Summary
Biz İmmunosteyn, floresan in situ hibridizasyon, tüm montaj Arabidopsis thaliana ovüllerindeki kantitatif, yüksek çözünürlüklü görüntüleme ile takip DNA boyama için burada etkin ve güvenilir bir protokol sağlar. Bu yöntem başarıyla kromatin modifikasyonları ve nükleer mimarisi kullanılarak analiz edildi.
Abstract
Çiçekli bitkilerde, somatik-to-üreme hücresi kader geçiş yetişkin bitkinin çiçek organlarında spor anne hücrelerin şartnamede (SMC'ler) ile işaretlenir. Kadın SMC (Megaspor anne hücre, MMC) yumurta hücresi primordiumunun içinde ayırır ve mayoz uğrar. Seçilen haploid Megaspor sonra birlikte aksesuar hücreleri ile, gamet sebebiyet verecek çok hücreli dişi gametofit, yumurta hücresi ve merkez hücre oluşturmak için mitoz uğrar. Ovüldeki içindeki MMC, meiocyte ve dişi gametopitin sınırlı erişilebilirlik sitolojik için teknik olarak zor ve sitogenetik tek hücre düzeyinde analiz eder. Özel olarak, hücresel ya da nükleer epitoplar doğrudan ya da dolaylı immunodeteksiyon bitki hücresi ve tek hücre görüntüleme içindeki reaktiflerin zayıf penetrasyon ile bozulur tüm montaj dokularda optik berraklık eksikliğinden demize edilir.
Böylece, Nucl analiz etmek için etkili bir yöntem geliştirditüm montaj gömülü Arabidopsis ovüllerindeki tek bir hücrede yüksek çözünürlükte kulak organizasyon ve kromatin modifikasyonu. Bu, bir mikroskop lamı üzerine akrilamid jel ince bir tabaka olarak diseksiyon ve sabit ovüllerin gömülmesi dayanmaktadır. Gömülü ovüller immüno-boyama reaktiflere doku açıklık ve geçirgenlik iyileştirmeyi amaçlayan kimyasal ve enzimatik tedavilere tabi tutulur. Bu tedaviler hücresel ve kromatin organizasyonu, DNA ve protein epitoplar korumak. Numuneler Kromatin immüno-lekeleme, in situ hibridizasyon (FISH) floresan ve heterokromatin analiz için DNA lekeleme gibi farklı alt sitolojik analizi için kullanılabilir. 3D rekonstrüksiyon geçmez yüksek çözünürlüklü konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) görüntüleme, tek hücreli çözünürlükte nicel ölçümler sağlar.
Introduction
Çiçekli bitkilerde üreme soy kurulması SMC'lerinin farklılaşması, kadın MMC ve erkek Mikrospor anne hücre ile başlar. MMC ovül primordiumunun uzak ucunda bir alt epidermal nucellar hücreden gelişen ve mikrospor anne hücre derin çiçek organları 1 içinde bulunan anter lokül içinde sporogenous dokusundan gelişir. SMC'ler sonra mitoz üzerine gametofitleri doğuran haploid sporlar, üretmek için mayoz tabi. Dişi gametofit veya embriyo kesesi, bir yumurta hücresinin, tek bir merkezi hücrenin, iki synergids ve üç zıtlar oluşur. Erkek gametofit veya polen, bir bitkisel hücre ve iki sperm hücrelerinin oluşmaktadır. Erkek gametofit nispeten erişilebilir nesne-of-çalışma devam ederken, kadın gametofitin kendisi çiçek karpelin içine, ovüldeki içine gömülü, ve dolayısıyla moleküler ve sitolojik analizler belirli zorluklar teşkil edilir. Ancak son zamanlarda, lazer desteklimikrodisseksiyon Transkriptomik MMC ve kadın gemotofitik hücrelerde 2-4 analizleri sağlayan zarif bir çözüm sundu. Aday gen ekspresyonuna ek olarak sitolojik analizleri, belirli hücre boyama doğrudan ya da dolaylı immüno-lekeleme kullanılarak, endojen hücre bileşenlerinin dinamiklerini araştıran, in situ melezleme ya da raportör gen deneyleri, örneğin RNA sağlar kullanarak analiz eder. Özellikle, birlikte kromatin modifikasyon veya kromatin bileşenleri immün ile, FISH ve DNA boyama kullanılarak sitogenetik boyama Arabidopsis'de 5 kromatin dinamikleri ve nükleer organizasyon aydınlatmak için merkezi yaklaşımlardır. Tipik olarak, mayoz de 6,7 meiocytes bitki erkekte araştırılmıştır spesifik kromozom dinamikleri gerektirir; muhtemelen dinamik epigenetik yeniden programlama yansıtan daha büyük ölçekli, hücreye özel kromatin düzenlenmesi, polen gelişimi sırasında 8-10 tarif edilmiştir. Buna karşın, nedenikadın meiocyte ve gametofit göreli erişilememesi nedeniyle, bu soruşturmaların uygulamak teknik olarak zor kalır ve sık sık (aşağıya bakınız) kesit veya manuel diseksiyonu ve enzimatik sindirim gerektirir. Buna ek olarak, tüm montaj içinde optik netlik yaygın olmaması sağlam ovüllerindeki üreme hücrelerinin yüksek çözünürlüklü görüntüleme için bir engeldir.
