Summary
Мы предоставляем здесь эффективную и надежную протокол для иммуноокрашивания, флуоресцентная в гибридизация, окрашивания ДНК с последующим количественным, изображений с высоким разрешением в целом монтажа арабидопсис яйцеклеток. Этот метод был успешно использован для анализа хроматина модификации и ядерной архитектуры.
Abstract
В цветущих растений, судьба клеток переход соматической к репродуктивного отмечен спецификации спор материнских клеток (ГМК) в цветочных органов взрослого растения. Самка SMC (мегаспоры материнская клетка, MMC) отличает в яйцеклетки зачатка и претерпевает мейоз. Выбранный гаплоидны мегаспоры затем подвергается митоза, чтобы сформировать многоклеточный женского гаметофита, которая даст начало гамет, яйцеклетку и центрального ячейку вместе с вспомогательными клетками. Ограниченная доступность из ГМК, meiocyte и женского гаметофита внутри яйцеклетки технически сложным для цитологического и цитогенетического анализа на уровне одной клетки. В частности, прямое или косвенное иммунодетекции сотовых или ядерных эпитопов нарушается плохим проникновением реагентов внутри изображений клеток растений и одноклеточных является наследству отсутствием оптической прозрачности в целом монтажа тканей.
Таким образом, мы разработали эффективный метод для анализа Nuclорганизация уха и модификация хроматина в высоком разрешении одной клетки в целом монтажа встроенных Arabidopsis яйцеклеток. Он основан на рассечения и вложения основных яйцеклеток в тонком слое акриламида гель на предметное стекло. Встроенные яйцеклетки подвергаются химической и ферментативных обработок, направленных на улучшение ясности тканей и проницаемость к иммуноокрашивания реагентов. Эти процедуры сохранить клеточные и организации хроматина, ДНК и белка эпитопы. Образцы могут быть использованы для различных последующих цитологических анализов, в том числе хроматина иммунным окрашиванием, флуоресценции в гибридизация (FISH) и окрашивания ДНК для анализа гетерохроматина. Конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM) изображений, с высоким разрешением, а затем 3D-реконструкции позволяет для количественных измерений при разрешении одноклеточных.
Introduction
В цветущих растений, создание репродуктивных линий начинается с дифференциации ГМК, женской MMC и мужской микроспора материнской клетки. ГМК развивается из суб-эпидермального нуцеллярных камере в дистальной части семяпочки зачатка, и микроспора материнская клетка развивается из спорообразующих ткани в пыльников гнезде, которые расположены глубоко внутри цветочных органов 1. ГМК пройти мейоз производить гаплоидные споры, которые затем дают начало к гаметофитов на митоза. Женского гаметофита, или зародышевого мешка, состоит из одной яйцеклетки, одной центральной ячейки, две синергид и три antipodals. Мужского гаметофита, или пыльца, состоит из одного вегетативной клетки и двух сперматозоидов. В то время как мужского гаметофита остается относительно доступным статьям исследование, женский гаметофит встраивается внутрь яйцеклетки, сам заключенный в цветочном пестика, и, таким образом ставит конкретные задачи перед молекулярных и цитологических анализов. Однако в последнее время с помощью лазерамикродиссекции предложил элегантное решение, позволяющее транскриптомных анализирует в ГМК и женских гаметофитного клеток 2-4. В дополнение к экспрессии генов кандидата анализирует, используя, например, РНК в гибридизация или гена-репортера анализов, цитологические анализы позволяет исследовать динамику эндогенных клеточных компонентов, использующих конкретные постоянного сотовой окрашивания или косвенный иммуноокрашивания. В частности, цитогенетический окрашивание с использованием рыбы и окрашивание ДНК вместе с иммунным модификаций хроматина или компонентов хроматина являются центральными подходы для выяснения динамики хроматина и ядерной организации в Arabidopsis 5. Как правило, мейоза влечет за собой конкретные динамику хромосом, который был хорошо исследованы в растительной мужчина meiocytes 6,7; дальнейших крупномасштабных, реорганизация хроматина соты, вероятно, отражает динамический эпигенетическую перепрограммирования был описан во время развития пыльцы 8-10. В противоположность этому, в результатеотносительной недоступности женского meiocyte и гаметофита, эти исследования остаются технически трудно применять, и часто требуют секционирования или ручной вскрытие и ферментативного расщепления (см. ниже). Кроме того, распространены отсутствие оптической прозрачности в целом монтажа является препятствием для изображений с высоким разрешением половых клеток у интактных яйцеклеток.
