Summary
Nous fournissons ici un protocole efficace et fiable pour immunologique, hybridation fluorescente in situ, la coloration de l'ADN suivie quantitative, imagerie à haute résolution dans des ovules d'Arabidopsis thaliana l'ensemble du montage. Cette méthode a été utilisée avec succès pour analyser des modifications de la chromatine nucléaire et de l'architecture.
Abstract
Chez les plantes à fleurs, la transition du destin cellulaire somatique à la reproduction est marquée par la spécification des cellules mères de spores (SMC) dans les organes floraux de la plante adulte. Le SMC femelle (cellule mère de mégaspore, MMC) distingue dans l'ébauche ovule et subit la méiose. Le mégaspore haploïde sélectionné est ensuite soumis à la mitose pour former le gamétophyte femelle multicellulaire, qui donnera naissance aux gamètes, l'ovule et la cellule centrale, avec des cellules accessoires. L'accessibilité limitée de la console MMC, meiocyte et gamétophyte femelle à l'intérieur de l'ovule est techniquement difficile pour cytologique et cytogénétique des analyses au niveau d'une seule cellule. En particulier, immunodétection directe ou indirecte d'épitopes cellulaires ou nucléaires est affaiblie par la faible pénétration des réactifs à l'intérieur de l'imagerie cellulaire végétale et une seule cellule est affermé par le manque de clarté optique dans l'ensemble du montage tissus.
Ainsi, nous avons développé une méthode efficace pour analyser les nucll'organisation de l'oreille et la modification de la chromatine à haute résolution de la cellule unique dans l'ensemble du montage ovules d'Arabidopsis embarqués. Il est basé sur la dissection et l'incorporation d'ovules fixes dans une fine couche de gel d'acrylamide sur une lame de microscope. Les ovules embarqués sont soumis à des traitements chimiques et enzymatiques visant à améliorer la clarté des tissus et de la perméabilité des réactifs d'immunomarquage. Ces traitements préserver organisation, ADN et de protéines épitopes cellulaires et la chromatine. Les échantillons peuvent être utilisés pour différentes analyses cytologiques aval, y compris la chromatine immunocoloration, l'hybridation in situ par fluorescence (FISH), et la coloration de l'ADN pour l'analyse de l'hétérochromatine. La microscopie confocale à balayage laser (CLSM), l'imagerie à haute résolution, suivie d'une reconstruction 3D permet des mesures quantitatives à seule cellule de résolution.
Introduction
Chez les plantes à fleurs, l'établissement de lignées de reproduction commence par la différenciation des CML, MMC féminine et masculine cellule microspores mère. La MMC se développe à partir d'une cellule nucellaire sous-épidermique à l'extrémité distale de l'ébauche ovule, et la cellule mère des microspores se développe à partir du tissu sporogène dans la loge des anthères, qui sont situés profondément à l'intérieur des organes floraux 1. SMC subissent une méiose pour produire des spores haploïdes, qui donnent alors lieu à des gamétophytes sur la mitose. Le gamétophyte femelle, ou sac embryonnaire, se compose d'un ovule, une cellule centrale, deux synergides et trois antipodes. Le gamétophyte mâle, ou le pollen, est composé d'une cellule végétative et deux spermatozoïdes. Alors que le gamétophyte mâle reste une étude d'objet de relativement accessible, le gamétophyte femelle est incorporé dans l'ovule, se joint à la carpelle de fleur, et pose donc des défis particuliers pour les analyses moléculaires et cytologiques. Récemment, cependant, assistée par lasermicrodissection offert une solution élégante permettant des analyses du transcriptome dans la console MMC et les cellules gamétophytiques femmes 2-4. En plus de l'expression du gène candidat analyses, par exemple, en utilisant l'hybridation in situ de l'ARN ou des dosages de gène rapporteur dans les analyses cytologiques permet l'étude des dynamiques de composants cellulaires endogènes en utilisant une coloration spécifique cellulaire directe ou indirecte immunomarquage. En particulier, la coloration cytogénétique utilisant FISH et coloration de l'ADN, avec immunomarquage des modifications de la chromatine ou des composants de la chromatine sont des approches centrales à élucider la dynamique de la chromatine et l'organisation nucléaire chez Arabidopsis 5. Typiquement, la méiose entraîne la dynamique des chromosomes spécifiques qui a été bien étudiés dans plante mâle méiocytes 6,7; encore à grande échelle, la réorganisation de la chromatine spécifique de la cellule, ce qui reflète probablement la reprogrammation épigénétique dynamique a été décrite au cours du développement du pollen 8-10. En revanche, en raisonà l'inaccessibilité relative de la meiocyte femelle et gamétophyte, ces enquêtes restent techniquement difficile à appliquer, et nécessitent souvent dissection sectionnement ou manuel et la digestion enzymatique (voir ci-dessous). En outre, l'absence fréquente de clarté optique dans l'ensemble du montage est un obstacle à l'imagerie haute résolution des cellules reproductrices dans ovules intacts.
