Abstract
Durante la última década, los channelrhodopsins se hicieron indispensables en la investigación neurocientífica donde se utilizan como herramientas para manipular de manera no invasiva procesos eléctricos en células diana. En este contexto, la selectividad iónica de una canalrhodopsina es de particular importancia. En este artículo se describe la investigación de la selectividad del cloruro para una canalrhodopsina de Proteomonas sulcata conductora de aniones recientemente identificada mediante grabaciones electrofisiológicas de la placa de sujeción en células HEK293. El procedimiento experimental para la medición de fotocorrientes de luz-gated requiere una fuente de luz conmutable rápida - idealmente monocromática - acoplada en el microscopio de una instalación de parche-abrazadera de otro modo convencional. Se describen los procedimientos preparativos previos al experimento que incluyen la preparación de soluciones tamponadas, consideraciones sobre los potenciales de unión de lıquidos, siembra y transfección de células y extracción de las pipetas de parche. La grabación real de la relación tensión-corrienteS para determinar los potenciales de inversión para diferentes concentraciones de cloruro se produce 24 h a 48 h después de la transfección. Por último, los datos electrofisiológicos se analizan con respecto a las consideraciones teóricas de la conducción de cloruro.
Introduction
Channelrhodopsins (ChR) son canales de iones ligeros que se producen en el ojo de las algas verdes móviles, y sirven como fotosensores primarios para fototaxis y respuestas fóbicas [ 1] . Desde su primera descripción en 2002 [ 2] , ChRs han allanado el camino para el campo emergente de la optogenética y se puede aplicar en una variedad de células excitables, por ejemplo, dentro de los músculos esqueléticos, el corazón o el cerebro [ 3 , 4 , 5] . La expresión de ChRs en células diana da como resultado la permeabilidad iónica controlable por luz de la célula respectiva. En un contexto neuronal, esto permite la activación 6 , 7 , 8 o inhibición 9 , 10 del potencial de acción (AP) disparando - dependiendo del ión conducido - con el espacio y temporalPrecisión de la luz enfatizando cómo la selectividad iónica de una variante ChR determina su aplicación optogenética.
Los primeros ChRs descubiertos de Chlamydomonas reinhardtii y Volvox carteri son permeables a los protones, pero también a los cationes monovalentes como el sodio, el potasio y, en menor medida, a los cationes divalentes como el calcio y el magnesio 11 , 12 , 13 . Hoy en día, más de 70 canalrhodopsins (CCRs) 14 , 15 , 16 , 17 de conducción de cationes naturales y varias variantes 18 , 19 , 20 de ingeniería con diferentes propiedades tales como El tamaño de la fotocorriente, la sensibilidad espectral, la cinética y la selectividad del catión. Mientras que en neurociencia, CCRs aRe utilizados para activar las células y disparar APs, bombas microbianas impulsadas por la luz fueron los únicos antagonistas disponibles para silenciar las neuronas durante años. En 2014, dos grupos mostraron simultáneamente que CCRs pueden ser convertidos en anión-conductora channelrhodopsins (ACRs) por la alteración de la polaridad a lo largo de la putativo ión de conducción poros a través de ingeniería molecular 9 , 21 . Posteriormente, ACRs naturales se identificaron en varios criptofitos alga 22 , 23 , 24 . Más importante aún, la activación de luz de ACRs media las corrientes de cloruro en las neuronas adultas permitiendo la inhibición de la actividad neuronal a intensidades de luz mucho más bajas que las bombas microbianas que sólo transportan cargas únicas por fotón absorbido.
La actividad de ChR se puede abordar directamente mediante grabaciones electrofisiológicas de las corrientes inducidas por luz en las células HEK293. La abrazadera de parcheTécnica fue desarrollada originalmente a finales de los años setenta 25 y mejorada por Hamill et al. , Permitiendo el registro de la entidad de corrientes desde una célula pequeña (modo de célula completa) con alta resolución de corriente y control directo de la tensión de membrana 26 . Aplicada en cultivo celular, esta técnica proporciona un control preciso de las condiciones de grabación iónica y eléctrica y permite estudiar la selectividad de iones junto con la contribución relativa de los iones a la corriente total. Aquí se ejemplifica el examen de la selectividad iónica de la canalrhodopsina conductora de aniones de Proteomonas sulcata ( Ps ACR1) 22 , 23 mediante el registro de las relaciones tensión-corriente en varias concentraciones de cloruro extracelular para demostrar una alta conductancia del cloruro.