Классический метод цитологического анализа организации хромосом в целом монтажа яйцеклеток использует окрашивание Фельгену в 11-13. Она включает в себя кислотного гидролиза (с использованием хлорноватистой кислоты) ДНК, что приводит к денатурации белков и, таким образом, вызывает разрушение структуры хроматина. Кроме того, организации хромосом в женских meiocytes и гаметофитного клеток можно наблюдать с помощью DAPI окрашивание и иммуноокрашивания на полу-тонких срезов или расчлененных зародышевых мешков и MMC (см., например, 14-18). Ясно, однако, руководство вскрытие и секционирования может быть трудоемким ипрепятствует на качественном и количественном анализе большого количества хроматина эпитопов.
Здесь мы предлагаем эффективный протокол подготовить большое количество Arabidopsis яйцеклеток, пригодных для различных вниз по течению окрашивания цитологического в целом монтажа. Короче говоря, бутоны инкубируют в закрепителя решения, ряды яйцеклеток расчленены из пестика и заливали в акриламида на слайде, как это сделано для пыльцы meiocytes 19,20. Встроенные яйцеклетки дополнительно очищен и фиксировали в метаноле, этаноле, и ксилол до клеточной стенки пищеварения и проницаемости. Обсуждаются возможные вариации этих шагов. Образцы затем могут быть использованы для окрашивания ДНК, иммуноокрашивания, и рыба. Режим подготовка является эффективным и позволяет параллельно экспериментальной установки (до 16 слайдов, могут быть получены в день для различных вниз по течению анализа). Лечение описанные включить однородные сигналы в целом монтажа и хорошо сохранились гистологические, сотовой,и ядерная организация в репродуктивных клеток и окружающих нуцеллярных клеток, которые пользуются качественные и количественные сравнения между типами клеток. Калиброванный, CLSM основе с высоким разрешением изображения с последующим 3-мерной реконструкции позволяет значимые количественные измерения флуоресцентных сигналов. Мы успешно использовали эту процедуру для анализа динамики хроматина в дифференциации MMC 21 и разработке женского гаметофита 22; мы представляем здесь репрезентативные результаты анализа гетерохроматина, хроматина иммуноокрашивания, GFP иммуноокрашивания и рыба в целом монтажа яйцеклеток. Мы также считаем, что наш протокол будут пригодны для других тканей и видов растений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Эта процедура описана в рабочий процесс на рисунке 1, а установка для вскрытия и вложения тканей представлены на рисунке 2.
1. Тканей Фиксация
- Сбор 20-30 плодолистиков в пробирке, содержащей свежеприготовленный БВО фиксирующий буфер на льду.
- Закрепите ткань 30 мин при осторожном встряхивании при комнатной температуре.
- Вращайте пробирки, содержащие плодолистиков в фиксатора в настольный микроцентрифуги 1 мин при 400 х г.
- Удалить внимательно фиксирующий буфер и добавить 1 мл PBT, поместить пробирки на льду.
2. Вскрытие и внедрение
- Подготовьте пять Эппендорф труб друг с 200 мкл свежеприготовленного, 5% акриламида смеси.
- Подготовьте пять SuperFrost слайды предварительно очищенную с 70% этанола и помечены карандашом.
- Оттепель один аликвоты 20% APS и 20% НПД каждый, на льду.
- Возьмите 4-5 плодолистиков с отключения кончиком, местоих на чистую слайд, удалить избыток жидкости.
- Сделать продольные разрезы с помощью тонкой иглы и отсоедините пестика стены, чтобы освободить ряды яйцеклеток, как показано рисунке 2, избежать высыхания, покрывая с PBS (не более 10 мкл).
- Быстро добавить и смешать 12 мкл НПД, 12 мкл APS с аликвоты 200 мкл акриламида смеси.
- Добавить 30 мкл активированного акриламида на рассеченных семяпочек.
- Накрыть мм покровным 20 х 20, не говоря полимеризации при комнатной температуре, 45-60 мин.
