Summary
Den här artikeln presenteras en enkel metod att tillhandahålla icke-kontinuerlig gradient statiska stammar på en koncentrisk cell-lastad hydrogel att reglera celljustering för vävnadsteknik.
Abstract
Konstgjorda vägledning för cellulär anpassning är ett hett ämne i fältet av vävnadsteknik. De flesta av tidigare forskning har undersökt enda stam-inducerad cellulära justering på en cell-lastad hydrogel med hjälp av komplexa experimentella processer och massa styrning av system, som är vanligtvis förknippas med föroreningar problem. Således i denna artikel föreslår vi en enkel strategi för att bygga en gradient statiska stam med en fluidic chip med en plastkåpa PDMS och UV genomskinligt glassubstrat för stimulering av cellulära beteende i en 3D hydrogel. Överbelastning foto-patternable cell prepolymer i fluidic kammaren kan generera ett konvext krökt PDMS membran på omslaget. Efter UV crosslinking, genom en koncentriska cirkulära micropattern under böjda PDMS membran och buffert tvättmaskin, en mikromiljö för utredande cell beteenden under en mängd gradient stammar är själv etablerade i en enda fluidic chip, utan externa instrument. NIH3T3 celler visades efter att observera förändringar i cellulära justering trenden under geometri vägledning, i samarbete med stam stimulering, som varierade från 15-65% på hydrogels. Efter en 3-dagars inkubation dominerade hydrogel geometri celljusteringen under låg tryckhållfasthet stam, där cellerna justerade längs hydrogel töjning riktning under hög tryckhållfasthet stam. Mellan dessa, cellerna visade slumpmässiga justering på grund av försvinnande av radikala ledning av hydrogel töjning och geometri vägledningen av de mönstrade hydrogel.
Introduction
Tjänstgjort som ett block material som efterliknar en native mikromiljö, kan en hydrogel som innehåller extracellulär matrix (ECM) återuppbygga biomimetiska vävnad ställningar för att stödja celltillväxt. Om du vill ha funktionerna i en vävnad, är organiserade celljusteringen ett viktigt krav. Olika 2D (dvs celler som odlas på en yta) och 3D (dvs celler som kapslas in i en hydrogel) celljusteringar har uppnåtts genom odling eller kapsla in celler i eller på flexibla underlag med mikro- eller nano-mönster1. 3D celljusteringen i mikroarkitekturen är mer attraktiva, eftersom närmiljön är närmare till infödda vävnad konstruera2,3,4. En gemensam strategi för 3D celljustering är den geometriska cue hydrogel form2,3. På grund av det begränsa utrymmet för cellproliferation i kort-axis riktning syftar celler till att anpassa längs long-axis riktning i en mikro-mönstrad hydrogel. En annan metod är att tillämpa draghållfasthet stretch på den hydrogeler att uppnå celljustering parallell till stretch riktning4,5.
Biofysiska stimulering på ECM hydrogels, såsom tryckkraft stam eller ett elektriskt fält, kan reglera cellfunktioner för korrekt vävnad integration, proliferation och differentiering1,2,3. Mycket forskning har gjorts för att undersöka cellulära beteende genom att tillämpa en stam skick i taget med flera mekaniska kontroll enheter4,6,7,8,9. Exempelvis användning av mekaniska steg motorer inklämd eller utsträckt på en 3D cell-inkapslat kollagen hydrogel har varit en gemensam närma sig7,10. Dock sådan kontrollerande utrustning kräver extra utrymme och står inför frågan om kontaminering i inkubatorn7,9,11,12. Dessutom kan inte det stora instrumentet ge en exakt kontrollmiljö att tillhandahålla hög reproducerbarhet13.
Med tanke på att cell-lastad hydrogeler är oftast anställda på mikro-skalan för biomedicinska tillämpningar, är det fördelaktigt att kombinera MEMS tekniker för att generera en rad stam/stretch stimulering samtidigt undersöka cell beteenden i 3D biomimetiska konstruktioner in vitro-2,14,15,16,17,18. Exempelvis kan använder gastryck för att deformera PDMS membranet i ultrakalla marker ge upphov till olika stammar, körning celldifferentiering till olika härstamningar9,16. Dock finns det många tekniska utmaningar, såsom komplicerade chip fabrication processer i ett rent rum och programvara kontroll integrationen av motorer, pumpar, ventiler och komprimerade gaser.
I detta arbete visar vi ett enkelt tillvägagångssätt för att erhålla ett självbärande gradient static-stam mikroflödessystem chip genom att anställa en koncentriska cirkulära hydrogel-mönster och en flexibel PDMS-membran. Till skillnad från de flesta av de befintliga metoderna är vår plattform en bärbar och disponibel miniatyr-enhet som kan fabriceras utanför ett gult rum och som äger själv genererar gradient stammar på koncentriska cell-inkapslat hydrogels, utan yttre mekanisk utrustning under ruvningen. 3T3 fibroblast cell beteenden påverkas av en kombination av hydrogel form och en mängd draghållfasthet stretch vägledning cues påvisades under observationen av celljustering inom 3D ECM-mimetiska miljöer i gradient stam chip i 3 dagar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att jämföra mekaniska variationerna mellan varje cirkulär hydrogel i avslutade gradient stam stimulering chip, mätte vi linje bredden av varje cirkulär hydrogel i två av samma marker, med injektionsvolymer på 0 µL (figur 4a) och 40 µL (figur 4b), respektive. De procent elongationer på varje cirkel har beräknats genom att dividera elongationer i 40 µL-injicerade chip med linje bredden av den motsvarande hydrogels i 0 µL-injiceras chipet (figur 4 c). Hydrogel är en inkompressibel material, så den vertikala upphandlande stammen kommer att vara likvärdig den laterala töjning stam. Därför de procent elongationer i chip med 40-µL injektionsvolymen Visa 15-65% töjning, som kan konverteras till tryckkraft stam (se kompletterande fil 1).
Fluorescerande färgning av cellkärnor och F-aktin med DAPI och phalloidin, respektive, gjordes för att analysera cellulär anpassning. DAPI färgningen tillhandahöll data om nukleära orientering och phalloidin färgningen tillämpades för att bedöma cell spridning. Figur 5a -c visar celljusteringen i gradient stam chip. I linje 1 justerad 3T3 cellerna längs radiella riktning. Cellerna i linje slumpmässigt hydrogel 7, och celler i linje längs cirkulära riktning i linje 12. I enlighet med den fluorescerande färgning bilder, upptäcktes en 90 ° förskjutning från vinkeln på celljustering 3T3 celler i rad 1 (max hydrogel töjning i radiell riktning) till justering vinkel av cellerna med lång-axis justering i linje 12 (lägsta hydrogel töjning i radiell riktning).
I tidigare forskning2,9, celler i 200 µm linje-mönstrad hydrogels syftar till att anpassa längs long-axis riktning av hydrogel. I denna studie konstaterade vi dock att långsträckt sträcka på de 200 µm hydrogels i kort-axis riktning som en annan faktor för att påverka och dominera cellulär anpassning genom att kontrollera procentandelen av belastningen på hydrogel. För 65% stam på linje 1 visade radikala justering att sträckan töjning av hydrogel dominerar celljusteringen. För 15% stam på linje 12 visade cirkulär justeringen att lång-axel effekten dominerade celljusteringen. För 40% stam på hydrogel 7 justerad cellerna slumpmässigt på grund av neutralizationen av geometri vägledning och stam effekten.