Une méthode classique pour l'analyse cytologique de l'organisation des chromosomes entiers dans des ovules de montage utilise la coloration de Feulgen 11-13. Elle implique une hydrolyse acide (en utilisant de l'acide hypochloreux) de l'ADN qui en résulte provoque la dénaturation des protéines et la destruction de la structure de la chromatine ainsi. Alternativement, l'organisation des chromosomes dans méiocytes femmes et les cellules gamétophytiques peut être observée en utilisant la coloration DAPI et immunomarquage sur coupes semi-fines ou sacs embryonnaires disséqués et MMC (par exemple voir 14-18). Il est clair, cependant, la dissection manuelle et la coupe peut être beaucoup de travail etentrave sur l'analyse qualitative et quantitative d'un grand nombre d'épitopes de la chromatine.
Ici, nous fournissons un protocole efficace pour préparer un grand nombre d'ovules Arabidopsis pour une variété de coloration cytologique en aval dans l'ensemble du montage. En bref, les boutons floraux sont incubées dans une solution de fixation, des rangées de ovules sont disséqués du carpelle et intégrés dans l'acrylamide sur la diapositive que fait pour méiocytes de pollen 19,20. Les ovules sont incorporés en outre compensées et fixés dans le méthanol, l'éthanol, le xylène et avant la digestion de la paroi cellulaire et de perméabilisation. Des variations possibles de ces étapes sont décrites. Les échantillons peuvent ensuite être utilisés pour la coloration de l'ADN, une immunocoloration et FISH. Le mode de préparation est efficace et permet parallèle expérimental (jusqu'à 16 lames peuvent être préparés d'une journée d'analyse en aval différent). Les traitements décrits permettent signaux homogènes dans l'ensemble du montage et bien conservés histologique, cellulaire,et l'organisation nucléaire dans les cellules reproductrices et les cellules environnantes qui bénéficient nucellaires comparaisons qualitatives et quantitatives entre les types cellulaires. Calibré, l'imagerie à haute résolution basée sur CLSM suivie d'une reconstruction en 3 dimensions permet des mesures quantitatives significatives de signaux fluorescents. Nous avons utilisé avec succès cette procédure pour analyser la dynamique de la chromatine dans la console MMC de différenciation 21 et le développement gamétophyte femelle 22; Nous présentons ici des résultats représentatifs de l'analyse de l'hétérochromatine, immunologique de la chromatine, la GFP immunologique et FISH dans l'ensemble du montage ovules. Nous croyons en outre que notre protocole sera adapté pour d'autres tissus végétaux et des espèces.
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Protocol
La procédure est décrite dans le flux de travail dans la figure 1, et la configuration de la dissection et l'incorporation de tissus sont présentés dans la figure 2.