- Удалить покровное лезвием бритвы. На этой стадии образцы можно хранить в течение ночи при 4 ° С в баночку, содержащую Коплин PBS.
3. Обработка ткани
ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги, кроме 3.2.1, 3.2.3, 3.3.2 и 3.4.3 осуществляются в Коплин банки с 80 мл раствора при химической капот при комнатной температуре. Слайды передаются с плоским наконечником щипцов.
- Ткань разъяснения ификсация:
- Инкубировать 5 мин в метаноле.
- Инкубировать 5 мин в этаноле.
- Инкубировать 30 мин в смеси этанол: ксилол (1:1).
- Инкубировать 5 мин в этаноле.
- Инкубировать 5 мин в метаноле.
- Инкубировать 15 мин в метаноле и PBT (1:1), дополненной 2,5% формальдегида.
- Промойте 2 х 10 мин в PBT. На данном этапе, слайды могут храниться в течение ночи при 4 ° С.
- Клеточная стенка пищеварения:
- Оттепель аликвоту клеточной стенки пищеварения смеси на льду.
- Возьмите слайд из фляги Коплин, слейте избыток жидкости, поместив его вертикально на бумажное полотенце.
- Добавить 100 мкл клеточной стенки пищеварения смеси над акриламида площадку и накройте мм покровным 23 х 46. Повторите эти действия для других слайдов. Инкубировать в течение 2 ч при 37 ° С во влажной камере (описанного в материалах).
- Вымойте слайды 2 х 5 мин в PBT.
- РНКазы А лечение:
- Возьмите слайд из фляги Коплин, процедить тыс.е избыток жидкости, как раньше.
- Инкубируют каждый слайд с 100 мкл РНКазы А при 100 мкг / мл в PBS с 1% Твин-20 в течение 1 часа при 37 ° С во влажной камере.
- Вымойте слайды для 2 х 5 мин в PBT.
- После фиксации и пермеабилизации:
- После исправить в течение 20 мин в свежеприготовленный PBT-F.
- Промыть слайды в течение 10 мин в PBT.
- Проницаемыми в течение 2 ч в PBS с 2% Tween-20 при 4 ° С.
- Промыть слайды для 2 х 5 мин в PBT.
4. Иммуноокрашивание
Примечание: На этом этапе, оптимальная концентрация первичного антитела должна быть проверена с использованием различных разведений (1:200, 1:500, 1:1000) антител.
- Инкубируют каждый слайд с 100 мкл первичного антитела разбавленных в PBS с 0,2% твина-20 в течение 12-24 ч при 4 ° С.
- Промыть слайдов в течение 2-4 PBT ч при комнатной температуре при осторожном встряхивании.
- Применить1:200 вторичное антитело в PBS + 0,2% Tween-20 в течение 24 ч при 4 ° С.
- Промыть слайдов в PBT в течение 1 часа при комнатной температуре при легком встряхивании.
- Контрастирующая с 10 мкг / мл пропидийиодидом в PBS в течение 15 мин, затем смыть 15 мин в PBS при осторожном встряхивании при комнатной температуре.
- Крепление в анти-замиранием жидкого mountant с добавлением 10 мкг / мл пропидийиодидом. Пусть монтажа средних затвердеть в течение 1 часа до приобретения изображения, CLSM.
5. Количественный изображений
- Приобретение изображения:
- Получение изображений с высоким разрешением с помощью КЛСМ, в идеале, используя режим сканирования резонанса, который позволяет лучшее сохранение флуоресцентных сигналов над длительной обработки изображений 23, и 63X глицерина погружение линзы.
- Проверьте параметры измерения, такие как интенсивность лазерного, усиления обскуры, размер воксела и коэффициентом увеличения в начале эксперимента, чтобы определить стандартную процедуру приобретения строго следовать во всемвсе горки для последовательных количественных измерений.
- Проверьте отсутствие перекрестных помех между флуорохромами. Если присутствует, установить последовательное сканирование. Получение изображений передачи отдельно, а не одновременно.
- Выполните серийный, трехмерное сканирование изображения с максимально возможным разрешением в х и у размеров и с 2x передискретизации в измерении г (правило Найквиста).
- Обработка изображений:
- Реконструировать серийные изображения в трех измерениях, используя коммерческую или открытое программное обеспечение.
- Определить контурные поверхности вокруг каждого ядра (или ячейки), представляющие интерес в 3D.
