Abstract
Geçtiğimiz on yıl boyunca, kanalhodopsinler nörobilimsel araştırmalarda vazgeçilmez bir unsur haline geldi ve hedef hücrelerdeki elektrik süreçlerini invaziv olmayan bir şekilde manipüle etmek için kullanılan araçlar haline geldi. Bu bağlamda, bir kanalhodopsinin iyon seçiciliği özellikle önem taşımaktadır. Bu makale, HEK293 hücrelerindeki elektrofizyolojik yama-klemp kayıtları yoluyla Proteomonas sulcata'nın yakın zamanda tanımlanmış bir anyon iletici kanallıdopsininin klorür seçiciliğinin araştırmasını açıklamaktadır. Işık geçitli fotokroallerinin ölçülmesine yönelik deneysel prosedür, hızlı bir şekilde değiştirilebilir - ideal olarak monokromatik bir ışık kaynağı gerektirir, aksi halde geleneksel bir patch-clamp tertibatının mikroskopta birleştirilir. Deneyden önce preparatif prosedürler, tamponlanmış solüsyonların hazırlanması, sıvı bağlantı potansiyelleri üzerine düşünceler, hücrelerin tohumlanması ve transfeksiyonu ve yama pipetlerinin çekilmesi ile ilgili olarak özetlenmektedir. Akım-gerilim ilişkisinin gerçek kaydıS farklı klorür konsantrasyonları için reversal potansiyelleri belirlemek için transfeksiyondan 24 saat sonra 48 saat gerçekleşir. Son olarak, elektrofizyolojik veriler, klorür iletiminin teorik düşüncelerine göre analiz edilir.
Introduction
Channelrhodopsins (ChR), hareketli yeşil alglerin göz noktasında bulunan ve fototaksis ve fobik reaksiyonlar için birincil fotosensör olarak işlev gören ışık geçmeli iyon kanallarıdır. 2002'deki ilk tanımından bu yana, ChRs ortaya çıkan optogenetik alanın yolunu açtı ve iskelet kasları, kalp veya beyin 3 , 4 , 5 gibi çeşitli uyarılabilir hücrelerde uygulanabilir. ChR'lerin hedef hücrelerde ekspresyonu ilgili hücrenin ışık kontrollü iyon geçirgenliğine neden olur. Nöronal bağlamda, bu, aktarılan iyona bağlı olarak, hareket potansiyeli (AP) tetiklemenin 6 , 7 , 8 veya inhibisyon 9 , 10'un mekansal ve zamansalIşık hassasiyeti, bir ChR varyantının iyon seçiciliğinin optogenetik uygulamasını nasıl belirlediğini vurgular.
Chlamydomonas reinhardtii ve Volvox carteri'den keşfedilen ilk ChRs, protonlara , ayrıca sodyum, potasyum gibi monovalent katyonlara ve daha az oranda kalsiyum ve magnezyum gibi iki değerlikli katyonlara karşı geçirgendir11,12,13. Bugün, 70'den fazla doğal katyon ileten kanalrodopsin (CCR) 14 , 15 , 16 , 17 ve değişik özelliklere sahip 18 , 19 , 20 değişik mühendislik varyasyonları Fotokupi boyutu, spektral duyarlılık, kinetik ve katyon seçiciliği mevcuttur. Nörobilimde, CCR'lerHücreleri harekete geçirmek ve AP'leri tetiklemek için kullanıldığında ışık tahrikli mikrobiyal pompalar yıllardır nöronları susturmak için mevcut tek antagonistti. 2014'te, iki grup aynı anda CCR'lerin, moleküler mühendislik 9 , 21 aracılığıyla varsayılan iyon iletken gözenek boyunca polaritenin değiştirilmesi yoluyla anyon ileten kanalrodopsinlere (ACR'ler) dönüştürülebileceğini gösterdi. Daha sonra doğal ACR'ler birkaç kriptofit alg içinde tanımlandı 22 , 23 , 24 . En önemlisi, ACR'lerin hafif aktivasyonu, erişkin nöronlardaki klorür akımlarına aracılık eder ki, emilen foton başına yalnızca tek yükleri taşıyan mikrobik pompalardan çok daha düşük ışık yoğunluklarında nöronal aktivitenin engellenmesine izin verir.
ChR aktivitesi doğrudan HEK293 hücrelerindeki ışık kaynaklı akımların elektrofizyolojik yama-klemp kayıtları ile ele alınabilir. Yama kelepçesiTekniği başlangıçta 1970'lerin sonlarında geliştirildi ve Hamill ve ark. Tarafından daha da geliştirildi . , Yüksek akım çözünürlüğü ve membran voltajının doğrudan kontrolü ile küçük bir hücreden (bütün hücre modu) akımların varlığının kayıt edilmesine izin verir 26 . Hücre kültürüne uygulanan bu teknik, iyonik ve elektrik kayıt koşullarını doğru bir şekilde kontrol eder ve iyon seçiciliğinin yanı sıra toplam akımın iyonların görece katkısı ile çalışılmasını sağlar. Burada, Proteomonas sulcata'nın ( Ps ACR1) 22 , 23'ün anyon iletken kanal rehidopsiyonu için iyon seçiciliğinin incelenmesini, yüksek klorür iletkenliğini kanıtlamak için çeşitli hücre dışı klorür konsantrasyonları altındaki akım-voltaj ilişkilerinin kaydı inceleyerek örnekleyeceğiz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Şekil 1: Mandal kelepçesi kurulumu. (1) Işık kaynağı, (2) optik fiber, (3) programlanabilir kepenk, (4) sayısallaştırıcı, (5) kepenk sürücüsü, (6) yükseltici, (7) perfüzyon sistemi, (8) kişisel bilgisayar, (9) monitör (10) faraday kafes, (11) mikroskop sahne, (12) perfüzyon girişi, (13) perfüzyon çıkışı, (14) kayıt odası, (15) sıvı seviyesi sensörü, (16) ağar köprüsü ile banyo elektrotu, (17) Pipet tutucu, (22) mikroskop lamba güç kaynağı, (23) su dolu U-tüp, (24) mikroskop lamba yuvası, (21) ters yönlü mikroskop, (18) headstage, Valf, (25) titreşim önleyici masa, (26) CCD kamera. ( A ) Fotoğraflar ve ( B ) kurulumun şematik gösterimi. T daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen buraya tıklayınızOnun şekli.
1. Kayıttan Önce Kurulum
| içi. | extra.1 | extra.2 | |
| Yüksek klorür | Yüksek klorür | Düşük klorür | |
| C [mM] | C [mM] | C [mM] | |
| Na-ASP | 0 | 0 | 140 |
| NaCl | 110 | 140 | 0 |
| KCl | 1 | 1 | 1 |
| CsCl | 1 | 1 | 1 |
| CaCl2 | 2 | 2 | 2 |
| MgCI2 | 2 | 2 | 2 |
| HEPES | 10 | 10 | 10 |
| EGTA | 10 | 0 | 0 |
| pH | 7.2 | 7.2 | 7.2 |
| osmolarite | 290 mOsm | 320 mOsm | 320 mOsm |
Tablo 1: Tamponlanmış Solüsyonların İyonik Kompozisyonu. HEK hücrelerinde klorür seçicilik deneyleri için hücreiçi (intra.) Ve hücre dışı (ekstra.) Tamponların bileşimi. Kullanılan kısaltmalar: etilen glikol tetraasetik asit (EGTA), 4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit (HEPES) ve aspartat (ASP). Tüm konsantrasyonlar mM cinsindendir.
- Kayıt solüsyonlarını, Tablo 1'de gösterildiği gibi iyon konsantrasyonları ile hazırlayın.
- MgCl 2 , CaCl 2 , KCl ve CsCl için ultra saf suda 15 mL 2 M stok solüsyonu hazırlayın.
- Katı bileşenleri 100 mL'lik hücre içi ve500 mL ekstraselüler tamponlu solüsyonları, tablo 1'e göre ayrı ayrı behere yerleştirin ve hazırlanan stok çözeltilerinin ilgili miktarını daha sonra ekleyin. Örneğin, hücre içi tampon için 0.3803 g (10 mM) EGTA, 0.2383 g (10 mM) HEPES ve 0.6428 g (110 mM) NaCI kullanın ve 100 uL 2 M MgCI2 ve CaCl2 ve 50 uL 2 M KCI ve CsCl stok solüsyonları.
- Çok saf su ekleyin ve sitrik asit ve N-metil-D-glukamin (NMG + ) gibi, ChR tarafından yürütülmeyen, ölçüm ile müdahale etmeyen asitler ve bazlar kullanarak pH'ı dikkatle ayarlayın.
- Ozmolarite, hücre içi için 290 mOsm ve glikozlu hücre dışı çözeltiler için 320 mOsm olarak ayarlanır.
Not: Biraz hipoosmotik hücre içi çözümleri yama başarısını artırır 26 . - Tüm solüsyonları steril filtre ile 0.22 μm'lik filtrelerden geçirin. Çözeltileri 4 ° C'de iki hafta depolayınS veya uzun süreli depolamada -20 ° C'de dondurulmalıdır.
- Sıvı bağlantı potansiyellerini hesaplayabilir ve kayıt protokollerini hazırlayabilir.
NOT: Bütün hücre konfigürasyonunu oluşturduktan sonra hücre dışı klorür konsantrasyonunun değişimi, düzeltilmesi gereken önemli sıvı birleşim potansiyeline (LJP) neden olur 27 , 28 . LJP'ler doğrudan ölçülebilir veya hesaplanabilir, burada ikinci seçenek kullanılır. Bu protokolde, her harici tampon için bir kayıt protokolünü gerektiren on-line düzeltme kullanılacaktır. Bununla birlikte, daha büyük bir harici çözüm seti için yanlış düzeltmeyi önlemek için LJP'nin düzeltilmesi önerilmektedir.- Birleşim potansiyeli hesaplayıcıyı (JPC) açın 27 ve 'Yeni Deneme' diyalogunu açın. Ardından "Yama sıkıştırma ölçümleri" ni seçin. "Bütün hücre ölçümleri", "Standart tuz çözeltisi elektrodu" nu seçin ve bir sıcaklık girin.25 ° C. Her adım arasında, "sonraki" düğmesine basarak seçimi kabul ederek ilerleyin.
NOT: Deneyler, klimalı bir laboratuarda 25 ° C'lik oda sıcaklığında yapılır. Deneyleri başlatmadan önce tampon çözeltilerin oda sıcaklığına sahip olduğundan emin olun. Numune sıcaklığını değiştirmek için bir kuluçka safhası veya bölmesi kullanılabilir. Banyo sıcaklığı sıklıkla bir termometre ile ölçülebilir. - Tablo 1'de listelenen konsantrasyonlara göre pipetli solüsyonun ve yüksek klorür tampon maddesinin bütün anyon ve katyon konsantrasyonlarını ekleyin.
NOT: JPC başlangıç koşulları için -0.5 mV'lik bir LJP'yi hesaplar. - Düşük klorür tampon maddesinin anyonik ve katyonik bileşimine girmek için "Yeni Banyo Çözeltisi" ne tıklayın.
NOT: JPC, şimdi değiştirilmiş ekstraselüler kayıt çözümüne göre +12.6 mV yeni bir LJP hesaplayacaktır. - Için iki LJP düzeltmeli protokol hazırlayın.Hesaplanan LJP'yi uygulanan tutma potansiyelinden çıkararak iki ölçüm koşulunu; -0.5 mV yüksek ve düşük klorür harici çözümler için +12.6 mV. Böylece, her iki durumda da -80 mV'lik LJP düzeltmeli bir başlangıç tutma potansiyeli elde etmek için protokoller sırasıyla -79.5 mV (yüksek klorür) ve -92.6 mV (düşük klorür) ile başlar.
NOT: Aşağıdaki adımlar, malzeme listesinde bahsedilen veri edinme yazılımı için geçerlidir. - Satın alma yazılımındaki protokol düzenleyicisini açın. "Mod" menüsüne geçerek "Episodik uyarı" yı seçin ve 7 temizleme ekleyin.
- Editördeki "Dalgaformu" menüsüne geçin ve 0 mV tutma potansiyeline sahip 200 ms periyot ve bunu takiben yüksek klorür için -79.5 mV değerinde değişen tutma potansiyeli olan 2 sn periyot ekleyin. Her taramada tutma potansiyelini 20 mV artırmak için ikinci periyot için 20 mV'luk bir "Delta seviyesi" ekleyin.
- Dalga şeklindeki voltaj adımları içinde540 nm ışıkla (3.10 mW / mm²) 500 ms'lik bir aydınlatma periyodu uygulayın. Bunu yapmak için, açıklanan ikinci periyottan 500 ms sonra ışık kaynağını kontrol eden bağlı deklanşörün "dijital bit düzenini" değiştirin (bkz. 1.2.6).
NOT: Işık yoğunluğu genlik veya inaktivasyon gibi kanal akımlarının biyofiziksel özelliklerini etkileyebilir. Bu nedenle, ışık gücü yoğunlukları daima bildirilmelidir. Tüm optikleri ve lamelleri geçtikten sonra ışığı ölçmek için kalibre edilmiş bir optometre kullanın. Güç yoğunluğunu hesaplamak için nesnenin aydınlık alanını bir nesne mikrometresi ile belirleyin ve ölçülen ışık gücünü belirlenen aydınlatılmış alana bölün. - Yüksek klorid hücre dışı çözeltinin protokolünü kaydedin. Protokolü değiştirin ve birinci seviye tutma potansiyelini -92.6 mV değiştirin (düşük dış klorür). Düşük klorür hücre dışı durumu ölçmek için bu ikinci protokolü kaydedin.
- Cam kapağın lisin kaplaması uyarlanmış protokole göre kayar 29 .
- Bir cam petri kabı içine 100 kapak fişleri yerleştirin ve 250 mL HC1 (1 N) ekleyin.
- Petri kabı kapak folyolarıyla doğrusal çalkalayıcıya yerleştirin ve kapak kayışlarını temizlemek için 120 rpm'de 72 saat çalkalayın ve daha sonra pH'ı nötralize etmek için ultra saf su ile durulayın.
- Daha temizlik için bunları az miktarda% 95 etanol içinde bekletin.
NOT: Devam etmeden önce temiz kapak fişleri% 70 etanol içinde saklanabilir. Aşağıdaki adımlar için laminer akış kaputunun altında çalışın. - Bir Bunsen brülörü ve cımbız kullanarak, her kapak kaymasını alevlendirin ve yeni bir petri kabına aktarın.
- Cam kapak fişlerini 150 rpm'de doğrusal bir çalkalayıcı ile çalkalarken oda sıcaklığında en az 1 saat (veya gece boyunca) steril 50 ug / mL poli-D-lisin solüsyonu ile inkübe edin.
- Fazla poli-D-lisini çıkarmak için kapak fişlerini çok saf su ile yıkayın.
- Kapak fermuarlarını steril kağıda 10 dakika kadar kurumaya bırakın ve sterilizasyon için UV ışığına maruz bırakın (en az 20 dakika).
- Kapak fişlerini, kullanana kadar alüminyum folyo ile kaplanmış steril bir petri kabına koyun.
- Standart moleküler biyoloji teknikleri kullanılarak mCherry ile kaynaştırılmış Ps ACR1 geninin DNA'sını hazırlayın.
- Restriksiyon enzimleri veya diğer kurulan klonlama yöntemleri kullanılarak mCherry floroforu çerçevesinde Ps ACR1'i kodlayan insan kodonuna göre optimize edilmiş gen dizisini bir peGFP-C1 plasmidine (CMV promotor, kanamisin direnci) klonlayın.
Not: Diğer fluoroforlar da kullanılabilir, ancak kurulumda mikroskop altında flüoresanslarını izlemek için uygun filtre setlerine sahip olduğunuzdan emin olun. - Standart protokole göre ısı şoku vasıtasıyla plasmid DNA'yı kemocompetent XL1Blue E. coli hücrelerine dönüştürün ve agar plakalarına (30 μg / mL kanamisin) 30 yerleştirin
- Ertesi gün, tek kolonilerden alınan hücrelerle birlikte 30 μg / mL kanamisin ile desteklenmiş 4 ml likozyojen broth ortamı aşılayın ve bir gece boyunca 37 ° C'de ve 180 rpm'de gece boyunca inkübe edin.
- Gecelik inkübasyondan sonra, imalatçının talimatlarına uygun olarak ticari olarak temin edilebilir bir kit (bakınız Malzeme Tablosu ) kullanılarak kültürlerden plazmid DNA'yı saflaştırınız.
- Restriksiyon enzimleri veya diğer kurulan klonlama yöntemleri kullanılarak mCherry floroforu çerçevesinde Ps ACR1'i kodlayan insan kodonuna göre optimize edilmiş gen dizisini bir peGFP-C1 plasmidine (CMV promotor, kanamisin direnci) klonlayın.
- Hücreleri tohumladım
NOT: Adımları laminar bir akış kaputunun altında yapın.- 35 mm'lik bir petri kabı içinde üç adete kadar lizin kaplı cam kapak folyosunu yan yana koyun.
NOT: Birbirinize kaymayı önlemek için çanağın tabanına hafifçe bastırın. - Her çanakta% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile takviye edilmiş 2 mL standart Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) içinde 1.5 x 10 5 HEK hücresi tohumları.
- At all- trans retinaya ilave1 uM'lik bir nihai konsantrasyon. Adım 1.6 ile devam etmeden önce hücreleri en az bir gün daha büyütün.
- 35 mm'lik bir petri kabı içinde üç adete kadar lizin kaplı cam kapak folyosunu yan yana koyun.
- Lipofeksiyon yoluyla hücreleri geçici olarak transfecte 31 .
- Her bir hücre çanağı için, FBS ve 6 uL transfeksiyon reaktifi olmadan 250 μL DMEM'de (adım 1.4'te hazırlandığı gibi) 2 μg plazmid DNA'nın bir çözeltisi hazırlayın (Bkz. Malzeme Tablosu ).
- 15 dakika kuluçkadan sonra, yavaşça (damla damla) çözeltiyi hücrelere ekleyin.
- Agar köprüleri hazırlayın
- 50 mL steril sodyum klorür çözeltisine (140 mM) 0.75 g agaroz ekleyin ve bir mikrodalga fırında ısıtarak çözün.
NOT: Ağar köprü hazırlığı için 2 - 3 M KCl, daha yüksek konsantrasyon ( örneğin köprüden sabit difüzyon) ve K + ve Cl - iyonlarının eşit hareket kabiliyeti nedeniyle LJP'yi daha da düşürür, ancak iyon- (özellikle Cl-) sızıntısını en aza indirgemek için önlenmiştir Içine Banyo çözeltisi 32 . - Bir şırınga kullanarak sıvı agaroz çözeltisi ile 10 mcL pipet uçları (veya küçük çaplı bir hortum) doldurun.
NOT: Köprüde hava kabarcıklarından kaçının. - Agar köprüleri soğutulduktan ve katılaştıktan sonra, bunları steril 140 mM sodyum klorür çözeltisi içinde saklayın.
- 50 mL steril sodyum klorür çözeltisine (140 mM) 0.75 g agaroz ekleyin ve bir mikrodalga fırında ısıtarak çözün.
- Kayıt ve banyo elektrotlarını hazırlayın.
- Banyodaki gümüş telleri ve patch-clamp tertibatının kayıt elektrodunu çıkarın.
- Önceki deneylerdeki gümüş klorürü gidermek için zımpara ile telleri silkeleyin. Temiz gümüş telini 3 M KCl'ye daldırın ve gümüş klorür ile elektrolitik kaplama için 1,5 V'luk bir pozitif kutupa bağlayın.
NOT: Bir pil yerine bir laboratuar güç kaynağı kullanılabilir.
- Düşük bir dirençli yama pipetlerini (1.5-3.0 MΩ) cam kılcallardan bir mikropipet çekici ile çekin ve Brown ve diğerleri tarafından tarif edildiği gibi ateş parlatınLass = "xref"> 33. Ölçüm günü için pipetleri tozsuz olarak saklayın.
- 30 dakika önceki kayıtlardan çalışma sıcaklığına kadar ısınmak için tüm kurulum bileşenlerini açın. Tamponların oda sıcaklığında olduğundan emin olun.
2. Seçkenlik Ölçümleri
- 1.6'da açıklanan hücrelerin geçici transfeksiyonundan 24-48 saat sonra kayıtları başlatın.
- Ölçüm odasına bir kapak kayışı yerleştirin ve harici tamponun sızmasını önlemek için silikon ile mühürleyin. Bir sonraki deney seti için petri kabını diğer kapak folyolarıyla birlikte bir kuluçka makinesinde saklayın.
- Hücrelerin ayrılmasını önlemek için dikkatli bir şekilde hücre dışı tampon (yüksek [Cl - ]) doldurun, daha sonra mikroskop altına yerleştirin ve hücre görüntüleme için 40X hedefini kullanın.
- Banyo elektrodunun üzerine bir agar köprüsü koyun ve sıvı seviyesi sensörü ve banyo tutucusunun perfüzyon çıkışıyla birlikte odaya yerleştirin.
- Eski değiştirKalıntı kültür ortamı ve ayrılmış hücreleri çıkarmak için iki kez harici hücre çözeltisi 1 mL taze harici çözelti (yüksek [Cl - ]) ile yıkandı.
- Hücreleri odağa getirin ve diğer hücrelerden izole edilmesi gereken transfekte (flüoresan) bir hücre arayın. MCherry'i heyecanlandırmak ve görselleştirmek için üç bantlı filtre seti ve turuncu ışık (590 nm; bant genişliği 15 nm;% 100 yoğunluk) kullanın.
NOT: HEK hücreleri, komşularına boşluk kavşakları 34 ile elektriksel olarak bağlanabilir ve tüm hücre konfigürasyonunda düşük zar direncine neden olabilir. - Çekilen pipetlerden birini hücre içi çözeltiyle doldurun ve birkaç kez pipet çevirerek hava kabarcıklarını alın.
- Pipet tutacağı üzerine pipet takın ve ucun tıkanmasını önlemek için pozitif bir basınç uygulayın.
- Düzeltme pipetinin ucunu mikroskop altında bulun ve mikromanipülatörü kullanarak hücrenin yakınına gidin.
NOT: Aşağıdaki adımlar,Mpeptör, veri toplama ve değerlendirme yazılımları. - Veri toplama yazılımındaki "membran testi" ni başlatın ve "membran testi" çalıştırırken "banyo modu" kullanarak belirtilen yazılım aracılığıyla manuel veya otomatik olarak bir voltaj adımı (test pulsu, örneğin 10 mS için 5 mV, taban çizgisi 0 mV) Veri edinme yazılımında.
- Pipet direncinin istenen aralıkta (1,5-3,0 MΩ) olup olmadığını kontrol edin.
- "Membran testi" nin "banyo modu" nda çalışırken amplifikatördeki pipet kaydırma düğmesini çevirerek pipet potansiyelini ayarlayarak sıfır ofset akımlar.
- Tüm hücre konfigürasyonunda bir yama oluşturun 26 .
NOT: Aşağıdaki adımlar, kullanılan pipet tutucusunun yan bağlantı noktasına iletilen pozitif ve negatif basınç uygulamasını gerektirir. Bu, bir şırınga, bir ağız parçası veya bir elektronik olarak koni yoluyla yapılabilirTrolled basınç regülatörü. Bu protokolde pozitif ve negatif basınç bir ağız parçası vasıtasıyla uygulanır.- Üzerinden yama pipetiyle hücrenin yanına yavaş yavaş yaklaşın ve dokunmadan önce pozitif basıncı rahatlatın.
NOT: Uç hücreye yakın olduğunda, direnç hafifçe yükselir; Bu, test darbesinin azaltılmış boyutu ile gösterilir. - "Membran testi" ni "banyo modu" ndan "yama modu" na, böylece bekleme potansiyelini beklenen istirahat potansiyeline (-30 ila -40 mV) değiştirin.
- Bazı durumlarda, hücreye bağlı konfigürasyon, pozitif basıncın (2.13.1) serbest bırakılmasından sonra kendini oluşturur, öyle değilse, gigaseal oluşumuna yardımcı olmak için yavaşça negatif basınç uygulayın.
NOT: Test ekibi, darbenin başında ve sonunda iki küçük kapasitif tepe değerine düştüğünde ve membran direnci GΩ aralığında olduğunda, hücreye bağlı yapılandırma kurulur; -60 mV m'ye kadar negatif gerilimlerBu, gigaseal oluşumunu kolaylaştırır. - Test palsına düz tepki elde etmek için "pipet kapasitans kompanzasyonu" düğmelerini çevirerek pipet kapasitesini telafi edin.
- Tam hücreli konformasyon elde etmek için, yamayı, negatif basınç veya negatif basınç ile artan mukavemet arasında kısa darbeler uygulayarak mühür bozulmadan yırtın.
NOT: Hücrelere bağlı hücrelerden tam hücreli konfigürasyona geçiş başarılı bir şekilde kapasitif zirve artışıyla belirtilir. - Zar potansiyelini istenen tutma voltajına doğru sıkıştırmak için, bütün hücre parametresini ve kullanılan amplifikatörün telafi ayarlarını ayarlayarak seri direnç telafisini uygulayın.
- "Seri direnç telafisi" paneli "membran testi" ni "bütün hücre" moduna geçirin, kapasitif yanıtın aşırı ve titremesinden kaçınarak "tahmini" ve "düzeltme" değerlerini 90'a kadar açın, tüm hücreyi açınKompanzasyon anahtarı açılmalı ve tüm hücre parametrelerini, ideal olarak düz bir test sızdırmazlık tepkisi elde etmek için amplifikatörün uygun ön panel düğmeleriyle ("bütün hücre kapasitesi" ve "seri direnci") tekrarlayan bir şekilde ayarlayın.
NOT: Bu prosedür farklı imalatçılar arasında değişiklik göstereceğinden seri direnç telafisinin ve düzeltmesinin ayrıntılı açıklaması için amplifikatör el kitabına veya kılavuza bakın.
- "Seri direnç telafisi" paneli "membran testi" ni "bütün hücre" moduna geçirin, kapasitif yanıtın aşırı ve titremesinden kaçınarak "tahmini" ve "düzeltme" değerlerini 90'a kadar açın, tüm hücreyi açınKompanzasyon anahtarı açılmalı ve tüm hücre parametrelerini, ideal olarak düz bir test sızdırmazlık tepkisi elde etmek için amplifikatörün uygun ön panel düğmeleriyle ("bütün hücre kapasitesi" ve "seri direnci") tekrarlayan bir şekilde ayarlayın.
- Tam hücre konfigürasyonunu oluşturduktan sonra, yama pipet 35 aracılığıyla hücre içi çözeltinin yeterli bir şekilde değiştirilmesini sağlamak için kayıttan önce en az 2 dakika bekleyin.
- Üzerinden yama pipetiyle hücrenin yanına yavaş yavaş yaklaşın ve dokunmadan önce pozitif basıncı rahatlatın.
- Daha önce kurulmuş olan protokolleri kullanarak ışık tutarlı akımları farklı tutma potansiyellerinde kaydedin (1.2'de).
- Ekstraselüler tamponu bölgedeki düşük [Cl - ] yamayı yok etmeden en az beş kez değiştirin ve t de bir başka akım-gerilim ilişkisi (adım 1.2'yi kaydedin) kaydedinO yeni klorür konsantrasyonu.
NOT: Otomatik tampon değişimi için bir perfüzyon sistemi bu işlemi kolaylaştırır, ancak gerekli değildir. - 2.15'i tekrarlayın. Test edilecek her iyonik koşul için, ancak yukarıda açıklanan "membran testi" ile ölçümler arasındaki yamanın kalitesini defalarca kontrol edin.
NOT: Doğru membran voltajını ve istikrarlı hücre içi iyon kompozisyonunu garanti altına almak için zar direnci 500 MΩ'un üzerinde olmalıdır, oysa erişim direnci 10 MΩ'u geçmemelidir, bkz . 2.12.6). Membran testi için bütün hücre parametre kompanzasyonunu kapatmayı unutmayın. - 2.2 tekrarlayın. 2.15'e. Birkaç hücre için, ancak hücrelerin sağlıklı olmasını sağlamak için her test serisi için yeni bir kapak kayışı kullanın.
3. Veri Değerlendirmesi
- Aydınlatmadan önce ortalama akımı çıkararak her akım izinin taban çizgisini ayarlayın.
- Ortalama durağan fotokupi I s (
- Test edilen tüm koşullar ve farklı hücreler için 3.1 ve 3.2 adımlarını tekrarlayın.
- Elde edilen tutma potansiyeline karşı belirlenen fotokroaller çizin.
NOT: Birden fazla ölçüm ortalaması alınırsa, bireysel kayıtlar belirli bir koşula veya hücrenin kapasitesine göre normalleştirilebilir. - Akım-voltaj ilişkisinin voltaj ekseni ile kesişimi, ters potansiyelini (net akım sıfır) temsil eder. İki komşu veri noktası arasındaki doğrusal enterpolasyonla bunu belirleyin.
NOT: Fotokrasilerin polarite tersine çevrilmesi yoksa, kesişme noktasının bir yaklaştırmasını elde etmek için son iki noktadan doğrusal olarak ekspolasyon yapın. - Belirlenmiş r ortalamasının ortalamasıAynı koşullar için everspower potansiyelleri ve onları harici tampon çözeltilerinin klorür konsantrasyonuna karşı planlayın ( Şekil 2B'ye bakın ).
- Birleşim potansiyeli hesaplayıcıyı (JPC) açın 27 ve 'Yeni Deneme' diyalogunu açın. Ardından "Yama sıkıştırma ölçümleri" ni seçin. "Bütün hücre ölçümleri", "Standart tuz çözeltisi elektrodu" nu seçin ve bir sıcaklık girin.25 ° C. Her adım arasında, "sonraki" düğmesine basarak seçimi kabul ederek ilerleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 2 , tarif edilen protokolden sonraki ölçümlerden elde edilen temsili sonuçları göstermektedir. Yeşil ışık ile aydınlatma esnasında, Ps ACR1 hızlı bir geçici akım içerir ve bu hızla sabit bir akım seviyesine kadar azalır. Işık kapatıldıktan sonra, fotokupiller milisaniye içinde sıfıra iner ( Şekil 2A ). Ekstrasellüler klorür konsantrasyonunun değişimi, elde edilen fotokupl izlerinde doğrudan görülebilen ters potansiyelin kaymasına neden olur. Birden fazla ölçümden gelen reversal potansiyellerin değerlendirilmesi, dış klorür konsantrasyonunun değişiminden kaynaklanan çarpıcı ters potansiyel kaymasını nicelendirir ( Şekil 2B ). Çarpıcı şekilde, ölçülen ters potansiyeller doğrudan Ps ACR1'in yüksek klorür seçiciliğini teyit eden klorür için hesaplanan Nernst potansiyellerine karşılık gelir ( Şekil 2C ).
T "fo: keep-together.within-sayfa =" 1 ">
Şekil 2: PS ACR1'in klorür seçiciliği . ( A ) HEK293 hücrelerinde Ps ACR1'in temsili mevcut izleri. Hücre içi klorür konsantrasyonu 120 mM'de muhafaza edilirken, hücre dışı konsantrasyon, NaCl'nin Na aspartat ile kısmen değiştirilmesiyle 150 mM (yeşil) ila 10 mM (mor) klorid arasında değişti. Holding potansiyeli -80 mV'den +40 mV'ye (LJP düzeltilmiş) 20 mV adımlarla yükseltildi. ( B ) Ortalama akım-gerilim ilişkileri (n = 6, A'daki koşullara karşılık gelir). ( C ) Ters çevirme potansiyelleri (merkez çizgiler medyan gösterir, kutu sınırları 25 ve 75 persantilleri, bıyıklar standart sapmanın 2 katını uzar ve daireler tek veri noktalarını gösterir) akım voltaj ilişkilerinden çıkarılır. Yüksek klorür konsantrasyonu için(Yeşil) değer, -20 mV ile 0 mV tutma potansiyeli arasında doğrusal olarak enterpolasyona tabi tutulurken, değer +40 mV'nin üzerinde (mor, kesik çizgi, panel B) lineer olarak ekstrapole edilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tanımlanmış iyonik ve elektrik koşullarındaki ters potansiyellerin saptanması, ChRs'in ışık aktivasyonu sonrasında taşınan iyon türleri hakkında bilgi verir. Tek bir iyon türü karmaşık bir fizyolojik ortamda çeşitlenirse ve elde edilen ters potansiyel teorik Nernst potansiyeline göre değişirse, bu iyon türü taşınan tek sayıdır.
Bununla birlikte, ChR'ler için, ters potansiyel kaymalar, farklı iyonik türlere geçirgenlik ve ayrıca iletken iyonlar arasındaki rekabet nedeniyle Nernst denkleminden beklenenden daha az belirgindir. Bu durumda, durum daha karmaşık hale gelir ve potansiyel olarak iletilen tüm iyonlar, çeşitli ölçme çözümleri talep ederek ayrı olarak değiştirilmelidir. Buna ek olarak, çoğu CCR ve ilk yapay ACR 9 , 10 , 21 protonlar için iletkendir, ancak değişen proton konsantrasyonlarıProton konsantrasyonu sadece reversal potansiyelleri kaydırmakla kalmayıp aynı zamanda iyon iletkenliğini 9 , fotokuperal kinetiği 21,36 ve spektral ışık hassasiyetini 11,37 etkileyebileceğinden , özellikle ayrıntılı bir analiz gerektirir, çünkü hidrojen bağlanma ağlarının değişimi, protonlanma durumu Bireysel kalıntılar ve ikincil yapı değişiklikleri. Proton iletkenliği, Na + , Ca 2+ veya Cl - gibi diğer tüm potansiyel olarak iletilen iyonların konsantrasyonlarının azaltılmasıyla, yukarıda bahsedilen protein değişimlerinden kaçınmak için pH'ı sabit tutarak ele alınabilir. Yapılmayan ikameler genellikle katyonlar 12 için NMG + ve glukonat, 2- ( N- morfolino) etansülfonat (MES - ) veya anyonlar için aspartat gibi hacimli yüklü moleküllerdir. Farklı i'deki ters potansiyellerin karşılaştırılmasıOnik çözeltiler, Goldman-Hodgkin-Katz gerilim denklemi ile denge koşullarında göreli iyon geçirgenliklerinin hesaplanmasına izin verir. Bununla birlikte, denge koşullarının ötesinde iyon rekabetini göz önüne alarak, farklı iyonların net fotokroenerasyona olan tam katkısını nicel olarak ölçmek, karmaşık matematiksel modelleri 12 , 38 gerektirir.
ChRs tarafından taşınan iyonların bileşiminin bilinmesi özellikle nörofizyolojik bağlamda ChR uygulamasından kaynaklanabilecek yan etkilerin aydınlatılmasına yardımcı olur. Örneğin, uzun süren ChR aktivasyonu, intraselüler asidifikasyona neden olabilir 39 veya iletken Ca 2+ , sinaptik salınımı ve ikinci mesaj yollarını tetikleyebilir 40 . Hücreler genellikle dokularda sıkı bir şekilde dolaştırıldığından, mikrobiyal rhodopsins'in aktivasyonu hücre içi iyon kompozisyonunu değil aynı zamanda hücre dışı lümeni de etkiler ve böylece nKomşu hücreler 41 .
İyon seçiciliğine rağmen, ChRs'in fotoaktif akım amplitüdleri, inaktivasyonu, spektral veya ışık duyarlılığı ve kinetik özellikleri gibi diğer biyofiziksel özellikleri, optogenetik teknikler içeren deneyleri yapmak, tasarlamak ve yorumlamak için çoğu zaman ilgi çekicidir. Bu özelliklerin bazıları, başka yerde 18 , 37 , 42'de açıklandığı gibi yukarıdaki protokolden de tespit edilebilir. ChR ifade eden hücrenin ışık duyarlılığını araştırmak için ışık yoğunluğu, ışık kaynağının gücünü ayarlayarak veya nötr yoğunluk filtreleri ile aktivasyon ışığını hafifleterek değiştirilebilir. Spektral duyarlılığı elde etmek için çok renkli bir ışık kaynağı gereklidir ve şiddetler, tüm dalga boyları için eşit foton akısına ve bant genişliğine ayarlanmalıdır. Yüksek yoğunluklu spektrumlar, kısa ışık palsları veya fotosentezin emilim spektrumlarına benzemektedir.Lazer yanıp sönüyor, aksi takdirde adaptasyon fenomeni ve fotokimyasal geri tepkiler oluşabilir. Kısmen inaktive tamamen aktif ChR'ye (genel fotosikül devri süresi) geri dönüş, iki ışıklı darbe arasında artan karanlık aralıklarla çift pulslu bir protokol uygulayarak belirlenebilir. Yukarıda tartışılan ChRs'in biyofiziksel özellikleri, deneysel ihtiyaçlara uyan uygun bir ChR seçimi için önemlidir 40 .
Bu biyofiziksel özelliklerin elektrofizyolojik tekniklerle türetilmesi, spektroskopik yöntemlerle zar zor kaplanan protein fonksiyonuna doğrudan benzemektedir. Voltaj kelepçesi ölçümlerinin başarılı bir şekilde kurulmasından sonra, teknik bölgeye yönelik mutajenez 9 , 11 , 43 , 44 , heliks-shuffling 37 gibi protein mühendisliği yaklaşımları ile birleştirilebilir ,
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Mükemmel teknik yardım için Maila Reh, Tharsana Tharmalingam ve özellikle Altina Klein'e teşekkür ediyoruz. Bu çalışma, Alman Araştırma Vakfı (DFG) (SFB1078 B2, PH için FOR1279 SPP1665) ve Kataliz, UniCat, BIG-NSE (JV) ve E4 (PH) Kavramlarını Birleştiren Kümeler tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK293 cells | Sigma Aldrich | 85120602 | Human embryonic kidney cells |
| Retinal | Sigma Aldrich | R2500 | all-trans retinal |
| FuGENE HD | Promega | E2312 | Transfection reagent |
| DMEM | Biochrome | FG 0445 | Dulbecco's Modified Eagle Medium |
| Agarose | Roth | 3810 | Agar bridges |
| CaCl2 | Roth | 5239 | CaCl2 2H2O |
| CsCl | Biomol | 2452 | |
| EGTA | Roth | 3054 | |
| FBS | Biochrome | S0615 | Cell culture |
| Glucose | Roth | HN06 | D(+)-Glucose |
| KCl | Roth | 6781 | |
| MgCl2 | Roth | 2189 | MgCl2 6H2O |
| NaCl | Roth | 3957 | |
| NMG | Sigma Aldrich | M2004 | N-Methyl-D-glucamine |
| Na-Aspartate | Sigma Aldrich | A6683 | L-Aspartic acid sodium salt monohydrate |
| Citric acid | Roth | 6490 | |
| AgeI | ThermoFischerScientific | ER1462 | Restriction enzyme |
| XhoI | ThermoFischerScientific | ER0695 | Restriction enzyme |
| NheI | ThermoFischerScientific | ER0975 | Restriction enzyme |
| XL1Blue E. coli | Agilent Technologies | 200249 | Chemocompetent E. coli |
| Kanamycin | Roth | T832 | |
| Lysogeny broth medium | Roth | X964 | |
| Agar-Agar | Roth | 6494 | Agar plates |
| Plasmid purification kit | Marchery-Nagel | 740727.25 | |
| Penicilin/Streptomycin | Biochrome | A 2213 | Cell culture |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma Aldrich | P6407-5MG | Cover slip coating |
| Microforge | Custom made | Fire polishing | |
| Serological pipettes | TPP | Different sizes | |
| Clean bench | Kojair | Biowizard SL130 | |
| Stirrer | IKA | RCT classic | |
| Silver wire | Science Products | AG-T25; AG-T10 | Electrodes, 0.64 mm (bath); 0.25 mm (electrode) |
| pH-meter | Knick | 765 Calimetric | |
| Osmometer | Vogel | OM 815 | |
| Microscope | Carl Zeiss | ID03 | Fire polishing |
| CO2 incubator | Binder | CB150 | |
| Cell culture dishes | TPP | 93040 | 34 mm internal diameter |
| Cover slips | Roth | P232 | 15 mm diameter |
| Thermometer | Rössel Messtechnik | MTM12 | |
| Beamsplitter | Chroma | 21011 | 90/10 transmission |
| Pipette holder | ALA Scientific Instruments | PPH-1P-AXU-0-1.5 | |
| Headstage | Molecular Devices | CV203BU | |
| Amplifier | Molecular Devices | AxoPatch200B | |
| Digitizer | Molecular Devices | DigiData1400 | Digital analog converter |
| Lightsource | TILL Photonics | Polychrome V | Set to 540 nm full intensity |
| Microscope | Carl Zeiss | Axiovert 100 | |
| Shutter | Vincent Associates | VS25 | |
| Shutter driver | Vincent Associates | VCM-D1 | |
| Glass capilarries | Warner Instruments | G150F-3 | Boresilicate capillaries with fire polished ends OD 1.5 mm ID 0.86 mm |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P1000 | |
| Bath handler | Lorenz Messgerätebau | MPCU | |
| Tripleband filterset | Chroma | 69008 | Fluorescence filter ECFP/EYFP/mCherry |
| CCD camera | Watec | Wat-221SCCD | |
| Optometer | Gigahertz Optik | P9710 | Measure light intensities |
| Objective | Carl Zeiss | 421462-9900-000 | W Plan-Apochromat 40X/1.0 DIC |
| Micromanipulator | Scientifica | PatchStar | |
| Recording chamber | Custom made | ||
| Power supply | Manson | HCS-3202 | Avoids electrical noise from microscope built-in power supply |
| Vibration isolated table | Newport | M-VW-3636-OPT-01 | |
| Faraday cage | Custom made or any commercial matching table | ||
| Hoses | Any comercial; e.g. Roth | Different sizes and materials for bath handling and application of pipette pressure; agar bridges | |
| Linear shaker | Sunlab Instruments | SU 1000 | |
| Liquid junction potential calculator | Molecular Devices or directly from Peter H. Barry | Program is included in the Clampex aquisition software or can be obtained from p.barry@unsw.edu.au | |
| Data acquisition software | Molecular Devices | Clampex 10.X | |
| Data evaluation software | Molecular Devices | Clampfit 10.X | |
| PsACR1 | GenBank or Addgene | KF992074.1 or Addgene plasmid #85465 | Gene encoding for PsACR1 |
| Amplifier guide | Molecular Devices | The Axon Guide |
References
- Hegemann, P. Algal sensory photoreceptors. Annu. Rev. Plant Biol. 59, 167-189 (2008).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae. Science. 296 (5577), 2395-2398 (2002).
- Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of contractile function in skeletal muscle. Nat. Commun. 6 (7153), 1-8 (2015).
- Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo. Nat. Methods. 7 (11), 897-900 (2010).
- Zhang, F., et al. The microbial opsin family of optogenetic tools. Cell. 147 (7), 1446-1457 (2011).
- Nagel, G., et al. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr. Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
- Li, X., et al. Fast noninvasive activation and inhibition of neural and network activity by vertebrate rhodopsin and green algae channelrhodopsin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (49), 17816-17821 (2005).
- Ishizuka, T., Kakuda, M., Araki, R., Yawo, H. Kinetic evaluation of photosensitivity in genetically engineered neurons expressing green algae light-gated channels. Neurosci. Res. 54 (2), 85-94 (2006).
- Wietek, J., et al. Conversion of channelrhodopsin into a light-gated chloride channel. Science. 344 (6182), 409-412 (2014).
- Berndt, A., et al. Structural foundations of optogenetics: Determinants of channelrhodopsin ion selectivity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 113 (4), 822-829 (2016).
- Tsunoda, S. P., Hegemann, P. Glu 87 of Channelrhodopsin-1 Causes pH-dependent Color Tuning and Fast Photocurrent Inactivation. Photochem. Photobiol. 85 (2), 564-569 (2009).
- Schneider, F., Gradmann, D., Hegemann, P. Ion selectivity and competition in channelrhodopsins. Biophys. J. 105 (1), 91-100 (2013).
- Prigge, M. Über die elektrophysiologische Untersuchung und Entwicklung von farbverschobenen Kanalrhodopsinchimären aus der Grünalge Volvox carteri. , Diss. Humboldt-Universität zu Berlin. Available from: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:11-100203476 (2012).
- Govorunova, E. G., Spudich, E. N., Lane, C. E., Sineshchekov, O. A., Spudich, J. L. New Channelrhodopsin with a Red-Shifted Spectrum and Rapid Kinetics from Mesostigma viride. MBio. 2 (3), 1-9 (2011).
- Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Li, H., Janz, R., Spudich, J. L. Characterization of a highly efficient blue-shifted channelrhodopsin from the marine alga Platymonas subcordiformis. J. Biol. Chem. 288 (41), 29911-29922 (2013).
- Hou, S. -Y., et al. Diversity of Chlamydomonas Channelrhodopsins. Photochem. Photobiol. 88 (1), 119-128 (2012).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat. Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophys. J. 96 (5), 1803-1814 (2009).
- Yizhar, O., et al. Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction. Nature. 477 (7363), 171-178 (2011).
- Berndt, A., Yizhar, O., Gunaydin, L. a, Hegemann, P., Deisseroth, K. Bi-stable neural state switches. Nat. Neurosci. 12 (2), 229-234 (2009).
- Berndt, A., Lee, S. Y., Ramakrishnan, C., Deisseroth, K. Structure-Guided Transformation of Channelrhodopsin into a Light-Activated Chloride Channel. Science. 344 (6182), 420-424 (2014).
- Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Spudich, J. L. Proteomonas sulcata ACR1: A Fast Anion Channelrhodopsin. Photochem. Photobiol. 92 (2), 257-263 (2016).
- Wietek, J., Broser, M., Krause, B. S., Hegemann, P. Identification of a Natural Green Light Absorbing Chloride Conducting Channelrhodopsin from Proteomonas sulcata. J. Biol. Chem. 291 (8), 4121-4127 (2016).
- Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Janz, R., Liu, X., Spudich, J. L. Natural light-gated anion channels: A family of microbial rhodopsins for advanced optogenetics. Science. 349 (6248), 647-650 (2015).
- Neher, E., Sakmann, B., Steinbach, J. H. The extracellular patch clamp: A method for resolving currents through individual open channels in biological membranes. Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. 375 (2), 219-228 (1978).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. Arch. Eur. J. Physiol. 391 (2), 85-100 (1981).
- Barry, P. H. JPCalc, a software package for calculating liquid junction potential corrections in patch-clamp, intracellular, epithelial and bilayer measurements and for correcting junction potential measurements. J. Neurosci. Methods. 51 (1), 107-116 (1994).
- Amtmann, A., Sanders, D. A unified procedure for the correction of liquid junction potentials in patch clamp experiments on endo- and plasma membranes. J. Exp. Bot. 48, (Special) 361-364 (1997).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).
- Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. J. Vis. Exp. (63), e1-e18 (2012).
- Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 84 (21), 7413-7417 (1987).
- Halliwell, J., Whitaker, M., Ogden, D. Using microelectrodes. Microelectrode Tech. Plymouth Work. Handb. 3, 1-15 (1949).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J. Vis. Exp. (20), e1-e2 (2008).
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
- Pusch, M., Neher, E. Rates of diffusional exchange between small cells and a measuring patch pipette. Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. 411 (2), 204-211 (1988).
- Berndt, A. Mechanismus und anwendungsbezogene Optimierung von Channelrhodopsin-2. , Diss Humboldt-Universität zu Berlin. Available from: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:11-100191266 (2011).
- Prigge, M., et al. Color-tuned channelrhodopsins for multiwavelength optogenetics. J. Biol. Chem. 287 (38), 31804-31812 (2012).
- Gradmann, D., Berndt, A., Schneider, F., Hegemann, P. Rectification of the channelrhodopsin early conductance. Biophys. J. 101 (5), 1057-1068 (2011).
- Beppu, K., et al. Optogenetic countering of glial acidosis suppresses glial glutamate release and ischemic brain damage. Neuron. 81 (2), 314-320 (2014).
- Wietek, J., Prigge, M. Enhancing Channelrhodopsins: An Overview. Methods Mol. Biol. 1408, 141-165 (2016).
- Ferenczi, E. A., et al. Optogenetic approaches addressing extracellular modulation of neural excitability. Sci. Rep. 6, 1-20 (2016).
- Zhang, F., et al. Red-shifted optogenetic excitation: a tool for fast neural control derived from Volvox carteri. Nat. Neurosci. 11 (6), 631-633 (2008).
- Sugiyama, Y., et al. Photocurrent attenuation by a single polar-to-nonpolar point mutation of channelrhodopsin-2. Photochem. Photobiol. Sci. 8 (3), 328-336 (2009).
- Kleinlogel, S., et al. Ultra light-sensitive and fast neuronal activation with the Ca2+-permeable channelrhodopsin CatCh. Nat. Neurosci. 14 (4), 513-518 (2011).
- Wang, H., et al. Molecular determinants differentiating photocurrent properties of two channelrhodopsins from chlamydomonas. J. Biol. Chem. 284 (9), 5685-5696 (2009).
- Gradinaru, V., Thompson, K. R., Deisseroth, K. eNpHR: a Natronomonas halorhodopsin enhanced for optogenetic applications. Brain Cell Biol. 36 (1-4), 129-139 (2008).
- Berglund, K., et al. Luminopsins integrate opto- and chemogenetics by using physical and biological light sources for opsin activation. Proc. Natl. Acad. Sci. 113 (3), 358-367 (2016).
