Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

كامل خلية التصحيح المشبك تسجيلات لتحديد الكهربية من أيون الانتقائية في تشانلرودوبسينز

Published: May 22, 2017 doi: 10.3791/55497
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Experimental Biophysics, Institute of Biology, Humboldt-Universität zu Berlin
* These authors contributed equally

Abstract

على مدى العقد الماضي، أصبح تشانلرودوبسينز لا غنى عنه في البحوث علم الأعصاب حيث أنها تستخدم كأدوات للتلاعب غير الغازية العمليات الكهربائية في الخلايا المستهدفة. في هذا السياق، الانتقائية أيون من تشانلرودوبسين هي ذات أهمية خاصة. توضح هذه المقالة التحقيق في انتقائية الكلوريد ل أنيون-كونفيغنينغ تشانلرودوبسين من بروتيموناس سولكاتا عن طريق التسجيلات الكهربية التصحيح المشبك على خلايا HEK293. الإجراء التجريبي لقياس فوتوكرنتس بوابات الخفيفة يتطلب سريع للتحويل - أحادية اللون مثالي - مصدر الضوء إلى جانب المجهر من الإعداد على خلاف ذلك التصحيح المشبك التقليدي. يتم توضيح الإجراءات التحضيرية قبل التجربة التي تنطوي على إعداد حلول مخزنة، والاعتبارات على إمكانيات تقاطع السائل، والبذر وترنسفكأيشن من الخلايا، وسحب ماصات التصحيح. التسجيل الفعلي للعلاقة الجهد الحاليثانية لتحديد إمكانات انعكاس لمختلف تركيزات الكلوريد يأخذ مكان 24 ساعة إلى 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن. وأخيرا، يتم تحليل البيانات الكهربية فيما يتعلق الاعتبارات النظرية من توصيل الكلوريد.

Introduction

تشانلرودوبسينز (شر) هي قنوات ايون ضوء بوابات التي تحدث في بقعة العين من الطحالب الخضراء المتحركة، وتكون بمثابة أجهزة الاستشعار الضوئية الأولية للالاستشعار والردود الرهابية 1 . منذ وصفها الأول في عام 2002 2 ، شرس مهدت الطريق لمجال الناشئة من علم الوراثة الضوئية ويمكن تطبيقها في مجموعة متنوعة من الخلايا المنفعلة على سبيل المثال داخل العضلات والهيكل العظمي، والقلب، أو الدماغ 3 ، 4 ، 5 . التعبير عن شرس في الخلايا المستهدفة النتائج في نفاذية أيون الضوء يمكن السيطرة عليها من الخلية المعنية. في سياق الخلايا العصبية، وهذا يسمح تفعيل 6 ، 7 ، 8 أو تثبيط 9 ، 10 من العمل المحتملة (أب) إطلاق - اعتمادا على أيون أجريت - مع المكانية والزمانيةدقة الضوء التي تؤكد كيفية انتقائية أيون من البديل شر يحدد تطبيق أوبتوجينيتيك لها.

وقد اكتشفت أول شرس من كلاميدوموناس راينهاردتي وفولفوكس كارتيري نفاذية للبروتونات، ولكن أيضا إلى الكاتيونات أحادي التكافؤ مثل الصوديوم والبوتاسيوم، وبدرجة أقل إلى الكاتيونات ثنائي التكافؤ مثل الكالسيوم والمغنيسيوم 11 ، 12 ، 13 . اليوم، أكثر من 70 الموجبة الطبيعية الموجبة تشانلرودودبسينز (سرس) 14 و 15 و 16 و 17 والعديد من المتغيرات المهندسة 18 و 19 و 20 مع خصائص مختلفة مثل حجم فوتوكرنت، حساسية الطيفية، حركية، الانتقائية الموجبة المتاحة. بينما في علم الأعصاب، سرس أإعادة استخدامها لتنشيط الخلايا وإطلاق أبس، كانت المضخات الميكروبية مدفوعة ضوء المضادات المتاحة فقط لإسكات الخلايا العصبية لسنوات. في عام 2014، أظهرت مجموعتان في وقت واحد أن سرس يمكن تحويلها إلى أنيون-ترانزلاتيوندودوبسينز (أكرس) عن طريق تغيير القطبية على طول المسود أيون إجراء المسام عن طريق الهندسة الجزيئية 9 ، 21 . وفي وقت لاحق، تم تحديد أكر الطبيعية في العديد من الطحالب كريبتوفيت 22 ، 23 ، 24 . الأهم من ذلك، تفعيل ضوء أكرس يتوسط تيارات الكلوريد في الخلايا العصبية البالغة السماح تثبيط نشاط الخلايا العصبية في شدة الضوء أقل بكثير من المضخات الميكروبية التي تنقل فقط رسوم واحدة لكل الفوتون استيعابها.

نشاط كر يمكن معالجتها مباشرة عن طريق التسجيلات الكهربية التصحيح المشبك من التيارات التي يسببها الضوء في خلايا HEK293. التصحيح المشبكوقد تم تطوير تقنية أصلا في أواخر 1970s 25 ومواصلة تحسينها من قبل هاميل وآخرون. ، مما يسمح لتسجيل كيان التيارات من خلية صغيرة (وضع خلية كاملة) مع ارتفاع القرار الحالي والتحكم المباشر من الجهد الغشاء 26 . تطبق هذه التقنية في ثقافة الخلية، وتوفر التحكم الدقيق في ظروف التسجيل الأيونية وكذلك الكهربائية، وتمكن من دراسة الانتقائية الأيونية جنبا إلى جنب مع المساهمة النسبية للأيونات إلى التيار الكلي. هنا نحن تجسد فحص أيون الانتقائية ل أنيون-ترانزلاتيونرودوبسين من بروتيوموناس سولكاتا ( بس ACR1) 22 ، 23 عن طريق تسجيل العلاقات الجهد الحالي تحت مختلف تركيزات كلوريد خارج الخلية لإثبات ارتفاع كلوريد تصرف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

شكل 1
الشكل 1: الإعداد التصحيح المشبك. (1) مصدر الضوء، (2) الألياف البصرية، (3) برمجة مصراع، (4) محول الأرقام، (5) سائق مصراع، (6) مكبر للصوت، (7) نظام نضح، (10) قفص فاراداي و (11) مرحلة مجهر و (12) مدخل نضح و (13) مخرج نضح و (14) غرفة تسجيل و 15 مستشعر مستوى السائل و 16 قطب حمام مع جسر اجار، (18) هيدستيج، (19) ميكرومانيبولاتور، (20) المجهر المقلوب، (21) السكن مصباح المجهر، (22) امدادات الطاقة مصباح المجهر، (23) أنبوب مليء بالماء U- صمام، (25) الجدول المضادة للاهتزاز، (26) كاميرا كسد. ( A ) صور و ( B ) التمثيل التخطيطي للإعداد. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من tرقمه.