- Количественно флуоресценции в каждом канале в виде суммы интенсивностей пикселей в каждом объекте.
- Экспортировать данные в Excel для статистического анализа. Нормализовать антител сигналы против окрашивания сигналов например ДНК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы предоставляем надежную протокол для подготовки масштабной и переработки Arabidopsis яйцеклеток, пригодных для цитологического окрашивания в целом монтажа. Благодаря вложению, семяпочки сохранить 3-мерную структуру (рис. 3). Кроме того, обработка ткани в том числе оптического разъяснения позволяет визуализации субклеточных структур в высоком разрешении. Рисунок 4 показывает окрашивание ДНК в целом монтажа яйцеклетки зачатков где гетерохроматина появляется как яркий, хорошо определены заметный очаги (не деконволюция не был использован для этой картины). Эти изображения были использованы для анализа содержания гетерохроматина в ГМК и нуцеллуса (рис. 4) 21.
Кроме того, мы успешно использовали этот протокол для количественного анализа динамики хроматина по иммуноокрашивания в мегаспоры материнских клеток, функциональной мегаспоры, развивающихся женских гаметофитов и раннего эмбриона 21, 22-24. На рисунке 5 Arabidopsis семяпочек. 5А показан пример иммунологического в яйцеклетки зачатков, в том числе мегаспоры материнской клетки, о эухроматина-ассоциированной разрешающей знаком (H3K4me3) и гетерохроматина ассоциированных с репрессивной марки (H3K27me1). фиг.5В показан пример GFP иммунологического в зрелой яйцеклетки, в том числе зародышевого мешка (в данном случае, протокол был слегка модифицирован для использования GFP бустер антитело (см. обсуждение). Мы также обнаружили родные хроматина белки, такие как H3 и H1 21 показывает, что процедура сохраняет хроматина белковых эпитопов. Процедура также позволяет воспроизводимых количественными, позволяющих сравнение между типами клеток (например, репродуктивное против соматических, окружающие клетки) 21.
Наконец, мы также успешно применяется эту процедуру проводить FISH анализы на весь монтажа яйцеклетка рrimordia. Пример показан Рисунок 6 показывает FISH сигналы с помощью зонда против 45S рДНК повторяет определяющую ядрышкового организационные регионы 25. Зонд ДНК непосредственно помечены Alexa 488 с помощью FISH-Tag 26, гибридизация было сделано по существу, как описано 27 с незначительными изменениями, в то время как контрастного ДНК было сделано, как описано в нашем протоколе.
Рисунок 1. Workflow иммуноокрашивания, окрашивание ДНК и флуоресценции в гибридизация в Arabidopsis яйцеклеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Настройка для вскрытия и вложения плодолистиков на слайде. Пестика стены удаляется и пестика рассечен на слайде, чтобы освободить ряды яйцеклеток (см. Закройте расчлененных яйцеклеток в шаге 3), а затем расчленены пестика встроен в активированном акриламида смеси, покрыт 20 х 20 мм покровным. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Протокол позволяет сохранении 3-мерную структуру, позволяя оптической прозрачности и однородную окраску. Изображения, показывает вид сплит раздел 3D-изображения в ху, хг и уг оси, как указано. Данные изображения были приобретеныконфокальной лазерной сканирующей микроскопии и реконструирован в 3-х измерениях с помощью программного обеспечения Imaris. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Всего монтажа окрашивание ДНК по пропидийиодидом в яйцеклетки primodia позволяет точно гетерохроматина количественного. Изображение слева показывает окрашивание целом монтажа ДНК на протяжении яйцеклетки зачатков. ГМК ядро отмечена белым контуром и нуцеллярных ядра в красный цвет. Проекции 3D-реконструированных ядер показано на рисунке справа. Ясность ткани позволяет с высоким разрешением изображения из гетерохроматиновых очагов отмеченных желтым контуром и количественной оценки флуоресцентных сигналов в них. Графики показывают относительную heterochromatin фракции 21. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5. Представитель результаты целом монтажа иммуноокрашивания в Arabidopsis яйцеклеток. А) Иммуноокрашивание хроматина изменений в молодых яйцеклетки зачатков обнаружения Эухроматин (H3K4me3) и гетерохроматина (H3K27me1). Сигнал антитела зеленый, ДНК контрастно по пропидийиодидом в красный цвет. Наложение флуоресцентных сигналов показан вместе с изображением в передачи света с помощью дифференциального интерференционного контраста (серый). ММС обозначены белыми контурами. Крупным планом ММС ядра показана как вставка в верхней панели. Изображения одного конфокальной разделе. Б) иммунодетекции GFP в зрелом яйцеклетки.GFP был иммуноокрашиванию помощью GFP-бустер антитела и яйцеклетка была контрастно с DAPI. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 6. Целом монтажа флуоресценции в гибридизация в Arabidopsis семяпочек. Семяпочка зачаток гибридизовали с ДНК-зондом, определенной в 45S-рДНК повторного локусов и помечены с Alexa 488 с использованием технологии FISH-Tag, и контрастно с DAPI 26. Наложение 45S рДНК с DAPI и изображения, полученного в передачи светового канала (серый) также показаны. Крупным планом ММС ядра показана как вставка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой рисЮр.