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Protocol
Figura 1: Configuración de la abrazadera de parche. (1) fuente de luz, (2) fibra óptica, (3) obturador programable, (4) digitalizador, (5) controlador de obturador, (6) amplificador, (7) sistema de perfusión, (8) ordenador personal, , (11) etapa de microscopio, (12) entrada de perfusión, (13) salida de perfusión, (14) cámara de registro, (15) sensor de nivel de fluido, (16) electrodo de baño con puente de agar, (17) (19) microscopio invertido, (21) carcasa de la lámpara del microscopio, (22) fuente de alimentación de la lámpara del microscopio, (23) tubo de U lleno de agua, (24) de tres vías Válvula, (25) mesa antivibración, (26) cámara CCD. ( A ) Fotografías y ( B ) representación esquemática de la disposición. Haga clic aquí para ver una versión más grande de tSu figura
1. Configuración previa a las grabaciones
| Intra | Extra 1 | Extra 2 | |
| Alto contenido de cloruro | Alto contenido de cloruro | Bajo en cloruro | |
| C [mM] | C [mM] | C [mM] | |
| Na-ASP | 0 | 0 | 140 |
| NaCl | 110 | 140 | 0 |
| KCl | 1 | 1 | 1 |
| CsCl | 1 | 1 | 1 |
| CaCl $ ₂ $ | 2 | 2 | 2 |
| MgCl $ ₂ $ | 2 | 2 | 2 |
| HEPES | 10 | 10 | 10 |
| EGTA | 10 | 0 | 0 |
| PH | 7,2 | 7,2 | 7,2 |
| Osmolaridad | 290 mOsm | 320 mOsm | 320 mOsm |
TABLA 1 Composición iónica de las soluciones tampón. Composición de los tampones intracelulares (intra.) Y extracelulares (extra) para los experimentos de selectividad del cloruro en células HEK. Abreviaturas utilizadas: ácido etilenglicol tetraacético (EGTA), ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanosulfónico (HEPES) y aspartato (ASP). Todas las concentraciones son en mM.
- Preparar las soluciones de registro con concentraciones iónicas como se indica en la Tabla 1.
- Preparar 15 ml de soluciones madre 2 M en agua ultrapura para MgCl2, CaCl2, KCl y CsCl.
- Pesar los componentes sólidos para 100 ml de la solución intracelular y500 ml de las soluciones tamponadas extracelulares de acuerdo con la tabla 1 en vasos de precipitados separados y a~nadir después la cantidad respectiva de las soluciones madre preparadas. Por ejemplo, para el tampón intracelular, se usan 0,3803 g (10 mM) de EGTA, 0,2383 g (10 mM) de HEPES y 0,6428 g (110 mM) de NaCl y se añaden 100 μl de MgCl $ ₂ $ 2 y CaCl $ ₂ $ y 50 μl del 2 M de KCl y CsCl soluciones madre.
- Añada agua ultrapura y ajuste cuidadosamente el pH utilizando ácidos y bases que no interfieran con la medición, es decir , no se realicen por el ChR, como el ácido cítrico y la N-metil-D-glucamina (NMG + ).
- Ajuste la osmolaridad a 290 mOsm para el intracelular ya 320 mOsm para las soluciones extracelulares con glucosa.
Nota: Las soluciones intracelulares ligeramente hipoosmóticas aumentan la tasa de éxito del parche 26 . - Filtro estéril todas las soluciones a través de filtros de 0,22 μm. Almacenar las soluciones a 4 ° C durante dos semanasS o congelar a -20 ° C para el almacenamiento a largo plazo.
- Calcular los potenciales de unión de líquidos y preparar protocolos de grabación.
NOTA: El cambio de la concentración de cloruro extracelular después de establecer la configuración de células enteras causa un potencial de unión de líquidos significativo (LJP) que tiene que ser corregido 27 , 28 . Los LJP se pueden medir o calcular directamente, aquí se utiliza la última opción. En este protocolo, se utilizará la corrección en línea exigiendo un protocolo de grabación para cada búfer externo. Sin embargo, para un conjunto más grande de soluciones externas se recomienda una corrección posterior de LJP para evitar falsas correcciones.- Abra la calculadora de potencial de unión (JPC) 27 y abra el diálogo 'Nuevo experimento'. A continuación, seleccione "Medidas de la abrazadera de parche". Seleccione "Mediciones de células enteras", "Electrodo de solución salina estándar" e introduzca una temperatura de25ºC. Entre cada paso, siga adelante aceptando la selección presionando el botón "siguiente".
NOTA: Los experimentos se realizan a una temperatura ambiente de 25 ° C en un laboratorio con aire acondicionado. Asegúrese de que las soluciones tampón tengan temperatura ambiente antes de iniciar los experimentos. Para variar la temperatura de la muestra se puede usar una etapa o cámara de incubación. La temperatura del baño se puede medir frecuentemente con un termómetro. - Añadir todas las concentraciones individuales de aniones y cationes de la solución pipeteada y el tampón de cloruro alto de acuerdo con las concentraciones enumeradas en la Tabla 1 .
