Abstract
Negli ultimi dieci anni, i channelrhodopsins sono diventati indispensabili nella ricerca neuroscientificale, dove vengono utilizzati come strumenti per manipolare in modo non invasivo i processi elettrici nelle cellule bersaglio. In questo contesto, la selettività ionica di un channelrhodopsin è di particolare importanza. In questo articolo si descrive l'analisi della selettività di cloruro per una scanografia di Proteomonas sulcata recentemente identificata da anion-conducting channel mediante protezioni elettrofisiologiche di patch-clamp sulle cellule HEK293. La procedura sperimentale per misurare le fotocorri luminose richiede una sorgente luminosa rapida - idealmente monocromatica - accoppiata nel microscopio di una configurazione di patch-clamps altrimenti convenzionale. Sono state descritte procedure preparative prima dell'esperimento che prevedono la preparazione di soluzioni tamponate, considerazioni sui potenziali di giunzione liquidi, la semina e la trasfezione delle cellule e la trazione delle pipette patch. La registrazione effettiva della relazione di tensione-correnteS per determinare le potenzialità di inversione per diverse concentrazioni di cloruro si svolge 24 h a 48 h dopo la trasfezione. Infine, i dati elettrofisiologici vengono analizzati rispetto alle considerazioni teoriche della conduzione di cloruro.
Introduction
Channelrhodopsins (ChR) sono canali ionici leggeri che si verificano nel punto di occhio delle alghe verdi motile e servono come fotosensori primari per fototassi e risposte fobiche 1 . Dalla loro prima descrizione nel 2002 2 , i ChRs hanno aperto la strada per il campo emergente dell'ottogenetica e possono essere applicati in una varietà di cellule eccitabili, ad es. Nei muscoli scheletrici, nel cuore o nel cervello 3 , 4 , 5 . L'espressione di ChRs nelle cellule bersaglio produce una permeabilità ionica controllabile dalla luce della rispettiva cellula. In un contesto neuronale, questo consente l'attivazione 6 , 7 , 8 o inibizione 9 , 10 di cottura del potenziale d'azione (AP) - a seconda dello ione condotto - con lo spazio e temporaliPrecisione della luce sottolineando come la selettività ionica di una variante ChR determina l'applicazione ottogenetica.
I primi ChRs scoperti da Chlamydomonas reinhardtii e Volvox carteri sono permeabili a protoni, ma anche a cationi monovalenti come il sodio, il potassio e, in misura minore, a cationi bivalenti come il calcio e il magnesio 11 , 12 , 13 . Oggi, più di 70 cantipolisini naturali (CCR) 14 , 15 , 16 , 17 e varie varianti progettate 18 , 19 , 20 con proprietà diverse come La dimensione fotocirrente, la sensibilità spettrale, la cinetica e la selettività del cation sono disponibili. Mentre nella neuroscienza, CCRs aUtilizzati per attivare le cellule e attivare AP, le pompe microbiche a luce guidata sono stati gli unici antagonisti disponibili per annientare i neuroni. Nel 2014, due gruppi hanno dimostrato simultaneamente che i CCRs possono essere convertiti in channelrhodopsins (ACR) di anion-conducting mediante alterazione della polarità lungo il poro conducente ionico attraverso l'engineering molecolare 9 , 21 . Successivamente, ACR naturali sono stati identificati in diverse alghe di crittophyte 22 , 23 , 24 . Più importante, l'attivazione leggera di ACR mediata dalle correnti di cloruro nei neuroni adulti permette di inibire l'attività neuronale a intensità luminosa molto minori rispetto alle pompe microbiche che trasportano solo singole cariche per fotone assorbito.
L'attività di ChR può essere direttamente affrontata mediante registrazioni elettrofisiologiche di patch-clamp di correnti indotte da luce nelle cellule HEK293. La pinzettaLa tecnica è stata originariamente sviluppata alla fine degli anni '70 25 e ulteriormente migliorata da Hamill et al. , Consentendo la registrazione dell'entità delle correnti da una piccola cella (modalità di intera cellula) con alta risoluzione di corrente e controllo diretto della tensione della membrana 26 . Applicata nella coltura cellulare, questa tecnica fornisce un preciso controllo delle condizioni di registrazione ioniche e elettriche e consente di studiare la selettività degli ioni insieme al relativo contributo degli ioni alla corrente totale. Qui esemplifica l'esame della selettività ionica per il channelrhodopsin di Anion -conducting di Proteomonas sulcata ( Ps ACR1) 22 , 23 attraverso la registrazione di relazioni di tensione-corrente in varie concentrazioni di cloruro extracellulare per dimostrare un'elevata conduttanza di cloruro.