1. الإعداد قبل تسجيلات

داخل. extra.1 extra.2
كلوريد عالي كلوريد عالي كلوريد منخفض
c [مم] c [مم] c [مم]
نا-ASP 0 0 140
كلوريد الصوديوم 110 140 0
بوكل 1 1 1
CSCL 1 1 1
كاكل 2 2 2 2
مغكل 2 2 2 2
HEPES 10 10 10
EGTA 10 0 0
الرقم الهيدروجيني 7.2 7.2 7.2
الأسمولية 290 مسم 320 مسم 320 مسم

الجدول 1: التركيب الأيوني للحلول المخزنة مؤقتا. تكوين داخل الخلايا (داخل). وخارجية (إضافية.) مخازن للتجارب انتقائية الكلوريد في خلايا هيك. الاختصارات المستخدمة: إثيلين غليكول تيتراسيتيك أسيد (إغتا)، 4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبيرازينيثانسولفونيك أسيد (هيبيس) و أسبارتاتي (أسب). جميع التركيزات هي في ملي.

  1. إعداد حلول التسجيل مع تركيزات أيون كما هو مبين في الجدول 1.
    1. إعداد 15 مل من 2 M حلول الأسهم في الماء عالى النقاء ل مغكل 2 ، كاكل 2 ، بوكل و سكل.
    2. وزن المكونات الصلبة ل 100 مل من الخلايا و500 مل من الحلول المخزنة خارج الخلية وفقا للجدول 1 في أكواب منفصلة وإضافة كمية منها من حلول الأسهم استعداد بعد ذلك. على سبيل المثال، لعازلة داخل الخلايا، واستخدام 0.3803 ز (10 ملم) إغتا، 0.2383 ز (10 ملي) هيبيس و 0.6428 ز (110 ملم) كلوريد الصوديوم وإضافة 100 ميكرولتر من 2 M مغكل 2 و كاكل 2 و 50 ميكرولتر من 2 M بوكل و سكل حلول الأسهم.
    3. إضافة الماء عالى النقاء وضبط بعناية الرقم الهيدروجيني باستخدام الأحماض والقواعد، والتي لا تتداخل مع القياس، أي لا تجري من قبل شر، مثل حامض الستريك و N- ميثيل- D- الجلوكامين (نمغ + ).
    4. ضبط الأسمولية إلى 290 مسم لداخل الخلايا و 320 مسم للحصول على حلول خارج الخلية مع الجلوكوز.
      ملاحظة: حلول الخلايا هيبوزموتيك قليلا زيادة نسبة النجاح من الترقيع 26 .
    5. تصفية معقمة جميع الحلول من خلال مرشحات 0.22 ميكرون. تخزين الحلول في 4 درجات مئوية لمدة أسبوعينs أو تجميد في -20 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
  2. حساب إمكانات تقاطع السائل وإعداد بروتوكولات تسجيل.
    ملاحظة: تغيير تركيز كلوريد خارج الخلية بعد إنشاء تكوين خلية كاملة يسبب إمكانية كبيرة تقاطع السائل (لجب) التي يجب تصحيحها 27 ، 28 . لجبس يمكن قياسها مباشرة أو حسابها، وهنا يتم استخدام الخيار الأخير. في هذا البروتوكول، وسوف تستخدم على الخط تصحيح تطالب بروتوكول تسجيل واحد لكل عازلة مؤقت. ومع ذلك، لمجموعة أكبر من الحلول الخارجية ينصح تصحيح آخر من لجب لتجنب تصحيح كاذب.
    1. فتح تقاطع المحتملة آلة حاسبة (جيك) 27 وفتح الحوار "تجربة جديدة". ثم حدد "التصحيح المشبك القياسات". حدد "القياسات خلية كاملة"، "معيار الملح الملح الكهربائي" ودخول درجة حرارة25 درجة مئوية. بين كل خطوة، والمضي قدما من خلال قبول اختيار عن طريق الضغط على زر "التالي".
      ملاحظة: يتم إجراء التجارب في درجة حرارة الغرفة من 25 درجة مئوية في مختبر مكيفة الهواء. تأكد من أن حلول المخزن المؤقت لها درجة حرارة الغرفة قبل بدء التجارب. لتغيير درجة حرارة العينة مرحلة الحضانة أو غرفة يمكن استخدامها. يمكن قياس درجة حرارة الحمام في كثير من الأحيان مع ميزان الحرارة.
    2. إضافة جميع أنيون الفردية والتركيز الموجبة من محلول بيبيتد والعازلة كلوريد عالية وفقا لتركيزات المدرجة في الجدول 1 .
      ملاحظة: سوف جيك حساب لجب من -0.5 مف لظروف البداية.
    3. انقر على "جديد حمام الحل" للدخول في تكوين الأيونية الموجبة من المخزن المؤقت كلوريد منخفضة.
      ملاحظة: سوف جيك الآن حساب لجب جديد من +12.6 مف وفقا لتغير حل تسجيل خارج الخلية.
    4. إعداد اثنين من لبب تصحيح البروتوكولات لشرطين قياس بطرح لجب محسوبة من إمكانية عقد تطبيقية؛ -0.5 مف ل عالية و +12.6 مف للحلول الخارجية كلوريد منخفضة. وهكذا تبدأ البروتوكولات مع -79.5 مف (كلوريد عالية) و -92.6 مف (انخفاض الكلوريد)، على التوالي للحصول على لجب تصحيح بدء انطلاق إمكانية -80 مف في كلتا الحالتين.
      ملاحظة: تنطبق الخطوات التالية على برنامج الحصول على البيانات المذكورة في قائمة المواد.
    5. افتح محرر البروتوكول في برنامج الاستحواذ. التبديل إلى "وضع" القائمة حدد "التحفيز العرضي" وتشمل 7 الاحتلالات.
    6. التبديل إلى "الموجي" القائمة في المحرر وتشمل فترة 200 مللي ثانية مع 0 مللي أمبير عقد المحتملة تليها فترة 2 ثانية مع متفاوتة عقد محتملة ابتداء من -79.5 مف لكلوريد عالية. وتشمل "مستوى دلتا" من 20 مف للفترة الثانية لزيادة إمكانية عقد من قبل 20 مف في كل اكتساح.
    7. ضمن خطوات الجهد من الموجي إدإيتور تطبيق فترة 500 مللي ثانية من الإضاءة مع 540 نانومتر ضوء (3.10 ميغاواط / مم ²). وللقيام بذلك، قم بتغيير "نمط البتات الرقمية" للمصراع المتصل الذي يتحكم في مصدر الضوء ليصبح نشطا مس 500 بعد الفترة الثانية الموصوفة أعلاه (انظر 1.2.6).
      ملاحظة: شدة الضوء يمكن أن تؤثر على الخصائص الفيزيائية الحيوية للتيارات قناة مثل السعة أو التعطيل. ولذلك، ينبغي دائما الإبلاغ عن كثافات الطاقة الخفيف. لقياس قوة الضوء بعد المرور من خلال جميع البصريات وساترة، واستخدام مقياس المعايرة معايرة. لحساب كثافة القدرة، حدد حقل مضيئة للهدف من قبل ميكرومتر كائن وتقسيم قوة الضوء المقاسة من قبل حقل مضيئة المحدد.
