Summary
Denne artikkelen presenterer en enkel tilnærming til å gi ikke-sammenhengende gradient statisk påkjenningene på en konsentrisk celle-laden hydrogel å regulere cellejustering tissue engineering.
Abstract
Kunstig veiledning for mobilnettet justering er et hett tema innen tissue engineering. De fleste av de tidligere forskningen har undersøkt enkelt press-indusert mobilnettet justering på en celle-laden hydrogel med komplekse eksperimentelle prosesser og masse kontrollere systemer, som er vanligvis tilknyttet forurensning problemer. Derfor, i denne artikkelen foreslår vi en enkel tilnærming til å bygge en gradient statisk belastning bruker en fluidic chip med en plast PDMS cover og en UV gjennomsiktig barometer substrate for stimulering av mobilnettet atferd i en 3D hydrogel. Overbelasning bilde-patternable celle prepolymer i det fluidic kammeret kan generere en konveks buede PDMS membran på forsiden. Etter UV crosslinking, gjennom en konsentrisk sirkulære micropattern under den buede PDMS membran, og buffer vaskemaskin, en microenvironment for undersøke celle atferd under en rekke gradient stammer er selv etablert i én enkelt fluidic brikke, uten eksterne virkemidler. NIH3T3 celler ble vist etter å observere endringen i mobilnettet justering trenden under geometri veiledning, i samarbeid med belastning stimulering, som varierte fra 15-65% på hydrogels. Etter en 3-dagers inkubasjon dominert hydrogel geometrien cellejustering under lav kompresjons belastning, der cellene justeres hydrogel forlengelse retning under høy kompresjons press. Mellom disse cellene viste tilfeldig justering på grunn av spredning av radikale veiledning av hydrogel forlengelse og geometri veiledning av mønstret hydrogel.
Introduction
Tjene som en blokk materiale som etterligner en innfødt microenvironment, kan en hydrogel inneholder ekstracellulær matrix (EFM) re bygge biomimetic vev stillaser for å støtte cellevekst. For å ha en vev funksjoner, er organisert cellejustering en viktig forutsetning. Ulike 2D (dvs. celler kultivert på en overflate) og 3D (dvs. celler innkapslet i en hydrogel) cellejustering oppnådd av dyrking eller innkapsle celler i eller på fleksible underlag med micro- eller nano-mønstre1. 3D cellejustering i mikroarkitektur er mer attraktiv som microenvironment er nærmere innfødt vev konstruere2,3,4. En felles tilnærming for 3D cellejustering er geometriske stikkordet hydrogel figur2,3. På grunn av begrenset plass til celle spredning i kort-aksen retning, celler som mål å justere lang-aksen retning i en mikro-mønstret hydrogel. En annen tilnærming er å bruke strekk strekker hydrogels å oppnå cellejustering parallell til strekk retning4,5.
Biofysiske stimulering på ECM hydrogels, for eksempel kompresjons belastning eller et elektrisk felt, kan regulere celle funksjoner for riktig vev integrasjon, spredning og differensiering1,2,3. Mye forskning har blitt gjort for å undersøke mobilnettet atferd ved å bruke en belastning betingelse samtidig bruker flere mekanisk styring enheter4,6,7,8,9. For eksempel bruk av mekaniske trinn motorer klemmet eller strukket på en 3D celle-innkapslet kollagen hydrogel er en felles tilnærming7,10. Men slik kontrollerer utstyr krever ekstra plass og står overfor spørsmålet om forurensning i inkubator7,9,11,12. I tillegg gi store apparatet ikke et nøyaktig kontrollmiljø å gi høy reproduserbarhet13.
Tatt i betraktning at celle-laden hydrogels er vanligvis ansatt på mikro-skala for biomedisinsk programmer, er det fordelaktig å kombinere MEMS teknikker for å generere en rekke belastning/stretch stimulering samtidig undersøke celle atferd i 3D biomimetic konstruksjoner i vitro2,14,15,16,17,18. For eksempel kan bruker gasstrykket for å deformere PDMS membran microfluidic sjetonger gi opphav til ulike belastninger, kjører celledifferensiering til forskjellige overleveringslinjer9,16. Men er det mange tekniske utfordringer, for eksempel komplisert flis fabrikasjon prosesser i et rent rom og programvare kontroll integrering av motorer, pumper, ventiler og komprimerte gasser.