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Protocol
Figura 1: Configurazione Patch-clamp. (8) personal computer, (9) monitor (9) monitoraggio (1) sorgente luminosa, (2) fibra ottica, (3) otturatore programmabile, , (16) elettrodo del bagno con il ponte agar (17), (16) elettrodo del bagno con il ponte agarico, (17) (22) lampada a microscopio, (23) tubo a U con acqua, (24) a tre vie Valvola, (25) tabella antivibrazioni, (26) telecamera CCD. ( A ) Fotografie e ( B ) rappresentazione schematica del setup. Clicca qui per vedere una versione più grande di tLa sua figura.
1. Impostazione prima delle registrazioni
| intra. | extra.1 | extra.2 | |
| Alto cloruro | Alto cloruro | Basso cloruro | |
| C [mM] | C [mM] | C [mM] | |
| Na-ASP | 0 | 0 | 140 |
| NaCl | 110 | 140 | 0 |
| KCl | 1 | 1 | 1 |
| CsCl | 1 | 1 | 1 |
| CaCl2 | 2 | 2 | 2 |
| MgCl2 | 2 | 2 | 2 |
| HEPES | 10 | 10 | 10 |
| EGTA | 10 | 0 | 0 |
| pH | 7.2 | 7.2 | 7.2 |
| osmolarità | 290 mOsm | 320 mOsm | 320 mOsm |
Tabella 1: Composizione ionica delle soluzioni tamponate. Composizione di tamponi intracellulari (intra) e extracellulari (extra) per esperimenti di selettività di cloruri nelle cellule HEK. Abbreviazioni utilizzate: acido tetraacetico etilenico glicole (EGTA), acido 4- (2-idrossietil) -1-piperazinattanesolfonico (HEPES) e aspartato (ASP). Tutte le concentrazioni sono in mM.
- Preparare le soluzioni di registrazione con concentrazioni di ioni come indicato nella Tabella 1.
- Preparare 15 ml di 2 M stock solutions in acqua ultrapure per MgCl2, CaCl2, KCl e CsCl.
- Pesare i componenti solidi per 100 ml di intracellulari e500 ml delle soluzioni tamponate extracellulari secondo la tabella 1 in bicchieri separati e aggiungere successivamente la rispettiva quantità delle soluzioni preparate. Ad esempio, per il tampone intracellulare, utilizzare 0,3803 g (10 mM) EGTA, 0,2383 g (10 mM) HEPES e 0,6428 g (110 mM) NaCl e aggiungere 100 μL di 2 M MgCl 2 e CaCl 2 e 50 μL di 2 M soluzioni KCl e CsCl.
- Aggiungere acqua ultrapure e regolare con precisione il pH utilizzando acidi e basi, che non interferiscono con la misura, cioè non sono condotti dal ChR, come acido citrico e N-metil-D-glucamina (NMG + ).
- Regolare l'osmolarità a 290 mOsm per l'intracellulare e fino a 320 mOsm per le soluzioni extracellulari con glucosio.
Nota: Le soluzioni intracellulari leggermente ipoosmotiche aumentano il tasso di successo delle patch 26 . - Sterile filtra tutte le soluzioni attraverso filtri da 0,22 μm. Conservare le soluzioni a 4 ° C per due settimaneS o congelare a -20 ° C per l'immagazzinamento a lungo termine.
- Calcolare potenziali di giunzione liquidi e preparare protocolli di registrazione.
NOTA: La variazione della concentrazione di cloruro extracellulare dopo la configurazione di una cellula intera provoca un significativo potenziale di giunzione liquido (LJP) che deve essere corretto 27 , 28 . LJPs possono essere direttamente misurati o calcolati, qui viene utilizzata l'ultima opzione. In questo protocollo verrà utilizzata una correzione on-line che richiede un protocollo di registrazione per ogni buffer esterno. Tuttavia, per una serie più grande di soluzioni esterne è consigliabile una correzione post di LJP per evitare la falsa correzione.- Aprire la calcolatrice di potenziale di giunzione (JPC) 27 e aprire il dialogo "Nuovo esperimento". Quindi, selezionare "Misura delle pinze". Selezionare "misurazioni a cellule intere", "Elettrodo di soluzione salina standard" e inserire una temperatura di25 ° C. Tra ogni passaggio, andare avanti accettando la selezione premendo il pulsante "successivo".
NOTA: Gli esperimenti vengono eseguiti ad una temperatura ambiente di 25 ° C in un laboratorio climatizzato. Assicurarsi che le soluzioni tampone abbiano temperatura ambiente prima di iniziare esperimenti. Per variare la temperatura del campione è possibile utilizzare uno stadio o una camera di incubazione. La temperatura del bagno può essere spesso misurata con un termometro. - Aggiungere tutte le concentrazioni individuali di anione e catione della soluzione pipettata e dell'alta tampone cloruro in base alle concentrazioni elencate nella tabella 1 .
NOTA: il JPC calcola un LJP di -0,5 mV per le condizioni di partenza. - Fare clic su "New Bath Solution" per entrare nella composizione anionica e cationica del buffer di cloruro basso.