NOTA: El JPC calculará un LJP de -0,5 mV para las condiciones de partida. - Haga clic en "New Bath Solution" para introducir la composición aniónica y catiónica del búfer de cloruro bajo.
NOTA: El JPC calculará ahora un nuevo LJP de +12.6 mV de acuerdo con la solución de grabación extracelular cambiada. - Prepare dos protocolos corregidos por LJP para laDos condiciones de medición restando el LJP calculado del potencial de retención aplicado; -0,5 mV para la alta y +12,6 mV para las soluciones de bajo contenido de cloruro. Así, los protocolos comienzan con -79,5 mV (cloruro alto) y -92,6 mV (cloruro bajo), respectivamente, para obtener un potencial de retención inicial corregido por LJP de -80 mV en ambos casos.
NOTA: Los siguientes pasos se aplican al software de adquisición de datos mencionado en la lista de materiales. - Abra el editor de protocolo en el software de adquisición. Cambie al menú "Modo" seleccione "Estimulación episódica" e incluya 7 barridos.
- Cambie al menú "Waveform" en el editor e incluya un período de 200 ms con potencial de retención de 0 mV seguido por un periodo de 2 s con potencial de retención variable a partir de -79,5 mV para cloruro alto. Incluir un "nivel Delta" de 20 mV para el segundo período para aumentar el potencial de retención en 20 mV en cada barrido.
- Dentro de los pasos de tensión de la forma de ondaO aplicar un periodo de iluminación de 500 ms con una luz de 540 nm (3,10 mW / mm²). Para ello, cambie el "patrón de bits digital" del obturador conectado que controla la fuente de luz para que esté activa 500 ms después del segundo período descrito anteriormente (véase 1.2.6).
NOTA: La intensidad de la luz puede influir en las propiedades biofísicas de las corrientes del canal como la amplitud o la inactivación. Por lo tanto, las densidades de potencia de luz deben ser siempre reportadas. Para medir la potencia de la luz después de pasar por todas las ópticas y el cubreobjetos, utilice un optometro calibrado. Para calcular la densidad de potencia, determine el campo iluminado del objetivo mediante un micrómetro de objeto y divida la potencia luminosa medida por el campo iluminado determinado. - Guardar el protocolo para la solución extracelular de alto cloruro. Modifique el protocolo y sustituya el potencial de retención del primer nivel por -92,6 mV (cloruro externo bajo). Guardar este segundo protocolo para medir la baja condición de cloruro extracelular.
- Abra la calculadora de potencial de unión (JPC) 27 y abra el diálogo 'Nuevo experimento'. A continuación, seleccione "Medidas de la abrazadera de parche". Seleccione "Mediciones de células enteras", "Electrodo de solución salina estándar" e introduzca una temperatura de25ºC. Entre cada paso, siga adelante aceptando la selección presionando el botón "siguiente".
- Lysine-revestimiento de cubiertas de vidrio según protocolo adaptado 29 .
- Coloque varias cubiertas en una placa de Petri de vidrio y agregue 250 ml de HCl (1 N).
- Coloque la placa de Petri con los portaobjetos en un agitador lineal y agite a 120 rpm durante 72 h para limpiar las tapas y después enjuague con agua ultrapura para neutralizar el pH.
- Remoje estos en un pequeño volumen de etanol al 95% para una limpieza posterior.
NOTA: Los portaobjetos limpios se pueden almacenar en etanol al 70% antes de proceder. Trabajar bajo campana de flujo laminar para los siguientes pasos. - Utilizando un quemador Bunsen y pinzas, la llama de cada cubierta se desliza y transferirlo a una nueva placa de Petri.
- Incubar las cubiertas de vidrio con una solución estéril de poli-D-lisina de 50 μg / mL durante al menos 1 h (o durante la noche) a temperatura ambiente mientras se agita con un agitador lineal a 150 rpm.
- Lave las tapas con agua ultrapura para eliminar el exceso de poli-D-lisina.
- Separe las tapas sobre papel estéril para que se sequen durante 10 minutos y se exponen a luz UV para esterilización (al menos 20 minutos).
- Recoger las tapas en una placa de Petri estéril cubierta en papel de aluminio hasta su uso.
- Preparar ADN del gen Ps ACR1 fusionado a mCherry usando técnicas de biología molecular estándar.
- Clonar la secuencia del gen optimizado con codones humanos que codifica Ps ACR1 en un plásmido peGFP-C1 (promotor CMV, resistencia a la kanamicina) en marco con el fluoróforo mCherry usando enzimas de restricción u otros métodos de clonación establecidos.