I dette arbeidet viser vi en enkel tilnærming for å få en selvdrevet gradient statisk-belastning microfluidic chip ved å bruke et konsentrisk sirkulære hydrogel mønster og en fleksibel PDMS membran. I motsetning til de fleste av de eksisterende metodene er vår plattform en bærbar og disponibel miniatyr enhet som kan fremstille utenfor en gul rommet og som besitter selv generere gradient påkjenningene på konsentriske celle-kapslet hydrogels, uten eksterne mekanisk utstyr under incubation. 3T3 fibroblast celle atferd påvirket av en kombinasjon av hydrogel form og en rekke strekk strekk veiledning signaler ble vist under observasjon av cellejustering i 3D ECM-mimetic miljøer i gradient belastning chip for 3 dager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å sammenligne de mekaniske variasjonene mellom hver runde hydrogel i fullført gradient belastning stimulering chip, målt vi linje bredden på hver runde hydrogel i to av samme chips, med injeksjon mengder 0 µL (figur 4a) og 40 µL (figur 4b), henholdsvis. De prosent videreutvikling på hver sirkel ble beregnet ved å dele videreutvikling i 40 µL-injisert chip linje bredden på den tilsvarende hydrogels i 0 µL-injisert brikken (Figur 4 c). Hydrogel er et incompressible materiale, så vertikal kontraherende belastningen vil være tilsvarende til lateral forlengelse belastning. Derfor de prosent videreutvikling i brikken med 40-µL injeksjon volumet Vis 15-65% elongation, som kan konverteres til kompresjons belastning (se utfyllende fil 1).
Fluorescerende farging av cellen kjerner og F-utgangen med DAPI og phalloidin, henholdsvis, ble gjort for å analysere mobilnettet justeringen. Den DAPI flekker gitt data om kjernefysisk retning, og den phalloidin flekker ble brukt for å vurdere celle spredning. Figur 5a - viser cellejusteringen i gradient belastning chip. I linje 1 og linje 3T3 cellene radial retning. I hydrogel 7, cellene justeres tilfeldig, og cellene justeres sirkulær retning i linje 12. I samsvar med fluorescerende flekker bilder, ble en 90 ° dreining fra vinkelen på cellejustering 3T3 cellene i linje 1 (maksimal hydrogel forlengelse i radial retning) til justeringen vinkelen på cellene med lang-aksen justering i linje 12 (laveste hydrogel forlengelse i radial retning) oppdaget.
I tidligere forskning2,9, celler i 200 µm linje-mønstret hydrogels mål å justere lang-aksen retning av hydrogel. Men i denne studien observerte vi at den langstrakt strekningen på 200 µm hydrogels i kort-aksen retning gitt en annen faktor å påvirke og dominere mobilnettet justeringen ved å kontrollere prosentandelen av belastningen på hydrogel. For 65% belastningen på linje 1 viste radikale justeringen at forlengelse strekningen av hydrogel dominerer cellejusteringen. For 15% belastningen på linje 12 viste sirkulære justeringen at lang-aksen effekten dominert av cellejustering. For 40% belastningen på hydrogel 7 justert cellene tilfeldig på grunn av nøytralisering av geometri veiledning og belastning effekten.