NOTA: il JPC calcola un nuovo LJP di +12,6 mV in base alla soluzione di registrazione extracellulare modificata. - Preparare due protocolli corretti da LJP per ilDue condizioni di misurazione sottraendo il LJP calcolato dal potenziale di tenuta applicato; -0,5 mV per l'alto e +12,6 mV per le basse soluzioni esterne di cloruro. Così i protocolli iniziano con -79,5 mV (alto cloruro) e -92,6 mV (basso cloruro), rispettivamente per ottenere un potenziale di avviamento corretto da LJP -80 mV in entrambi i casi.
NOTA: Le seguenti fasi si applicano al software di acquisizione dati elencato nell'elenco dei materiali. - Aprire l'editor di protocollo nel software di acquisizione. Passare al menu "Modalità" selezionare "Stimolazione episodica" e includere 7 spazzamenti.
- Passare al menu "Forma d'onda" dell'editor e includere un periodo di 200 ms con potenziale di mantenimento 0 mV seguito da un periodo di 2 secondi con un potenziale di tenuta variabile a partire da -79,5 mV per l'alto cloruro. Includere un "livello delta" di 20 mV per il secondo periodo per aumentare il potenziale di tenuta di 20 mV in ogni sweep.
- All'interno delle fasi di tensione della forma d'onda edApplicare un periodo di illuminazione di 500 ms con luce di 540 nm (3,10 mW / mm²). A tal fine, cambiare il "bit bit digitale" dell'otturatore collegato che controlla la sorgente luminosa per essere attiva 500 ms dopo il secondo periodo descritto in precedenza (vedere 1.2.6).
NOTA: L'intensità della luce può influenzare le proprietà biofisiche delle correnti di canale come l'ampiezza o l'inattivazione. Pertanto, la densità di potenza luminosa deve sempre essere segnalata. Per misurare la potenza luminosa dopo aver superato tutte le ottiche e la copertura, utilizzare un ottometro calibrato. Per calcolare la densità di potenza, determinare il campo illuminato dell'oggetto da un micrometro di oggetti e dividere la potenza luminosa misurata dal campo luminoso determinato. - Salvare il protocollo per la soluzione extracellulare ad alto contenuto di cloruro. Modificare il protocollo e sostituire il primo livello di potenziale di mantenimento di -92,6 mV (basso cloruro esterno). Salva questo secondo protocollo per misurare la bassa condizione extracellulare del cloruro.
- Il rivestimento di lisina della copertura in vetro si scivola secondo il protocollo adattato 29 .
- Posizionare più 100 coperchi di copertura in un piatto di vetro di Petri e aggiungere 250 mL di HCl (1 N).
- Posizionare il piatto di Petri con i coperchi della copertura su un agitatore lineare e scuotere a 120 giri / min per 72 h per pulire le coperture del coperchio e poi risciacquare con acqua ultrapure per neutralizzare il pH.
- Immergetela in un piccolo volume di etanolo al 95% per una ulteriore pulizia.
NOTA: Le pasticche pulite possono essere conservate in etanolo al 70% prima di procedere. Lavori sotto cappuccio flusso laminare per le seguenti fasi. - Utilizzando un bruciatore e pinzette Bunsen, fiamma ogni coperchio scivolare e trasferirlo in un nuovo piatto di Petri.
- Incubare le coperture di vetro con una soluzione sterile di poli-D-lisina da 50 μg / mL per almeno 1 h (o durante la notte) a temperatura ambiente agitando con un agitatore lineare a 150 giri / min.
- Lavare le coperture del coperchio con acqua ultrapure per rimuovere l'eccesso di poli-D-lisina.
- Spalmare i coperchi della copertura su carta sterile per asciugare per 10 minuti e esporli alla luce UV per la sterilizzazione (almeno 20 minuti).
- Raccogliere le coperture in un piatto di Petri sterile rivestito in foglio di alluminio fino all'uso.
- Preparare il DNA del gene Ps ACR1 fuso a mCherry usando tecniche standard di biologia molecolare.
- Clonare la sequenza genica ottimizzata dal codone umano che codifica Ps ACR1 in un plasmide peGFP-C1 (promotore CMV, resistenza kanamycina) in fotogramma con il fluoroforo mCherry utilizzando enzimi di restrizione o altri metodi di clonazione stabiliti.
Nota: Possono essere utilizzati anche altri fluorofori, ma assicurarsi di avere i corrispondenti filtri disponibili per osservare la loro fluorescenza sotto il microscopio nell'installazione. - Trasformare il DNA plasmidico in cellule E. coli XL1Blue chemocompetenti mediante scoppio di calore secondo protocollo standard e piatturarle su piastre agar (30 μg / mL kanamicina) 30
- Il giorno successivo, inoculare 4 mL di media di brodo di lisossine integrato con 30 μg / mL di kanamicina con le cellule di singole colonie e incubarle di notte a 37 ° C e 180 rpm in un incubatore.