Tüm montaj ovüllerindeki kromozom örgüt sitolojik analizi için klasik bir yöntem Feulgen en lekelenme 11-13 kullanır. Protein denatürasyonu ile sonuçlanır ve bu nedenle, kromatin yapısının yok edilmesine neden olan DNA (hipokloröz asit kullanılarak) asit hidrolizi içerir. Alternatif olarak, kadın meiocytes ve gemotofitik hücrelerde kromozom organizasyonu (örneğin 14-18 bakınız) yarı-ince kesitler veya disseke embriyo keseleri ve MMC Dapi ve immun boyama kullanılarak görülebilir. Açıkçası, ancak, manuel diseksiyon ve kesit yoğun emek olabilir vekromatin epitoplarının büyük bir sayıda nitel ve nicel analizi engellemektedir.
Burada bütün montaj içinde alt sitolojik lekelenme çeşitli için uygun Arabidopsis ovüller, çok sayıda hazırlanması için etkin bir protokol sağlar. Kısaca, çiçek tomurcukları bir sabitleyici çözelti içinde inkübe edilir, ovüller sıraları karpelin ayrılır ve polen meiocytes 19,20 için yapıldığı gibi slayt üzerinde akrilamid gömülü. Gömülü ovüller bundan başka, metanol, etanol, ve hücre duvarı sindirim ve nüfuziyet önce iksilen içinde temizlendi ve sabitlenir. Bu adımların olası varyasyonları tartışılmıştır. Numuneler daha sonra DNA lekeleme, imüno ve FISH için kullanılabilir. Hazırlık modu verimli ve (en fazla 16 slaytlar farklı alt analizi için bir gün içinde hazırlanabilir) paralel deneysel set-up sağlar. Açıklanan tedaviler, tüm montaj içinde homojen sinyalleri etkinleştirmek ve iyi histolojik, hücresel konservelerive hücre tipleri arasında nitel ve nicel karşılaştırmaları yarar üreme hücreleri ve çevresindeki nucellar hücrelerde nükleer organizasyonu. Kalibre, 3-boyutlu rekonstrüksiyon ardından CLSM-tabanlı yüksek çözünürlüklü görüntüleme floresan sinyalleri anlamlı kantitatif ölçümleri sağlar. Biz başarıyla ayırt MMC 21 ve dişi gametofit 22 gelişmekte kromatin dinamiklerini analiz etmek için bu prosedürü kullanılır; biz burada tüm montaj ovüllerindeki heterokromatinin analizi, kromatin immünoboyamayla, GFP İmmunosteyn ve FISH temsilcisi sonuçlarını sunmak. Bu protokol daha da diğer bitki dokularında ve türleri için uygun olacağına inanıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Prosedür, Şekil 1 'de iş akışı tarif edilmektedir, ve diseksiyon ve dokuların yerleştirilmesi için kurulum Şekil 2'de sunulmuştur.
1.. Doku Fixation
- Buz üzerinde taze BVO sabitleyici tampon içeren bir mikrofuj tüp içinde 20-30 carpels toplayın.
- Yumuşak, oda sıcaklığında çalkalanarak doku 30 dak.
- 400 x g de bir tezgah üstü mikrosantrfuj 1 dakika içinde sabitleyici carpels ihtiva eden tüpler dönerler.
- Dikkatlice sabitleyici tamponunu çıkarın ve PBT 1 ml eklemek, buz üzerinde tüpleri.
2.. Diseksiyon ve katıştırma
- Bir taze yapılmış,% 5 akrilamid karışımı her 200 ul beş Eppendorf tüpleri hazırlayın.
- Beş Superfrost slaytlar% 70 etanol ile önceden temizlenmiş ve bir kalem ile etiketlenmiş hazırlayın.
- Bir% 20 APS bölüntüsünün ve buz üzerinde% 20 Naps her çözülme.
- Bir kesim uç ucu, yer ile 4-5 carpels alıntemiz bir slayt üzerine onları, sıvı fazlalığı kaldırın.
- Ince bir iğne ile uzunlamasına kesim yapın ve gösterildiği gibi, Şekil 2 ovüller satır serbest bırakmak için meyve yaprağı duvarları ayırmak, PBS (en fazla 10 ul) ile kaplayarak kurumayı önlemek.
- Çabuk 12 ul Naps, 200 ul akrilamid karışımı bir bölümüyle 12 ul APS ekleyin ve karıştırın.