1. Fixation tissulaire
- Recueillir 20-30 carpelles dans un tube de centrifugeuse contenant fraîchement tampon fixateur BVO sur la glace.
- Fixer le tissu 30 min en agitant doucement à température ambiante.
- Faites tourner les tubes contenant les carpelles en fixateur dans une paillasse centrifuger 1 min à 400 x g.
- Retirez soigneusement le tampon fixateur et ajouter 1 ml de PBT, placer les tubes sur la glace.
2. Dissection and Embedding
- Préparer cinq tubes Eppendorf avec chacun 200 pl d'une fraîchement préparé, 5% d'acrylamide mélange.
- Préparer cinq lames Superfrost pré-nettoyées à l'éthanol à 70% et étiquetés avec un crayon.
- Décongeler une aliquote de 20% et 20% APS NaPS chacun, sur la glace.
- Prenez 4-5 carpelles avec une pointe coupe-fin, le lieueux sur une lame propre, éliminer l'excès de liquide.
- Faire des coupes longitudinales avec une aiguille fine et détacher les murs de carpelles de libérer les lignes de ovules comme le montre la figure 2, éviter le séchage en couvrant avec du PBS (pas plus de 10 pi).
- Ajouter rapidement et mélanger 12 NaPS pi, 12 pi APS avec une aliquote de 200 ul acrylamide mélange.
- Ajouter 30 ul de l'acrylamide activé sur les ovules disséqués.
- Couvrir avec une lamelle mm 20 x 20, laisser polymériser à température ambiante, 45-60 min.
- Retirer la lamelle couvre-objet en utilisant une lame de rasoir. A ce stade, les échantillons peuvent être conservés pendant une nuit à 4 ° C dans une jarre de Coplin contenant du PBS.
3. Traitement des tissus
NOTE: Toutes les étapes, sauf 3.2.1, 3.2.3, 3.3.2 et 3.4.3 sont effectués dans des bocaux de Coplin avec 80 ml de solution sous le capot chimique à température ambiante. Les lames sont transférés avec une pointe plate-pince.
- clarification des tissus etfixation:
- Incuber 5 min dans du methanol.
- Incuber 5 min dans de l'éthanol.
- Incuber 30 min dans de l'éthanol: xylène (1:1).
- Incuber 5 min dans de l'éthanol.
- Incuber 5 min dans du methanol.
- Incuber 15 min dans du methanol et le PBT (1:01), complété avec 2,5% de formaldehyde.
- Rincer 2 x 10 min en PBT. A ce stade, les lames peuvent être conservées pendant une nuit à 4 ° C.
- paroi cellulaire digestion:
- Décongeler une aliquote de la paroi cellulaire digestion mélange sur de la glace.
- Prenez une diapositive de la cuve à rainures, drainer l'excès de liquide en le plaçant à la verticale sur une serviette en papier.
- Ajouter 100 pi de la paroi cellulaire digestion mélange sur le pavé de l'acrylamide et couvrir avec une lamelle 23 mm x 46. Répétez l'opération pour les autres diapositives. Incuber pendant 2 heures à 37 ° C dans une chambre humide (décrit dans Matériels).
- Laver les lames 2 x 5 min en PBT.
- RNase A de traitement:
- Prenez une diapositive de la cuve à rainures, égoutter èmee excès de liquide que précédemment.
- Incuber chaque lame avec 100 pl de RNase A à 100 ug / ml dans du PBS avec 1% de Tween-20 pendant 1 h à 37 ° C dans une chambre humide.
- Laver les lames de 2 x 5 min en PBT.
- Post-fixation et perméabilisation:
- Post-fixer pendant 20 min dans fraîchement PBT-F.
- Rincer les lames pendant 10 minutes dans le PBT.
- Perméabiliser pendant 2 h dans du PBS avec 2% de Tween-20 à 4 ° C.
- Rincer les lames de 2 x 5 min en PBT.