- Dopo incubazione durante la notte, purificare il DNA plasmidico dalle colture usando un kit disponibile in commercio (vedere tabella materiali) secondo le istruzioni del produttore.
- Clonare la sequenza genica ottimizzata dal codone umano che codifica Ps ACR1 in un plasmide peGFP-C1 (promotore CMV, resistenza kanamycina) in fotogramma con il fluoroforo mCherry utilizzando enzimi di restrizione o altri metodi di clonazione stabiliti.
- Seme le cellule
NOTA: eseguire i passaggi sotto una cappa a flusso laminare.- Posizionare fino a tre coperture in vetro liscio rivestite in fianco a fianco in un piatto di Petri da 35 mm.
NOTA: Premete delicatamente contro il fondo del piatto per evitare che si scivolino l'uno sull'altro. - Seme 1,5 x 10 5 cellule HEK in 2 ml di standard Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) completato con 10% di siero fetale fetale (FBS) in ogni piatto.
- Supplemento di tutti i retinici aUna concentrazione finale di 1 μM. Crescere le cellule per almeno un giorno prima di procedere con il passo 1.6.
- Posizionare fino a tre coperture in vetro liscio rivestite in fianco a fianco in un piatto di Petri da 35 mm.
- Trasfezionare transitoriamente le cellule tramite la lipofezione 31 .
- Per ogni piatto di cellule, preparare una soluzione di 2 μg di DNA plasmidico (come preparato al punto 1.4) in 250 μl di DMEM senza FBS e 6 μl di reagente di transfection (vedi tabella dei materiali ).
- Dopo 15 minuti di incubazione, aggiungete delicatamente (a goccia) la soluzione alle cellule.
- Preparare ponti agar
- Aggiungere 0,75 g di agarosio a 50 ml di soluzione di cloruro di sodio sterile (140 mM) e sciogliere con il riscaldamento in un forno a microonde.
NOTA: 2 - 3 M KCl per la preparazione del ponte agar ulteriormente riduce LJP a causa della concentrazione più elevata ( ad es. Diffusione costante dal ponte) e pari mobilità di K + e Cl - ioni, ma è stata evitata per ridurre al minimo le perdite ioniche (particolarmente Cl) In t Ha la soluzione di bagno 32 . - Riempire 10 μL di pipetta (o un tubo di piccolo diametro) con la soluzione di agarosio liquido usando una siringa.
NOTA: evitare le bolle d'aria nel ponte. - Dopo che i ponti agarici sono stati raffreddati e solidificati, conservarli in soluzione sterile 140 mM di cloruro di sodio.
- Aggiungere 0,75 g di agarosio a 50 ml di soluzione di cloruro di sodio sterile (140 mM) e sciogliere con il riscaldamento in un forno a microonde.
- Preparare elettrodi di registrazione e bagno.
- Rimuovere i fili d'argento del bagno e l'elettrodo di registrazione della messa a punto del patch-clamp.
- Peli i fili con carta vetrata per rimuovere il cloruro d'argento da esperimenti precedenti. Immergere il filo d'argento pulito in 3 M KCl e collegarlo al polo positivo di una batteria da 1,5 V per rivestimento elettrolitico con cloruro d'argento.
NOTA: è possibile utilizzare un alimentatore per laboratorio anziché una batteria.
- Tirare pipette a bassa resistenza (1,5-3,0 MΩ) dai capillari di vetro con un estrattore di micropipette e lucidarli come descritto da Brown et alLass = "xref"> 33. Conservare le pipette senza polvere per il giorno della misurazione.
- Accendere tutti i componenti di setup per riscaldare fino alla temperatura di lavoro 30 minuti prima delle registrazioni. Assicurarsi che i buffer siano a temperatura ambiente.
2. Misura di selettività
- Avviare le registrazioni 24 a 48 h dopo la transizione transitoria delle cellule descritte in 1.6.
- Posizionare uno scivolo di copertura nella camera di misura e sigillarlo con silicio per evitare perdite del buffer esterno. Conservare il piatto di Petri con l'altra copertura in un incubatore per il prossimo set di esperimenti.
- Riempire con cura la camera con tampone extracellulare (alto [Cl - ]) per impedire la stacco delle cellule, quindi collocarlo sotto il microscopio e utilizzare l'obiettivo 40X per la visualizzazione delle celle.
- Mettere un ponte agar sull'elettrodo per vasca e posizionarlo nella camera insieme al sensore del livello del fluido e all'uscita di perfusione del gestore del bagno.
- Scambia l'exSoluzione tracellulare due volte con 1 ml di soluzione esterna fresca (alta [Cl - ]) per rimuovere il mezzo di coltura residuo e le cellule staccate.
- Portare le cellule in messa a fuoco e cercare una cella transfettata (fluorescente), che deve essere isolata da altre cellule. Utilizzare un set di filtri tripla banda e una luce arancione (590 nm, larghezza di banda 15 nm, intensità del 100%) per eccitare e visualizzare la mCherry.