Рисунок 7. Влияние фиксации, пищеварения и процедуры окрашивания по сигналам ДНК в целом монтажа яйцеклеток.) Пожилые яйцеклетки были зафиксированы 30 мин либо 4% параформальдегидом или БВО фиксатором и обрабатываются 30 мин или 1 час с клеточной стенки переварить смеси ферментов до окрашивания ДНК с пропидийиодидом. Для данной партии, больше инкубационный влияет более негативно на окрашивания ДНК яйцеклеток, которые были исправлены с параформальдегидом, чем с БВО. Б) окрашивание целом монтажа ДНК с использованием реагента Фельгена после необходимого кислотно-гидролиза 28 или с помощью пропидий йодида следующий за нерабочим Протокол денатурации описано в тексте. Верхняя панель показывает одну плоское сечение через зародышевого мешка, нижняя панель представляет собой увеличение на центральную клеточного ядра, показывая ясно изменениеорганизации хроматина в Фельгену окрашенных яйцеклеток. CCN, ядро центральная клетка, ECN, ядро яйцеклетки, син, synergid ядро. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В цветущих растений, женская репродуктивная линия окружена несколькими слоями клеток, включая нуцеллуса и яйцеклетка покровы, таким образом отдавая цитологический окрашивание в целом монтажа технически сложной задачей. Здесь мы представляем эффективную протокол, позволяющий подготовку и обработку большого количества яйцеклеток, пригодных для цитологического окрашивания таких как иммуноокрашивания, окрашивание ДНК и флуоресценции в гибридизация в целом монтажа. Мы успешно использовали его для анализа женской репродуктивной зародышевой линии в Arabidopsis 21,22. Этот способ очень эффективен в качестве несколько слайдов можно лечить параллельно для различных окрашивания. Это также дает прочное и однородное распределение сигнала и обеспечивает воспроизводимые количественного анализа. В отличие от классического метода, такого как Фельгену окрашивания который включает в себя денатурацию структуры хроматина, наш протокол сохраняет организацию хроматина и ядерные эпитопы. В дополненияition, ткани разъяснение позволяет визуализации сигналы с высоким разрешением на уровне одноклеточного.
Этот протокол может быть ускорено путем исключения действия, описанные в п. 3.1, если цветы были зафиксированы в 4% параформальдегида (в PBS + 1% Твин) вместо БВО буфера (1.1). Хотя это меньше, процедура оказалась функционал для нескольких иммуноокрашивания 22-24, мы обнаружили, что это ослабляет устойчивость окрашивания через образцов, антитела и партии клеточной стенки пищеварение ферментной смеси (см. ниже). Кроме того, мы не были успешными для FISH-гибридизации с этой короткой процедуры. Для иммунологического из КГП с использованием молекул-носителей, как показано на фиг.5В, аналогичной протокола, как описано здесь был использован с незначительными изменениями на этапе 1 и 3: плодолистики фиксировали в 2,5%-ном формалине в течение 45 мин (1.1), первый этап обработки тканей был сокращен до 5-10 мин метанола лечения (3.1), был введен блокирующий шаг (30 мин в 2% BSA в PBS) до антителом приложение ночь, как описано. Нет вторичное антитело не нужно с усилителем.
Мы обсудим ниже некоторых критических шагов:
Ткань Фиксация, рассечение и вложение.