4. Immunocoloration
NOTE: Pour cette étape, la concentration optimale de l'anticorps primaire doit être testée en utilisant différentes dilutions (1:200, 1:500, 1:1000) d'anticorps.
- Incuber chaque lame avec 100 pi d'anticorps primaire dilué dans du PBS avec 0,2% de Tween-20 pendant 12 à 24 heures à 4 ° C.
- Laver les lames en PBT pour 2-4 heures à température ambiante sous agitation douce.
- Appliquer le1:200 d'anticorps secondaire dans du PBS + 0,2% de Tween-20 pendant 24 h à 4 ° C.
- Laver les lames dans PBT pendant 1 heure à température ambiante sous agitation douce.
- Contre-colorer avec 10 pg / ml d'iodure de propidium dans du PBS pendant 15 min, puis rincer 15 min dans du PBS sous agitation douce, à température ambiante.
- Mont en milieu de montage anti-décoloration de liquide supplémenté avec 10 pg / ml d'iodure de propidium. Que le milieu de montage durcir pendant 1 heure avant l'acquisition d'images par CLSM.
5. Imagerie quantitative
- acquisition de l'image:
- Acquérir des images de haute résolution en utilisant CLSM, de préférence en utilisant un mode de balayage de résonance, ce qui permet une meilleure conservation des signaux de fluorescence au cours de l'imagerie 23 prolongée, et une lentille à immersion 63X de glycérol.
- Testez les paramètres d'acquisition tels que l'intensité du laser, le gain, sténopé, la taille de voxel et le facteur de zoom au début de l'expérience de définir une procédure d'acquisition standard pour suivre strictement tout au long detoutes les diapositives pour des mesures quantitatives cohérentes.
- Vérifier l'absence de diaphonie entre fluorochromes. Le cas échéant, mettre en place une analyse séquentielle. Acquérir les images de transmission séparément et non simultanément.
- Effectuer une acquisition d'image de série, en trois dimensions avec la plus haute résolution possible dans les dimensions X et Y et avec 2x suréchantillonnage dans la dimension z (la règle de Nyquist).
- Traitement de l'image:
- Reconstruire des images de série en trois dimensions en utilisant un logiciel de source commerciale ou ouvert.
- Définir des surfaces de contour autour de chaque noyau (ou cellule) d'intérêt en 3D.
- Quantifier la fluorescence dans chaque canal à la somme des intensités de pixels dans chaque objet.
- Exporter les données vers Excel pour des analyses statistiques. Normaliser les signaux d'anticorps contre les signaux de coloration par exemple d'ADN.
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Representative Results
Nous fournissons un protocole robuste pour la préparation à grande échelle et le traitement des ovules Arabidopsis appropriés pour la coloration cytologique dans l'ensemble du montage. Merci à l'encastrement, les ovules conservent une structure en 3 dimensions (Figure 3). En outre, le traitement des tissus, y compris la clarification optique permet des structures sous-cellulaires d'imagerie à haute résolution. Figure 4 montre coloration de l'ADN dans l'ovule primordia tout montage où l'hétérochromatine apparaît comme clair, bien défini foyers visibles (pas de déconvolution a été utilisée pour cette image). Ces images ont été utilisées pour l'analyse du contenu de l'hétérochromatine dans la console MMC et nucelle (figure 4) 21.
En outre, nous avons utilisé avec succès ce protocole pour l'analyse quantitative dynamique de la chromatine par immunomarquage dans des cellules mégaspore mère, mégaspore fonctionnelle, développement gamétophytes femelles et embryon précoce 21, 22-24. Dans la Figure 5 Arabidopsis. figure 5A montre un exemple d'immunodétection dans primordia ovule, y compris la cellule mégaspore de mère, d'une marque permissive euchromatine associé (H3K4me3) et une marque répressive hétérochromatine associée (H3K27me1). figure 5B montre un exemple de la GFP immunodétection dans un ovule mature, y compris le sac embryonnaire (dans ce cas, le protocole a été légèrement modifié pour l'utilisation de l'anticorps de rappel de la GFP (voir la discussion). Nous avons également détecté des protéines de la chromatine indigènes comme H3 et H1 21 montrant que la procédure préserve la chromatine épitopes de protéines. Cette procédure permet également de quantifications reproductibles permettant la comparaison entre les différents types de cellules (par exemple, en matière de reproduction par rapport à somatiques, les cellules environnantes) 21.