- Kesilmiş ovüllerde üzerine aktive akrilamidin 30 ul ekle.
- 20 x 20 mm lamel ile kaplayın, oda sıcaklığında 45-60 dk polimerize edelim.
- Bir jilet kullanarak lamel çıkarın. Bu aşamada, numuneler PBS içeren bir Coplin kavanoz içinde 4 ° C'de bir gece boyunca muhafaza edilebilir.
3.. Doku İşleme
Not: 3.2.1, 3.2.3, 3.3.2 ve 3.4.3 dışındaki tüm aşamalar oda sıcaklığında kimyasal başlık altında 80 ml solüsyonu ile Coplin kavanoz içinde gerçekleştirilmektedir. Slaytlar düz uçlu forseps ile aktarılır.
- Doku açıklama vesabitleme:
- Metanol içinde 5 dakika inkübe edin.
- Etanol içinde 5 dakika inkübe edin.
- Ksilen (1:1): Etanol içinde 30 dakika inkübe edin.
- Etanol içinde 5 dakika inkübe edin.
- Metanol içinde 5 dakika inkübe edin.
- % 2.5 formaldehit ile tamamlanır, metanol ve PBT (1:1) içinde 15 dakika inkübe edin.
- PBT 2 x 10 dakika durulayın. Bu aşamada, slaytlar, 4 ° C de bir gece tutulabilir
- Hücre duvarı sindirim:
- Buz üzerinde hücre duvarı sindirim karışımı bir kısım çözülme.
- Bir kağıt havlu üzerinde dikey yerleştirerek sıvının aşırı drenaj, Coplin kavanoz bir slayt atın.
- Akrilamid pad üzerinde hücre duvarı sindirim karışımı 100 ul ekleyin ve 23 x 46 mm lamel ile kaplayın. Diğer slaytlar için tekrarlayın. (Malzemelerde anlatılan) bir nem odası içinde 37 ° C'de 2 saat boyunca inkübe edilir.
- PBT slaytlar 2 x 5 dakika yıkanır.
- Bir tedavi RNaz:
- Coplin kavanoz bir slayt atın, inci tahliyedaha önce olduğu gibi, fazla sıvının e.
- % 1 Tween-20, 1 saat boyunca 37 ° C'de nemli bir odaya ile PBS içinde 100 ug / ml 'de RnazA 100 ul her bir slayt inkübe edin.
- PBT 2 x 5 dakika boyunca slaytlar yıkayın.
- Post-fiksasyon ve permeabilizasyon:
- Taze yapılmış PBT-F 20 dakika için Post-fix.
- PBT içinde 10 dakika için slaytlar durulayın.
- 4 ° C'de% 2 Tween-20 ile PBS içinde 2 saat boyunca geçirgen
- PBT 2 x 5 dakika boyunca slaytlar durulayın.
4. İmmünoboyama
NOT: Bu adımda, birincil antikorun optimum konsantrasyonu, değişik seyreltiler antikorların (1:200, 1:500, 1:1000) kullanılarak test edilmesi gerekir.
- 4 ° C'de 12-24 saat süre ile% 0.2 Tween-20 ile PBS içinde seyreltilmiş birincil antikor, 100 ul her bir slayt inkübe
- Nazik çalkalama altında oda sıcaklığında 2-4 saat boyunca PBT slaytlar yıkayın.
- Uygulaİkincil antikor 1:200 PBS +% 0.2 Tween-20, 24 saat boyunca 4 ° C'de
- Nazik çalkalama altında oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBT slaytlar yıkayın.
- 15 dakika boyunca PBS içinde 10 ug / ml propidyum iyodür Counterstain, daha sonra oda sıcaklığında, hafifçe çalkalayarak, PBS içinde 15 dakika durulayın.
- Anti-solma sıvı mountant Mount 10 ug / ml propidyum iyodür ile takviye edilmiştir. Montaj orta CLSM görüntüleri almadan önce 1 saat boyunca sertleşmeye bırakın.
5.. Sayısal Görüntüleme
- Görüntü edinimi:
- Ideal daha uzun görüntüleme üzerinde 23 floresan sinyallerin korunması ve 63X gliserol daldırma objektifi sağlayan bir rezonans tarama modunu kullanarak, CLSM kullanarak yüksek çözünürlüklü görüntüler elde.
- Kesinlikle boyunca takip için standart bir toplama prosedürü tanımlamak için böyle bir deney başında lazer yoğunluğu, kazanç, iğne deliği, voksel boyutu ve yakınlaştırma faktörü olarak satın alma parametreleri testTutarlı kantitatif ölçümler için tüm slaytlar.
- Fluorochromes arasında çapraz konuşma olmadığını doğrulayın. Eğer varsa, sıralı bir tarama kurmak. Ayrı ayrı ve eş zamanlı iletim görüntü kazanır.
