MMC kärna präglas av en vit kontur och en nucellar kärna i rött. Prognoser för 3D-rekonstruerade kärnor visas till höger. Tydligheten i vävnaden möjliggör högupplöst avbildning av heterochromatin foci markerade med en gul kontur och kvantifiering av de fluorescerande signaler däri. Graferna visar den relativa heterochromatin fraktion 21. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Representativa resultat av hel-mount immunfärgning i Arabidopsis fröämnen. A) Immunfärgning av kromatin ändringar i unga ovule primordia upptäcka eukromatin (H3K4me3) och heterokromatin (H3K27me1). Antikropps signalen är grön, DNA motfärgades med propidiumjodid i rött. Ett överdrag av fluorescerande signaler visas tillsammans med en bild i transmissionsljus med användning av differentialinterferenskontrast (grå). MMC indikeras med vita konturer. En närbild av MMC kärnan visas som infälld i den övre panelen. Bilderna är enda konfokala avsnitt. B) Immunodetektering av GFP i en mogen ovule.Den GFP immunostained hjälp av GFP-booster antikropp och fröämnet motfärgades med DAPI. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Hela montering fluorescens in situ hybridisering i Arabidopsis fröämnen. Den ovule primordium hybridiserades med en DNA-prob specifik för 45S rDNA upprepa loci och märkt med Alexa 488 med hjälp av FISH-Tag-teknik, och motfärgades med DAPI 26. Den överlagring av 45S rDNA med DAPI och bild förvärvats i transmissionsljuskanalen (grå) visas också. En närbild av MMC kärnan visas som infälld. Klicka här för att se en större version av denna bildure.
Figur 7. Inverkan av fixering, matsmältning och färgningsprocedur på DNA-signaler i hel-mount fröämnen. A) Mogna fröämnen fixerades 30 min antingen med 4% paraformaldehyd eller BVO fixativ och bearbetas 30 min eller 1 timme med cellväggen smälta enzymblandning innan DNA-färgning med propidiumjodid. För ett givet parti, drabbar längre inkubation mer negativt på DNA färgnings fröämnen som korrigerades med paraformaldehyd än med BVO. B) Hela montering DNA-färgning hjälp av Feulgen reagens efter en krävs syra-hydrolys 28 eller med hjälp av propidiumjodid efter icke- denatureringsprotokoll beskrivs i texten. Det övre fältet visar en enda plan sektion genom embryo sac, presenterar den nedre panelen en förstoring över det centrala cellkärnan som tydligt visar förändring avkromatin organisation i Feulgen-färgade fröämnen. CCN, central cellkärna, ECN, ägg cellkärna, syn, synergid kärna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I blommande växter, är det kvinnliga reproduktiva härstamning omgiven av flera cellager inklusive nucellus och fröämnet teguments, vilket gör cytologisk färgning i hela montering tekniskt utmanande. Här presenterar vi ett effektivt protokoll som möjliggör bearbetning och beredning av ett stort antal fröämnen lämpliga för cytologisk färgning såsom immunfärgning, DNA-färgning och fluorescens in situ hybridisering i hela-fäste. Vi använde framgångsrikt det för analys av det kvinnliga reproduktiva könsceller i Arabidopsis 21,22. Denna metod är mycket effektiv som flera bilder kan behandlas parallellt för olika färgning. Det är också robust och ger homogen signal distribution och möjliggör reproducerbara kvantitativa analyser. I motsats till klassisk metod såsom Feulgen-färgning som innefattar denaturering av kromatinstrukturen, våra protokoll bevarar kromatin organisation och nukleära epitoper. In addUtgåva, förtydligande vävnad möjliggör avbildning signalerna med hög upplösning vid encelliga nivå.
Detta protokoll kan påskyndas genom att utelämna stegen som beskrivs i 3.1, om blommorna rättats i 4% paraformaldehyd (i PBS + 1% Tween) istället för BVO buffert (1,1). Även om detta kortare förfarande visade sig funktionellt för flera immunfärgning 22-24, fann vi att det dämpar robusthet färgning över prover, antikroppar och sats av cellväggen matsmältningen enzymblandning (se nedan). Dessutom var vi inte lyckas för FISH hybridisering med denna korta förfarande. För immunodetektion av GFP: s med hjälp av booster molekyler som visas Figur 5B, ett liknande protokoll som beskrivs här användes med smärre ändringar i steg 1 och 3: fruktblad fixerades i 2,5% formaldehyd i 45 min (1,1), det första steget i vävnadsbehandling förkortades till 5-10 min metanolbehandling (3.1), var en blockerande steg introduceras (30 min i 2% BSA i PBS) före antikropps ansökan natten som beskrivs. Ingen sekundär antikropp är nödvändigt med booster.