Enfin, nous avons également réussi à appliquer cette procédure pour effectuer des analyses FISH sur l'ensemble du montage ovule primordia. Un exemple est présenté figure 6 montre des signaux de poissons à l'aide d'une sonde contre ADNr 45S répète définir les régions organisatrices nucléolaires 25. La sonde d'ADN a été marqué directement avec Alexa 488 avec les poissons-Tag 26, l'hybridation a été réalisée essentiellement comme décrit 27 avec des modifications mineures, alors que l'ADN contre-coloration a été effectuée comme décrit dans notre protocole.
Figure 1. Workflow immunologique, coloration de l'ADN et l'hybridation fluorescente in situ ovules Arabidopsis en. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Configuration pour la dissection et l'incorporation de carpelles sur la diapositive. L'paroi carpien est éliminé et le carpelle est disséqué sur la diapositive pour libérer les lignes de ovules (voir près d'ovules disséqués à l'étape 3), puis le carpelle disséqué est intégré dans activé mélange d'acrylamide, couvert par 20 x 20 mm lamelle. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Le protocole permet la préservation de la structure à 3 dimensions, tout en permettant une clarté optique et une coloration homogène. Les images montre une vue en section de fractionnement de l'image en 3D en xy, xz et yz axe comme indiqué. Les données d'images ont été acquises parmicroscopie confocale à balayage laser et reconstruit en trois dimensions à l'aide du logiciel Imaris. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Tout le montage coloration de l'ADN par l'iodure de propidium dans primodia ovule permet précise hétérochromatine quantification. L'image de gauche montre l'ensemble du montage coloration de l'ADN à travers une primordia ovule. Un noyau de MMC est marquée par un contour blanc et un noyau nucellaire en rouge. Projections des noyaux 3D reconstruits sont indiqués sur la droite. La clarté du tissu permet l'imagerie haute résolution des foyers d'hétérochromatine marqués par un contour jaune et la quantification des signaux fluorescents qui s'y trouvent. Les graphiques montrent le rapport heterochromatin fraction 21. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. Des résultats représentatifs de l'ensemble du montage immunomarquage dans des ovules d'Arabidopsis. A) Immunomarquage de modifications de la chromatine chez les jeunes primordia ovule détection euchromatine (H3K4me3) et l'hétérochromatine (H3K27me1). Le signal d'anticorps est vert, l'ADN counterstained par l'iodure de propidium en rouge. Une superposition de signaux fluorescents s'affiche avec une image à la lumière de transmission utilisant l'interférence différentiel contraste (gris). MMC sont indiqués par des contours blancs. Un gros plan du noyau de MMC est représenté comme encastré dans le panneau supérieur. Les images sont confocale seule section. B) Immunodétection de la GFP dans un ovule mature.La GFP a été immunocoloré utilisant un anticorps GFP-rappel et l'ovule a été DAPI. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6. Totalité montage hybridation fluorescente in situ dans des ovules d'Arabidopsis en. L'ébauche ovule a été hybridée avec une sonde d'ADN spécifique ADNr 45S répétition loci et marqué avec Alexa 488 en utilisant la technologie FISH-Tag, et DAPI 26. La superposition des ADNr 45S avec DAPI et image acquise dans le canal de lumière de transmission (gris) sont également représentés. Un gros plan du noyau de MMC est représenté comme encart. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figureure.