- X ve y boyutlarında mümkün olan en yüksek çözünürlükte ve z boyut (Nyquist kuralı) 2x Oversampling ile seri, üç boyutlu görüntü alımı gerçekleştirin.
- Görüntü işleme:
- Ticari veya açık kaynak kodlu yazılım kullanarak üç boyutlu olarak seri görüntüleri yeniden.
- 3D ilgi her çekirdek (veya hücre) etrafında kontur yüzeyleri tanımlayın.
- Her nesne piksel yoğunluklarının toplamı olarak, her kanaldaki floresansı ölçmek.
- Istatistiksel analizler için Excel'e veri ihracat. Örneğin, DNA boyama sinyallerine karşı antikor sinyallerini normalleştirmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu tam montaj sitolojik boyanması için uygun olan Arabidopsis ovüller, büyük ölçekli hazırlanması ve işlenmesi için sağlam bir protokol sağlar. Gömme sayesinde, ovülller bir 3-boyutlu yapı (Şekil 3) korur. Ayrıca, optik açıklama dahil olmak üzere doku işleme yüksek çözünürlükte görüntüleme hücre içi yapıları sağlar. 4 heterokromatinin (hayır Dekonvolüsyonun bu resim için kullanılan) de göze çarpan odaklar tanımlandığı gibi parlak görünen tüm montaj tohumcuk primordiada DNA boyanma göstermektedir. Bu görüntüler MMC ve nucellus (Şekil 4) 21 heterokromatinin içeriğini analiz etmek için kullanılmıştır.
Buna ek olarak, başarıyla kantitatif Megaspor anne hücreleri, fonksiyonel Megaspor, gelişmekte kadın gametofitleri ve erken embriyo 21, 22-24 boyanmasına tarafından kromatin dinamiklerini analiz etmek için bu protokolü kullanılır. Şekil 5'de Arabidopsis ovüller imüno temsili sonuçlarını göstermektedir. Şekil 5A, bir Ökromatin ilişkili izin veren işaretinin Megaspor ana hücre, (H3K4me3) ve heterokromatin ilişkili baskı işaretini içeren ovül primordia, imünobulgulama bir örneğini göstermektedir (H3K27me1). Şekil 5B, embriyo kesesi (bu durumda, protokol hafifçe GFP booster antikoru kullanılarak değiştirildiği (tartışmaya bakınız) içeren olgun bir ovülün, GFP İmmuno bir örneğini göstermektedir. Ayrıca, örneğin, doğal proteinleri tespit kromatin H3 ve H1 21 prosedür kromatin protein epitoplarının korur gösteren. prosedür de hücre tipleri (örneğin, üreme vs somatik, çevredeki hücreler) 21 arasında karşılaştırma yapılmasını sağlamak tekrarlanabilir quantifications sağlar.
Nihayet, biz de başarılı BALIK yürütmek için bu prosedürü uygulanan tüm montaj tohumcuk p analizleririmordia. Bir örnek nükleoler organize bölgeleri 25 tanımlayan 45S rDNA tekrar karşı bir sonda kullanılarak FISH sinyallerini gösteren Şekil 6. gösterilmiştir. Küçük modifikasyonlar ile tarif edildiği gibi 27, protokolde tarif edildiği gibi DNA karşı boyama yapıldı ise DNA probu, doğrudan FISH-Tag 26 kullanılarak Alexa 488 ile etiketlenmiştir, melezleme, esas olarak yapıldı.
Arabidopsis ovüllerindeki in situ Hibridizasyon immünoboyamayla, DNA boyama ve Floresans Şekil 1.. Akışı. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Diseksiyon ve slayt üzerinde carpels katıştırma için Şekil 2.. Kur. Karpal duvar kaldırıldı ve karpal (3. adımda yakın disseke ovüllerin yukarı bakınız) ovüllerin satırları serbest bırakmak için slaytta disseke ve sonra disseke karpal gömülü aktive akrilamid karışımı, 20 x 20 mm lamel ile kaplı. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Şekil 3,. Protokol optik berraklık ve homojen boyama izin verirken, 3-boyutlu yapısını koruyarak sağlar. Görüntü XY gösterildiği gibi, xz ve yz ekseninde 3D görüntü bölünmüş bir kesit görünümünü göstermektedir. Görüntü verileri ile elde edilmiştirkonfokal lazer tarama mikroskopisi ve Imaris yazılımı kullanılarak 3 boyutlu olarak yeniden. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Şekil 4. Tohumcuk primodia yılında Propidyum iyodür DNA lekelenme Tüm montaj hassas heterokromatinin ölçümü sağlar. Soldaki resim bir ovül primordiasında tüm montaj DNA boyanma gösterir. MMC çekirdek kırmızı beyaz bir kontur ve nucellar çekirdeği tarafından işaretlenir. 3D-yeniden çekirdeklerin Projeksiyonlar sağda gösterilir. Dokunun berraklığı içinde floresan sinyalleri san bir kontur ve miktar ile işaretlenmiş heterokromatin odakların yüksek çözünürlüklü görüntü sağlar. Grafikleri göreli heterochr göstermekFraksiyon 21 omatin. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Şekil 5. Arabidopsis ovüllerindeki tüm montaj immünboyanmadan Temsilcisi sonuçları. A) Ökromatin (H3K4me3) ve heterokromatine (H3K27me1) tespit genç tohumcuk primordiada kromatin modifikasyonları immün. Antikor sinyal, kırmızı propidyum iyodür ile zıt DNA yeşildir. Floresan sinyallerin bir bindirme birlikte diferansiyel girişim kontrast (gri) kullanarak iletim ışığında bir resim ile gösterilir. MMC'ler beyaz konturları ile gösterilir. Üst panelde vaziyettedir gibi MMC çekirdeğinin bir yakın çekim gösterilmiştir. Görüntüler, bir olgun yumurtada) GFP İmmuno tekli konfokal bölümü. B bulunmaktadır.GFP GFP-yükseltici antikoru kullanılarak immunohistokimyasal ve ovül DAPI ile karşıt. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Şekil 6,. Arabidopsis ovüllerde in situ Hibridizasyon Tüm montaj floresans. Ovül primordium 45S rDNA tekrar lokus özgü bir DNA probu ile hibritlenmiştir ve FISH-Tag teknolojisi kullanılarak Alexa 488 ile etiketlenmiş ve DAPI ile karşıt-26. DAPI ve (gri) iletim ışık kanalda edinilen görüntü ile 45S rDNA kaplama da gösterilmiştir. MMC çekirdeğinin bir yakın çekim içerlek olarak gösterilmiştir. , bu şek büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınızure.
Tüm montaj ovüllerindeki DNA sinyalleri üzerinde sabitleme, sindirim ve boyama prosedürü Şekil 7.. Etkisi. A) Olgun yumurtalar ya 4% paraformaldehitte veya BVO sabitleyici ile 30 dakika fikse edildi ve enzim karışımı sindirimi hücre duvarı ile 30 dakika ya da 1 saat işlem Propidyum iyodürle DNA lekelenme. Belirli bir yığını için, uzun inkübasyon BVO ile daha paraformaldehit ile sabitlendi DNA boyama ovüllerde ile ilgili daha fazla olumsuz etkilemektedir. B) Tüm montaj DNA boyama gerekli bir asitle hidrolizi 28 ya da aşağıdaki sonra, propidyum iyodür kullanılarak Feulgen reaktif kullanılarak non- denatüre edici protokol metinde tarif edilmiştir. Üst panelde, embriyo kesesi üzerinden tek bir düzlem kesiti göstermektedir, alt panel net değişiklik gösteren, merkez hücre çekirdeği üzerine bir büyütme sunulurFeulgen lekeli ovüllerindeki kromatin organizasyonu. ccn, merkez hücre çekirdeği, ECN, yumurta hücresi çekirdeği, syn, synergid çekirdeği. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Çiçekli bitkilerde, dişi üreme soy nedenle teknik zorlu tüm montaj sitolojik lekelenme render nucellus ve ovül teguments dahil olmak üzere birçok hücre tabakası ile çevrilidir. Burada örneğin tam montaj in situ hibridizasyon immüno-boyama, DNA boyama ve floresan gibi sitolojik boyanması için uygun ovüller, çok sayıda hazırlanmasını ve işlenmesini sağlayan etkin bir protokol sunmaktır. Başarıyla Arabidopsis 21,22 dişi üreme tohum çizgisi analizi için kullanılır. Birkaç farklı slaytlar boyanması için paralel olarak tedavi edilebilir olarak bu yöntem son derece etkilidir. Ayrıca sağlam ve homojen sinyal dağılımını verir ve tekrarlanabilir kantitatif analiz için izin verir. Bu tür kromatin yapısının denatüre içerir Feulgen boyama gibi klasik yöntemin aksine olarak, protokol kromatin organizasyon ve nükleer epitoplarını muhafaza etmektedir. In addTV'nizi yerleştirmeden, doku açıklama tek hücre düzeyinde yüksek çözünürlükte sinyallerini görüntüleme sağlar.