Figur 1 . PMMA mor mögel för PDMS ark och Plug Fabrication. (a) separerade komponenter av PMMA mögel, inklusive en bottenplatta, gränsen ram, och flöde kanal. Efter montering med dubbelhäftande tejp bildas (b) PMMA mor mögel för flöde arket. (c) en annan PMMA mögel är sammansatta till PDMS plugg. Röda siffran visar djupet. (enhet: mm) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Plast photomasken Design för den Cell-lastad Hydrogel-Micropattern. Det finns två öppningar med triangel former (2 mm på den nedersta raden och 6,5 mm i höjd) ansluta till flöde kanaler att leverera färska cellodlingsmedium. (a) den plast fotomask är märkt med dimensionen. Perioden av koncentriska cirklar är 400 nm och intermittensen är 50%. Diametern på mittcirkeln är 2 mm. (b) photomasken layouten, utan etiketter för laserutskrift på en transparent plastfilm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Tillverkning processer övertoningens stam Cell-lastad Hydrogel längs radiella riktning i ett PDMS Fluidic Chip. (a) en plast photomasken riktas och fastnat under chip med en TMSPMA-belagda fluidic kanal. En mikro-spruta med prepolymer cell lösning sätts in inloppet av chip och används för att injicera omkring 50 µL för att fylla kanalen flöde. (b) flöde kanalen utlopp är stängd med PDMS plugg och en ytterligare 40 µL av prepolymer cell lösning injiceras. Glas botten är UV-mönstrad för 30 s att fabricera den koncentriska cirkulära hydrogel i flödet chip. (c) flytande trycket släpps i kanalen flöde genom att koppla ur uttaget och FN-crosslinking blandningen spolas ut med DPBS. (d) ett chip med statiska lutningen stam gäller koncentriska cell-lastad hydrogels som är redo för cell odling. Under processen UV crosslinking bildas (e) en icke-kontinuerlig gradient höjd av hydrogel längs radien. (f) efter att koppla ur uttaget, PDMS membranet blir platt och gäller gradient stress på det cell-inkapslat hydrogels. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Ren Hydrogel töjning övertoningen. De töjning linjebredd och andelen ren hydrogel utan cell inkapsling i övertoningen stam chip på dag 3 med den (a) 0-µL (kontrollgrupp) och (b) 40-µL injektionsvolymer. (c) töjning procentsatsen beräknas genom att dividera värdet av linje bredd skillnaden mellan 40 µL och 0 µL med linjebredd 40 µL. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 5 . Fluorescerande aktin-nucleus fläck bilder av den 3T3 celler inkapslade i Gradient marker på dag 3. Cell anpassning riktning i (a-c) linje 1, (d-f) linje 7 och (g-i) linje 12 avslöja radiell justering, slumpmässiga justering och cirkulär justering, respektive. De gröna och blå färgerna Visa aktin och nucleus fläckar, respektive. Den streckade vita linjen representerar gränsen av hydrogel. Skalstapeln: 200 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Kompletterande bild 1. Beräkning av kupolformad PDMS krökning. H: konvex PDMS kurvan; H0: högsta höjdskillnaden mellan PDMS kupolen före och efter deformation; r: radien av kupolen; V: den över injektionsvolymen av regionen blå, som orsakar PDMS deformation som en kupol. Se kompletterande fil 1 för detaljer. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Kompletterande fil 1. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta papper rapporterar vi på ett enkelt sätt att jämföra cell anpassning beteende efter hydrogel form vägledning och draghållfasthet stretch. En flexibel PDMS-membranet skapar en kupolformad krökning för att generera olika höjder av koncentriska cirkulära hydrogels. Efter att släppa trycket, gäller PDMS membranet automatiskt kraft den mikro-mönstrad hydrogeler att bilda gradient stam/töjning, med maximalt på center och minst vid den yttre gränsen. Som bildandet av gradient stammen är designat av den flexibla PDMS-membranen och hanteringen av fluidic chip, finns det flera viktiga parametrar som bör åtgärdas: (i) exakt kontroll av tjockleken av PDMS membranet är avgörande för att justera lutningen stam värdet. Om membranet är för tjock, kommer även den maximal injektionsvolymen av cell prepolymer inte att kunna generera en korrekt konvex kurva i PDMS membran för crosslinking en gradient höjd av cell-lastad hydrogels. Däremot gäller inte ett alltför tunna PDMS membran tillräcklig kraft för hydrogels. Kontrollera att ohärdat PDMS i PDMS täcka formen väger omkring 1,6-2,0 gram per chip. (ii) kontaminering förebyggande är mycket viktigt under crosslink hanteringen av den cell-lastad hydrogel i fluidic chip. Innan cellen odling i inkubatorn, noggrant tvättas med steriliserad PBS i fluidic kanalen och använder 75% kan etanol att torka av chip hjälpa för att undvika kontamination problemet. (iii) koncentrationen av photoinitiator och doseringen av UV-exponering bör vara försiktig kontrollerade och i spänna av ~0.1% - 2% (0,5% rekommenderas). Över-crosslinking hydrogel och överdosering av UV-bestrålning resulterar i låg cellernas viabilitet. (iv) line-bredden på den mönstrade hydrogel bör inte vara alltför stor. Den näringsrika ersättningsnivån i den tjocka hydrogels kommer annars inte att kunna stödja cellproliferation. Vanligtvis är rekommenderas mindre än 300 µm. Avståndet mellan två hydrogel cirklar kan varieras och intermittensfaktor 50% rekommenderas. (v) samtidigt tvätta eller påfyllning flöde kanalen med lösning, bör bildandet av bubblor undvikas. Försiktigt pipettering lösningen i chipet kan hjälpa att ta bort bubblor.
Begreppet gradient stam genereras av PDMS-deformerade krökning kan uppgraderas ytterligare att tillämpa dynamisk gradient stammar och kan integreras med biokemiska stimulering, vilket kan gynna många studier på funktionella vävnadsregeneration. Modulen enkel fluidic injektion med en PDMS-kontakt kan ersättas med något avancerat fluidic system för utökad experimentell kontroll. PMMA mögel kan också ersättas med en biochips SU-8 mögel eller en bulk-etsade silikon mögel.
Denna gradient stam chip med en cirkulär cell-lastad hydrogel kan generera statiska tryckkraft på den 3D hydrogel utan externa mekaniska eller elektriska maskiner. Därför ger det en snabb screening plattform för att utreda cell beteenden i en serie av stam villkor, utan risk för kontaminering problem som orsakas av driften av externa maskiner. Tidsstyrda stam stimulering är dock inte möjligt eftersom PDMS membranet genererar stammar fram till nedbrytningen av hydrogel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Projektet stöddes av Graduate Student studie utomlands Program (NSC-101-2917-I-007-010); Biomedical Engineering programmet (NSC-101-2221-E-007-032-MY3); och nanoteknik nationella programmet (NSC-101-2120-M-007-001-), National Science Council av R.O.C., Taiwan. Författarna vill tacka Prof. Ali Khademhosseini, Gulden Camci-Unal, Arghya Paul och Ronglih Liao vid Harvard Medical School för att dela den hydrogel och cell inkapslingsteknik.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL black microcentrifuge tube | Argos Technologies | 03-391-161 | This one can be replaced with a neutral color of 1.5 mL tube covered with aluminun foil |
| 10x DPBS | Sigma-Aldrich | 56064C | |
| Alexa Fluor 488 phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| BSA | Sigma | A1595 | |
| Calcein | Molecular Probe | C1430 | For labeling viable cells |
| CCD | PCO. Imaging | Pixelfly qe | |
| Cell membrane permeating solution | Sigma-Aldrich | X100 | 0.5% Triton X-100 for permeating cell membrane |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | Cell nucleus staining |
| Dialysis membrane | Sigma-Aldrich | D9527 | Molecular weight cut-off = 14,000 |
| DMEM | Gibco | 11995-065 | |
| Double-side tape | 3M | 8003 | |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G2500 | gel strength 300, type A, from porcine skin |
| High frequency electronic corona generator | Electro-technic products | MODEL BD-20 | |
| Methacrylic Anhydride | Sigma-Aldrich | 276685 | |
| Micro syringe | Hamilton | 80501 | 50 μL |
| Microscope | Olympus | IX71 | Include two filter sets: LF405/LP-B-000 and LF488/LP-C-000 from Semrock |
| Oxygen plasma machine | Harrick plasma | PDC-001 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | For fixing cell |
| PDMS | DOW CORNING | Sylgard 184 | Mixture for PDMS chip cast-molding fabrication |
| Pen-Strep | Gibco | 10378-016 | penicillin/streptomycin |
| Photoinitiator | CIBA | Irgacure 2959 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | For labeling dead cells |
| Sterile Filtration cup | Millipore | SCGPT05RE | |
| TMSPMA | Sigma-Aldrich | 440159 | For hydrogel immobilization |
| Ultrasonicator | Delta | D150H | 150W, 43kHz |
| UV light | DAIHAN | WUV-L10 | |
| Freeze Dryer | FIRSTEK | 150311025 | |
| NIH3T3(fibroblast) | Food Industry Research and Development Institute(FIRDI) | 08C0011 | |
| MOXI Z Mini Automated Cell Counter | ORFLO | MXZ001 |
References
- Simmons, C. S., Petzold, B. C., Pruitt, B. L. Microsystems for biomimetic stimulation of cardiac cells. Lab Chip. 12 (18), 3235-3248 (2012).