Figure 7. Influence de la fixation, de la digestion et de la procédure de coloration sur des signaux d'ADN dans des ovules l'ensemble du montage. Ovules A) matures ont été fixés à 30 min, soit 4% de paraformaldéhyde ou BVO fixateur et traitées 30 min ou 1 h avec la paroi cellulaire digérer mélange d'enzymes avant coloration de l'ADN avec l'iodure de propidium. Pour un lot donné, plus incubation affecte plus négatif sur les ovules ADN de coloration qui ont été fixés avec du paraformaldéhyde qu'avec BVO. B) Tout montage coloration de l'ADN en utilisant le réactif de Feulgen la suite d'une hydrolyse acide requis 28 ou en utilisant l'iodure de propidium la suite de la non- protocole de dénaturation décrit dans le texte. Le panneau supérieur montre une section plane unique à travers le sac embryonnaire, le panneau inférieur présente un agrandissement sur le noyau de la cellule centrale montrant clairement l'altération deorganisation de la chromatine dans ovules Feulgen colorées. CCN, noyau de la cellule centrale, ecn, noyau de la cellule œuf, syn, noyau synergide. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Chez les plantes à fleurs, la lignée reproducteur féminin est entouré de plusieurs couches de cellules, y compris le nucelle et les téguments de l'ovule, ce qui rend la coloration cytologique en tout montage techniquement difficile. Nous présentons ici un protocole efficace permettant à l'élaboration et au traitement d'un grand nombre d'ovules appropriés pour la coloration cytologique comme immunologique, la coloration de l'ADN et l'hybridation fluorescente in situ l'ensemble du montage en. Nous avons utilisé avec succès pour l'analyse de la lignée germinale reproducteur féminin chez Arabidopsis 21,22. Cette méthode est très efficace car plusieurs diapositives peuvent être traités en parallèle pour une coloration différente. Il est également robuste et donne la distribution de signal homogène et permet des analyses quantitatives reproductibles. Par contraste avec la méthode classique telle que la coloration de Feulgen qui implique la dénaturation de la structure de la chromatine, notre protocole préserve organisation de la chromatine et des épitopes nucléaires. En complémentition, la clarification des tissus permet l'imagerie des signaux à haute résolution au niveau d'une seule cellule.
Ce protocole peut être accéléré en omettant les étapes décrites à la section 3.1 si les fleurs ont été corrigés dans du paraformaldéhyde 4% (dans du PBS + 1% de Tween) au lieu de tampon BVO (1.1). Bien que cette procédure plus courte s'avérait fonctionnel pour plusieurs immunomarquage 22-24, nous avons constaté qu'il atténue la robustesse de la coloration entre les échantillons, anticorps et lot de paroi cellulaire digestion enzymatique mélange (voir ci-dessous). En outre, nous n'avons pas réussi à FISH hybridation avec cette procédure courte. Pour immunodétection de la GFP de l'utilisation des molécules d'appoint, comme indiqué sur la figure 5B, un protocole analogue tel que décrit ici a été utilisé avec de légères modifications à l'étape 1 et 3: carpelles ont été fixées dans 2,5% de formaldehyde pendant 45 minutes (1,1), la première étape de traitement de tissus a été raccourcie de 5 à 10 min de traitement du methanol (3,1), une étape de blocage a été introduit (30 min à 2% BSA dans PBS) avant l'application anticorps nuit comme décrit. Aucun anticorps secondaire est nécessaire avec le servomoteur.
Nous discutons ci-dessous quelques étapes essentielles:
Fixation des tissus, la dissection et l'incorporation.