Çiçekler yerine BVO tamponu (1.1)% 4 paraformaldehid (PBS +% 1 Tween) sabit olmuştur bu protokol 3.1 anlatılan adımları atlayarak hızlandırılmış olabilir. Bu daha kısa işlem 22-24 immün çok işlevselliği kanıtlamıştır ile birlikte, bu (aşağıya bakınız) örnekleri, antikor ve hücre duvarı sindirim enzim karışımına toplu üzerinde boyamanın sağlamlığını azaltır bulundu. Ayrıca biz bu kısa işlem ile FISH melezleşme için başarılı olamadılar. Carpels doku işlemenin ilk aşaması, 45 dakika boyunca (1.1) için% 2.5 formaldehit içinde sabitlendi: burada açıklanan aşama 1 ve 3 de hafif değişiklikler ile kullanılmıştır gibi GFP en gösterildiği Şekil 5B'de, benzer bir protokolü olarak güçlendirici molekülleri kullanarak İmmuno için 2,% 5-10 dk metanol tedavi (3.1) için kısaltılmıştır, bir bloke edici aşama başlandı (30 dakika BTarif edildiği gibi, gece boyunca uygulama antikor önce PBS içinde SA). Hiçbir ikincil antikor güçlendirici ile gereklidir.
Biz bazı kritik adımlar aşağıda tartışacağız:
Doku Fixation, diseksiyon ve gömme.
Immün lekeleme ve DNA sinyaller sürekli olarak daha sağlam ve doku (topraktaki fide transferini takiben) en az 5 haftalık bitkilerden örneklenmiş zaman homojen bir şekilde dağıtılır. Muhtemelen, büyüme koşullarında, yetiştirme uzun bir süre da doku işleme verimini etkileyen hücre duvarının biyokimyasal bileşiminde değişiklikler eşlik edebilir. Böylece nispeten genç bitkilerden numune doku öneririz. Buna ek olarak, doku PBS den bir fazla manipülasyon zorlukları sırasında (aksi histolojik değişiklik ve boyama sinyallerin yokluğuna yol açar) diseksiyon boyunca kurumasını önlenmelidir; sol'deki aşan nazik bir tahliyeslayt üzerinde biriken doku etrafında ucuyla ution böylece tavsiye edilir. Ayrıca, kabarcıklar akrilamid karışımı içinde kaçınılması ve bir lamel ile kaplama sırasında olmalıdır. Onlar doku ve akrilamid yapışma için diğerlerinden üstün görünen Son olarak, Superfrost Plus, slaytlar şiddetle, yeterli akrilamid yapışma (bizim ellerde kırılgan ve istikrarsız yastıkları standart kalite kurşun) için tavsiye edilir.
Sabitleme, geçirgenleştirme ve hücre duvarı sindirim.
Hücre duvarı sindirim doku işleme kritik bir adımdır. Bu adım, homojen bir bitki dokusu boyunca boyama reaktiflerin iyi nüfuz etmesini kolaylaştıran olduğu düşünülmektedir. Biz, sindirim zaman ve enzimatik aktivitesine bağlı olarak (doku sadece kısmen sinyal, sinyal,% 100 doku lekelenmeye karşı değişen) boyama homojenliği değişkenlik deneyimli (seriye özgü, sağlayıcı tarafından tarif edilmiştir). Bu stok çözeltisi, büyük miktarda üretilmesi önerilirenzim karışımı (örneğin, 100 mi) ve -20 ° C'de 1 ml'lik numuneler tutmak Her bir stok çözeltisi, ilk olarak, büyük ölçekli kullanmadan önce 1-2 slaytlar üzerinde test edilmelidir. Doku sabit iken% 4 paraformaldehid içinde sabitlendi ovüllerin negatif, hücre duvarı sindirim karışımı ile uzun süreli kuluçkaya bırakma etkilenen: Ayrıca, sabitleyici type sindirimi hücre duvarı için farklı işlem süresi ile kombinasyon halinde DNA boyama verimini etkilediğini deneyimli BVO Çözelti daha sindirim kere dayanıklı ve daha iyi DNA boyama (Şekil 7A) izin verilir. Aynı zamanda RNA molekülüne bağlanan olarak doku propidyum iyodid ile karşı, buna ek olarak, bir RNAse (DNaz) tedavisi kesinlikle gereklidir. Biz nedeniyle diğer floroforlar ile örtüşen geniş floresan emisyon spektrumları için değil, aynı zamanda post-edinme kanal kaydırma düzeltmeleri gerektirecek akromatik sapmaları '4 kullanarak karşı ,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) öneriyoruz. Ayrıca,Özellikle embriyo kesesi (Şekil 7B) ve kromatin denatürasyona yol açan doku işlem 28 esnasında bir asit hidrolizine gerektirir Feulgen boyama karşı tavsiye. Alternatif DNA boyalar da 29 kullanılabilir, ancak bunların etkinliği burada test edilmemiştir.
İmmünoboyama.