Nota: También se pueden usar otros fluoróforos, pero asegúrese de tener los correspondientes conjuntos de filtros disponibles para observar su fluorescencia bajo el microscopio en la configuración. - Transformar el ADN plasmídico en células de E. coli XL1Blue quimocompetentes mediante choque térmico según el protocolo estándar y plancharlas sobre placas de agar (30 μg / ml de kanamicina) 30
- Al día siguiente, inocular 4 ml de medio de caldo de lisogenia suplementado con 30 μg / ml de kanamicina con células de colonias individuales e incubarlas durante la noche a 37 ° C y 180 rpm en una incubadora.
- Después de una incubación durante la noche, purificar el ADN plasmídico de los cultivos utilizando un equipo disponible comercialmente (véase Tabla de Materiales) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Clonar la secuencia del gen optimizado con codones humanos que codifica Ps ACR1 en un plásmido peGFP-C1 (promotor CMV, resistencia a la kanamicina) en marco con el fluoróforo mCherry usando enzimas de restricción u otros métodos de clonación establecidos.
- Sembrar las células
NOTA: Realice los pasos bajo una campana de flujo laminar.- Coloque hasta tres cubiertas de vidrio revestidas con lisina lado a lado en una placa de Petri de 35 mm.
NOTA: Presione suavemente contra la parte inferior del plato para evitar que se deslice entre sí. - Se sembró 1,5 x 10 ^ { 5 } células HEK en 2 ml de Medio Eagle Modificado de Dulbecco estándar (DMEM) suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10% en cada plato.
- Suplemento de todo el trans- retinal aUna concentración final de 1 μM. Cultivar las células por lo menos un día antes de proceder con el paso 1.6.
- Coloque hasta tres cubiertas de vidrio revestidas con lisina lado a lado en una placa de Petri de 35 mm.
- Transitoriamente transfectar las células a través de lipofection [ 31] .
- Para cada plato de células, preparar una solución de 2 μg de ADN plasmídico (como se preparó en el paso 1.4) en 250 μL de DMEM sin FBS y 6 μl de reactivo de transfección (véase Tabla de Materiales ).
- Después de 15 minutos de incubación, suavemente (gota a gota) agregue la solución a las células.
- Preparar puentes de agar
- Añadir 0,75 g de agarosa a 50 ml de solución de cloruro sódico estéril (140 mM) y disolverla calentando en un microondas.
NOTA: El KCl 2 - 3 M para la preparación del puente de agar reduce aún más el LJP debido a una mayor concentración ( por ejemplo, la difusión constante desde el puente) y la movilidad de los iones K + y Cl - , pero se evitó para minimizar las fugas de iones (especialmente Cl - En t Solución de baño 32 . - Llene 10 μl de puntas de pipeta (o una manguera de diámetro pequeño) con la solución de agarosa líquida usando una jeringa.
NOTA: Evite las burbujas de aire en el puente. - Después de que los puentes de agar se hayan enfriado y solidificado, almacenarlos en una solución estéril de cloruro de sodio 140 mM.
- Añadir 0,75 g de agarosa a 50 ml de solución de cloruro sódico estéril (140 mM) y disolverla calentando en un microondas.
- Prepare los electrodos de grabación y baño.
- Quite los cables de plata del baño y el electrodo de grabación de la configuración de la abrazadera de parche.
- Pulir los alambres con papel de lija para eliminar el cloruro de plata de los experimentos anteriores. Sumerja el cable de plata limpio en KCl 3 M y conéctelo al polo positivo de una batería de 1,5 V para recubrimiento electrolítico con cloruro de plata.
NOTA: Se puede utilizar una fuente de alimentación de laboratorio en lugar de una batería.
- Tire las pipetas de parche de baja resistencia (1.5-3.0 MΩ) de los capilares de vidrio con un extractor de micropipeta y aplíquelas como se describe en Brown et alLass = "xref"> 33. Almacene las pipetas sin polvo para el día de la medición.
- Encienda todos los componentes de configuración para calentar hasta la temperatura de trabajo 30 minutos antes de las grabaciones. Asegúrese de que los tampones estén a temperatura ambiente.
2. Medidas de Selectividad
- Iniciar las grabaciones 24 a 48 h después de la transfección transitoria de las células descritas en 1.6.
- Coloque una cubierta deslizante en la cámara de medición y séllela con silicio para evitar fugas de la reserva externa. Guarde la placa de Petri con la otra tapa se desliza en una incubadora para el siguiente conjunto de experimentos.
- Cuidadosamente llenar la cámara con buffer extracelular (alto [Cl - ]) para evitar el desprendimiento de las células, luego colocarlo bajo el microscopio y utilizar el objetivo 40X para la visualización de la célula.
- Coloque un puente de agar sobre el electrodo de baño y colóquelo en la cámara junto con el sensor de nivel de fluido y la salida de perfusión del manipulador del baño.