Иммуноокрашивание и окрашивания ДНК сигналы были последовательно более надежными и равномерно распределяется, когда ткани был взят из растений менее 5 недель (после передачи рассады в почву). Возможно, в наших условиях роста, продолжительный период выращивания может сопровождаться изменениями в биохимическом составе клеточной стенки, влияющих в свою очередь эффективность обработки ткани. Таким образом, мы рекомендуем выборки ткани из относительно молодых растений. Кроме того, ткань должна быть предотвращена от высыхания во время вскрытия (ведущий в противном случае гистологического изменения и отсутствие окрашивания сигналов), а избыток PBS оспаривает манипуляции; нежный слив избытка зольution кончиком вокруг ткани нанесенной на слайде Таким образом, рекомендуется. Кроме того, пузырьки следует избегать в акриламида смеси и при освещении с покровное. Наконец, горки Superfrost Плюс настоятельно рекомендуется для адекватного адгезии акриламида (стандарт качества приводят к хрупких и нестабильных прокладок в наших руках), как они появляются выше других для ткани и акриламида адгезии.
Фиксация, permeabilisation и клеточной стенки пищеварение.
Клеточная стенка пищеварения является важным шагом обработки ткани. Считается, что этот шаг способствует хорошее проникновение окрашивания реагентов равномерно по всей растительной ткани. Мы испытали изменчивость в окрашивания однородности (от нет сигнала, сигнала в только часть ткани, к окрашиванию 100% ткани) в зависимости от времени пищеварения и ферментативной активности (партия конкретных, описывается поставщика). Рекомендуется, чтобы произвести большое количество маточного раствораиз смеси ферментов (например, 100 мл) и держать 1 мл аликвоты при -20 ° С. Каждый раствор должен быть сначала проверены на 1-2 слайдов перед использованием в больших масштабах. Кроме того, мы испытали, что тип фиксатора влияет на эффективность окрашивания ДНК в комбинации с различным временем обработки для переваривания клеточной стенки: яйцеклетки фиксировали в 4% параформальдегида негативно влияет на длительной инкубации с клеточной стенки пищеварения смеси, в то время как ткань фиксировали Решение БВО были терпимы к увеличению времени пищеварения и позволили лучше окрашивание ДНК (рис. 7а). Кроме того, РНКазы (ДНКазы) лечение является строго необходимым, если ткань контрастному окрашиванию пропидийиодидом, поскольку она также связывается с молекул РНК. Мы советуем не использовать 4 ',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) из-за его широких люминесцентных спектров излучения перекрывающихся с другими флуорофорами но и ахроматических аберраций, которые требуют корректировки сдвига канала после приобретения. Мы такжене рекомендуем Фельгену окрашивания которая требует кислотно-гидролиз в процессе обработки ткани 28, ведущей к хроматина денатурации особенно в зародышевого мешка (рис. 7В). Альтернативные красители ДНК также могут быть использованы 29, но их эффективность не была испытана здесь.
Иммуноокрашивание.
Для иммуноокрашивания модификаций хроматина, мы рекомендуем проверить специфику первичного антитела в базе с открытым исходным кодом http://compbio.med.harvard.edu/antibodies/projects/1 30, так как некоторые коммерчески доступные антитела показали перекрестные реакции для другие модификации. Для вниз по течению количественное анализ, важно, чтобы откалибровать концентрации антитела и времени инкубации для измерения сигналов в линейной зависимости с эпитопом. Мы рекомендуем откалибровать разбавления антитела и обнаружения время с помощью DIL антителution серия 1:200, 1:500, 1:1000 и с 12-24 часов инкубации, соответственно, определить условия, дающие надежные и однородные сигналы. Самый высокий титр и короткий инкубационный период позволяет воспроизводимые сигналы должны использоваться для количественного анализа. Элементы управления без первичного антитела должны быть выполнены, чтобы проверить на специфике. Если иммунное окрашивание дает неспецифическую, рекомендуется, чтобы блокировать с 5% БСА + 0,1% Tween в PBS в течение 2 часов при 4 ° С перед нанесением первичного антитела. Антител сигналы могут быть проверены на слайде до контрастного ДНК, чтобы убедиться, успех эксперимента. В наших руках, стиральная PBT в течение 2-4 ч после инкубации с первичным антителом и 1 ч после вторичного антитела позволяет низких фоновых сигналов даже без блокировки.