Kromatin modifikasyonların imüno için, açık kaynak veritabanı birincil antikorun özgünlüğünü kontrol etmek için tavsiye http://compbio.med.harvard.edu/antibodies/projects/1 bazı ticari olarak temin edilebilir antikorlar, çapraz reaksiyonları için gösterdiği gibi, 30 diğer modifikasyonlar. Alt miktar analizleri için, bu epitop ile doğrusal bir ilişki içinde sinyalleri ölçmek için antikorlar, konsantrasyon ve inkübasyon süresi kalibre etmek önemlidir. Biz bir antikor inceltilmiş kullanılarak antikor seyreltme ve algılama zamanı ayarlamak için tavsiye1:200, 1:500, 1:1000 ve 12-24 saat inkübasyondan ution dizi, sırasıyla, sağlam ve homojen bir sinyal verme koşulları tespit etmek. Tekrarlanabilir sinyaller kantitatif analiz için kullanılmalıdır sağlayan en yüksek seyreltme ve en kısa inkübasyon süresi. Birincil antikor olmayan kontroller özgüllüğü test etmek için gerçekleştirilmelidir. Immüno-spesifik boyama üretirse, bu primer antikor uygulamadan önce, 4 ° C 'de 2 saat boyunca PBS içerisinde% 5 BSA +% 0.1 Tween ile bloke için tavsiye edilir. DNA counterstaining denemenin başarılı olduğunu doğrulamak için önce Antikor sinyalleri slaytta kontrol edilebilir. Elimizde olanlar, primer antikor ile inkübe edildikten sonra 2-4 saat ve sonra sekonder antikor, 1 saat boyunca PBT yıkama da engelleme olmadan düşük arka plan sinyallerine de izin verir.
Son olarak, bu protokol aynı zamanda diğer bitki dokularında (örneğin kök, yaprak fragmanı, çiçek meristem) uygulanacak muhtemel ve muhtemelen diğer bitki türlerine, prodiseksiyonu üzerinde bazı ayarlamalar viding, hücre duvarı sindirmek ve permeabilizasyon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| BVO Fixation Buffer (based on32) | 2 mM EGTA, pH 7.5, 1% (v/v) formaldehyde, 10% DMSO, 1x PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBT | 1x PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBT-F | 1x PBT, 2.5% (v/v) formaldehyde | ||
| 30% acrylamide:bisacrylamide | 3 g acrylamide, 0.33 g bisacrylamide, 1x PBS (prepare 10 ml, store at 4 °C) | ||
| 200 ml 5% acrylamide mix in PBS | 34 ml 30% acrylamide:bisacrylamide, 166 ml 1x PBS (make fresh from 30% stock) | ||
| 20% ammoniumpersulfte | 0.2 g ammoniumpersulfte, 1 ml sterile water (prepare aliquots with 1 ml and store at -20 °C) | ||
| 20% sodium sulfite | 0.2 g sodium sulfite, 1 ml sterile water (prepare aliquots with 1 ml and store at -20 °C) | ||
| Cell wall enzyme mix | 0.5% (w/v) cellulase, 1% (w/v) driselase, 0.5% (w/v) pectolyase | ||
| Reagents and Materials | |||
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| DMSO | Sigma | D5879 | |
| Tris | Amaresco | 0497 | |
| Ethanol | Schaurlau | ET00102500 | |
| Methanol | Schaurlau | ME03062500 | |
| Xylene | ROTH | 4436.1 | |
| Cellulase | Sigma | 1794 | |
| Driselase | Sigma | D8037 | |
| pectolyase | Sigma | P5936 | |
| Tween-20 | Merck | 8.22184.0500 | |
| EGTA | Sigma | E-4378 | |
| acrylamide | Sigma | A-3553 | |
| bisacrylamide | Sigma | M2022 | toxic |
| ammoniumpersulfate | Sigma | A9164 | |
| Sodium sulfite | Fluka | 71988 | |
| Anti-trimethyl-Histone H3 (Lys4) | Upstate | 07-473 | |
| Anti- monomethyl-Histone H3 (Lys27) | Upstate | 07-448 | |
| Alexa Fluor 488~goat ~anti ~rabbit (H+L) | Molecular Probe | A11008 | |
| ProlongGold | Invitrogen | P36934 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170 | toxic |
| DAPI | Sigma | D9542 | toxic |
| RNAse A | Roche | 10109169001 | |
| Coplin jar | Huber & CO | 10.055 | |
| Forceps | DUMONT BIOLOGY | ||
| Shaker | Heidolph | 543-12310-00-0 | |
| Moist chamber | A plastic box with damp paper towel inside, a plastic support is put into the box for supporting the slides and keep slides from the water. | ||
| Superfrost Plus slide | Thermo Fisher | J1800AMNZ | Menzel-Gläser |
| FISH Tag DNA KIt | Invitrogen | F32947 | |
| GFP booster | Chromotek |
References
- Maheshwari, P. An introduction to the embryology of angiosperms. , McGraw-Hill. New York. (1950).
- Schmidt, A., et al. Transcriptome analysis of the Arabidopsis megaspore mother cell uncovers the importance of RNA helicases for plant germline development. PLoS Biol. 9 (9), (2011).
- Schmidt, M. W., et al. A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA Sequencing. PLoS One. 7 (1), (2012).
- Wuest, S. E., et al. Arabidopsis female gametophyte gene expression map reveals similarities between plant and animal gametes. Curr Biol. 20 (6), 506-512 (2010).
- Koornneef, M., et al. Cytogenetic tools for Arabidopsis thaliana. Chromosome Res. 11 (3), 183-194 (2003).
- Oliver, C., et al. The dynamics of histone H3 modifications is species-specific in plant meiosis. Planta. 238 (1), 23-33 (2013).
- Ravi, M., et al. Meiosis-specific loading of the centromere-specific histone CENH3 in Arabidopsis thaliana. PLoS Genet. 7 (6), (2011).
- Borges, F., et al.
- Pandey, P., et al. Chromatin alterations during pollen development in Hordeum vulgare. Cytogenet Genome Res. 141 (1), 50-57 (2013).
- Schoft, V. K., et al. Induction of RNA-directed DNA methylation upon decondensation of constitutive heterochromatin. EMBO Rep. 10 (9), 1015-1021 (2009).
- Barrell, P. J., Grossniklaus, U. Confocal microscopy of whole ovules for analysis of reproductive development: the elongate1 mutant affects meiosis II. Plant J. 43 (2), 309-320 (2005).
- Braselton, J. P., et al. Feulgen staining of intact plant tissues for confocal microscopy. Biotech. Histochem. 71, 84-87 (1996).
- Scott, R. J., et al. Parent-of-origin effects on seed development in Arabidopsis thaliana. Development. 125, 3329-3341 (1998).
- Armstrong, S. J., Jones, G. H. Female meiosis in wild-type Arabidopsis thaliana and in two meiotic mutants. Sex Plant Reprod. 13, 177-183 (2001).
- Grimanelli, D., et al. Heterochronic expression of sexual reproductive programs during apomictic development in Tripsacum. Genetics. 165, 1521-1531 (2003).
- Gutierrez-Marcos, J. F., et al. Maternal gametophytic baseless1 is required for development of the central cell and early endosperm patterning in maize (Zea mays). Genetics. 174 (1), 317-329 (2006).
- Niedojadło, K., et al. Ribosomal RNA of Hyacinthus orientalis L. female gametophyte cells before and after fertilization. Planta. 236, 171-184 (2012).
- Williams, J. H., Friedman, W. E. The four-celled female gametophyte of Illicium (Illiciaceae; Austrobaileyales): Implications for understanding the origin and early evolution of monocots, eumagnoliids, and eudicots. Am J Bot. 91 (3), 332-351 (2004).
- Bass, H. W., et al. Telomeres cluster de novo before the initiation of synapsis: a three-dimensional spatial analysis of telomere positions before and during meiotic prophase. J Cell Biol. 137 (1), 5-18 (1997).
- Howe, E. S., et al. Three-dimensional acrylamide fluorescence in situ hybridization for plant cells. Methods Mol Biol. 990, 53-66 (2013).
- She, W., et al. Chromatin reprogramming during the somatic-to-reproductive cell fate transition in plants. Development. 140 (19), 4008-4019 (2013).
- Pillot, M., et al. Embryo and endosperm inherit distinct chromatin and transcriptional states from the female gametes in Arabidopsis. Plant Cell. 22 (2), 307-320 (2010).
- Borlinghaus, R. T. MRT letter: high speed scanning has the potential to increase fluorescence yield and to reduce photobleaching. Microsc Res Tech. 69 (9), 689-692 (2006).
- Autran, D., et al. Maternal epigenetic pathways control parental contributions to Arabidopsis early embryogenesis. Cell. 145 (5), 707-719 (2011).
- Fransz, P., et al. Interphase chromosomes in Arabidopsis are organized as well defined chromocenters from which euchromatin loops emanate. Proc Natl Acad Sci USA. 99 (22), 14584-14589 (2002).
- Cox, W. G., Singer, V. L. Fluorescent DNA hybridization probe preparation using amine modification and reactive dye coupling. BioTechniques. 36 (1), 114-122 (2004).
- Lysak, M., et al. Cytogenetic analyses of Arabidopsis In Arabidopsis Protocols: Methods in Molecular Biology, 2nd ed. Salinas, J., Sanchez-Serrano, J. J. , Humana Press. Totowa, NJ. 173-186 (2006).
- Chieco, P., Derenzini, M. The Feulgen reaction 75 years on. Histochem Cell Biol. 111 (5), 345-358 (1999).
- Suzuki, T., et al. DNA staining for fluorescence and laser confocal microscopy. J Histochem Cytochem. 45 (1), 49-53 (1997).
- Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
- Bauwens, S., Oostveldt, P. V. Whole mount fluorescence in situ hybridization (FISH) of repetitive DNA sequences on interphase nuclei of the small cruciferous plant Arabidopsis thaliana. Procedures for In Situ Hybridization to Chromosomes, Cells, and Tissue Sections. Nonradioactive in situ hybridization application manual. , 165-171 (1996).