- Aubin, H., et al. Directed 3D cell alignment and elongation in microengineered hydrogels. Biomaterials. 31 (27), 6941-6951 (2010).
- Guan, J., et al. The stimulation of the cardiac differentiation of mesenchymal stem cells in tissue constructs that mimic myocardium structure and biomechanics. Biomaterials. 32 (24), 5568-5580 (2011).
- Wan, C. R., Chung, S., Kamm, R. D. Differentiation of embryonic stem cells into cardiomyocytes in a compliant microfluidic system. Ann Biomed Eng. 39 (6), 1840-1847 (2011).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Li, X., Chu, J. S., Yang, L., Li, S. Anisotropic effects of mechanical strain on neural crest stem cells. Ann. Biomed. Eng. 40 (3), 598-605 (2012).
- Butcher, J. T., Barrett, B. C., Nerem, R. M. Equibiaxial strain stimulates fibroblastic phenotype shift in smooth muscle cells in an engineered tissue model of the aortic wall. Biomaterials. 27 (30), 5252-5258 (2006).
- Ramon-Azcon, J., et al. Gelatin methacrylate as a promising hydrogel for 3D microscale organization and proliferation of dielectrophoretically patterned cells. Lab Chip. 12 (16), 2959-2969 (2012).
- Park, S. H., Sim, W. Y., Min, B. H., Yang, S. S., Khademhosseini, A., Kaplan, D. L. Chip-Based Comparison of the Osteogenesis of Human Bone Marrow- and Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells under Mechanical Stimulation. PLoS One. 7 (9), e46689 (2012).
- Gould, R. A., et al. Cyclic Strain Anisotropy Regulates Valvular Interstitial Cell Phenotype and Tissue Remodeling in 3D Culture. Acta Biomater. 8 (5), 1710-1719 (2012).
- Kurpinski, K., Chu, J., Hashi, C., Li, S. Proc Anisotropic mechanosensing by mesenchymal stemcells. Natl Acad Sci USA. 103 (44), 16095-16100 (2006).
- Sim, W. Y., Park, S. W., Park, S. H., Min, B. H., Park, S. R., Yang, S. S. A pneumatic micro cell chip for the differentiation of human mesenchymal stem cells under mechanical stimulation. Lab Chip. 7 (12), 1775-1782 (2007).
- Vader, D., Kabla, A., Weitz, D., Mahadevan, L.
- Aguado, B. A., Mulyasasmita, W., Su, J., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Improving viability of stem cells during syringe needle flow through the design of hydrogel cell carriers. Tissue Eng Part A. 18 (7-8), 806-815 (2012).
- Wan, J. Microfluidic-Based Synthesis of Hydrogel Particles for Cell Microencapsulation and Cell-Based Drug Delivery. Polymers. 4 (2), 1084-1108 (2012).
- Moraes, C., Wang, G., Sun, Y., Simmons, C. A. A microfabricated platform for high-throughput unconfined compression of micropatterned biomaterial arrays. Biomaterials. 31 (3), 577-584 (2010).
- Keung, A. J., Kumar, S., Schaffer, D. V. Presentation Counts: Microenvironmental Regulation of Stem Cells by Biophysical and Material. Cues. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 533-556 (2010).
- Segers, V. F., Lee, R. T. Stem-cell therapy for cardiac disease. Nature. 451 (7181), 937-942 (2008).
- Hsieh, H. Y., et al. Gradient static-strain stimulation in a microfluidic chip for 3D cellular alignment. Lab Chip. 14 (3), 482-493 (2014).