Наконец, этот протокол также, вероятно, применима и к другим тканях растений (например корень, лист фрагмент, цветочные меристемы) и, возможно, других видов растений, проviding некоторые корректировки на вскрытии, клеточная стенка переварить и пермеабилизации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| BVO Fixation Buffer (based on32) | 2 mM EGTA, pH 7.5, 1% (v/v) formaldehyde, 10% DMSO, 1x PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBT | 1x PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBT-F | 1x PBT, 2.5% (v/v) formaldehyde | ||
| 30% acrylamide:bisacrylamide | 3 g acrylamide, 0.33 g bisacrylamide, 1x PBS (prepare 10 ml, store at 4 °C) | ||
| 200 ml 5% acrylamide mix in PBS | 34 ml 30% acrylamide:bisacrylamide, 166 ml 1x PBS (make fresh from 30% stock) | ||
| 20% ammoniumpersulfte | 0.2 g ammoniumpersulfte, 1 ml sterile water (prepare aliquots with 1 ml and store at -20 °C) | ||
| 20% sodium sulfite | 0.2 g sodium sulfite, 1 ml sterile water (prepare aliquots with 1 ml and store at -20 °C) | ||
| Cell wall enzyme mix | 0.5% (w/v) cellulase, 1% (w/v) driselase, 0.5% (w/v) pectolyase | ||
| Reagents and Materials | |||
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| DMSO | Sigma | D5879 | |
| Tris | Amaresco | 0497 | |
| Ethanol | Schaurlau | ET00102500 | |
| Methanol | Schaurlau | ME03062500 | |
| Xylene | ROTH | 4436.1 | |
| Cellulase | Sigma | 1794 | |
| Driselase | Sigma | D8037 | |
| pectolyase | Sigma | P5936 | |
| Tween-20 | Merck | 8.22184.0500 | |
| EGTA | Sigma | E-4378 | |
| acrylamide | Sigma | A-3553 | |
| bisacrylamide | Sigma | M2022 | toxic |
| ammoniumpersulfate | Sigma | A9164 | |
| Sodium sulfite | Fluka | 71988 | |
| Anti-trimethyl-Histone H3 (Lys4) | Upstate | 07-473 | |
| Anti- monomethyl-Histone H3 (Lys27) | Upstate | 07-448 | |
| Alexa Fluor 488~goat ~anti ~rabbit (H+L) | Molecular Probe | A11008 | |
| ProlongGold | Invitrogen | P36934 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170 | toxic |
| DAPI | Sigma | D9542 | toxic |
| RNAse A | Roche | 10109169001 | |
| Coplin jar | Huber & CO | 10.055 | |
| Forceps | DUMONT BIOLOGY | ||
| Shaker | Heidolph | 543-12310-00-0 | |
| Moist chamber | A plastic box with damp paper towel inside, a plastic support is put into the box for supporting the slides and keep slides from the water. | ||
| Superfrost Plus slide | Thermo Fisher | J1800AMNZ | Menzel-Gläser |
| FISH Tag DNA KIt | Invitrogen | F32947 | |
| GFP booster | Chromotek |
References
- Maheshwari, P. An introduction to the embryology of angiosperms. , McGraw-Hill. New York. (1950).
- Schmidt, A., et al. Transcriptome analysis of the Arabidopsis megaspore mother cell uncovers the importance of RNA helicases for plant germline development. PLoS Biol. 9 (9), (2011).
- Schmidt, M. W., et al. A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA Sequencing. PLoS One. 7 (1), (2012).
- Wuest, S. E., et al. Arabidopsis female gametophyte gene expression map reveals similarities between plant and animal gametes. Curr Biol. 20 (6), 506-512 (2010).
- Koornneef, M., et al. Cytogenetic tools for Arabidopsis thaliana. Chromosome Res. 11 (3), 183-194 (2003).
- Oliver, C., et al. The dynamics of histone H3 modifications is species-specific in plant meiosis. Planta. 238 (1), 23-33 (2013).
- Ravi, M., et al. Meiosis-specific loading of the centromere-specific histone CENH3 in Arabidopsis thaliana. PLoS Genet. 7 (6), (2011).
- Borges, F., et al.