NOTA: le celle HEK possono essere accoppiate elettricamente ai loro vicini mediante giunzioni di giunzione 34 con conseguente bassa resistenza alla membrana nella configurazione a cellule intere. - Riempire una delle pipette tirate con soluzione intracellulare e rimuovere le bolle d'aria spostando la pipetta più volte.
- Montare la pipetta sul porta pipetta e applicare una pressione positiva per impedire l'intasamento della punta.
- Individuare la punta della pipetta patch sotto il microscopio e spostarla vicino alla cella usando il micromanipolatore.
NOTA: i passaggi seguenti si applicano all'aMplifier, software di acquisizione e valutazione dei dati menzionati nell'elenco dei materiali. - Avviare il "test della membrana" nel software di acquisizione dati e applicare un passo di tensione (impulso di prova, ad es. 5 mV per 10 ms, basale a 0 mV), manualmente o automaticamente tramite software specifico usando "modalità bagno" mentre esegue "test di membrana" Nel software di acquisizione dati.
- Controllare che la resistenza della pipetta sia nell'intervallo desiderato (1,5-3,0 MΩ).
- Correndo le correnti di zero regolando il potenziale della pipetta ruotando la manopola di compensazione della pipetta all'amplificatore mentre si lavora in "modalità bagno" del "test della membrana".
- Stabilire una patch nella configurazione della cella intera 26 .
NOTA: Le seguenti fasi richiedono l'applicazione di una pressione positiva e negativa erogata alla porta laterale del porta pipetta utilizzata. Ciò può essere fatto usando una siringa, una bocca o un cono elettronicamenteRegolatore di pressione trollato. In questo protocollo si applica una pressione positiva e negativa tramite un boccaglio.- Raggiungere lentamente la cella con la pipetta patch dall'alto e sollevare la pressione positiva prima di toccarla.
NOTA: quando la punta è vicina alla cella, la resistenza aumenta leggermente; Ciò è indicato da una dimensione ridotta dell'impulso di prova. - Cambiare il "test della membrana" da "modalità bagno" a "modalità patch", quindi il potenziale di mantenimento al potenziale di riposo previsto dalle cellule (da -30 a -40 mV).
- In alcuni casi la configurazione connesso alla cella si forma dopo il rilascio della pressione positiva (2.13.1), altrimenti applica delicatamente la pressione negativa per aiutare la formazione di gigasea.
NOTA: La configurazione connessa alla cella viene stabilita quando l'impulso di prova viene ridotto a due piccoli picchi capacitivi all'inizio e alla fine dell'impulso e la resistenza della membrana è nella gamma GΩ; Tensioni negative fino a -60 mV mIght facilitano la formazione gigasea. - Compensare la capacità della pipetta ruotando le manopole per la compensazione della capacità della pipetta per ottenere una risposta piatta dell'impulso di prova.
- Rottura la patch senza distruggere la tenuta applicando brevi impulsi di pressione negativa o pressione negativa con forza crescente, per ottenere la conformazione a cellule intere.
NOTA: La transizione di successo dalla cella-attaccata alla configurazione a cellule intere è indicata da un aumento dei picchi capacitivi. - Applicare la compensazione della resistenza della serie impostando parametri a cellule intere e regolazioni di compensazione dell'amplificatore utilizzato per una precisa fissazione del potenziale della membrana alla tensione di ritenzione desiderata.
- Attivare il "test della membrana" in modalità "intera cella", nel pannello "Compensazione della resistenza di serie" attivare "previsione" e "correzione" fino al 90% per evitare sovraccarichi e oscillazione della risposta capacitiva, girare la cella interaL'interruttore di compensazione si accende e regola i parametri delle celle intere con le opportune manopole del pannello anteriore ("capacità della cella intera" e "resistenza della serie") dell'amplificatore in modo iterativo per ottenere una risposta di guarnizione ideale.
NOTA: Per una descrizione dettagliata della compensazione e della correzione della resistenza della serie, fare riferimento al manuale o alla guida dell'amplificatore, poiché questa procedura varia da diversi produttori.
- Attivare il "test della membrana" in modalità "intera cella", nel pannello "Compensazione della resistenza di serie" attivare "previsione" e "correzione" fino al 90% per evitare sovraccarichi e oscillazione della risposta capacitiva, girare la cella interaL'interruttore di compensazione si accende e regola i parametri delle celle intere con le opportune manopole del pannello anteriore ("capacità della cella intera" e "resistenza della serie") dell'amplificatore in modo iterativo per ottenere una risposta di guarnizione ideale.
- Dopo aver stabilito la configurazione a cellule intere, attendere almeno 2 minuti prima della registrazione per garantire una sostituzione sufficiente della soluzione intracellulare attraverso la pipetta patch.
- Raggiungere lentamente la cella con la pipetta patch dall'alto e sollevare la pressione positiva prima di toccarla.