    8. حفظ بروتوكول حل كلوريد عالية خارج الخلية. تعديل البروتوكول واستبدال المستوى الأول محتملة من قبل -92.6 مف (كلوريد خارجي منخفض). حفظ هذا البروتوكول الثاني لقياس انخفاض كلوريد حالة خارج الخلية.
    9. ليسين طلاء من زلات غطاء الزجاج وفقا للبروتوكول تكييفها 29 .
      1. وضع عدة 100 زلات تغطية في طبق بتري الزجاج وإضافة 250 مل حمض الهيدروكلوريك (1 N).
      2. وضع طبق بتري مع زلات غطاء على شاكر الخطي ويهز في 120 دورة في الدقيقة لمدة 72 ساعة لتنظيف زلات الغطاء وبعد ذلك شطف مع الماء عالى النقاء لتحييد الرقم الهيدروجيني.
      3. نقع هذه في حجم صغير من الايثانول 95٪ لمزيد من التنظيف.
        ملاحظة: يمكن تخزين زلات غطاء نظيفة في الايثانول 70٪ قبل المتابعة. العمل تحت غطاء تدفق الصفحي للخطوات التالية.
      4. باستخدام الموقد بنسن وملاقط، لهب كل غطاء زلة ونقله إلى طبق بتري جديد.
      5. احتضان زلات غطاء الزجاج مع عقيمة 50 ميكروغرام / مل حل بولي- D- يسين لمدة 1 ساعة على الأقل (أو بين عشية وضحاها) في درجة حرارة الغرفة بينما يهز مع شاكر الخطي في 150 دورة في الدقيقة.
      6. غسل زلات غطاء مع الماء عالى النقاء لإزالة الزائد بولي-D- يسين.
      7. نشر زلات غطاء على ورقة معقمة لتجف لمدة 10 دقيقة، وتعريضهم للأشعة فوق البنفسجية للتعقيم (على الأقل 20 دقيقة).
      8. جمع زلات غطاء في طبق بتري معقمة مغطاة في رقائق الألومنيوم حتى الاستخدام.
    10. إعداد الحمض النووي لجين ACR1 بس تنصهر ل مشيري باستخدام تقنيات البيولوجيا الجزيئية القياسية.
      1. استنساخ الإنسان كودون الأمثل تسلسل الجينات ترميز بس ACR1 في البلازميد بيغف-C1 (سمف المروج، مقاومة كاناميسين) في الإطار مع مشيري فلورفور باستخدام الإنزيمات تقييد أو غيرها من أساليب الاستنساخ المعمول بها.
        ملاحظة: فلوروفوريس أخرى يمكن استخدامها كذلك، ولكن تأكد من أن يكون المقابلة مرشح مجموعات المتاحة لمراقبة مضانهم تحت المجهر في الإعداد.
      2. تحويل الحمض النووي البلازميد إلى خلايا كيميائية XL1Blue E. كيمي من خلال صدمة الحرارة وفقا للبروتوكول القياسية وصفيحة على لوحات أجار (30 ميكروغرام / مل كانامايسين) 30
      3. في اليوم التالي، تطعيم 4 مل مستخلص مرق ليسوجيني تستكمل مع 30 ميكروغرام / مل كانامايسين مع خلايا من مستعمرات واحدة واحتضان لهم خلال الليل عند 37 درجة مئوية و 180 دورة في الدقيقة في حاضنة.
      4. بعد الحضانة بين عشية وضحاها، وتنقية الحمض النووي البلازميد من الثقافات باستخدام عدة متوفرة تجاريا (انظر المواد الجدول ) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    11. البذور الخلايا
      ملاحظة: تنفيذ الخطوات تحت غطاء محرك السيارة تدفق الصفحي.
      1. وضع ما يصل إلى ثلاثة ليسين المغلفة غطاء الزجاج زلات جنبا إلى جنب في طبق بتري 35 ملم.
        ملاحظة: اضغط بلطف لهم على الجزء السفلي من الطبق لمنع الانزلاق على بعضها البعض.
      2. البذور 1.5 × 10 5 خلايا هيك في 2 مل معيار دولبيكو تعديل النسر المتوسطة (دمم) تستكمل مع 10٪ مصل بقري الجنين (فبس) في كل طبق.
      3. ملحق جميع عبر شبكية العين فيتركيز النهائي من 1 ميكرومتر. تنمو الخلايا لمدة يوم واحد على الأقل قبل الشروع في الخطوة 1.6.
    12. ترانسفيكت عابر الخلايا عبر ليبوفكتيون 31 .
      1. لكل طبق من الخلايا، وإعداد حل من 2 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد (كما أعدت في الخطوة 1.4) في 250 ميكرولتر دمم دون فبس و 6 ميكرولتر ترنسفكأيشن كاشف (انظر المواد الجدول ).
      2. بعد 15 دقيقة من الحضانة، بلطف (قطرة قطرة) إضافة الحل إلى الخلايا.
    13. إعداد الجسور أجار
      1. إضافة 0.75 غرام أغاروس إلى 50 مل محلول كلوريد الصوديوم العقيمة (140 ملم) وحله عن طريق التسخين في الميكروويف.
        ملاحظة: 2 - 3 M بوكل ل أجار إعداد الجسر يقلل أيضا لجب بسبب تركيز أعلى (على سبيل المثال نشر مستمر من الجسر) والحركة على قدم المساواة من K + و كل - أيونات، ولكن تم تجنب لتقليل أيون (وخاصة كل - ) تسرب إلى t انه حل الحمام 32 .
      2. ملء 10 ميكرولتر نصائح ماصة (أو خرطوم قطره صغير) مع محلول الاغاروز السائل باستخدام حقنة.
        ملاحظة: تجنب فقاعات الهواء في الجسر.
      3. بعد أن تم تبريد الجسور أجار وترسيخها، وتخزينها في العقيمة 140 ملي محلول كلوريد الصوديوم.
    14. إعداد تسجيل وأقطاب حمام.
      1. إزالة الأسلاك الفضية للحمام وتسجيل القطب من الإعداد التصحيح المشبك.
      2. البولندية الأسلاك مع الصنفرة لإزالة كلوريد الفضة من التجارب السابقة. تزج الأسلاك الفضية النظيفة في 3 M بوكل وتوصيله إلى القطب الموجب للبطارية 1.5 V للطلاء كهربائيا مع كلوريد الفضة.
        ملاحظة: يمكن استخدام مصدر طاقة المختبر بدلا من البطارية.
    15. سحب ماصات التصحيح مقاومة منخفضة (1.5-3.0 MΩ) من الشعيرات الدموية الزجاج مع مجتذب ميكروبيبيت والنار تلميعها كما هو موضح من قبل براون وآخرونلاس = "كريف"> 33. تخزين ماصات الغبار خالية ليوم القياس.
    16. تشغيل جميع مكونات الإعداد لتسخين حتى درجة حرارة العمل 30 دقيقة التسجيلات السابقة. تأكد من أن المخازن المؤقتة في درجة حرارة الغرفة.