- Cambiar el exTracelular dos veces con 1 ml de solución externa fresca (alta [Cl - ]) para eliminar el medio de cultivo residual y las células desprendidas.
- Poner las células en foco y buscar una transfectada (fluorescente) de células, que necesita ser aislado de otras células. Utilice un conjunto de filtros de tres bandas y una luz naranja (590 nm, ancho de banda de 15 nm, 100% de intensidad) para excitar y visualizar mCherry.
NOTA: Las células HEK pueden acoplarse eléctricamente a sus vecinos por las uniones de separación 34, lo que da como resultado una baja resistencia a la membrana en la configuración de células enteras. - Llene una de las pipetas con solución intracelular y retire las burbujas de aire volteando la pipeta varias veces.
- Montar la pipeta en el soporte de la pipeta y aplicar una presión positiva para evitar el taponamiento de la punta.
- Localice la punta de la pipeta de parche bajo el microscopio y navegar cerca de la célula utilizando el micromanipulador.
NOTA: Los siguientes pasos se aplican a laMplifier, adquisición de datos y software de evaluación mencionados en la lista de materiales. - Inicie la "prueba de membrana" en el software de adquisición de datos y aplique un paso de tensión (impulso de prueba, por ejemplo 5 mV durante 10 ms, línea de base a 0 mV), manual o automáticamente mediante el software especificado utilizando "modo de baño" En el software de adquisición de datos.
- Compruebe que la resistencia de la pipeta esté en el rango deseado (1.5-3.0 MΩ).
- Corrientes de compensación cero ajustando el potencial de la pipeta girando la perilla de desplazamiento de la pipeta en el amplificador mientras se trabaja en "modo baño" de la "prueba de membrana".
- Establecer un parche en la configuración de células enteras 26 .
NOTA: Los siguientes pasos requieren la aplicación de la presión positiva y negativa entregada al puerto lateral del soporte de la pipeta usado. Esto se puede hacer utilizando una jeringa, a través de una boquilla oRegulador de presión controlado. En este protocolo se aplica presión positiva y negativa a través de una pieza bucal.- Lentamente acercarse a la celda con la pipeta de parche desde la parte superior y aliviar la presión positiva justo antes de tocarlo.
NOTA: Cuando la punta está cerca de la celda, la resistencia se elevará ligeramente; Esto se indica mediante un tamaño reducido del impulso de prueba. - Cambiar la "prueba de membrana" de "modo de baño" a "modo de parche", por lo tanto, el potencial de retención para el potencial de reposo esperado de las células (-30 a -40 mV).
- En algunos casos, la configuración unida a la célula se forma después de la liberación de la presión positiva (2.13.1), si no, aplique suavemente presión negativa para asistir a la formación de gigasas.
NOTA: La configuración unida a la célula se establece cuando el impulso de prueba se reduce a dos picos capacitivos pequeños al principio y al final del impulso y la resistencia de la membrana está en el rango de GΩ; Tensiones negativas hasta -60 mV mPueden facilitar la formación de gigasas. - Compensar la capacidad de la pipeta girando los mandos de "compensación de la capacitancia de la pipeta" para obtener una respuesta plana del impulso de prueba.
- Ruptura del parche sin destruir el sello mediante la aplicación de pulsos cortos de presión negativa o presión negativa con el aumento de la fuerza, para obtener la conformación de células enteras.
NOTA: La transición exitosa de la configuración de celda a célula completa se indica mediante un aumento de los picos capacitivos. - Aplique la compensación de resistencia en serie ajustando los parámetros de la célula completa y los ajustes de compensación del amplificador usado para una sujeción precisa del potencial de membrana a la tensión de retención deseada.
- Cambiar la "prueba de membrana" a "de células enteras" modo, en el "Compensación de resistencia de serie" panel de activar "predicción" y "corrección" hasta el 90% evitando overshots y la oscilación de la respuesta capacitiva,La compensación se enciende y ajusta los parámetros de celda completa con los mandos apropiados del panel frontal ("capacidad de célula entera" y "resistencia en serie") del amplificador de una manera iterativa para obtener una respuesta de sello de prueba idealmente plana.
NOTA: Para una descripción detallada de la compensación y corrección de la resistencia en serie, consulte el manual o la guía del amplificador, ya que este procedimiento varía entre las diferentes manufacturas.
- Cambiar la "prueba de membrana" a "de células enteras" modo, en el "Compensación de resistencia de serie" panel de activar "predicción" y "corrección" hasta el 90% evitando overshots y la oscilación de la respuesta capacitiva,La compensación se enciende y ajusta los parámetros de celda completa con los mandos apropiados del panel frontal ("capacidad de célula entera" y "resistencia en serie") del amplificador de una manera iterativa para obtener una respuesta de sello de prueba idealmente plana.
- Después de establecer la configuración de células enteras, espere al menos 2 minutos antes de la grabación para asegurar un reemplazo suficiente de la solución intracelular a través de la pipeta de parche 35 .
- Lentamente acercarse a la celda con la pipeta de parche desde la parte superior y aliviar la presión positiva justo antes de tocarlo.
- Registre las corrientes inducidas por la luz en diferentes potenciales de retención utilizando los protocolos que se configuraron previamente (en 1.2).
- Intercambie el tampón extracelular en [C] en la cámara por lo menos cinco veces sin destruir el parche y registre otra relación tensión-corriente ( ver paso 1.2) en tNueva concentración de cloruro.
NOTA: Un sistema de perfusión para intercambio automático de búfer facilita este proceso, pero no es necesario. - Repetir 2.15. Para cada condición iónica a ensayar, pero compruebe repetidamente la calidad del parche entre las mediciones mediante un "ensayo de membrana" descrito anteriormente.
NOTA: Para garantizar el voltaje preciso de la membrana y la composición de iones intracelulares estables, la resistencia de la membrana debe ser superior a 500 MΩ mientras que la resistencia de acceso no debe superar los 10 MΩ . 2.12.6). No olvide desactivar la compensación de parámetros de célula completa para la prueba de membrana. - Repetir 2.2. A 2,15. Para varias células, pero tome una nueva cubierta para cada serie de prueba para asegurar la salubridad de las células.
3. Evaluación de datos
- Ajuste la línea de base de cada traza actual restando la corriente media antes de la iluminación.
- Calcular la fotocorriente estacionaria media I s (
- Repita los pasos 3.1) y 3.2) para todas las condiciones ensayadas y diferentes células.
- Representar las fotocorrientes determinadas en función del potencial de retención respectivo.
NOTA: Si se promedian mediciones múltiples, las grabaciones individuales pueden normalizarse a una condición especificada oa la capacitancia de la celda. - La intersección de la relación corriente-tensión con el eje de la tensión representa el potencial de inversión (la corriente neta es cero). Determine por interpolación lineal entre los dos puntos de datos vecinos.
NOTA: Si no hay inversión de polaridad de las fotocorrientes, extrapolar linealmente de los dos últimos puntos cercanos a cero para obtener una aproximación del punto de intersección. - Promedio del r determinadoPara las mismas condiciones y representarlas frente a la concentración de cloruro de las soluciones tampón externas ( véase la Figura 2B ).
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Representative Results
La Figura 2 muestra los resultados representativos obtenidos de las mediciones siguiendo el protocolo descrito. Durante la iluminación con luz verde, Ps ACR1 presenta una corriente transitoria rápida que desciende rápidamente a un nivel de corriente estacionario. Después de que se apaga la luz, las fotocorrientes decaen a cero en milisegundos ( Figura 2A ). El intercambio de la concentración de cloruro extracelular provoca un desplazamiento del potencial de inversión que puede verse directamente en las trazas de fotocorriente adquiridas. La evaluación de los potenciales de inversión a partir de múltiples mediciones cuantifica el cambio de potencial de inversión dramática causado por la variación de la concentración de cloruro externo ( Figura 2B ). Sorprendentemente, los potenciales de inversión medidos corresponden directamente a los potenciales de Nernst calculados para el cloruro ( Figura 2C ), lo que confirma la alta selectividad del cloruro de Ps ACR1.
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Figura 2: Selectividad de cloruros de Ps ACR1 . ( A ) Rastros actuales representativos de Ps ACR1 en células HEK293. La concentración intracelular de cloruro se mantuvo a 120 mM, mientras que la concentración extracelular varió de 150 mM (verde) a 10 mM (púrpura) de cloruro por sustitución parcial de NaCl con Na-aspartato. El potencial de retención se incrementó en pasos de 20 mV de -80 mV a +40 mV (corregido LJP). ( B ) Relaciones corriente-tensión promedio (n = 6 correspondientes a las condiciones en A). ( C ) Los potenciales de inversión (las líneas centrales indican medianas, los límites de la caja indican los percentiles 25 y 75, los bigotes se extienden 2 veces la desviación estándar y los círculos indican puntos de datos únicos) extraídos de las relaciones corriente-voltaje. Para el cloruro de alta(Verde), el valor se interpoló linealmente entre -20 mV y 0 mV de potencial de retención, mientras que el valor se extrapoló linealmente por encima de +40 mV (púrpura, línea discontinua, panel B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La determinación de los potenciales de inversión en condiciones iónicas y eléctricas definidas proporciona información sobre las especies de iones transportadas después de la activación de luz de ChRs. Si exclusivamente varía una especie iónica en un medio fisiológico complejo y el potencial de inversión invertido se desplaza según el potencial teórico de Nernst, esta especie iónica es la única transportada.