- Registrare le correnti indotte dalla luce a differenti potenziali di azionamento utilizzando i protocolli precedentemente impostati (in 1.2).
- Scambiare il buffer estracellulare a basso [Cl - ] nella camera almeno cinque volte senza distruggere la patch e registrare un'altra relazione di tensione di corrente ( cfr. Punto 1.2) a tLa nuova concentrazione di cloruro.
NOTA: un sistema di perfusione per lo scambio automatico di buffer fa di questo processo, ma non è necessario. - Ripeti 2.15. Per ogni condizione ionica da sottoporre a test, ma verificare ripetutamente la qualità della patch tra le misurazioni con un "test a membrana" descritto in precedenza.
NOTA: Per garantire una precisa tensione di membrana e una resistenza di membrana intracellulare di resistenza allo stabile deve essere superiore a 500 MΩ, mentre la resistenza di accesso non deve superare 10 MΩ, si veda . 2.12.6). Non dimenticare di spegnere la compensazione del parametro delle cellule intere per il test della membrana. - Ripeti 2.2. A 2.15. Per diverse celle, ma prendere una nuova copertura di copertura per ogni serie di test per garantire la salubrità delle cellule.
3. Valutazione dei dati
- Regolare la linea di base di ogni traccia corrente sottraendo la corrente media prima dell'illuminazione.
- Calcolare il fotocorro stazionario medio I s (
- Ripetere i passaggi 3.1) e 3.2) per tutte le condizioni sperimentate e le diverse celle.
- Progettare le fotocorri determinate rispetto al rispettivo potenziale di tenuta.
NOTA: se vengono misurate più misurazioni, le singole registrazioni possono essere normalizzate a una condizione specificata o alla capacità della cella. - L'intersezione della relazione di tensione-corrente con l'asse di tensione rappresenta il potenziale di inversione (la corrente netta è zero). Determinare l'interpolazione lineare tra i due punti dati vicini.
NOTA: se non vi è alcuna inversione di polarità delle fotocorri, estrapolare linearmente dagli ultimi due punti vicini allo zero per ottenere una approssimazione del punto di intersezione. - Media la determinata rPotenziali eversori per le stesse condizioni e tracciarle contro la concentrazione di cloruro delle soluzioni tampone esterne ( cfr. Figura 2B ).
- Aprire la calcolatrice di potenziale di giunzione (JPC) 27 e aprire il dialogo "Nuovo esperimento". Quindi, selezionare "Misura delle pinze". Selezionare "misurazioni a cellule intere", "Elettrodo di soluzione salina standard" e inserire una temperatura di25 ° C. Tra ogni passaggio, andare avanti accettando la selezione premendo il pulsante "successivo".
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Representative Results
La Figura 2 mostra i risultati rappresentativi ottenuti dalle misurazioni seguendo il protocollo descritto. Durante l'illuminazione con luce verde, Ps ACR1 presenta una corrente transitoria veloce che decade rapidamente a un livello corrente fisso. Dopo la spegnimento della luce, le fotocorrienti decadono a zero entro millisecondi ( Figura 2A ). Scambiare la concentrazione di cloruro extracellulare provoca uno spostamento del potenziale di inversione che può essere visto direttamente nelle tracce acquisite di fotocirato. La valutazione dei potenziali di inversione da molteplici misurazioni quantifica il drammatico spostamento del potenziale di inversione causato dalla variazione della concentrazione di cloruro esterno ( Figura 2B ). Attentamente, i potenziali di inversione misurati corrispondono direttamente ai potenziali Nernst calcolati per il cloruro ( Figura 2C ) che confermano l'alta selettività di cloruro di Ps ACR1.
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Figura 2: Selettività del cloruro di Ps ACR1 . ( A ) Tracce correnti rappresentative di Ps ACR1 nelle cellule HEK293. La concentrazione di cloruro intracellulare è stata mantenuta a 120 mM, mentre la concentrazione extracellulare varia da 150 mM (verde) a 10 mM (viola) cloruro per parziale sostituzione di NaCl con Na-aspartato. Il potenziale di mantenimento è aumentato a 20 mV da -80 mV a +40 mV (corretto LJP). ( B ) Rapporti di corrente-tensione mediati (n = 6 corrispondenti alle condizioni in A). ( C ) Potenziali di inversione (le linee centrali indicano i mediani, i limiti della casella indicano i percentili 25 e 75, i baffi estendono 2 volte la deviazione standard ei cerchi indicano punti dati singoli) estratti dalle relazioni di tensione di corrente. Per l'alto cloruro con(Verde) il valore è stato interpolato linearmente tra potenziale di mantenimento -20 mV e 0 mV, mentre il valore è stato estrapolato linearmente superiore a +40 mV (viola, linea tratteggiata, pannello B). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Determinazione dei potenziali di inversione a condizioni ioniche e elettriche definite fornisce informazioni sulle specie ioniche trasportate dopo l'attivazione luminosa dei ChRs. Se solo una specie di ioni varia in un complesso complesso fisiologico e il potenziale di inversione ottenuto si sposta in base al potenziale teorico di Nernst, questa specie ione è l'unico trasportato.