Figur 1 . PMMA mor Mold for PDMS ark og Plug fabrikasjon. (a) atskilt komponentene av PMMA mold, inkludert bunnplaten, grense rammen og flyt kanal. Etter montering med dobbeltsidig tape, er (b) PMMA mor mold for flyt arket dannet. (c) en annen PMMA mold er samlet for PDMS plugg. Den røde representerer dybden. (enhet: mm) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Plast Photomask Design for celle-laden Hydrogel Micropattern. Det er to åpninger med trekant former (2 mm på bunnlinjen og 6.5 mm i høyden) kobler til flyt kanalene å levere ferske celle kultur medium. (a) den plast photomask er merket med dimensjonen. Konsentrisk sirkel er 400 nm og driftssyklus er 50%. Diameteren på Midtsirkelen er 2 mm. (b) photomask oppsettet, uten etiketter for laserutskrift på plast gjennomsiktige filmen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Metallbearbeiding prosesser på graderingen stamme celle-laden Hydrogel Radial retning i en PDMS Fluidic Chip. (a) en plast photomask er justert og fast under chip med en TMSPMA-belagt fluidic kanal. En mikro-sprøyte med prepolymer cell løsningen er satt inn i mengden av chip og brukes til å injisere 50 µL å fylle flyt kanalen. (b) utløpet av flyt kanalen er lukket med PDMS plugg og en ytterligere 40 µL av prepolymer cell løsningen injiseres. Glass bunnen er UV-mønster for 30 å dikte den konsentriske sirkulær hydrogel i flyt chip. (c) flytende trykket frigjøres i flyt kanalen ved å koble fra stikkontakten og FN-crosslinking blandingen er vasket med DPBS. (d) en brikke med statisk gradient belastning gjelder konsentriske celle-laden hydrogels som er klare for cellen dyrking. Under UV crosslinking prosessen er (e) en ikke-sammenhengende gradient høyde av hydrogel langs radius dannet. (f) etter å koble fra stikkontakten, PDMS membranen blir flate og gjelder gradient stress på celle-kapslet hydrogels. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Ren Hydrogel forlengelse graderingen. Forlengelse linjebredden og prosentandel av ren hydrogel uten celle innkapsling i forløpningen belastning chip på dag 3 med den (a) 0-µL (kontrollgruppen) og (b) 40-µL injeksjon volumer. (c) forlengelse prosent beregnes ved å dele verdien av linje bredde forskjellen mellom 40 µL og 0 µL linjebredden for 40 µL. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 . Fluorescerende utgangen-kjernen flekken bilder av 3T3 celler innkapslet i Gradient chipsene på dag 3. Celle justering retning (a-c) linje 1, (d-f) linje 7 og (g-i) linje 12 avsløre radial justering, tilfeldig justering og sirkulære justering, henholdsvis. Den grønne og blå fargen vise utgangen og kjernen flekker, henholdsvis. Den prikkete hvite linjen representerer grensen av hydrogel. Skala bar: 200 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 1. Beregning av ryggsøylens kuppel-formet PDMS. H: konveks PDMS kurven; H0: maksimal høyde forskjellen mellom PDMS dome før og etter deformasjon; r: radius av kuppelen; V: over injeksjon volumet av blå regionen, som forårsaker PDMS deformasjon som en kuppel. Se utfyllende fil 1 for detaljer. Klikk her for å laste ned dette tallet.
Supplerende filen 1. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette papiret rapportere vi om en enkel tilnærming til å sammenligne celle justeringsalternativer etter hydrogel figur veiledning og strekk strekker. En fleksibel PDMS membran oppretter en kuppel-formet kurvatur for å generere ulike høyder av konsentrisk sirkulære hydrogels. Etter slippe presset, gjelder PDMS membranen automatisk kraft mikro-mønstret hydrogels til gradient belastning/elongation, med et maksimum på center og minimum på den ytre grensen. Som dannelsen av gradient belastningen er designet av fleksible PDMS membranen og håndtering av fluidic chip, det er flere viktige parametere som bør være ivaretatt: (i) nøyaktig kontroll over tykkelsen på PDMS membran er avgjørende for å justere gradient belastning verdien. Hvis membranen er for tykk, vil ikke selv maksimal injeksjon volumet av celle prepolymer kunne generere en riktig konveks kurve i PDMS membranen for crosslinking en gradient høyde på celle-laden hydrogels. Derimot kan ikke en for tynne PDMS membran bruke tilstrekkelig styrke til hydrogels. Kontroller at vekten av uherdet PDMS i PDMS dekke mold er rundt 1.6-2.0 g per brikke. (ii) forurensning forebygging er svært viktig i krysskobling håndtering av celle-laden hydrogel i fluidic chip. Før dyrking i inkubator, grundig vask med sterilisert PBS i fluidic kanalen og bruke 75% kan etanol å tørke overflaten av chip bidra til å unngå forurensning problemet. (iii) konsentrasjon av photoinitiator og dosering av UV eksponering bør være nøye kontrollert og i området av ~0.1% - 2% (0,5% anbefales). Over-crosslinking hydrogel og overdoser UV-bestråling vil resultere i lav celle levedyktighet. (iv) linjebredden for den mønstrede hydrogel bør ikke være for stor. Ellers vil det næringsstoffet erstatningsrate i den tykke hydrogels ikke kunne støtte celle spredning. Vanligvis anbefales mindre enn 300 µm. Avstanden mellom to hydrogel sirkler kan varieres og en 50% driftssyklus anbefales. (v) mens vask eller påfylling flyt kanalen med løsning, bør dannelsen av bobler unngås. Forsiktig pipettering løsningen i chip kan hjelpe fjerne bobler.