Sin embargo, para ChRs, los cambios potenciales de reversión suelen ser menos pronunciados de lo esperado de la ecuación de Nernst debido a la permeabilidad a diferentes especies iónicas, así como la competencia entre los iones conducidos. En este caso, la situación se vuelve más compleja y todos los iones potencialmente conducidos se deben intercambiar por separado exigiendo una variedad de soluciones de medición. Además, la mayoría de las CCR y las primeras ACR 9 , 10 , 21 artificiales son conductivas para protones pero concentraciones de protón variablesLa concentración de protones puede no sólo desplazar los potenciales de inversión, sino que también puede influir sobre la conductancia iónica 9 , la cinética de fotocorrientes 21 , 36 y la sensibilidad a la luz espectral 11 , 37 debido a la alteración de las redes de enlace de hidrógeno, el estado de protonación de Residuos individuales y cambios en la estructura secundaria. La conductancia del protón se puede resolver reduciendo las concentraciones de todos los otros iones potencialmente conducidos tales como Na + , Ca 2+ o Cl - manteniendo el pH constante para evitar los cambios de proteínas mencionados anteriormente. Los sustitutos no realizados son generalmente moléculas voluminosas cargadas como NMG + para los cationes 12 , y gluconato, 2- ( N- morfolino) etanosulfonato (MES - ) o aspartato para aniones. Comparando los potenciales de inversión en diferentes iEntonces permite el cálculo de las permeabilidades iónicas relativas en condiciones de equilibrio por la ecuación de voltaje de Goldman-Hodgkin-Katz. La cuantificación de la contribución exacta de diferentes iones a las fotocorrientes netas considerando la competencia de iones más allá de las condiciones de equilibrio, sin embargo, exige complejos modelos matemáticos [ 12 , 38] .
Conocer la composición de los iones transportados por los CHR ayuda a dilucidar los posibles efectos secundarios resultantes de la aplicación de ChR especialmente en un contexto neurofisiológico. Por ejemplo, prolongada ChR activación puede causar la acidificación intracelular 39 o conducido-Ca 2 + puede desencadenar la liberación sináptica y el segundo mensajero vías [ 40] . Como las células suelen estar fuertemente empaquetadas dentro de los tejidos, la activación de las rodopsinas microbianas no sólo puede influir en la composición de iones intracelulares sino también en la luz extracelular, afectando así a nCeldas vecinas 41 .
A pesar de la selectividad iónica, otras características biofísicas de ChRs como amplitudes fotocorrientes, inactivación, sensibilidad espectral o de luz y propiedades cinéticas son a menudo de interés para conducir, diseñar e interpretar experimentos que implican técnicas optogenéticas. Algunas de estas propiedades también se pueden determinar a partir del protocolo anterior como se describe en otra parte 18 , 37 , 42 . Para investigar la sensibilidad a la luz de la célula que expresa ChR, la intensidad de luz se puede variar ajustando la potencia de la fuente de luz o atenuando la luz de activación con filtros de densidad neutra. Para obtener la sensibilidad espectral, se necesita una fuente de luz policromática y las intensidades tienen que ser ajustadas para que el flujo de fotones y el ancho de banda sean iguales para todas las longitudes de onda. Los espectros de alta intensidad sólo se parecen a los espectros de absorción del fotorreceptor si los pulsos de luz cortos oSe utilizan destellos láser, de lo contrario pueden producirse fenómenos de adaptación y reacciones posteriores fotoquímicas. La recuperación de ChR parcialmente activado a ChR completamente activo (tiempo total de rotación de fotociclos) puede ser probada aplicando un protocolo de doble impulso con intervalos de oscuridad crecientes entre los dos impulsos de luz. Las propiedades biofísicas de los ChRs discutidos anteriormente son importantes para la elección de un ChR adecuado que coincida con las necesidades experimentales [ 40] .