Tuttavia, per i ChRs, i cambi potenziali di inversione sono generalmente meno pronunciati di quelli previsti dall'equazione di Nernst dovuti alla permeabilità alle diverse specie ioniche e alla concorrenza tra gli ioni condotti. In questo caso, la situazione diventa più complessa e tutti gli ioni potenzialmente condotti devono essere scambiati separatamente richiedendo una varietà di soluzioni di misura. Inoltre, la maggior parte dei CCR e dei primi ACR artificiali 9 , 10 , 21 sono conduttivi per i protoni, ma la concentrazione protonica variaL'analisi richiede un'analisi particolarmente approfondita, in quanto la concentrazione di protoni non solo può spostare le potenzialità di inversione, ma può anche influenzare la conducibilità ionica 9 , le cinetiche fotocorrenti 21 , 36 e la sensibilità spettrale di luce 11 , 37 , a causa del cambiamento di idrogeno, Singoli residui e cambiamenti della struttura secondaria. La conducibilità del protone può essere affrontata riducendo le concentrazioni di tutti gli altri ioni potenzialmente condotti come Na + , Ca 2+ o Cl - mantenendo costante il pH al fine di evitare variazioni proteiche menzionate sopra. I sostituti non condotti sono solitamente molecole ingombranti e cariche come NMG + per cationi 12 e gluconato, 2- ( N- morfolino) etansolfonato (MES) o aspartato per anioni. Confrontando i potenziali di inversione in differenti iLe soluzioni oniche consentono quindi di calcolare le relative permeabilità di ioni in condizioni di equilibrio dall'equazione di tensione Goldman-Hodgkin-Katz. Quantificando l'esatto contributo di ioni diversi alle fotocorri nette considerando la concorrenza ionica al di là delle condizioni di equilibrio, tuttavia, richiede complessi modelli matematici 12 , 38 .
Conoscere la composizione degli ioni trasportati da ChR aiuta a chiarire eventuali effetti collaterali derivanti dall'applicazione di ChR in particolare in un contesto neurofisiologico. Ad esempio, l'attivazione prolungata di ChR può causare l'acidificazione intracellulare 39 o condotta-Ca 2+ può innescare il rilascio sinaptico e il secondo percorso messaggero 40 . Poiché le cellule sono di solito imballate strettamente all'interno dei tessuti, l'attivazione delle rodopinte microbiche non può solo influenzare la composizione intracellulare di ioni, ma anche il lumen extracellulare, influenzando così nCellule ebbrezie 41 .
Nonostante la selettività di ioni, altre caratteristiche biofisiche di ChR come ampiezze di fotocolore, inattivazione, sensibilità spettrale o leggera e proprietà cinetiche sono spesso di interesse per condurre, progettare e interpretare esperimenti che coinvolgono tecniche ottogenetiche. Alcune di queste proprietà possono anche essere determinate dal protocollo sopra descritto come descritto altrove 18 , 37 , 42 . Per studiare la sensibilità alla luce della cella espressa da ChR, l'intensità della luce può essere variata regolando la potenza della sorgente luminosa o attenuando la luce di attivazione con filtri di densità neutra. Per ottenere la sensibilità spettrale, è necessaria una sorgente luminosa poligromatica e le intensità devono essere regolate a flusso di foton equivalente e larghezza di banda per tutte le lunghezze d'onda. Gli spettri ad alta intensità assomigliano solo agli spettri di assorbimento del fotorecettore in caso di impulsi di luce corta oVengono utilizzati lampi laser, altrimenti possono verificarsi fenomeni di adattamento e reazioni fotochemiche. Il recupero da parte inattivato in modo completamente attivo (tempo totale di rotazione del fotociclo totale) può essere verificato applicando un protocollo a doppio impulso con incrementi di intervalli scuri tra i due impulsi luminosi. Le proprietà biofisiche dei ChRs discussi in precedenza sono importanti per la scelta di un appropriato ChR corrispondente alle esigenze sperimentali 40 .
