Summary
Denne artikel introducerer en enkel metode til at give ikke-fortløbende gradient statisk stammer på en koncentrisk celle-belæsset hydrogel til at regulere cellejustering for vævsmanipulering.
Abstract
Kunstige vejledning for cellulære justering er et varmt emne i feltet af vævsmanipulering. De fleste af de tidligere forskning har undersøgt enkelt stamme-induceret cellulære justering på en celle-belæsset hydrogel ved hjælp af komplekse eksperimentelle processer og masse kontrol systemer, som er normalt forbundet med forurening spørgsmål. Således, i denne artikel, vi foreslår en simpel tilgang til opbygning af en gradient statisk belastning ved hjælp af en fluidic chip med en plastik PDMS dækning og en UV gennemsigtigt glas substrat for stimulering af cellulære adfærd i en 3D hydrogel. Overbelastning foto-patternable celle prepolymer i fluidic salen kan generere en konveks buede PDMS membran på forsiden. Efter UV crosslinking, gennem en koncentrisk cirkulære micropattern under den buede PDMS membran, og buffer vask, en mikromiljø for behandlende celle adfærd under en række af gradient stammer er selv etablerede i en enkelt fluidic chip, uden eksterne instrumenter. NIH3T3 celler blev påvist efter at observere ændringer i den cellulære justering tendens under geometri vejledning, i samarbejde med stamme stimulation, som varierede fra 15-65% på hydrogels. Efter en 3-dages inkubation dominerede hydrogel geometri cellejustering under lav trykstyrke stamme, hvor cellerne justeres langs hydrogel brudforlængelse retning under høj trykstyrke stamme. Mellem disse celler viste tilfældige justering som følge af spredning af den radikale ledelse af hydrogel strækforlængelse og geometri vejledning af den mønstrede hydrogel.
Introduction
Tjener som en blok materiale, der efterligner en native mikromiljø, kan en hydrogel, som indeholder ekstracellulære matrix (ECM) genetablere opbygge biomimetiske væv stilladser til støtte for cellevækst. Til at besidde funktionerne af en væv, er organiseret cellejustering en væsentlig forudsætning. Forskellige 2D (dvs. celler dyrkes på en overflade) og 3D (dvs. celler indkapslet i en hydrogel) celle alignments har opnået ved dyrkning eller indkapsle celler i eller på fleksible substrater med mikro- eller nano-mønstre1. 3D cellejustering i mikroarkitekturen er mere attraktive, da mikromiljø er tættere på den indfødte væv konstruere2,3,4. En almindelig metode til 3D cellejustering er den geometriske cue hydrogel figur2,3. På grund af den begrænsede plads til celleproliferation i kort-akse retningen, celler har til formål at bringe langs lange-akse retningen i en mikro-mønstrede hydrogel. En anden metode er at anvende trækstyrke strækning til hydrogels at opnå cellejustering parallelt med stretch retning4,5.
Biofysiske stimulation på ECM hydrogels, såsom trykstyrke stamme eller et elektrisk felt, kan regulere cellefunktioner for ordentlig væv integration, spredning og differentiering1,2,3. Megen forskning er blevet gjort for at undersøge cellulære adfærd ved at anvende én stamme tilstand ad gangen ved hjælp af flere mekaniske kontrol enheder4,6,7,8,9. For eksempel, brug af mekaniske trin motors klemt eller strakt på en 3D celle-indkapslede kollagen hydrogel har været en fælles tilgang7,10. Men sådanne kontrollerende udstyr kræver ekstra plads og står over for spørgsmålet om forurening i inkubator7,9,11,12. Derudover kan ikke det store instrument give en præcis kontrolmiljø at give høj reproducerbarhed13.
I betragtning af, at celle-laden hydrogels normalt er beskæftiget på mikro-skalaen for biomedicinske programmer, er det en fordel at kombinere MEMS teknikker for at generere en række stamme/stretch stimulation til samtidig undersøge celle adfærd i 3D biomimetiske konstruktioner in vitro-2,14,15,16,17,18. For eksempel kan bruger gas pres til at deformere PDMS membran i mikrofluid chips give anledning til forskellige stammer, køre Celledifferentiering til forskellige slægter9,16. Men der er mange tekniske udfordringer, såsom komplicerede chip fabrication processer i et rent værelse og software kontrol integration af motorer, pumper, ventiler og komprimerede gasser.
I dette arbejde viser vi en enkel tilgang for at opnå en selvbærende gradient statisk-stamme mikrofluid chip ved at ansætte en koncentrisk cirkulære hydrogel mønster og en fleksibel PDMS membran. I modsætning til de fleste af de eksisterende metoder er vores platform en transportabel og engangs miniature enhed der kan fremstilles uden for en gul stue og der besidder selv generere gradient stammer på koncentriske celle-indkapslede hydrogels, uden ydre mekanisk udstyr under inkubation. 3T3 fibroblast celle adfærd påvirkes af en kombination af hydrogel form og en bred vifte af trækstyrke stretch vejledning stikord blev påvist under observation af cellejustering i 3D ECM-mimetiske miljøer i gradient stamme chip for 3 dage.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hvis du vil sammenligne de mekaniske variationer mellem hver cirkulære hydrogel i afsluttede gradient stamme stimulation chip, målte vi stregtykkelser af hver cirkulære hydrogel i to af de samme chips, med injektionsvolumener på 0 µL (figur 4a) og 40 µL (figur 4b), henholdsvis. De procent forlængelser på hver cirkel blev beregnet ved at dividere ordentligt i de 40 µL-indsprøjtning chip med stregtykkelser af den tilsvarende hydrogels i 0 µL-indsprøjtning chip (fig. 4 c). Hydrogel er en inkompressible materiale, så den lodrette ordregivende stamme vil være svarende til den laterale brudforlængelse stamme. Derfor, de procent ordentligt i chip med 40 µL Injektionsvolumen Vis 15-65% strækforlængelse, som kan konverteres til den trykstyrke stamme (Se supplerende fil 1).
Fluorescerende farvning af cellekerner og F-actin med DAPI og phalloidin, henholdsvis, blev gjort for at analysere den cellulære justering. DAPI farvning leverede data om nukleare orientering, og phalloidin farvning blev anvendt til at vurdere celle spredning. Figur 5a -c viser cellejustering i gradient stamme chip. I linje 1 linje 3T3 celler langs den radialt. I hydrogel 7, cellerne justeres efter tilfældigt, og cellerne justeres langs den cirkulære retning på linje 12. I overensstemmelse med fluorescerende farvning billeder, blev en 90 ° Skift fra vinklen af cellejustering 3T3 celler i linje 1 (maksimal hydrogel brudforlængelse i radial retning) justering vinklen af cellerne med long-akse justering i linie 12 (laveste hydrogel brudforlængelse i radial retning) opdaget.
I tidligere forskning2,9, celler i 200 µm linje-mønstrede hydrogels sigter mod at tilpasse langs lange-akse retningen af hydrogel. Dog i denne undersøgelse konstaterede vi, at den aflange strækning på 200 µm hydrogels i kort-akse retningen forudsat en anden faktor til at påvirke og dominere den cellulære justering af kontrollerende procentdel af belastningen på hydrogel. For 65% belastning af linje 1 beviste den radikale justering, strækforlængelse strækning af hydrogel dominerer cellejustering. For 15% pres på linje 12 viste den cirkulære justering, den lange akse effekt domineret cellejustering. For 40% belastning af hydrogel 7, cellerne tilpasset tilfældigt på grund af neutralisering af geometri vejledning og stamme effekt.
Figur 1 . PMMA mor støbeform til PDMS ark og Plug fabrikation. (a) de adskilte komponenter af PMMA mug, herunder en bundplade, grænse indramme og flow kanal. Efter samling med dobbeltklæbende tape, er (b) PMMA mor støbeform til arket flow dannet. (c) en anden PMMA mug er samlet for at PDMS stik. Den røde tal repræsenterer dybden. (enhed: mm) Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Plast Photomask Design for celle-belæsset Hydrogel Micropattern. Der er to åbninger med trekant figurer (2 mm på bundlinjen og 6.5 mm i højden) tilslutning til flow-kanaler til at levere friske cellekulturmedium. (a) den plast photomask er mærket med dimensionen. Den koncentriske cirkel er 400 nm og normeret maksimalydelse er 50%. Diameteren af midtercirklen er 2 mm. (b) photomask layout uden etiketter til laserprinter på et gennemsigtigt plastfolie. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Fabrication processer farveforløbets stamme celle-belæsset Hydrogel langs den radiale retning i en PDMS Fluidic Chip. (a) en plastik photomask er justeret og fast under chippen med en TMSPMA-belagt fluidic kanal. En mikro-sprøjte med prepolymer celle løsning er indsat i indfaldende for chippen og bruges til at injicere omkring 50 µL for at fylde flow-kanal. (b) outlet i flow-kanal lukkes med PDMS plug og en yderligere 40 µL af prepolymer celle løsning sprøjtes. Glas bund er UV-mønstret for 30 s til at fabrikere den koncentriske cirkulære hydrogel i flow-chippen. (c) den flydende pres er udgivet i flow-kanal ved at frakoble outlet og FN-crosslinking blandingen er vasket ud med DPBS. (d) en chip med statisk gradient stamme gælder koncentriske celle-laden hydrogels, der er klar til celle dyrkning. Under UV crosslinking proces, er (e) en ikke-fortløbende gradienten højden af hydrogel langs radius dannet. f efter frakoble outlet, PDMS membranen bliver flad og gælder gradient stress på den celle-indkapslede hydrogels. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Ren Hydrogel brudforlængelse Gradient. Brudforlængelse linjebredden og procentdel af ren hydrogel uden celle indkapsling i farveforløbet stamme chip på dag 3 med det (en) 0-µL (kontrolgruppen) og (b) 40 µL injektionsvolumener. (c) brudforlængelse procenten beregnes ved at dividere værdien af line bredde forskellen mellem 40 µL og 0 µL af stregbredden for 40 µL. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 . Fluorescerende Actin-kernen pletten billeder af 3T3 celler indkapslet i den Gradient Chips på dag 3. Celle justering retning i (a-c) linje 1, (d-f) linje 7 og (g-i) linje 12 afsløre radial justering, tilfældige justering og cirkulær justering, henholdsvis. De grønne og blå farver viser de actin og kerne pletter, henholdsvis. Den stiplede hvid linje repræsenterer grænsen for hydrogel. Skalalinjen: 200 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 1. Beregning af kuppelformet PDMS krumning. H: den konvekse PDMS kurve; H0: den maksimale højdeforskellen mellem PDMS dome før og efter deformation; r: radiussen af kuplen; V: den overdrevne Injektionsvolumen i regionen blå, som forårsager PDMS deformation som en kuppel. Se supplerende fil 1 for detaljer. Venligst klik her for at downloade denne figur.
Supplerende fil 1. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette papir rapport vi om en enkel metode til at sammenligne celle justering adfærd efter hydrogel figur vejledning og trækstyrke strækning. En fleksibel PDMS membran skaber en dome-formet krumning til at generere forskellige højder af koncentriske cirkulære hydrogels. Efter at slippe trykket, gælder PDMS membran automatisk kraft til den mikro-mønstrede hydrogels at danne gradient stamme/strækforlængelse, med et maksimum i midten og et minimum ved den ydre grænse. Som dannelsen af den gradient stamme er designet af den fleksible PDMS membran og håndtering af det fluidic chip, der er flere vigtige parametre, der skal være deltog til: (i) præcis kontrol af tykkelsen af PDMS membran er afgørende for at justere værdien gradient stamme. Hvis membranen er for tyk, vil selv maksimalt Injektionsvolumen af celle prepolymer ikke kunne generere en ordentlig konvekst kurve i PDMS membran for crosslinking celle-laden hydrogels gradient højde. I modsætning hertil er kan ikke en alt for tynd PDMS membran anvendes tilstrækkelig kraft hydrogels. Kontroller, at vægten af uhærdet PDMS i PDMS dække mug er omkring 1,6-2,0 g pr. chip. (ii) forurening forebyggelse er meget vigtigt under bitmapgenkendelse håndtering af den celle-belæsset hydrogel i fluidic chip. Før celle dyrkning i rugemaskinen, grundigt vaske med steriliseret PBS i fluidic kanal og bruger 75% kan ethanol til at tørre overfladen af chippen bidrage til at undgå forurening problem. III koncentration af photoinitiator og dosering af UV-eksponering skal passe kontrolleret og i rækken af ~0.1% - 2% (0,5% anbefales). Over-crosslinking af hydrogel og overdosis UV-bestråling vil resultere i lav celle levedygtighed. (iv) linjebredden af den mønstrede hydrogel bør ikke være for stor. Ellers, næringsstof bruttokompensationsgraden i den tykke hydrogels vil ikke kunne støtte celledelingen. Normalt er anbefales mindre end 300 µm. Afstanden mellem to hydrogel kredse kan varieres, og en 50% intermittens anbefales. (v) mens vask eller opfyldning flow-kanal med løsning, bør dannelsen af boblerne undgås. Forsigtigt pipettering løsning i chippen kan bidrage til at fjerne boblerne.
Begrebet gradient stamme genereret af PDMS-deforme krumning kan opgraderes yderligere at anvende dynamisk gradient stammer og kan integreres med biokemiske stimulation, som kan gavne mange undersøgelser af funktionel væv revitalisering. Modulet simpel fluidic injektion med et PDMS stik kan erstattes af enhver avanceret fluidic system til udvidet eksperimentelle kontrol. PMMA mug kan også erstattes af en microfabricated SU-8 skimmel eller en bulk-ætset silicium skimmel.
Denne gradient stamme chip med en cirkulær celle-belæsset hydrogel kan generere statisk trykstyrke kraft på den 3D hydrogel uden eksterne mekaniske eller elektriske maskiner. Derfor, det giver en hurtig screening platform for undersøger celle adfærd i en serie af stamme betingelser, uden risiko for kontamination problemer forårsaget af driften af eksterne maskiner. Tid-kontrollerede stamme stimulation er imidlertid ikke kan opnås, fordi PDMS membran genererer stammer indtil nedbrydningen af hydrogel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette projekt blev støttet af den Graduate studerende undersøgelse i udlandet Program (NSC-101-2917-I-007-010); Programmet Biomedicinsk teknik (NSC-101-2221-E-007-032-MY3); og nanoteknologi nationale Program (NSC-101-2120-M-007-001-), National Science Council af R.O.C., Taiwan. Forfatterne vil gerne takke professor Ali Khademhosseini, Gulden Camci-Unal, Arghya Paul og Ronglih Liao på Harvard Medical School for at dele den hydrogel og celle indkapsling teknologi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL black microcentrifuge tube | Argos Technologies | 03-391-161 | This one can be replaced with a neutral color of 1.5 mL tube covered with aluminun foil |
| 10x DPBS | Sigma-Aldrich | 56064C | |
| Alexa Fluor 488 phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| BSA | Sigma | A1595 | |
| Calcein | Molecular Probe | C1430 | For labeling viable cells |
| CCD | PCO. Imaging | Pixelfly qe | |
| Cell membrane permeating solution | Sigma-Aldrich | X100 | 0.5% Triton X-100 for permeating cell membrane |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | Cell nucleus staining |
| Dialysis membrane | Sigma-Aldrich | D9527 | Molecular weight cut-off = 14,000 |
| DMEM | Gibco | 11995-065 | |
| Double-side tape | 3M | 8003 | |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G2500 | gel strength 300, type A, from porcine skin |
| High frequency electronic corona generator | Electro-technic products | MODEL BD-20 | |
| Methacrylic Anhydride | Sigma-Aldrich | 276685 | |
| Micro syringe | Hamilton | 80501 | 50 μL |
| Microscope | Olympus | IX71 | Include two filter sets: LF405/LP-B-000 and LF488/LP-C-000 from Semrock |
| Oxygen plasma machine | Harrick plasma | PDC-001 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | For fixing cell |
| PDMS | DOW CORNING | Sylgard 184 | Mixture for PDMS chip cast-molding fabrication |
| Pen-Strep | Gibco | 10378-016 | penicillin/streptomycin |
| Photoinitiator | CIBA | Irgacure 2959 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | For labeling dead cells |
| Sterile Filtration cup | Millipore | SCGPT05RE | |
| TMSPMA | Sigma-Aldrich | 440159 | For hydrogel immobilization |
| Ultrasonicator | Delta | D150H | 150W, 43kHz |
| UV light | DAIHAN | WUV-L10 | |
| Freeze Dryer | FIRSTEK | 150311025 | |
| NIH3T3(fibroblast) | Food Industry Research and Development Institute(FIRDI) | 08C0011 | |
| MOXI Z Mini Automated Cell Counter | ORFLO | MXZ001 |
References
- Simmons, C. S., Petzold, B. C., Pruitt, B. L. Microsystems for biomimetic stimulation of cardiac cells. Lab Chip. 12 (18), 3235-3248 (2012).
- Aubin, H., et al. Directed 3D cell alignment and elongation in microengineered hydrogels. Biomaterials. 31 (27), 6941-6951 (2010).
- Guan, J., et al. The stimulation of the cardiac differentiation of mesenchymal stem cells in tissue constructs that mimic myocardium structure and biomechanics. Biomaterials. 32 (24), 5568-5580 (2011).
- Wan, C. R., Chung, S., Kamm, R. D. Differentiation of embryonic stem cells into cardiomyocytes in a compliant microfluidic system. Ann Biomed Eng. 39 (6), 1840-1847 (2011).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Li, X., Chu, J. S., Yang, L., Li, S. Anisotropic effects of mechanical strain on neural crest stem cells. Ann. Biomed. Eng. 40 (3), 598-605 (2012).
- Butcher, J. T., Barrett, B. C., Nerem, R. M. Equibiaxial strain stimulates fibroblastic phenotype shift in smooth muscle cells in an engineered tissue model of the aortic wall. Biomaterials. 27 (30), 5252-5258 (2006).
- Ramon-Azcon, J., et al. Gelatin methacrylate as a promising hydrogel for 3D microscale organization and proliferation of dielectrophoretically patterned cells. Lab Chip. 12 (16), 2959-2969 (2012).
- Park, S. H., Sim, W. Y., Min, B. H., Yang, S. S., Khademhosseini, A., Kaplan, D. L. Chip-Based Comparison of the Osteogenesis of Human Bone Marrow- and Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells under Mechanical Stimulation. PLoS One. 7 (9), e46689 (2012).
- Gould, R. A., et al. Cyclic Strain Anisotropy Regulates Valvular Interstitial Cell Phenotype and Tissue Remodeling in 3D Culture. Acta Biomater. 8 (5), 1710-1719 (2012).
- Kurpinski, K., Chu, J., Hashi, C., Li, S. Proc Anisotropic mechanosensing by mesenchymal stemcells. Natl Acad Sci USA. 103 (44), 16095-16100 (2006).
- Sim, W. Y., Park, S. W., Park, S. H., Min, B. H., Park, S. R., Yang, S. S. A pneumatic micro cell chip for the differentiation of human mesenchymal stem cells under mechanical stimulation. Lab Chip. 7 (12), 1775-1782 (2007).
- Vader, D., Kabla, A., Weitz, D., Mahadevan, L.
- Aguado, B. A., Mulyasasmita, W., Su, J., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Improving viability of stem cells during syringe needle flow through the design of hydrogel cell carriers. Tissue Eng Part A. 18 (7-8), 806-815 (2012).
- Wan, J. Microfluidic-Based Synthesis of Hydrogel Particles for Cell Microencapsulation and Cell-Based Drug Delivery. Polymers. 4 (2), 1084-1108 (2012).
- Moraes, C., Wang, G., Sun, Y., Simmons, C. A. A microfabricated platform for high-throughput unconfined compression of micropatterned biomaterial arrays. Biomaterials. 31 (3), 577-584 (2010).
- Keung, A. J., Kumar, S., Schaffer, D. V. Presentation Counts: Microenvironmental Regulation of Stem Cells by Biophysical and Material. Cues. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 533-556 (2010).
- Segers, V. F., Lee, R. T. Stem-cell therapy for cardiac disease. Nature. 451 (7181), 937-942 (2008).
- Hsieh, H. Y., et al. Gradient static-strain stimulation in a microfluidic chip for 3D cellular alignment. Lab Chip. 14 (3), 482-493 (2014).