signaux de IMMUNOCOLORATION et coloration de l'ADN étaient toujours plus robuste et homogène distribués lorsque le tissu a été échantillonné à partir de plantes de moins de 5 semaines (après le transfert de la plantule dans le sol). Peut-être, dans les conditions de croissance, une période prolongée de culture peut être accompagné par des changements de la composition biochimique de la paroi cellulaire, qui influencent à leur tour l'efficacité de traitement des tissus. Ainsi, nous recommandons de tissus d'échantillonnage de relativement jeunes plantes. De plus, le tissu doit être empêché de séchage au cours de la dissection (conduisant par ailleurs à l'altération histologique et l'absence de signaux de coloration), tandis que l'excès de PBS conteste la manipulation; un drainage doux de l'excès de solution avec la pointe autour du tissu déposé sur la lame est donc recommandé. En outre, les bulles doivent être évités dans le mélange à base d'acrylamide et tout en recouvrant avec une lamelle. Enfin, les lames Superfrost Plus sont fortement recommandés pour l'adhésion de l'acrylamide suffisante (plomb de qualité standard à des plots fragiles et instables dans nos mains), telles qu'elles apparaissent supérieurs aux autres pour tissus et d'acrylamide adhérence.
Fixation, perméabilisation et la paroi cellulaire digestion.
digestion de la paroi cellulaire est une étape critique de traitement des tissus. On pense que cette étape favorise une bonne pénétration des réactifs de coloration de manière homogène dans tout le tissu de la plante. Nous avons connu variabilité dans l'homogénéité de coloration (allant de l'absence de signal, le signal que dans une partie du tissu, à 100% de coloration des tissus) en fonction du temps de la digestion et de l'activité enzymatique (spécifique au lot, décrit par le fournisseur). Il est recommandé de produire une grande quantité de solution mèredu mélange d'enzymes (par exemple, 100 ml) et de maintenir aliquotes de 1 ml à -20 ° C. Chaque solution mère doit d'abord être testé sur 1-2 diapositives avant de l'utiliser à grande échelle. En outre, nous avons connu que le type de fixateur influe sur l'efficacité de coloration de l'ADN en combinaison avec le temps de traitement différent pour la paroi cellulaire digérer: ovules fixés dans du paraformaldéhyde 4% ont été affectés négativement par une incubation prolongée avec la digestion mélange de la paroi cellulaire, tandis que le tissu fixé avec le solution BVO étaient tolérantes à de plus longues durées de digestion et on laisse une meilleure coloration de l'ADN (figure 7A). En outre, une RNase (DNase) traitement est strictement nécessaire si le tissu est contre-colorées avec de l'iodure de propidium comme elle se lie également à des molécules d'ARN. Nous déconseillons d'utiliser 4 ',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) en raison de ses larges spectres d'émission de fluorescence qui se chevauchent avec d'autres fluorophores mais aussi à des aberrations achromatiques qui nécessitent des corrections de décalage de canal post-acquisition. Nous avons égalementrecommander contre coloration de Feulgen qui nécessite une hydrolyse acide pendant le traitement du tissu 28 qui conduit à la dénaturation de la chromatine en particulier dans le sac embryonnaire (Figure 7B). Des colorants d'ADN alternatives peuvent également être utilisées 29, mais leur efficacité n'a pas été testé ici.
Immunocoloration.
Pour immunomarquage des modifications de la chromatine, nous vous recommandons de vérifier la spécificité de l'anticorps primaire dans la base de données open source http://compbio.med.harvard.edu/antibodies/projects/1 30, que certains anticorps disponibles dans le commerce ont montré des réactions croisées pour d'autres modifications. Pour les analyses de quantification en aval, il est important d'étalonner la concentration d'anticorps et la durée d'incubation pour mesurer des signaux dans une relation linéaire avec l'épitope. Nous vous recommandons de calibrer le temps de dilution d'anticorps et la détection en utilisant un dil d'anticorpssérie ution de 1:200, 1:500, 1:1000 et de 12 à 24 heures d'incubation, respectivement, d'identifier les conditions donnant des signaux robustes et homogènes. La dilution la plus élevée et le plus court temps d'incubation permettant à des signaux reproductibles doivent être utilisées pour des analyses quantitatives. Contrôles sans anticorps primaire doivent être effectués pour tester la spécificité. Si immunomarquage produit une coloration non spécifique, il est conseillé de bloquer avec 5% de BSA + 0,1% de Tween dans du PBS pendant 2 heures à 4 ° C avant d'appliquer l'anticorps primaire. Signaux d'anticorps peuvent être contrôlés sur le coulisseau contre-coloration de l'ADN avant de vérifier le succès de l'expérience. Dans nos mains, laver en PBT pour 2-4 heures après incubation avec l'anticorps primaire, et une heure après l'anticorps secondaire permet de signaux de fond bas, même sans blocage.