Derivar estas propiedades biofísicas mediante técnicas electrofisiológicas se asemeja directamente a la función de la proteína que apenas se cubre por métodos espectroscópicos. Después del establecimiento exitoso de mediciones de voltaje de sujeción, la técnica puede combinarse con enfoques de ingeniería de proteínas como la mutagénesis dirigida 9 , 11 , 43 , 44 , el arrastre de hélice 37 ,
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Acknowledgments
Agradecemos a Maila Reh, Tharsana Tharmalingam y especialmente Altina Klein por su excelente asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Alemana de Investigación (DFG) (SFB1078 B2, FOR1279 SPP1665 a PH) y el Cluster of Excellence Unifying Concepts en Catálisis, UniCat, BIG-NSE (JV) y E4 (PH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK293 cells | Sigma Aldrich | 85120602 | Human embryonic kidney cells |
| Retinal | Sigma Aldrich | R2500 | all-trans retinal |
| FuGENE HD | Promega | E2312 | Transfection reagent |
| DMEM | Biochrome | FG 0445 | Dulbecco's Modified Eagle Medium |
| Agarose | Roth | 3810 | Agar bridges |
| CaCl2 | Roth | 5239 | CaCl2 2H2O |
| CsCl | Biomol | 2452 | |
| EGTA | Roth | 3054 | |
| FBS | Biochrome | S0615 | Cell culture |
| Glucose | Roth | HN06 | D(+)-Glucose |
| KCl | Roth | 6781 | |
| MgCl2 | Roth | 2189 | MgCl2 6H2O |
| NaCl | Roth | 3957 | |
| NMG | Sigma Aldrich | M2004 | N-Methyl-D-glucamine |
| Na-Aspartate | Sigma Aldrich | A6683 | L-Aspartic acid sodium salt monohydrate |
| Citric acid | Roth | 6490 | |
| AgeI | ThermoFischerScientific | ER1462 | Restriction enzyme |
| XhoI | ThermoFischerScientific | ER0695 | Restriction enzyme |
| NheI | ThermoFischerScientific | ER0975 | Restriction enzyme |
| XL1Blue E. coli | Agilent Technologies | 200249 | Chemocompetent E. coli |
| Kanamycin | Roth | T832 | |
| Lysogeny broth medium | Roth | X964 | |
| Agar-Agar | Roth | 6494 | Agar plates |
| Plasmid purification kit | Marchery-Nagel | 740727.25 | |
| Penicilin/Streptomycin | Biochrome | A 2213 | Cell culture |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma Aldrich | P6407-5MG | Cover slip coating |
| Microforge | Custom made | Fire polishing | |
| Serological pipettes | TPP | Different sizes | |
| Clean bench | Kojair | Biowizard SL130 | |
| Stirrer | IKA | RCT classic | |
| Silver wire | Science Products | AG-T25; AG-T10 | Electrodes, 0.64 mm (bath); 0.25 mm (electrode) |
| pH-meter | Knick | 765 Calimetric | |
| Osmometer | Vogel | OM 815 | |
| Microscope | Carl Zeiss | ID03 | Fire polishing |
| CO2 incubator | Binder | CB150 | |
| Cell culture dishes | TPP | 93040 | 34 mm internal diameter |
| Cover slips | Roth | P232 | 15 mm diameter |
| Thermometer | Rössel Messtechnik | MTM12 | |
| Beamsplitter | Chroma | 21011 | 90/10 transmission |
| Pipette holder | ALA Scientific Instruments | PPH-1P-AXU-0-1.5 | |
| Headstage | Molecular Devices | CV203BU | |
| Amplifier | Molecular Devices | AxoPatch200B | |
| Digitizer | Molecular Devices | DigiData1400 | Digital analog converter |
| Lightsource | TILL Photonics | Polychrome V | Set to 540 nm full intensity |
| Microscope | Carl Zeiss | Axiovert 100 | |
| Shutter | Vincent Associates | VS25 | |
| Shutter driver | Vincent Associates | VCM-D1 | |
| Glass capilarries | Warner Instruments | G150F-3 | Boresilicate capillaries with fire polished ends OD 1.5 mm ID 0.86 mm |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P1000 | |
| Bath handler | Lorenz Messgerätebau | MPCU | |
| Tripleband filterset | Chroma | 69008 | Fluorescence filter ECFP/EYFP/mCherry |
| CCD camera | Watec | Wat-221SCCD | |
| Optometer | Gigahertz Optik | P9710 | Measure light intensities |
| Objective | Carl Zeiss | 421462-9900-000 | W Plan-Apochromat 40X/1.0 DIC |
| Micromanipulator | Scientifica | PatchStar | |
| Recording chamber | Custom made | ||
| Power supply | Manson | HCS-3202 | Avoids electrical noise from microscope built-in power supply |
| Vibration isolated table | Newport | M-VW-3636-OPT-01 | |
| Faraday cage | Custom made or any commercial matching table | ||
| Hoses | Any comercial; e.g. Roth | Different sizes and materials for bath handling and application of pipette pressure; agar bridges | |
| Linear shaker | Sunlab Instruments | SU 1000 | |
| Liquid junction potential calculator | Molecular Devices or directly from Peter H. Barry | Program is included in the Clampex aquisition software or can be obtained from p.barry@unsw.edu.au | |
| Data acquisition software | Molecular Devices | Clampex 10.X | |
| Data evaluation software | Molecular Devices | Clampfit 10.X | |
| PsACR1 | GenBank or Addgene | KF992074.1 or Addgene plasmid #85465 | Gene encoding for PsACR1 |
| Amplifier guide | Molecular Devices | The Axon Guide |
References
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