    2. سيلكتيفيتي القياسات

    1. بدء التسجيلات 24 إلى 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن عابر من الخلايا وصفها في 1.6.
    2. وضع زلة غطاء واحد في غرفة القياس وختم عليه مع السيليكون لمنع تسرب العازلة الخارجية. تخزين طبق بتري مع زلات تغطية أخرى في حاضنة للمجموعة التالية من التجارب.
    3. ملء بعناية الغرفة مع العازلة خارج الخلية (عالية [كل - ]) لمنع فصل الخلايا، ثم وضعه تحت المجهر واستخدام الهدف 40X لتصور الخلية.
    4. وضع جسر أجار فوق القطب حمام ووضعه في غرفة جنبا إلى جنب مع جهاز استشعار مستوى السائل ومخرج نضح من معالج الحمام.
    5. تبادل إكسحل الخلوي مرتين مع 1 مل من محلول خارجي جديد (عالية [كل - ]) لإزالة وسط الاستزراع المتبقية والخلايا منفصلة.
    6. جعل الخلايا في التركيز والبحث عن خلية ترانزفكتد (الفلورسنت)، الذي يحتاج إلى أن تكون معزولة عن الخلايا الأخرى. استخدام الثلاثي النطاق مرشح مجموعة والبرتقالي ضوء (590 نانومتر، عرض النطاق الترددي 15 نانومتر، كثافة 100٪) لإثارة وتصور مشيري.
      ملاحظة: خلايا هيك يمكن أن يقترن كهربائيا لجيرانهم عن طريق تقاطعات الفجوة 34 مما أدى إلى انخفاض مقاومة الغشاء في تكوين خلية كاملة.
    7. ملء واحدة من ماصات سحبت مع حل الخلايا وإزالة فقاعات الهواء عن طريق التقليب ماصة عدة مرات.
    8. جبل ماصة على حامل ماصة وتطبيق بعض الضغوط الإيجابية لمنع انسداد الطرف.
    9. تحديد موقع غيض من ماصة التصحيح تحت المجهر والتنقل على مقربة من الخلية باستخدام ميكرومانيبولاتور.
      ملاحظة: تنطبق الخطوات التالية علىمكبر للصوت، والحصول على البيانات وتقييم البرمجيات المذكورة في قائمة المواد.
    10. بدء "اختبار الغشاء" في برنامج الحصول على البيانات وتطبيق خطوة الجهد (نبض الاختبار؛ على سبيل المثال 5 مف ل 10 مس، خط الأساس في 0 مف)، يدويا أو تلقائيا عن طريق برنامج محدد باستخدام "وضع حمام" أثناء تشغيل "اختبار الغشاء" في برنامج الحصول على البيانات.
    11. تحقق من أن المقاومة ماصة في النطاق المطلوب (1.5-3.0 MΩ).
    12. صفر تعويض التيارات عن طريق تعديل إمكانية ماصة عن طريق تحويل مقبض ماصة تعويض في مكبر للصوت أثناء العمل في "وضع حمام" من "اختبار الغشاء".
    13. إنشاء التصحيح في تكوين خلية كاملة 26 .
      ملاحظة: الخطوات التالية تتطلب تطبيق الضغط الإيجابي والسلبي تسليمها إلى ميناء الجانب من حامل ماصة المستخدمة. ويمكن القيام بذلك عن طريق استخدام حقنة، عن طريق قطعة الفم أو يخدع إلكترونيامنظم الضغط. في هذا البروتوكول يتم تطبيق الضغط الإيجابي والسلبي عن طريق قطعة الفم.
      1. ببطء الاقتراب من الخلية مع ماصة التصحيح من أعلى وتخفيف الضغط الإيجابي الحق قبل لمسها.
        ملاحظة: عندما طرف قريب من الخلية، المقاومة سوف ترتفع قليلا؛ ويشار إلى ذلك من خلال انخفاض حجم نبض الاختبار.
      2. تغيير "اختبار الغشاء" من "وضع حمام" إلى "وضع التصحيح" وبالتالي القدرة على عقد المحتملة لاستعادة الخلايا المحتملة (-30 إلى -40 مف).
      3. في بعض الحالات تكوين الخلية المرفقة تشكل نفسها بعد الافراج عن الضغط الإيجابي (2.13.1)، إن لم يكن، وتطبيق بلطف الضغط السلبي للمساعدة في تشكيل القحز.
        ملاحظة: يتم إنشاء التكوين المرفقة الخلية عندما يتم تخفيض نبض الاختبار إلى قمم اثنين بالسعة الصغيرة في بداية ونهاية النبض ومقاومة الغشاء في نطاق G؛. الفولتية السلبية تصل إلى -60 مف mإايت تسهيل تشكيل الجيجاسي.
      4. تعويض السعة ماصة عن طريق تحويل "ماصة السعة تعويض" المقابض للحصول على استجابة مسطحة من نبض الاختبار.
      5. تمزق التصحيح دون تدمير الختم عن طريق تطبيق نبضات قصيرة من الضغط السلبي أو الضغط السلبي مع زيادة القوة، للحصول على التشكل خلية كاملة.
        ملاحظة: الانتقال الناجح من خلية تعلق على تكوين خلية كاملة يشار إليه بزيادة القمم بالسعة.
      6. تطبيق سلسلة المقاومة التعويض عن طريق وضع كامل خلية المعلمة والتعويضات التعديلات من مكبر للصوت المستخدمة لقط دقيقة من الغشاء المحتملة إلى الجهد عقد المطلوب.
        1. تبديل "اختبار غشاء" إلى وضع "خلية كاملة"، في لوحة "تعويض المقاومة سلسلة" بدوره على "التنبؤ" و "تصحيح" تصل إلى 90٪ تجنب أوفيرشوتس والتذبذب للاستجابة بالسعة، وتحويل خلية كاملةالتبديل التعويضي على وضبط المعلمات خلية كاملة مع المقابض اللوحة الأمامية المناسبة ("قدرة الخلية الكاملة" و "سلسلة المقاومة") من مكبر للصوت بطريقة تكرارية للحصول على استجابة ختم اختبار شقة بشكل مثالي.
          ملاحظة: للحصول على وصف تفصيلي للتعويض المقاومة سلسلة وتصحيح الرجوع إلى دليل مكبر للصوت أو المبدأ التوجيهي لأن هذا الإجراء يختلف بين مختلف المصنوعات.
      7. بعد إنشاء التكوين خلية كاملة، انتظر 2 دقيقة على الأقل قبل تسجيل لضمان استبدال كاف من حل الخلايا من خلال ماصة التصحيح 35 .
    14. سجل التيارات التي يسببها ضوء في إمكانات عقد مختلفة باستخدام البروتوكولات التي تم الإعداد سابقا (في 1.2).
    15. تبادل العازلة خارج الخلية إلى انخفاض [كل - ] في الغرفة خمس مرات على الأقل دون تدمير التصحيح وتسجيل آخر الجهد الحالي الجهد ( راجع الخطوة 1.2) في رانه تركيز الكلوريد الجديد.
      ملاحظة: نظام نضح لتبادل العازلة الآلي يسهل هذه العملية، ولكن ليس من الضروري.
    16. كرر 2.15. لكل حالة الأيونية لفحصها، ولكن التحقق مرارا وتكرارا نوعية التصحيح بين القياسات من قبل "اختبار الغشاء" المذكورة أعلاه.
      ملاحظة: لضمان دقة غشاء الجهد ومستقرة داخل الخلية يجب أن تكون المقاومة أيون تكوين غشاء فوق 500 MΩ في حين أن مقاومة الوصول يجب أن لا تتجاوز 10 MΩ، انظر . 2.12.6). لا ننسى أن تبديل كامل خلية تعويض المعلمة قبالة لاختبار الغشاء.
    17. كرر 2.2. إلى 2.15. لعدة خلايا، ولكن تأخذ زلة تغطية جديدة لكل سلسلة اختبار لضمان صحة الخلايا.