Derivare queste proprietà biofisiche con tecniche elettrofisiologiche si associa direttamente alla funzione proteica che è appena coperta da metodi spettroscopici. Dopo aver stabilito con successo le misurazioni della tensione-tensione, la tecnica può essere combinata con approcci di ingegneria proteica come la mutagenesi localizzata 9 , 11 , 43 , 44 , 37 ,
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Acknowledgments
Ringraziamo Maila Reh, Tharsana Tharmalingam e specialmente Altina Klein per un'ottima assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione di Ricerca Tedesca (DFG) (SFB1078 B2, FOR1279 SPP1665 a PH) e il Cluster of Excellence Unifying Concepts in Catalysis, UniCat, BIG-NSE (JV) e E4 (PH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK293 cells | Sigma Aldrich | 85120602 | Human embryonic kidney cells |
| Retinal | Sigma Aldrich | R2500 | all-trans retinal |
| FuGENE HD | Promega | E2312 | Transfection reagent |
| DMEM | Biochrome | FG 0445 | Dulbecco's Modified Eagle Medium |
| Agarose | Roth | 3810 | Agar bridges |
| CaCl2 | Roth | 5239 | CaCl2 2H2O |
| CsCl | Biomol | 2452 | |
| EGTA | Roth | 3054 | |
| FBS | Biochrome | S0615 | Cell culture |
| Glucose | Roth | HN06 | D(+)-Glucose |
| KCl | Roth | 6781 | |
| MgCl2 | Roth | 2189 | MgCl2 6H2O |
| NaCl | Roth | 3957 | |
| NMG | Sigma Aldrich | M2004 | N-Methyl-D-glucamine |
| Na-Aspartate | Sigma Aldrich | A6683 | L-Aspartic acid sodium salt monohydrate |
| Citric acid | Roth | 6490 | |
| AgeI | ThermoFischerScientific | ER1462 | Restriction enzyme |
| XhoI | ThermoFischerScientific | ER0695 | Restriction enzyme |
| NheI | ThermoFischerScientific | ER0975 | Restriction enzyme |
| XL1Blue E. coli | Agilent Technologies | 200249 | Chemocompetent E. coli |
| Kanamycin | Roth | T832 | |
| Lysogeny broth medium | Roth | X964 | |
| Agar-Agar | Roth | 6494 | Agar plates |
| Plasmid purification kit | Marchery-Nagel | 740727.25 | |
| Penicilin/Streptomycin | Biochrome | A 2213 | Cell culture |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma Aldrich | P6407-5MG | Cover slip coating |
| Microforge | Custom made | Fire polishing | |
| Serological pipettes | TPP | Different sizes | |
| Clean bench | Kojair | Biowizard SL130 | |
| Stirrer | IKA | RCT classic | |
| Silver wire | Science Products | AG-T25; AG-T10 | Electrodes, 0.64 mm (bath); 0.25 mm (electrode) |
| pH-meter | Knick | 765 Calimetric | |
| Osmometer | Vogel | OM 815 | |
| Microscope | Carl Zeiss | ID03 | Fire polishing |
| CO2 incubator | Binder | CB150 | |
| Cell culture dishes | TPP | 93040 | 34 mm internal diameter |
| Cover slips | Roth | P232 | 15 mm diameter |
| Thermometer | Rössel Messtechnik | MTM12 | |
| Beamsplitter | Chroma | 21011 | 90/10 transmission |
| Pipette holder | ALA Scientific Instruments | PPH-1P-AXU-0-1.5 | |
| Headstage | Molecular Devices | CV203BU | |
| Amplifier | Molecular Devices | AxoPatch200B | |
| Digitizer | Molecular Devices | DigiData1400 | Digital analog converter |
| Lightsource | TILL Photonics | Polychrome V | Set to 540 nm full intensity |
| Microscope | Carl Zeiss | Axiovert 100 | |
| Shutter | Vincent Associates | VS25 | |
| Shutter driver | Vincent Associates | VCM-D1 | |
| Glass capilarries | Warner Instruments | G150F-3 | Boresilicate capillaries with fire polished ends OD 1.5 mm ID 0.86 mm |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P1000 | |
| Bath handler | Lorenz Messgerätebau | MPCU | |
| Tripleband filterset | Chroma | 69008 | Fluorescence filter ECFP/EYFP/mCherry |
| CCD camera | Watec | Wat-221SCCD | |
| Optometer | Gigahertz Optik | P9710 | Measure light intensities |
| Objective | Carl Zeiss | 421462-9900-000 | W Plan-Apochromat 40X/1.0 DIC |
| Micromanipulator | Scientifica | PatchStar | |
| Recording chamber | Custom made | ||
| Power supply | Manson | HCS-3202 | Avoids electrical noise from microscope built-in power supply |
| Vibration isolated table | Newport | M-VW-3636-OPT-01 | |
| Faraday cage | Custom made or any commercial matching table | ||
| Hoses | Any comercial; e.g. Roth | Different sizes and materials for bath handling and application of pipette pressure; agar bridges | |
| Linear shaker | Sunlab Instruments | SU 1000 | |
| Liquid junction potential calculator | Molecular Devices or directly from Peter H. Barry | Program is included in the Clampex aquisition software or can be obtained from p.barry@unsw.edu.au | |
| Data acquisition software | Molecular Devices | Clampex 10.X | |
| Data evaluation software | Molecular Devices | Clampfit 10.X | |
| PsACR1 | GenBank or Addgene | KF992074.1 or Addgene plasmid #85465 | Gene encoding for PsACR1 |
| Amplifier guide | Molecular Devices | The Axon Guide |
References
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