- Pandey, P., et al. Chromatin alterations during pollen development in Hordeum vulgare. Cytogenet Genome Res. 141 (1), 50-57 (2013).
- Schoft, V. K., et al. Induction of RNA-directed DNA methylation upon decondensation of constitutive heterochromatin. EMBO Rep. 10 (9), 1015-1021 (2009).
- Barrell, P. J., Grossniklaus, U. Confocal microscopy of whole ovules for analysis of reproductive development: the elongate1 mutant affects meiosis II. Plant J. 43 (2), 309-320 (2005).
- Braselton, J. P., et al. Feulgen staining of intact plant tissues for confocal microscopy. Biotech. Histochem. 71, 84-87 (1996).
- Scott, R. J., et al. Parent-of-origin effects on seed development in Arabidopsis thaliana. Development. 125, 3329-3341 (1998).
- Armstrong, S. J., Jones, G. H. Female meiosis in wild-type Arabidopsis thaliana and in two meiotic mutants. Sex Plant Reprod. 13, 177-183 (2001).
- Grimanelli, D., et al. Heterochronic expression of sexual reproductive programs during apomictic development in Tripsacum. Genetics. 165, 1521-1531 (2003).
- Gutierrez-Marcos, J. F., et al. Maternal gametophytic baseless1 is required for development of the central cell and early endosperm patterning in maize (Zea mays). Genetics. 174 (1), 317-329 (2006).
- Niedojadło, K., et al. Ribosomal RNA of Hyacinthus orientalis L. female gametophyte cells before and after fertilization. Planta. 236, 171-184 (2012).
- Williams, J. H., Friedman, W. E. The four-celled female gametophyte of Illicium (Illiciaceae; Austrobaileyales): Implications for understanding the origin and early evolution of monocots, eumagnoliids, and eudicots. Am J Bot. 91 (3), 332-351 (2004).
- Bass, H. W., et al. Telomeres cluster de novo before the initiation of synapsis: a three-dimensional spatial analysis of telomere positions before and during meiotic prophase. J Cell Biol. 137 (1), 5-18 (1997).
- Howe, E. S., et al. Three-dimensional acrylamide fluorescence in situ hybridization for plant cells. Methods Mol Biol. 990, 53-66 (2013).
- She, W., et al. Chromatin reprogramming during the somatic-to-reproductive cell fate transition in plants. Development. 140 (19), 4008-4019 (2013).
- Pillot, M., et al. Embryo and endosperm inherit distinct chromatin and transcriptional states from the female gametes in Arabidopsis. Plant Cell. 22 (2), 307-320 (2010).
- Borlinghaus, R. T. MRT letter: high speed scanning has the potential to increase fluorescence yield and to reduce photobleaching. Microsc Res Tech. 69 (9), 689-692 (2006).
- Autran, D., et al. Maternal epigenetic pathways control parental contributions to Arabidopsis early embryogenesis. Cell. 145 (5), 707-719 (2011).
- Fransz, P., et al. Interphase chromosomes in Arabidopsis are organized as well defined chromocenters from which euchromatin loops emanate. Proc Natl Acad Sci USA. 99 (22), 14584-14589 (2002).
- Cox, W. G., Singer, V. L. Fluorescent DNA hybridization probe preparation using amine modification and reactive dye coupling. BioTechniques. 36 (1), 114-122 (2004).
- Lysak, M., et al. Cytogenetic analyses of Arabidopsis In Arabidopsis Protocols: Methods in Molecular Biology, 2nd ed. Salinas, J., Sanchez-Serrano, J. J. , Humana Press. Totowa, NJ. 173-186 (2006).
- Chieco, P., Derenzini, M. The Feulgen reaction 75 years on. Histochem Cell Biol. 111 (5), 345-358 (1999).
- Suzuki, T., et al. DNA staining for fluorescence and laser confocal microscopy. J Histochem Cytochem. 45 (1), 49-53 (1997).
- Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
- Bauwens, S., Oostveldt, P. V. Whole mount fluorescence in situ hybridization (FISH) of repetitive DNA sequences on interphase nuclei of the small cruciferous plant Arabidopsis thaliana. Procedures for In Situ Hybridization to Chromosomes, Cells, and Tissue Sections. Nonradioactive in situ hybridization application manual. , 165-171 (1996).