    3. تقييم البيانات

    1. ضبط خط الأساس لكل تتبع الحالي عن طريق طرح المتوسط ​​الحالي قبل الإضاءة.
    2. حساب متوسط ​​فوتوكرنت ثابتة s ق ( ملاحظة: تحليل ذروة فوتوكرنتس أو تختلف طول المتوسط ​​لتحديد فوتوكرنت ثابتة اعتمادا على بروتوكول أو سؤال علمي.
    3. كرر الخطوات 3.1) و 3.2) لجميع الظروف اختبار وخلايا مختلفة.
    4. رسم فوتكرنتس يحدد مقابل إمكانات عقد منها.
      ملاحظة: إذا تم حساب متوسطات متعددة، يمكن تطبيع التسجيلات الفردية إلى حالة محددة أو السعة للخلية.
    5. تقاطع العلاقة الجهد الحالي مع محور الجهد يمثل إمكانية عكس (صافي الحالي هو صفر). تحديد ذلك عن طريق الاستيفاء الخطي بين نقاط البيانات المجاورة اثنين.
      ملاحظة: إذا لم يكن هناك انقلاب قطبية من فوتوكرنتس، استقراء خطيا من آخر نقطتين قريبة من الصفر للحصول على تقريب من نقطة التقاطع.
    6. متوسط ​​rوإمكانات ظهري لنفس الظروف ومؤامرة لهم ضد تركيز الكلوريد من الحلول العازلة الخارجية ( راجع الشكل 2B ).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويبين الشكل 2 النتائج التمثيلية التي تم الحصول عليها من القياسات التالية بروتوكول وصفها. خلال الإضاءة مع الضوء الأخضر، بس ACR1 يتميز تيار عابر سريع الذي يتحلل بسرعة إلى مستوى ثابت الحالي. بعد أن يتم إيقاف الضوء، فوتوكرنتس تسوس إلى الصفر في غضون ميلي ثانية ( الشكل 2A ). تبادل تركيز كلوريد خارج الخلية يسبب تحولا في إمكانية انعكاس التي يمكن رؤيتها مباشرة في آثار فوتوكرنت المكتسبة. تقييم إمكانات انعكاس من قياسات متعددة كميا التحول دراماتيكية انعكاس المحتملة الناجمة عن اختلاف تركيز كلوريد الخارجي ( الشكل 2B ). ومن المذهل، ويقابل إمكانات انعكاس تتوافق مباشرة إلى إمكانيات نيرنست المحسوبة لكلوريد ( الشكل 2C ) مما يؤكد الانتقائية كلوريد عالية من بس ACR1.