Begrepet gradient belastning generert av PDMS-deformert krumning kan bli ytterligere oppgradert å bruke dynamisk gradient stammer og kan integreres med biokjemiske stimulering, som kan ha nytte mange studier på funksjonell vev gjenfødelse. Enkel fluidic injeksjon modulen med en PDMS plugg kan erstattes av en avansert fluidic system for utvidet eksperimentelle kontroll. PMMA mold kan også bli erstattet av en microfabricated SU-8 mold eller en bulk-etset silicon formen.
Denne gradient belastning brikke med en sirkulær celle-laden hydrogel kan generere statisk kompresjons styrken på 3D hydrogel uten eksterne mekanisk eller elektrisk. Derfor gir det en rask screening plattform for å undersøke celle atferd i en rekke belastningen forhold, uten risiko for smitte problemer som skyldes bruk av eksterne maskiner. Tidsstyrt belastning stimulering er imidlertid ikke oppnåelig fordi PDMS membranen genererer stammer til nedbrytning av hydrogel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette prosjektet ble støttet av den Graduate Student studere i utlandet Program (NSC-101-2917-I-007-010); Biomedisinsk Engineering programmet (NSC-101-2221-E-007-032-MY3); og nanoteknologi nasjonale programmet (NSC-101-2120-M-007-001-), National Science Council for R.O.C., Taiwan. Forfatterne vil gjerne takke Prof Ali Khademhosseini, Gulden Camci-Unal, Arghya Paul, og Ronglih Liao ved Harvard Medical School for deling hydrogel og celle innkapsling teknologien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL black microcentrifuge tube | Argos Technologies | 03-391-161 | This one can be replaced with a neutral color of 1.5 mL tube covered with aluminun foil |
| 10x DPBS | Sigma-Aldrich | 56064C | |
| Alexa Fluor 488 phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| BSA | Sigma | A1595 | |
| Calcein | Molecular Probe | C1430 | For labeling viable cells |
| CCD | PCO. Imaging | Pixelfly qe | |
| Cell membrane permeating solution | Sigma-Aldrich | X100 | 0.5% Triton X-100 for permeating cell membrane |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | Cell nucleus staining |
| Dialysis membrane | Sigma-Aldrich | D9527 | Molecular weight cut-off = 14,000 |
| DMEM | Gibco | 11995-065 | |
| Double-side tape | 3M | 8003 | |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G2500 | gel strength 300, type A, from porcine skin |
| High frequency electronic corona generator | Electro-technic products | MODEL BD-20 | |
| Methacrylic Anhydride | Sigma-Aldrich | 276685 | |
| Micro syringe | Hamilton | 80501 | 50 μL |
| Microscope | Olympus | IX71 | Include two filter sets: LF405/LP-B-000 and LF488/LP-C-000 from Semrock |
| Oxygen plasma machine | Harrick plasma | PDC-001 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | For fixing cell |
| PDMS | DOW CORNING | Sylgard 184 | Mixture for PDMS chip cast-molding fabrication |
| Pen-Strep | Gibco | 10378-016 | penicillin/streptomycin |
| Photoinitiator | CIBA | Irgacure 2959 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | For labeling dead cells |
| Sterile Filtration cup | Millipore | SCGPT05RE | |
| TMSPMA | Sigma-Aldrich | 440159 | For hydrogel immobilization |
| Ultrasonicator | Delta | D150H | 150W, 43kHz |
| UV light | DAIHAN | WUV-L10 | |
| Freeze Dryer | FIRSTEK | 150311025 | |
| NIH3T3(fibroblast) | Food Industry Research and Development Institute(FIRDI) | 08C0011 | |
| MOXI Z Mini Automated Cell Counter | ORFLO | MXZ001 |
References
- Simmons, C. S., Petzold, B. C., Pruitt, B. L. Microsystems for biomimetic stimulation of cardiac cells. Lab Chip. 12 (18), 3235-3248 (2012).