Enfin, ce protocole est également probable applicable à d'autres tissus de la plante (par exemple root, fragment de feuille, méristème floral) et probablement à d'autres espèces végétales, proViding quelques ajustements sur la dissection, la paroi cellulaire digérer et perméabilisation.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| BVO Fixation Buffer (based on32) | 2 mM EGTA, pH 7.5, 1% (v/v) formaldehyde, 10% DMSO, 1x PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBT | 1x PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBT-F | 1x PBT, 2.5% (v/v) formaldehyde | ||
| 30% acrylamide:bisacrylamide | 3 g acrylamide, 0.33 g bisacrylamide, 1x PBS (prepare 10 ml, store at 4 °C) | ||
| 200 ml 5% acrylamide mix in PBS | 34 ml 30% acrylamide:bisacrylamide, 166 ml 1x PBS (make fresh from 30% stock) | ||
| 20% ammoniumpersulfte | 0.2 g ammoniumpersulfte, 1 ml sterile water (prepare aliquots with 1 ml and store at -20 °C) | ||
| 20% sodium sulfite | 0.2 g sodium sulfite, 1 ml sterile water (prepare aliquots with 1 ml and store at -20 °C) | ||
| Cell wall enzyme mix | 0.5% (w/v) cellulase, 1% (w/v) driselase, 0.5% (w/v) pectolyase | ||
| Reagents and Materials | |||
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| DMSO | Sigma | D5879 | |
| Tris | Amaresco | 0497 | |
| Ethanol | Schaurlau | ET00102500 | |
| Methanol | Schaurlau | ME03062500 | |
| Xylene | ROTH | 4436.1 | |
| Cellulase | Sigma | 1794 | |
| Driselase | Sigma | D8037 | |
| pectolyase | Sigma | P5936 | |
| Tween-20 | Merck | 8.22184.0500 | |
| EGTA | Sigma | E-4378 | |
| acrylamide | Sigma | A-3553 | |
| bisacrylamide | Sigma | M2022 | toxic |
| ammoniumpersulfate | Sigma | A9164 | |
| Sodium sulfite | Fluka | 71988 | |
| Anti-trimethyl-Histone H3 (Lys4) | Upstate | 07-473 | |
| Anti- monomethyl-Histone H3 (Lys27) | Upstate | 07-448 | |
| Alexa Fluor 488~goat ~anti ~rabbit (H+L) | Molecular Probe | A11008 | |
| ProlongGold | Invitrogen | P36934 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170 | toxic |
| DAPI | Sigma | D9542 | toxic |
| RNAse A | Roche | 10109169001 | |
| Coplin jar | Huber & CO | 10.055 | |
| Forceps | DUMONT BIOLOGY | ||
| Shaker | Heidolph | 543-12310-00-0 | |
| Moist chamber | A plastic box with damp paper towel inside, a plastic support is put into the box for supporting the slides and keep slides from the water. | ||
| Superfrost Plus slide | Thermo Fisher | J1800AMNZ | Menzel-Gläser |
| FISH Tag DNA KIt | Invitrogen | F32947 | |
| GFP booster | Chromotek |
References
- Maheshwari, P. An introduction to the embryology of angiosperms. , McGraw-Hill. New York. (1950).
- Schmidt, A., et al. Transcriptome analysis of the Arabidopsis megaspore mother cell uncovers the importance of RNA helicases for plant germline development. PLoS Biol. 9 (9), (2011).
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