t "فو: كيب-together.within-بادج =" 1 "> الشكل 2
الشكل 2: انتقائية كلوريد من بس ACR1 . ( A ) آثار الحالية ممثل بس ACR1 في خلايا HEK293. تم الاحتفاظ تركيز كلوريد داخل الخلايا في 120 ملم، في حين أن تركيز خارج الخلية متنوعة من 150 ملي (الأخضر) إلى 10 ملم (الأرجواني) كلوريد عن طريق استبدال جزئي من كلوريد الصوديوم مع نا-أسبارتات. تم زيادة إمكانات القابضة في 20 خطوات مف من -80 مف إلى +40 مف (تصحيح لجب). ( ب ) متوسط ​​العلاقات الحالية الجهد (ن = 6 المقابلة للظروف في A). ( C ) إمكانات عكسية (تشير خطوط الوسط إلى الوسط، تشير حدود المربع إلى النسب المئوية 25 و 75، وتمدد الشعيرات 2 مرات الانحراف المعياري وتشير الدوائر إلى نقاط بيانات واحدة) المستخرجة من علاقات الجهد الحالي. ل كلوريد عالية يخدع(الأخضر) كانت قيمة محايدة خطيا بين -20 مف و 0 مف قابلية محتملة، في حين أن قيمة استقراء خطيا فوق +40 مف (الأرجواني، خط متقطع، لوحة B). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تحديد إمكانات عكس في ظروف الأيونية والكهربائية محددة يوفر معلومات عن الأنواع الأيونية المنقولة بعد تفعيل الضوء من شر. إذا تنوعت الأنواع الأيونية حصريا في وسط فسيولوجي معقد، وتحولت إمكانية الانعكاس التي تم الحصول عليها وفقا لإمكانية نيرنست النظرية، فإن هذا النوع من الأيونات هو النوع الوحيد المنقول.

ومع ذلك، بالنسبة ل شرس، والتحولات المحتملة عكس عادة ما تكون أقل وضوحا مما كان متوقعا من معادلة نيرنست بسبب نفاذية لمختلف الأنواع الأيونية وكذلك المنافسة بين الأيونات التي أجريت. في هذه الحالة، يصبح الوضع أكثر تعقيدا ويجب أن يتم تبادل جميع الأيونات التي يمكن أن تجري بشكل منفصل تطالب مجموعة متنوعة من حلول القياس. وبالإضافة إلى ذلك، فإن معظم سكرز وأول الاصطناعي أكر 9 ، 10 ، 21 هي موصل للبروتونات ولكن متفاوتة بروتون كونسنتراتيتطلب تركيزا شاملا بشكل خاص، حيث أن تركيز البروتون قد لا يؤدي فقط إلى تغيير إمكانات الانعكاس، بل يمكن أن يؤثر أيضا على سلوك الأيونات 9 ، والحركية الضوئية 21 ، 36 والحساسية الضوئية الطيفية 11 ، 37 بسبب تغير شبكات الترابط الهيدروجيني، وحالة البروتونات البقايا الفردية والتغيرات الهيكلية الثانوية. ويمكن التعامل مع بروتون تصرف عن طريق الحد من تركيزات جميع الأيونات الأخرى التي يمكن أن تجري مثل نا + ، كا 2 + أو كل - مع الحفاظ على الرقم الهيدروجيني المستمر من أجل تجنب التغيرات البروتين المذكورة أعلاه. وعادة ما تكون البدائل التي لم يتم إجراؤها كبيرة، وجزيئات مشحونة مثل نمغ + ل كاتيونس 12 ، و غلوكونات، 2- ( N -morpholino) إيثان سلفونات (ميس) أو أسبارتات للأنيونات. مقارنة إمكانيات الانعكاس في مختلف iحلول أونيك ثم يسمح حساب نفاذية الأيونات النسبية في ظروف التوازن بمعادلة الجهد غولدمان-هودجكين-كاتس. قياس مساهمة الأيونات المختلفة لصافي فوتوكرنتس النظر في المنافسة أيون خارج ظروف التوازن ومع ذلك، يتطلب نماذج رياضية معقدة 12 ، 38 .

معرفة تكوين الأيونات المنقولة بواسطة شرس يساعد على توضيح الآثار الجانبية المحتملة الناجمة عن تطبيق شر وخاصة في السياق العصبي الفسيولوجي. على سبيل المثال، يمكن لفترات طويلة تفعيل شر يسبب التحمض داخل الخلايا 39 أو أجريت كا 2+ قد يؤدي الإفراج متشابك ومسارات رسول الثانية 40 . كما عادة ما تكون الخلايا معبأة بإحكام داخل الأنسجة، وتفعيل رودوبسينس الميكروبية لا يمكن أن تؤثر فقط على تكوين الأيونات داخل الخلايا ولكن أيضا التجويف خارج الخلية، مما يؤثر على نالخلايا المجاورة 41 .

على الرغم من الانتقائية الأيونية، والميزات الفيزيائية الحيوية الأخرى من شرس مثل السعة فوتوكرنت، تعطيل، حساسية طيفية أو خفيفة وخصائص حركية غالبا ما تكون ذات فائدة لإجراء وتصميم وتفسير التجارب التي تنطوي على تقنيات أوبتوجينيتيك. ويمكن أيضا تحديد بعض هذه الخصائص من البروتوكول أعلاه كما هو موضح في أماكن أخرى 18 و 37 و 42 . للتحقيق في حساسية الضوء من شر التعبير عن الخلية، يمكن أن تختلف شدة الضوء عن طريق ضبط قوة مصدر الضوء أو عن طريق تخفيف ضوء التنشيط مع مرشحات كثافة محايدة. وللحصول على الحساسية الطيفية، هناك حاجة إلى مصدر ضوئي متعدد الألوان، ويجب تعديل الشدة لتدفق الفوتون وعرض النطاق الترددي على قدم المساواة لجميع أطوال الموجات. الأطياف عالية الكثافة تشبه فقط أطياف الامتصاص من مبصرة إذا نبضات ضوء قصيرة أووتستخدم ومضات الليزر، وإلا الظواهر التكيف وردود الفعل الضوئية الظهر يمكن أن يحدث. ويمكن البحث عن الانتعاش من المعطل جزئيا إلى شر نشطة تماما (عموما دوران دورة ضوئية) عن طريق تطبيق بروتوكول النبض المزدوج مع زيادة فترات الظلام بين نبضات الضوء اثنين. الخصائص الحيوية الفيزيائية ل شرس التي نوقشت أعلاه هي مهمة لاختيار شر مناسبة مطابقة الاحتياجات التجريبية 40 .