- Aubin, H., et al. Directed 3D cell alignment and elongation in microengineered hydrogels. Biomaterials. 31 (27), 6941-6951 (2010).
- Guan, J., et al. The stimulation of the cardiac differentiation of mesenchymal stem cells in tissue constructs that mimic myocardium structure and biomechanics. Biomaterials. 32 (24), 5568-5580 (2011).
- Wan, C. R., Chung, S., Kamm, R. D. Differentiation of embryonic stem cells into cardiomyocytes in a compliant microfluidic system. Ann Biomed Eng. 39 (6), 1840-1847 (2011).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Li, X., Chu, J. S., Yang, L., Li, S. Anisotropic effects of mechanical strain on neural crest stem cells. Ann. Biomed. Eng. 40 (3), 598-605 (2012).
- Butcher, J. T., Barrett, B. C., Nerem, R. M. Equibiaxial strain stimulates fibroblastic phenotype shift in smooth muscle cells in an engineered tissue model of the aortic wall. Biomaterials. 27 (30), 5252-5258 (2006).
- Ramon-Azcon, J., et al. Gelatin methacrylate as a promising hydrogel for 3D microscale organization and proliferation of dielectrophoretically patterned cells. Lab Chip. 12 (16), 2959-2969 (2012).
- Park, S. H., Sim, W. Y., Min, B. H., Yang, S. S., Khademhosseini, A., Kaplan, D. L. Chip-Based Comparison of the Osteogenesis of Human Bone Marrow- and Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells under Mechanical Stimulation. PLoS One. 7 (9), e46689 (2012).
- Gould, R. A., et al. Cyclic Strain Anisotropy Regulates Valvular Interstitial Cell Phenotype and Tissue Remodeling in 3D Culture. Acta Biomater. 8 (5), 1710-1719 (2012).
- Kurpinski, K., Chu, J., Hashi, C., Li, S. Proc Anisotropic mechanosensing by mesenchymal stemcells. Natl Acad Sci USA. 103 (44), 16095-16100 (2006).
- Sim, W. Y., Park, S. W., Park, S. H., Min, B. H., Park, S. R., Yang, S. S. A pneumatic micro cell chip for the differentiation of human mesenchymal stem cells under mechanical stimulation. Lab Chip. 7 (12), 1775-1782 (2007).
- Vader, D., Kabla, A., Weitz, D., Mahadevan, L.
- Aguado, B. A., Mulyasasmita, W., Su, J., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Improving viability of stem cells during syringe needle flow through the design of hydrogel cell carriers. Tissue Eng Part A. 18 (7-8), 806-815 (2012).
- Wan, J. Microfluidic-Based Synthesis of Hydrogel Particles for Cell Microencapsulation and Cell-Based Drug Delivery. Polymers. 4 (2), 1084-1108 (2012).
- Moraes, C., Wang, G., Sun, Y., Simmons, C. A. A microfabricated platform for high-throughput unconfined compression of micropatterned biomaterial arrays. Biomaterials. 31 (3), 577-584 (2010).
- Keung, A. J., Kumar, S., Schaffer, D. V. Presentation Counts: Microenvironmental Regulation of Stem Cells by Biophysical and Material. Cues. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 533-556 (2010).
- Segers, V. F., Lee, R. T. Stem-cell therapy for cardiac disease. Nature. 451 (7181), 937-942 (2008).
- Hsieh, H. Y., et al. Gradient static-strain stimulation in a microfluidic chip for 3D cellular alignment. Lab Chip. 14 (3), 482-493 (2014).