Vi diskuterar nedan några viktiga steg:
Tissue Fixering, dissektion och inbäddning.
Immunfärgning och DNA färgningssignaler var genomgående mer robust och homogent fördelad när vävnaden togs prover från växter mindre än 5 veckor (efter överföring av plantan i jorden). Möjligen, i våra tillväxtförhållanden, en längre period av odling kan åtföljas av förändringar i den biokemiska sammansättningen av cellväggen, påverkar i sin tur effektiviteten i vävnadsbehandling. Således rekommenderar vi provtagning vävnad från relativt unga plantor. Dessutom bör vävnaden förhindras från att torka under dissektion (som leder annars till histologisk förändring och frånvaro av färgningssignaler), medan ett överskott av PBS utmanar manipulation; en mild dränering av överskottet av solution med spetsen runt vävnaden avsattes på sliden rekommenderas därför. Vidare bör bubblor undvikas i blandning av akrylamid och samtidigt som det täcker med ett täckglas. Slutligen Superfrost Plus diabilder rekommenderas starkt för tillräcklig vidhäftning akrylamid (standardkvalitet leder till sköra och instabila kuddar i våra händer), så som de visas överlägsen andra för vävnad och vidhäftning akrylamid.
Fixering, permeabilisering och cellväggen matsmältningen.
Cellvägg matsmältning är ett kritiskt steg i vävnadsbehandling. Man tror att detta steg underlättar en god penetration av färgreagenser homogent i hela växtvävnaden. Vi upplevde variabilitet i färgnings homogenitet (som sträcker sig från ingen signal, signal i endast en del av vävnaden, till 100% vävnadsfärgning) beroende på koktiden och den enzymatiska aktiviteten (batch-specifika, beskrivna av leverantören). Det rekommenderas att producera en stor mängd av förrådslösningenav enzymblandning (t.ex. 100 ml) och håll 1 ml alikvoter vid -20 ° C. Varje stamlösning bör först testas på 1-2 slides innan du använder i stor skala. Dessutom upplevde vi att den typ av fixerings påverkar effektiviteten av DNA-färgning i kombination med olika behandlingstid för cellvägg digest: fröämnen som fastställs i 4% paraformaldehyd påverkades negativt av långvarig inkubation med cellväggen matsmältningen mix, medan vävnad fast med BVO lösning var toleranta till längre uppslutningstider och får bättre DNA-färgning (Figur 7A). Dessutom är absolut nödvändigt en RNAse (DNas fritt) behandling om vävnaden motfärgas med propidiumjodid eftersom det binder också till RNA-molekyler. Vi avråder från att använda 4 ',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) på grund av dess breda fluorescerande emissionsspektra överlappar med andra fluoroforer utan också akromatiska avvikelser som kräver kanalskift korrigeringar efter förvärvet. Vi ocksårekommenderar mot Feulgen färgning som kräver en syra-hydrolys under vävnadsbehandling 28 som leder till kromatin denaturering i synnerhet i fostersäcken (Figur 7B). Alternativa DNA-färgämnen kan också användas 29, men deras effektivitet har inte testats här.
Immunfärgning.
För immunfärgning av kromatin ändringar, rekommenderar vi att verifiera specificiteten för den primära antikroppen i den databas med öppen källkod http://compbio.med.harvard.edu/antibodies/projects/1 30, som några kommersiellt tillgängliga antikroppar visade korsreaktioner för andra modifikationer. För nedströms kvantifiering analyser, är det viktigt att kalibrera tids antikroppar koncentration och inkubationstid för att mäta signaler i ett linjärt förhållande med epitopen. Vi rekommenderar att kalibrera utspädning och detektionsantikropp tid med hjälp av en antikropp dilution serie av 1:200, 1:500, 1:1000 och 12-24 timmars inkubation, respektive, för att identifiera de villkor som ger stabila och homogena signaler. Den högsta utspädning och kortaste inkubationstiden möjliggör reproducerbara signaler bör användas för kvantitativa analyser. Kontroller utan primär antikropp bör utföras för att testa specificiteten. Om immunfärgning producerar ospecifik färgning, är det tillrådligt att blockera med 5% BSA + 0,1% Tween i PBS i 2 timmar vid 4 ° C innan den primära antikroppen. Kan kontrolleras Antikropps signaler på objektglaset före DNA motfärgning för att kontrollera framgången med experimentet. I våra händer, tvättning i PBT under 2-4 h efter inkubering med den primära antikroppen, och 1 h efter den sekundära antikroppen möjliggör låga bakgrundssignaler även utan blockering.
Slutligen är detta protokoll också sannolikt tillämpas på andra växtvävnader (t.ex. rot, blad fragment, blommig meristem) och förmodligen till andra växtarter, proViding viss justering på dissekering, cellväggen smälta och permeabilisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| BVO Fixation Buffer (based on32) | 2 mM EGTA, pH 7.5, 1% (v/v) formaldehyde, 10% DMSO, 1x PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBT | 1x PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBT-F | 1x PBT, 2.5% (v/v) formaldehyde | ||
| 30% acrylamide:bisacrylamide | 3 g acrylamide, 0.33 g bisacrylamide, 1x PBS (prepare 10 ml, store at 4 °C) | ||
| 200 ml 5% acrylamide mix in PBS | 34 ml 30% acrylamide:bisacrylamide, 166 ml 1x PBS (make fresh from 30% stock) | ||
| 20% ammoniumpersulfte | 0.2 g ammoniumpersulfte, 1 ml sterile water (prepare aliquots with 1 ml and store at -20 °C) | ||
| 20% sodium sulfite | 0.2 g sodium sulfite, 1 ml sterile water (prepare aliquots with 1 ml and store at -20 °C) | ||
| Cell wall enzyme mix | 0.5% (w/v) cellulase, 1% (w/v) driselase, 0.5% (w/v) pectolyase | ||
| Reagents and Materials | |||
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| DMSO | Sigma | D5879 | |
| Tris | Amaresco | 0497 | |
| Ethanol | Schaurlau | ET00102500 | |
| Methanol | Schaurlau | ME03062500 | |
| Xylene | ROTH | 4436.1 | |
| Cellulase | Sigma | 1794 | |
| Driselase | Sigma | D8037 | |
| pectolyase | Sigma | P5936 | |
| Tween-20 | Merck | 8.22184.0500 | |
| EGTA | Sigma | E-4378 | |
| acrylamide | Sigma | A-3553 | |
| bisacrylamide | Sigma | M2022 | toxic |
| ammoniumpersulfate | Sigma | A9164 | |
| Sodium sulfite | Fluka | 71988 | |
| Anti-trimethyl-Histone H3 (Lys4) | Upstate | 07-473 | |
| Anti- monomethyl-Histone H3 (Lys27) | Upstate | 07-448 | |
| Alexa Fluor 488~goat ~anti ~rabbit (H+L) | Molecular Probe | A11008 | |
| ProlongGold | Invitrogen | P36934 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170 | toxic |
| DAPI | Sigma | D9542 | toxic |
| RNAse A | Roche | 10109169001 | |
| Coplin jar | Huber & CO | 10.055 | |
| Forceps | DUMONT BIOLOGY | ||
| Shaker | Heidolph | 543-12310-00-0 | |
| Moist chamber | A plastic box with damp paper towel inside, a plastic support is put into the box for supporting the slides and keep slides from the water. | ||
| Superfrost Plus slide | Thermo Fisher | J1800AMNZ | Menzel-Gläser |
| FISH Tag DNA KIt | Invitrogen | F32947 | |
| GFP booster | Chromotek |
References
- Maheshwari, P. An introduction to the embryology of angiosperms. , McGraw-Hill. New York. (1950).
- Schmidt, A., et al. Transcriptome analysis of the Arabidopsis megaspore mother cell uncovers the importance of RNA helicases for plant germline development. PLoS Biol. 9 (9), (2011).
- Schmidt, M. W., et al. A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA Sequencing. PLoS One. 7 (1), (2012).
- Wuest, S. E., et al. Arabidopsis female gametophyte gene expression map reveals similarities between plant and animal gametes. Curr Biol. 20 (6), 506-512 (2010).
- Koornneef, M., et al. Cytogenetic tools for Arabidopsis thaliana. Chromosome Res. 11 (3), 183-194 (2003).
- Oliver, C., et al. The dynamics of histone H3 modifications is species-specific in plant meiosis. Planta. 238 (1), 23-33 (2013).
- Ravi, M., et al. Meiosis-specific loading of the centromere-specific histone CENH3 in Arabidopsis thaliana. PLoS Genet. 7 (6), (2011).
- Borges, F., et al.
- Pandey, P., et al. Chromatin alterations during pollen development in Hordeum vulgare. Cytogenet Genome Res. 141 (1), 50-57 (2013).
- Schoft, V. K., et al. Induction of RNA-directed DNA methylation upon decondensation of constitutive heterochromatin. EMBO Rep. 10 (9), 1015-1021 (2009).
- Barrell, P. J., Grossniklaus, U. Confocal microscopy of whole ovules for analysis of reproductive development: the elongate1 mutant affects meiosis II. Plant J. 43 (2), 309-320 (2005).
- Braselton, J. P., et al. Feulgen staining of intact plant tissues for confocal microscopy. Biotech. Histochem. 71, 84-87 (1996).
- Scott, R. J., et al. Parent-of-origin effects on seed development in Arabidopsis thaliana. Development. 125, 3329-3341 (1998).
- Armstrong, S. J., Jones, G. H. Female meiosis in wild-type Arabidopsis thaliana and in two meiotic mutants. Sex Plant Reprod. 13, 177-183 (2001).
- Grimanelli, D., et al. Heterochronic expression of sexual reproductive programs during apomictic development in Tripsacum. Genetics. 165, 1521-1531 (2003).
- Gutierrez-Marcos, J. F., et al. Maternal gametophytic baseless1 is required for development of the central cell and early endosperm patterning in maize (Zea mays). Genetics. 174 (1), 317-329 (2006).
- Niedojadło, K., et al. Ribosomal RNA of Hyacinthus orientalis L. female gametophyte cells before and after fertilization. Planta. 236, 171-184 (2012).
- Williams, J. H., Friedman, W. E. The four-celled female gametophyte of Illicium (Illiciaceae; Austrobaileyales): Implications for understanding the origin and early evolution of monocots, eumagnoliids, and eudicots. Am J Bot. 91 (3), 332-351 (2004).
- Bass, H. W., et al. Telomeres cluster de novo before the initiation of synapsis: a three-dimensional spatial analysis of telomere positions before and during meiotic prophase. J Cell Biol. 137 (1), 5-18 (1997).
- Howe, E. S., et al. Three-dimensional acrylamide fluorescence in situ hybridization for plant cells. Methods Mol Biol. 990, 53-66 (2013).
- She, W., et al. Chromatin reprogramming during the somatic-to-reproductive cell fate transition in plants. Development. 140 (19), 4008-4019 (2013).
- Pillot, M., et al. Embryo and endosperm inherit distinct chromatin and transcriptional states from the female gametes in Arabidopsis. Plant Cell. 22 (2), 307-320 (2010).
- Borlinghaus, R. T. MRT letter: high speed scanning has the potential to increase fluorescence yield and to reduce photobleaching. Microsc Res Tech. 69 (9), 689-692 (2006).
- Autran, D., et al. Maternal epigenetic pathways control parental contributions to Arabidopsis early embryogenesis. Cell. 145 (5), 707-719 (2011).
- Fransz, P., et al. Interphase chromosomes in Arabidopsis are organized as well defined chromocenters from which euchromatin loops emanate. Proc Natl Acad Sci USA. 99 (22), 14584-14589 (2002).
- Cox, W. G., Singer, V. L. Fluorescent DNA hybridization probe preparation using amine modification and reactive dye coupling. BioTechniques. 36 (1), 114-122 (2004).
- Lysak, M., et al. Cytogenetic analyses of Arabidopsis In Arabidopsis Protocols: Methods in Molecular Biology, 2nd ed. Salinas, J., Sanchez-Serrano, J. J. , Humana Press. Totowa, NJ. 173-186 (2006).
- Chieco, P., Derenzini, M. The Feulgen reaction 75 years on. Histochem Cell Biol. 111 (5), 345-358 (1999).
- Suzuki, T., et al. DNA staining for fluorescence and laser confocal microscopy. J Histochem Cytochem. 45 (1), 49-53 (1997).
- Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
- Bauwens, S., Oostveldt, P. V. Whole mount fluorescence in situ hybridization (FISH) of repetitive DNA sequences on interphase nuclei of the small cruciferous plant Arabidopsis thaliana. Procedures for In Situ Hybridization to Chromosomes, Cells, and Tissue Sections. Nonradioactive in situ hybridization application manual. , 165-171 (1996).