اشتقاق هذه الخصائص الفيزيائية الحيوية عن طريق تقنيات الكهربية يشبه مباشرة وظيفة البروتين الذي يكاد يغطيها طيفي الأساليب. بعد النجاح في إنشاء القياسات الجهد المشبك، ويمكن الجمع بين تقنية مع نهج الهندسة البروتين مثل الطفرات الموجهة للموقع 9 ، 11 ، 43 ، 44 ، الحلزون خلط 37 ، 46 أو الانصهار مع بروتينات أخرى 41 ، 47 . وقد زاد هذا من المعرفة الجزيئية عن شرس وطريقة عملها وخلق تنوعا عاليا من الاختلافات شر مع حركية تغير، السلوك، الحساسية الطيفية والانتقائية الأيونية 40 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

نشكر مايلا ريه، ثارسانا ثارمالينجام وخاصة ألتينا كلاين للمساعدة التقنية الممتازة. وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة البحوث الألمانية (SFB1078 B2، FOR1279 SPP1665 إلى ف) ومجموعة المفاهيم الموحدة التميز في الحفز، ونيكات، بيج-نس (جف) و E4 (ف).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEK293 cells Sigma Aldrich 85120602 Human embryonic kidney cells
Retinal Sigma Aldrich R2500 all-trans retinal
FuGENE HD Promega E2312 Transfection reagent
DMEM Biochrome FG 0445 Dulbecco's Modified Eagle Medium
Agarose Roth 3810 Agar bridges
CaCl2 Roth 5239 CaCl2 2H2O
CsCl Biomol 2452
EGTA Roth 3054
FBS Biochrome S0615 Cell culture
Glucose Roth HN06 D(+)-Glucose
KCl Roth 6781
MgCl2 Roth 2189 MgCl2 6H2O
NaCl Roth 3957
NMG Sigma Aldrich M2004 N-Methyl-D-glucamine
Na-Aspartate Sigma Aldrich A6683 L-Aspartic acid sodium salt monohydrate
Citric acid Roth 6490
AgeI ThermoFischerScientific ER1462 Restriction enzyme
XhoI ThermoFischerScientific ER0695 Restriction enzyme
NheI ThermoFischerScientific ER0975 Restriction enzyme
XL1Blue E. coli Agilent Technologies 200249 Chemocompetent E. coli
Kanamycin Roth T832
Lysogeny broth medium Roth X964
Agar-Agar Roth 6494 Agar plates
Plasmid purification kit Marchery-Nagel 740727.25
Penicilin/Streptomycin Biochrome A 2213 Cell culture
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma Aldrich P6407-5MG Cover slip coating
Microforge Custom made Fire polishing
Serological pipettes TPP Different sizes
Clean bench Kojair Biowizard SL130
Stirrer IKA RCT classic
Silver wire Science Products AG-T25; AG-T10 Electrodes, 0.64 mm (bath); 0.25 mm (electrode)
pH-meter Knick 765 Calimetric
Osmometer Vogel OM 815
Microscope Carl Zeiss ID03 Fire polishing
CO2 incubator Binder CB150
Cell culture dishes TPP 93040 34 mm internal diameter
Cover slips Roth P232 15 mm diameter
Thermometer Rössel Messtechnik MTM12
Beamsplitter Chroma 21011 90/10 transmission
Pipette holder ALA Scientific Instruments PPH-1P-AXU-0-1.5
Headstage Molecular Devices CV203BU
Amplifier Molecular Devices AxoPatch200B
Digitizer Molecular Devices DigiData1400 Digital analog converter
Lightsource TILL Photonics Polychrome V Set to 540 nm full intensity
Microscope Carl Zeiss Axiovert 100
Shutter Vincent Associates VS25
Shutter driver Vincent Associates VCM-D1
Glass capilarries Warner Instruments G150F-3 Boresilicate capillaries with fire polished ends OD 1.5 mm ID  0.86 mm
Micropipette puller Sutter Instruments P1000
Bath handler Lorenz Messgerätebau MPCU
Tripleband filterset Chroma 69008 Fluorescence filter  ECFP/EYFP/mCherry 
CCD camera Watec Wat-221SCCD
Optometer Gigahertz Optik P9710 Measure light intensities
Objective Carl Zeiss 421462-9900-000 W Plan-Apochromat 40X/1.0 DIC
Micromanipulator Scientifica PatchStar
Recording chamber Custom made
Power supply Manson HCS-3202 Avoids electrical noise from microscope built-in power supply
Vibration isolated table Newport M-VW-3636-OPT-01
Faraday cage Custom made or any commercial matching table
Hoses Any comercial; e.g. Roth Different sizes and materials for bath handling and application of pipette pressure; agar bridges
Linear shaker Sunlab Instruments SU 1000
Liquid junction potential calculator Molecular Devices or directly from Peter H. Barry Program is included in the Clampex aquisition software or can be obtained from  p.barry@unsw.edu.au
Data acquisition software Molecular Devices Clampex 10.X
Data evaluation software Molecular Devices Clampfit 10.X
PsACR1 GenBank or Addgene KF992074.1 or Addgene plasmid #85465 Gene encoding for PsACR1
Amplifier guide Molecular Devices The Axon Guide

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hegemann, P. Algal sensory photoreceptors. Annu. Rev. Plant Biol. 59, 167-189 (2008).
  2. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae. Science. 296 (5577), 2395-2398 (2002).
  3. Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of contractile function in skeletal muscle. Nat. Commun. 6 (7153), 1-8 (2015).
  4. Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo. Nat. Methods. 7 (11), 897-900 (2010).
  5. Zhang, F., et al. The microbial opsin family of optogenetic tools. Cell. 147 (7), 1446-1457 (2011).
  6. Nagel, G., et al. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr. Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
  7. Li, X., et al. Fast noninvasive activation and inhibition of neural and network activity by vertebrate rhodopsin and green algae channelrhodopsin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (49), 17816-17821 (2005).
  8. Ishizuka, T., Kakuda, M., Araki, R., Yawo, H. Kinetic evaluation of photosensitivity in genetically engineered neurons expressing green algae light-gated channels. Neurosci. Res. 54 (2), 85-94 (2006).
  9. Wietek, J., et al. Conversion of channelrhodopsin into a light-gated chloride channel. Science. 344 (6182), 409-412 (2014).
  10. Berndt, A., et al. Structural foundations of optogenetics: Determinants of channelrhodopsin ion selectivity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 113 (4), 822-829 (2016).
  11. Tsunoda, S. P., Hegemann, P. Glu 87 of Channelrhodopsin-1 Causes pH-dependent Color Tuning and Fast Photocurrent Inactivation. Photochem. Photobiol. 85 (2), 564-569 (2009).
  12. Schneider, F., Gradmann, D., Hegemann, P. Ion selectivity and competition in channelrhodopsins. Biophys. J. 105 (1), 91-100 (2013).
  13. Prigge, M. Über die elektrophysiologische Untersuchung und Entwicklung von farbverschobenen Kanalrhodopsinchimären aus der Grünalge Volvox carteri. , Diss. Humboldt-Universität zu Berlin. Available from: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:11-100203476 (2012).
  14. Govorunova, E. G., Spudich, E. N., Lane, C. E., Sineshchekov, O. A., Spudich, J. L. New Channelrhodopsin with a Red-Shifted Spectrum and Rapid Kinetics from Mesostigma viride. MBio. 2 (3), 1-9 (2011).
  15. Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Li, H., Janz, R., Spudich, J. L. Characterization of a highly efficient blue-shifted channelrhodopsin from the marine alga Platymonas subcordiformis. J. Biol. Chem. 288 (41), 29911-29922 (2013).
  16. Hou, S. -Y., et al. Diversity of Chlamydomonas Channelrhodopsins. Photochem. Photobiol. 88 (1), 119-128 (2012).
  17. Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat. Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
  18. Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophys. J. 96 (5), 1803-1814 (2009).
  19. Yizhar, O., et al. Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction. Nature. 477 (7363), 171-178 (2011).
  20. Berndt, A., Yizhar, O., Gunaydin, L. a, Hegemann, P., Deisseroth, K. Bi-stable neural state switches. Nat. Neurosci. 12 (2), 229-234 (2009).
  21. Berndt, A., Lee, S. Y., Ramakrishnan, C., Deisseroth, K. Structure-Guided Transformation of Channelrhodopsin into a Light-Activated Chloride Channel. Science. 344 (6182), 420-424 (2014).
  22. Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Spudich, J. L. Proteomonas sulcata ACR1: A Fast Anion Channelrhodopsin. Photochem. Photobiol. 92 (2), 257-263 (2016).
  23. Wietek, J., Broser, M., Krause, B. S., Hegemann, P. Identification of a Natural Green Light Absorbing Chloride Conducting Channelrhodopsin from Proteomonas sulcata. J. Biol. Chem. 291 (8), 4121-4127 (2016).
  24. Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Janz, R., Liu, X., Spudich, J. L. Natural light-gated anion channels: A family of microbial rhodopsins for advanced optogenetics. Science. 349 (6248), 647-650 (2015).
  25. Neher, E., Sakmann, B., Steinbach, J. H. The extracellular patch clamp: A method for resolving currents through individual open channels in biological membranes. Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. 375 (2), 219-228 (1978).
  26. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. Arch. Eur. J. Physiol. 391 (2), 85-100 (1981).
  27. Barry, P. H. JPCalc, a software package for calculating liquid junction potential corrections in patch-clamp, intracellular, epithelial and bilayer measurements and for correcting junction potential measurements. J. Neurosci. Methods. 51 (1), 107-116 (1994).
  28. Amtmann, A., Sanders, D. A unified procedure for the correction of liquid junction potentials in patch clamp experiments on endo- and plasma membranes. J. Exp. Bot. 48, (Special) 361-364 (1997).
  29. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).
  30. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. J. Vis. Exp. (63), e1-e18 (2012).
  31. Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 84 (21), 7413-7417 (1987).
  32. Halliwell, J., Whitaker, M., Ogden, D. Using microelectrodes. Microelectrode Tech. Plymouth Work. Handb. 3, 1-15 (1949).
  33. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J. Vis. Exp. (20), e1-e2 (2008).
  34. Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
  35. Pusch, M., Neher, E. Rates of diffusional exchange between small cells and a measuring patch pipette. Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. 411 (2), 204-211 (1988).
  36. Berndt, A. Mechanismus und anwendungsbezogene Optimierung von Channelrhodopsin-2. , Diss Humboldt-Universität zu Berlin. Available from: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:11-100191266 (2011).
  37. Prigge, M., et al. Color-tuned channelrhodopsins for multiwavelength optogenetics. J. Biol. Chem. 287 (38), 31804-31812 (2012).
  38. Gradmann, D., Berndt, A., Schneider, F., Hegemann, P. Rectification of the channelrhodopsin early conductance. Biophys. J. 101 (5), 1057-1068 (2011).
  39. Beppu, K., et al. Optogenetic countering of glial acidosis suppresses glial glutamate release and ischemic brain damage. Neuron. 81 (2), 314-320 (2014).
  40. Wietek, J., Prigge, M. Enhancing Channelrhodopsins: An Overview. Methods Mol. Biol. 1408, 141-165 (2016).
  41. Ferenczi, E. A., et al. Optogenetic approaches addressing extracellular modulation of neural excitability. Sci. Rep. 6, 1-20 (2016).
  42. Zhang, F., et al. Red-shifted optogenetic excitation: a tool for fast neural control derived from Volvox carteri. Nat. Neurosci. 11 (6), 631-633 (2008).
  43. Sugiyama, Y., et al. Photocurrent attenuation by a single polar-to-nonpolar point mutation of channelrhodopsin-2. Photochem. Photobiol. Sci. 8 (3), 328-336 (2009).
  44. Kleinlogel, S., et al. Ultra light-sensitive and fast neuronal activation with the Ca2+-permeable channelrhodopsin CatCh. Nat. Neurosci. 14 (4), 513-518 (2011).
  45. Wang, H., et al. Molecular determinants differentiating photocurrent properties of two channelrhodopsins from chlamydomonas. J. Biol. Chem. 284 (9), 5685-5696 (2009).
  46. Gradinaru, V., Thompson, K. R., Deisseroth, K. eNpHR: a Natronomonas halorhodopsin enhanced for optogenetic applications. Brain Cell Biol. 36 (1-4), 129-139 (2008).
  47. Berglund, K., et al. Luminopsins integrate opto- and chemogenetics by using physical and biological light sources for opsin activation. Proc. Natl. Acad. Sci. 113 (3), 358-367 (2016).

Tags

علم الأعصاب، العدد 123، الفيزياء الحيوية، واحد المشبك الجهد الكهربائي، تكوين خلية كاملة، خلية HEK293، علم البصريات، تشانلرودودوبسين، فوتوكرنت، الانتقائية، إمكانات انعكاس، إمكانات تقاطع، كلوريد، أنيون
كامل خلية التصحيح المشبك تسجيلات لتحديد الكهربية من أيون الانتقائية في تشانلرودوبسينز
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Grimm, C., Vierock, J., Hegemann,… More

Grimm, C., Vierock, J., Hegemann, P., Wietek, J. Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins. J. Vis. Exp. (123), e55497, doi:10.3791/55497 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter