Abstract
지난 10 년 동안 channelrhodopsins은 신경 세포 학적 연구에서 없어서는 안되게되었고, 대상 세포에서 전기 과정을 비 침습적으로 조작하는 도구로 사용되었습니다. 이러한 맥락에서, 채널로도 딘의 이온 선택성은 특히 중요하다. 이 기사는 최근 HEK293 세포의 전기 생체 학적 패치 클램프 기록을 통해 Proteomonas sulcata 의 최근 확인 된 음이온 전도성 채널로도 딘에 대한 염화물 선택성에 대한 조사를 기술 합니다. 빛에 의해 제어되는 광전류를 측정하기위한 실험 절차는 기존의 패치 - 클램프 설정의 현미경에 결합 된 신속하게 전환 가능한 이상적인 단색 광원을 필요로합니다. 실험 이전의 준비 절차는 완충 용액의 준비, 액체 접합 전위에 대한 고려, 세포의 파종 및 형질 감염 및 패치 피펫의 당김과 관련하여 개략적으로 설명됩니다. 전류 - 전압 관계의 실제 기록transfection 후 24 시간에서 48 시간 사이에 다양한 염화물 농도에 대한 reversal potential을 결정합니다. 마지막으로, 전기 생리 학적 데이터는 염화물 전도의 이론적 고려 사항과 관련하여 분석된다.
Introduction
Channelrhodopsins (ChR)는 운동성 녹조류의 눈 지점에서 발생하는 광 게이 티드 이온 채널이며 광 택 및 공포 반응에 대한 기본 광 센서 역할을합니다 1 . ChR은 2002 년에 처음으로 기술 된 이래로 optogenetics의 새로운 분야에 대한 길을 열었고 골격근, 심장 또는 뇌의 다양한 흥분성 세포, 예를 들어 3 , 4 , 5 에 적용될 수 있습니다. 표적 세포에서 ChR을 발현 시키면 각 세포의 가벼운 조절 가능한 이온 투과성을 갖게된다. 연결 컨텍스트에서 이것은 활동 전위 (AP) 발화의 활성화 6 , 7 , 8 또는 억제 9,10 (수행 된 이온에 따라 다름)을 공간적 및 시간적ChR 변이체의 이온 선택성이 어떻게 그것의 광 생성 적용을 결정 하는지를 강조하는 빛의 정밀도.
Chlamydomonas reinhardtii 와 Volvox carteri에서 처음으로 발견 된 ChR은 양성자뿐만 아니라 나트륨, 칼륨과 같은 1가 양이온, 칼슘과 마그네슘과 같은 2가 양이온에 덜 영향을 미친다 11,12,13. 오늘날, 70 가지 이상의 천연 양이온 전도성 채널 로돕신 (CCRs) 14 , 15 , 16 , 17 및 광전류 크기, 분광 감도, 동역학 및 양이온 선택도를 이용할 수 있습니다. 신경 과학에서 CCR은 a다시 세포를 활성화하고 AP를 트리거하는 데 사용되는 경우, 빛에 의해 구동되는 미생물 펌프는 수년간 뉴런을 조용하게하는 유일한 길항제였다. 2014 년에 두 그룹은 동시에 CCR이 분자 공학을 통해 추정 이온 전도 기공을 따라 극성을 바꾸어 음이온 전도성 채널로도 틴 (ACR)으로 전환 될 수 있음을 보여주었습니다 9 , 21 . 그 결과, 여러 가지 cryptophyte alga 22 , 23 , 24 에서 자연 ACR이 확인되었다. 가장 중요한 것은, ACR의 가벼운 활성화는 흡수 된 광자 당 단 하나의 전하만을 운반하는 미생물 펌프보다 훨씬 낮은 광 강도에서 신경 세포 활동의 억제를 허용하는 성인 뉴런에서 염화물 전류를 매개한다는 것이다.
ChR 활동은 HEK293 세포의 빛 유도 전류의 전기 생체 학적 패치 클램프 기록으로 직접 해결할 수 있습니다. 패치 클램프기술은 원래 1970 년대 후반에 개발되었고, Hamill et al. 높은 전류 분해능과 멤브레인 전압의 직접 제어로 작은 셀 (전체 셀 모드)에서 전류 엔티티를 기록 할 수 있습니다. 세포 배양에 적용된이 기술은 이온 및 전기 기록 조건을 정확하게 제어하고 총 전류에 대한 이온의 상대적 기여와 함께 이온 선택성을 연구 할 수있게합니다. 여기서 우리는 염소 이온 전도도를 증명하기 위해 다양한 세포 외 염화물 농도 하에서 전류 - 전압 관계를 기록함으로써 Proteomonas sulcata ( Ps ACR1) 22 , 23 의 음이온 전도성 채널로도 펩신에 대한 이온 선택성의 시험을 예시한다.
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Protocol
그림 1 : 패치 클램프 설정. (1) 광원, (2) 광섬유, (3) 프로그램 가능한 셔터, (4) 디지타이저, (5) 셔터 드라이버, (6) 증폭기, (7) 관류 시스템, (8) 개인용 컴퓨터, , (10) 패러데이 케이지, (11) 현미경 스테이지, (12) 관류 입구, (13) 관류 출구, (14) 기록 챔버, (15) 유체 레벨 센서, (21) 현미경 램프 하우징, (22) 현미경 램프 전원 공급 장치, (23) 물이 채워진 U- 튜브, (24) 3 방향 (21) 마이크로 렌즈 조작기, 밸브, (25) 방진 테이블, (26) CCD 카메라. ( A ) 사진 및 ( B ) 설정의 개략적 표현. 더 큰 버전의 t를 보려면 여기를 클릭하십시오.그의 모습.
1. 녹음 전 설정
| intra. | 추가 1 | extra.2 | |
| 고 염화물 | 고 염화물 | 저 염화물 | |
| c [mM] | c [mM] | c [mM] | |
| Na-ASP | 0 | 0 | 140 |
| NaCl | 110 | 140 | 0 |
| KCl | 1 | 1 | 1 |
| CsCl | 1 | 1 | 1 |
| CaCl2 | 2 | 2 | 2 |
| MgCl2 | 2 | 2 | 2 |
| HEPES | 10 | 10 | 10 |
| EGTA | 10 | 0 | 0 |
| pH | 7.2 | 7.2 | 7.2 |
| 삼투압 | 290 mOsm | 320 mOsm | 320 mOsm |
표 1 : 완충 용액의 이온 조성. HEK 세포에서 클로라이드 선택성 실험을위한 세포 내 (intra.) 및 세포 외 (extra.) 완충액의 조성. 사용 된 약어 : 에틸렌 글리콜 테트라 아세트산 (EGTA), 4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES) 및 아스파 테이트 (ASP). 모든 농도는 mM입니다.
- 표 1에 표시된 이온 농도의 기록 용액을 준비합니다.
- MgCl 2 , CaCl 2 , KCl 및 CsCl에 대해 초순수의 2 M 저장 용액 15 mL를 준비한다.
- 100 mL의 세포 내 성분에 대해 고체 성분의 무게를 잰다.500 mL의 표 1에 따른 세포 외 완충 용액을 별도의 비이커에 넣고 그 후에 준비된 원액의 양을 더한다. 예를 들어, 세포 내 버퍼의 경우 0.3803g (10mM) EGTA, 0.2383g (10mM) HEPES 및 0.6428g (110mM) NaCl을 사용하고 100μL의 2M MgCl 2 및 CaCl 2 와 50μL의 2 M KCl 및 CsCl 저장 용액.
- 초순수를 첨가하고 측정을 방해하지 않는 산과 염기를 사용하여 조심스럽게 pH를 조절하십시오. 예를 들어 시트르산과 N- 메틸 -D- 글루 카민 (NMG + )과 같은 ChR이 실시하지 않습니다.
- 세포 내에서 osmolarity를 290 mOsm으로 조절하고 포도당으로 세포 외 용액에서 320 mOsm으로 조정하십시오.
참고 : 약간 hypoosmotic intracellular 솔루션은 패치 26 의 성공률을 증가시킵니다. - 0.22 μm 필터를 통해 모든 용액을 무균 여과하십시오. 솔루션을 4 ° C에서 2 주 동안 보관하십시오.-20 ° C에서 장기간 보관할 수 있습니다.
- 액체 접합 전위를 계산하고 기록 프로토콜을 준비하십시오.
주 : 전체 세포 구성을 확립 한 후 세포 외 염화물 농도를 변화 시키면 보정해야하는 현저한 액체 접합 전위 (LJP)가 발생한다 ( 27 , 28) . LJP는 직접 측정하거나 계산할 수 있습니다. 여기서는 후자의 옵션이 사용됩니다. 이 프로토콜에서는 각 외부 버퍼에 대해 하나의 기록 프로토콜을 요구하는 온라인 교정이 사용됩니다. 그러나 더 큰 외부 솔루션 세트의 경우 거짓 교정을 피하기 위해 LJP의 사후 수정을 권장합니다.- JPC (Junction Potential Calculator) 27 을 열고 'New Experiment'대화 상자를 엽니 다. 그런 다음 "Patch-clamp measurements"를 선택하십시오. "전체 셀 측정", "표준 소금 용액 전극"을 선택하고 온도를 입력하십시오.25 ° C. 각 단계 사이에서 "다음"버튼을 눌러 선택을 수락하면 진행됩니다.
참고 : 실험은 공기 조절 실험실에서 25 ° C의 실내 온도에서 수행됩니다. 실험을 시작하기 전에 버퍼 용액의 온도가 실온인지 확인하십시오. 샘플 온도를 변화 시키려면 배양 단계 또는 챔버를 사용할 수 있습니다. 목욕 온도는 온도계로 자주 측정 할 수 있습니다. - 표 1 에 나열된 농도에 따라 피펫 팅 용액과 염화칼슘 완충액의 모든 개별 음이온 및 양이온 농도를 추가합니다.
참고 : JPC는 시작 조건에 대해 -0.5 mV의 LJP를 계산합니다. - "New Bath Solution"을 클릭하여 저 염소 완충액의 음이온 및 양이온 조성을 입력하십시오.
참고 : JPC는 이제 변경된 세포 외 기록 솔루션에 따라 +12.6 mV의 새로운 LJP를 계산합니다. - 두 가지 LJP 수정 프로토콜을 준비하십시오.인가 된 유지 전위로부터 계산 된 LJP를 감산함으로써 2 개의 측정 조건; 낮은 염화물 외부 용액의 경우 높은 경우에는 -0.5 mV이고 +12.6 mV 인 경우. 따라서 프로토콜은 두 경우 모두 -80mV의 LJP 보정 시작 유지 전위를 얻기 위해 -79.5mV (높은 염화물) 및 -92.6mV (낮은 염화물)로 시작합니다.
참고 : 다음 단계는 재료 목록에 언급 된 데이터 수집 소프트웨어에 적용됩니다. - 수집 소프트웨어에서 프로토콜 편집기를 엽니 다. "Mode"메뉴로 전환하여 "Episodic stimulation"을 선택하고 7 개의 스윕을 포함합니다.
- 에디터에서 "Waveform"메뉴로 전환하고 0mV의 유지 전위를 갖는 200ms주기와 높은 염화물의 경우 -79.5mV에서 시작하는 다양한 유지 전위를 갖는 2 초 기간을 포함합니다. 두 번째 기간 동안 20mV의 "델타 레벨"을 포함시켜 각 스윕에서 20mV의 유지 전위를 증가시킵니다.
- 파형의 전압 스텝 내에서540 nm 광 (3.10 mW / mm²)으로 500 ms의 조명주기를 적용합니다. 이렇게하려면 광원을 제어하는 연결된 셔터의 "디지털 비트 패턴"을 위에서 설명한 두 번째 시간 (500 페이지 참조)에서 500ms 후에 활성화하십시오 (1.2.6 참조).
참고 : 광도는 진폭이나 불활 화와 같은 채널 전류의 생물 물리학 적 특성에 영향을 줄 수 있습니다. 따라서 항상 광 밀도가보고되어야합니다. 모든 광학계와 커버 슬립을 통과 한 후 빛의 세기를 측정하려면 눈금 검사기를 사용하십시오. 출력 밀도를 계산하려면 대상 마이크로 미터로 대상의 조명 된 필드를 결정하고 측정 된 조명 전력을 결정된 조명 된 필드로 나눕니다. - 고 염화물 세포 외 용액에 대한 프로토콜을 저장하십시오. 프로토콜을 수정하고 첫 번째 레벨 유지 전위를 -92.6 mV (낮은 외부 염화물)로 대체합니다. 낮은 염화물의 세포 외 조건을 측정하기 위해이 두 번째 프로토콜을 저장하십시오.
- 수정 된 프로토콜 29에 따라 유리 커버 슬립의 라이신 코팅.
- 유리 배양 접시에 여러 개의 커버 슬립을 넣고 250 mL HCl (1 N)을 넣으십시오.
- 선형 쉐이커에 커버 슬립과 페트리 접시를 놓고 커버 슬립을 청소하고 후 pH를 중화하기 위해 초순수로 씻어 72 시간 동안 120 rpm으로 흔들어.
- 추가 세척을 위해 소량의 95 % 에탄올에 담급니다.
참고 : 진행하기 전에 깨끗한 커버 슬립을 70 % 에탄올에 저장할 수 있습니다. 다음 단계를 위해 층류 후드 아래에서 작업하십시오. - Bunsen 버너와 핀셋을 사용하여 각 덮개를 벗겨내어 새 페트리 접시에 옮깁니다.
- 150 rpm에서 선형 셰이커로 흔들면서 실온에서 적어도 1 시간 (또는 하룻밤) 멸균 50 μg / ML 폴리 D - 라이신 솔루션과 유리 커버 전표를 품어.
- 과량의 폴리 -D- 라이신을 제거하기 위해 커버 슬립을 초순수로 씻으십시오.
- 커버 슬립을 멸균 종이에 펴서 10 분간 건조시킨 다음 자외선에 노출시켜 살균합니다 (최소 20 분).
- 사용하기 전까지 알루미늄 호일로 덮여있는 멸균 페트리 접시에 커버 전표를 수집합니다.
- 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 mCherry에 융합 된 Ps ACR1 유전자의 DNA를 준비합니다.
- 제한 효소 또는 다른 확립 된 복제 방법을 사용하여 mCherry 형광 단과 프레임에있는 peGFP-C1 플라스미드 (CMV 프로모터, 카나마이신 내성)에 Ps ACR1을 코딩하는 인간 코돈 최적화 유전자 서열을 클로닝한다.
참고 : 다른 형광체도 사용할 수 있지만 설정에서 현미경으로 형광을 관찰 할 수있는 해당 필터 세트가 있는지 확인하십시오. - 표준 프로토콜에 따라 열 충격을 통해 chemocompetent XL1Blue 대장균 세포로 플라스미드 DNA를 변형하고 한천 플레이트 (30 μg / ML 카나마이신) 30 플레이트
- 다음날, 단일 식민지에서 세포와 30 μg / ML kanamycin 보충 4 ML의 lysogeny 국물 매체를 접종하고 인큐베이터에서 37 ° C와 180 RPM에서 밤새 그들을 품어.
- 하룻밤 배양 후, 제조사의 지시에 따라 상업적으로 이용 가능한 키트 ( 물질 표 참조)를 사용하여 배양 물로부터 플라스미드 DNA를 정제한다.
- 제한 효소 또는 다른 확립 된 복제 방법을 사용하여 mCherry 형광 단과 프레임에있는 peGFP-C1 플라스미드 (CMV 프로모터, 카나마이신 내성)에 Ps ACR1을 코딩하는 인간 코돈 최적화 유전자 서열을 클로닝한다.
- 세포에 씨를 뿌린다.
참고 : 층류 후드 아래에서 단계를 수행하십시오.- 35mm 배양 접시에 최대 3 개의 라이신 코팅 유리 커버를 놓습니다.
참고 : 서로 미끄러지는 것을 방지하기 위해 접시의 바닥에 부드럽게 누르십시오. - 각 접시에 10 % 태아 소 혈청 (FBS)이 보충 된 2 ML 표준 Dulbecco의 수정 독수리 매체 (DMEM)에 종자 1.5 X 10 5 HEK 세포.
- 모든에서 트랜스 레티 날 보충1 μM의 최종 농도. 단계 1.6으로 진행하기 전에 적어도 하루 동안 세포를 성장시킵니다.
- 35mm 배양 접시에 최대 3 개의 라이신 코팅 유리 커버를 놓습니다.
- 일시적으로 lipofection 31 을 통해 세포 transfect.
- 세포의 각 요리에 대해, FBS 및 6 μL transfection 시약없이 250 μL DMEM에서 플라스미드 DNA (1.4 단계에서 준비) 2 μg의 용액을 준비합니다 ( 재료 표 참조).
- 배양 15 분 후, 부드럽게 (방울) 세포에 솔루션을 추가합니다.
- 한천 다리 준비
- 50 ML 멸균 염화 나트륨 솔루션 (140 MM)에 0.75 g 아가로 오스를 추가하고 전자 레인지에 가열하여 용해.
참고 : 한천 다리 준비를위한 2 - 3M KCl은 K + 와 Cl - 이온의 동등한 이동성과 높은 농도 ( 예 : 다리로부터의 일정한 확산)로 인해 LJP를 추가로 줄이지 만 이온 - (특히 Cl - ) 누출을 최소화하는 것은 피했다 ~로 그는 목욕 용액 32 . - 주사기를 사용하여 액체 아가로 오스 솔루션 10 μL 피펫 팁 (또는 작은 직경 호스)을 기입하십시오.
참고 : 다리에 기포가 생기지 않도록하십시오. - 한천 다리가 냉각되고 고형화 된 후에는 멸균 된 140 mM 염화나트륨 용액에 보관하십시오.
- 50 ML 멸균 염화 나트륨 솔루션 (140 MM)에 0.75 g 아가로 오스를 추가하고 전자 레인지에 가열하여 용해.
- 녹음 및 목욕 전극을 준비하십시오.
- 패치 클램프 설정의 욕조와 녹음 전극의 은선을 제거합니다.
- 이전 실험에서 염화은을 제거하기 위해 사포로 전선을 연마하십시오. 깨끗한은 전선을 3M KCl에 담그고 염화은으로 전해 코팅을위한 1.5V 배터리의 양극에 연결하십시오.
참고 : 실험실 전원 공급 장치는 배터리 대신 사용할 수 있습니다.
- Micropipette 풀러를 사용하여 유리 모세관에서 저 저항 패치 피펫 (1.5-3.0 MΩ)을 당겨 Brown et allass = "xref"> 33. 측정 당일 피펫을 먼지가 없도록 보관하십시오.
- 모든 설정 구성 요소를 켜고 녹음 30 분 전에 작동 온도까지 가열하십시오. 버퍼가 실온에 있는지 확인하십시오.
2. 선택도 측정
- 1.6에서 설명한 세포의 일시적인 transfection 후 24 ~ 48 시간 녹음을 시작합니다.
- 하나의 커버 슬립을 측정 챔버에 넣고 실리콘으로 밀봉하여 외부 버퍼가 누출되지 않도록하십시오. 다음 실험 세트를 위해 인큐베이터에 다른 커버 슬립과 페트리 접시를 저장하십시오.
- 조심스럽게 세포의 분리를 막기 위해 세포 외 완충액 (높은 [Cl - ])으로 챔버를 채운 다음 현미경으로 놓고 세포 시각화를 위해 40X 대물 렌즈를 사용하십시오.
- 한천 다리를 욕조 전극 위에 놓고 유체 레벨 센서와 목욕 처리기의 관류 출구와 함께 챔버에 놓습니다.
- 전 교환tracellular solution을 신선한 외부 용액 (높은 [Cl - ]) 1 mL로 두 번 두어 잔여 배양액과 분리 된 세포를 제거한다.
- 세포를 집중시켜 다른 세포와 분리해야하는 형질 전환 (형광) 세포를 찾으십시오. 삼중 밴드 필터 세트와 주황색 빛 (590 nm, 대역폭 15 nm, 100 % 강도)을 사용하여 mCherry를 자극하고 시각화하십시오.
참고 : HEK 셀은 전체 셀 구성에서 낮은 멤브레인 저항을 초래하는 갭 접합부 (34) 에 의해 그 이웃에 전기적으로 결합 될 수있다. - 뽑은 피펫 중 하나를 세포 내 용액으로 채우고 피펫을 여러 번 뒤집어 공기 방울을 제거하십시오.
- 피펫 홀더에 피펫을 마운트하고 팁의 막힘을 방지하기 위해 몇 가지 긍정적 인 압력을 적용합니다.
- 현미경에서 패치 피펫의 팁을 찾아 micromanipulator를 사용하여 세포 가까이에서 탐색합니다.
참고 : 다음 단계는 a.mplifier, 데이터 수집 및 평가 소프트웨어를 제공합니다. - 데이터 수집 소프트웨어에서 "멤브레인 테스트"를 시작하고 "멤브레인 테스트"를 실행하는 동안 "목욕 모드"를 사용하여 지정된 소프트웨어를 통해 수동 또는 자동으로 전압 단계 (테스트 펄스, 예 : 5mV 10ms,베이스 라인 0mV)를 적용합니다. 데이터 수집 소프트웨어에서
- 피펫 저항이 원하는 범위 (1.5-3.0 MΩ)인지 확인하십시오.
- "멤브레인 테스트"의 "목욕 모드"에서 작동하는 동안 앰프에서 피펫 오프셋 손잡이를 돌려 피펫 전위를 조정하여 오프셋 전류를 제로화하십시오.
- 전체 셀 구성에서 패치를 설정하십시오.
참고 : 다음 단계에서는 사용 된 피펫 홀더의 측면 포트에 양수 및 음압을 적용해야합니다. 이것은 주사기를 사용하거나 마우스 피스를 통해 또는 전자적으로압력 조절기. 이 프로토콜에서는 양성 및 음압이 마우스 피스 를 통해 적용됩니다.- 천천히 상단에서 패치 피펫으로 세포에 접근하고 그것을 만지기 직전에 양압을 완화하십시오.
참고 : 팁이 셀에 가까워지면 저항이 약간 증가합니다. 이는 테스트 펄스의 축소 된 크기로 표시됩니다. - "멤브레인 테스트"를 "목욕 모드"에서 "패치 모드"로 변경하여 세포의 기대 휴식 잠재력 (-30 ~ -40 mV)을 유지하십시오.
- 어떤 경우에는 양성 압력 (2.13.1)이 방출 된 후에 세포 부착 형태가 형성되고, 그렇지 않은 경우 기저부 형성을 보조하기 위해 천천히 부압을 적용합니다.
참고 : 셀 부착 구성은 테스트 펄스가 펄스의 시작과 끝에서 두 개의 작은 용량 성 피크로 감소되고 멤브레인 저항이 GΩ 범위에있을 때 설정됩니다. -60 mVm까지의 음 전압gigaseal 형성을 촉진합니다. - "피펫 캐패시턴스 보상"노브를 돌려 피펫 캐패시턴스를 보상하여 테스트 펄스의 응답을 평평하게하십시오.
- 전체 세포 구조를 얻기 위해 음압 또는 음압의 짧은 펄스를가함으로써 강도를 증가시키면서 씰을 파괴하지 않고 패치를 파열시킵니다.
참고 : 셀 연결에서 전체 셀 구성으로의 성공적인 전환은 용량 성 피크의 증가로 나타납니다. - 멤브레인 전위를 원하는 유지 전압으로 정확하게 클램프하기 위해 사용 된 증폭기의 전체 셀 매개 변수 및 보상 조정을 설정하여 직렬 저항 보상을 적용하십시오.
- "시리즈 저항 보상"패널에서 "멤브레인 테스트"를 "예측"및 "보정"으로 최대 90 %까지 전환하여 용량 성 응답의 오버 슛 및 진동을 피하고 전체 셀을 돌립니다보정 스위치를 켜고 증폭기의 적절한 전면 패널 노브 ( "전체 셀 용량"및 "직렬 저항")를 사용하여 전체 셀 매개 변수를 반복적으로 조정하여 이상적으로 평평한 테스트 씰 응답을 얻으십시오.
참고 : 직렬 저항 보정 및 보정에 대한 자세한 설명은 앰프 설명서 또는 가이드 라인을 참조하십시오.이 절차는 제조업체마다 다릅니다.
- "시리즈 저항 보상"패널에서 "멤브레인 테스트"를 "예측"및 "보정"으로 최대 90 %까지 전환하여 용량 성 응답의 오버 슛 및 진동을 피하고 전체 셀을 돌립니다보정 스위치를 켜고 증폭기의 적절한 전면 패널 노브 ( "전체 셀 용량"및 "직렬 저항")를 사용하여 전체 셀 매개 변수를 반복적으로 조정하여 이상적으로 평평한 테스트 씰 응답을 얻으십시오.
- 전체 전지 구성을 확립 후 패치 피펫 35 를 통해 세포 내 솔루션의 충분한 교체를 보장하기 위해 녹음하기 전에 적어도 2 분 기다립니다.
- 천천히 상단에서 패치 피펫으로 세포에 접근하고 그것을 만지기 직전에 양압을 완화하십시오.
- 이전에 설정 한 프로토콜 (1.2 참조)을 사용하여 다른 유지 전위에서 광 유도 전류를 기록합니다.
- 패치를 파괴하지 않고 최소 5 번 이상 챔버의 낮은 [Cl - ]에 세포 외 완충액을 교환하고 t에서 다른 전류 - 전압 관계를 기록한다 (단계 1.2 참조 ).그는 새로운 염화물 농도.
참고 : 자동 버퍼 교환을위한 관류 시스템은이 과정을 용이하게하지만 반드시 필요한 것은 아닙니다. - 2.15를 반복하십시오. 테스트 할 모든 이온 상태에 대해, 위에서 설명한 "멤브레인 테스트"에 의한 측정 사이의 패치의 품질을 반복적으로 점검하십시오.
참고 : 정확한 멤브레인 전압과 안정적인 세포 내 이온 조성을 보장하기 위해 멤브레인 저항은 500MΩ 이상이어야하며 액세스 저항은 10MΩ을 초과해서는 안됩니다 . 2.12.6). 멤브레인 테스트를 위해 전체 셀 파라미터 보정을 해제하는 것을 잊지 마십시오. - 2.2 반복. 2.15로 여러 세포에 대해, 그러나 세포의 건강을 보장하기 위해 각 테스트 시리즈에 대한 새로운 커버 슬립을 가져 가라.
3. 데이터 평가
- 조명 전의 평균 전류를 뺀 값으로 각 전류 추적의 기준선을 조정하십시오.
- 평균 고정 광전류 I s (
- 테스트 한 모든 조건 및 다른 셀에 대해 3.1) 및 3.2) 단계를 반복하십시오.
- 결정된 광전류와 각 보유 전위를 플롯하십시오.
참고 : 여러 측정 값의 평균을 계산하면 개별 레코딩을 지정된 조건 또는 셀의 커패시턴스로 정규화 할 수 있습니다. - 전류 - 전압 관계와 전압 축의 교차점은 역전 전위 (순 전류가 0 임)를 나타냅니다. 두 인접 데이터 포인트 간의 선형 보간법으로이를 결정합니다.
참고 : 광전류의 극성 반전이없는 경우 마지막 두 점에서 0에 가까운 직선을 외삽하여 교차점의 근사값을 얻습니다. - 결정된 r의 평균외부 버퍼 용액 ( 그림 2B 참조 )의 염화물 농도에 대해 플로팅 (plot)한다.
- JPC (Junction Potential Calculator) 27 을 열고 'New Experiment'대화 상자를 엽니 다. 그런 다음 "Patch-clamp measurements"를 선택하십시오. "전체 셀 측정", "표준 소금 용액 전극"을 선택하고 온도를 입력하십시오.25 ° C. 각 단계 사이에서 "다음"버튼을 눌러 선택을 수락하면 진행됩니다.
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Representative Results
그림 2 는 설명 된 프로토콜에 따라 측정 한 결과를 보여줍니다. 초록색 조명으로 조명하는 동안 Ps ACR1은 빠르게 일시적인 전류 레벨로 빠르게 감쇄하는 빠른 과도 전류를 특징으로합니다. 빛이 꺼지면 광전류는 밀리 세컨드 내에 0으로 감소합니다 ( 그림 2A ). 세포 외 염화물 농도를 바꾸면 획득 한 광전자 흔적에서 직접 볼 수있는 역전 전위가 이동합니다. 다중 측정으로부터의 역전 전위의 평가는 외부 염소 농도의 변화에 의해 야기 된 극적인 역 전위 변화를 정량화합니다 ( 그림 2B ). 놀랍게도, 측정 된 반전 전위는 클로라이드의 계산 된 Nernst 전위와 직접적으로 일치한다 ( 그림 2C ). 이는 Ps ACR1의 높은 염화물 선택도를 확인한다.
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그림 2 : Ps ACR1 의 염화물 선택 도 . ( A ) HEK293 세포에서의 Ps ACR1의 대표적인 전류 추적. 세포 내 염화물 농도는 120 mM로 유지되는 반면, 세포 외 농도는 NaCl과 Na- 아스파 테이트의 부분 치환으로 150 mM (녹색)에서 10 mM (자주색) 염화물로 다양하다. 유지력은 -80 mV에서 +40 mV까지 20 mV 간격으로 증가했습니다 (LJP 보정 됨). ( B ) 평균 전류 - 전압 관계 (n = 6은 A의 조건에 해당). ( C ) 전류 - 전압 관계로부터 추출 된 역전 전위 (중심선은 중앙값, 박스 한계는 25 번째 및 75 번째 백분위 수, 휘발성 물질은 표준 편차의 2 배, 원은 단일 데이터 점을 나타냄). 염화 고밀도의 경우(녹색) 값은 -20 mV와 0 mV 유지 전위 사이에서 선형 적으로 보간되었지만 값은 +40 mV (보라색, 파선, 패널 B)에서 선형 적으로 외삽되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
정의 된 이온 및 전기 조건에서 역전 전위의 결정은 ChR의 가벼운 활성화 후에 운반 된 이온 종에 대한 정보를 제공합니다. 독점적으로 하나의 이온 종이 복잡한 생리 학적 매질에서 변화되고 얻어진 역전 전위가 이론상의 Nernst 전위에 따라 이동하면,이 이온 종이 유일한 수송 된 것입니다.
그러나 ChR의 경우 전도 이온 간의 경쟁은 물론 다른 이온 종에 대한 침투성 때문에 Nernst 방정식에서 예상했던 것보다 반전 전위 이동이 일반적으로 덜 명확합니다. 이 경우 상황이 더욱 복잡해지고 잠재적으로 수행되는 모든 이온을 다양한 측정 솔루션을 필요로하는 별도로 교환해야합니다. 또한, 대부분의 CCR 및 제 1 인공 ACR ( 9 , 10 , 21) 은 양성자에 대해서는 전도성이지만, 양성자 농도양성자 농도는 역전 전위를 이동시킬뿐만 아니라 수소 결합 네트워크의 변화, 이온 결합 상태의 변화로 인해 이온 전도도 9 , 광전류 운동 21 , 36 및 분광 광 민감도 11 , 37 에도 영향을 줄 수 있으므로 특히 철저한 분석이 필요하다. 개별 잔기 및 2 차 구조 변화. 양성자 전도성은 위에서 언급 한 단백질 변화를 피하기 위해 pH를 일정하게 유지하면서 Na + , Ca 2+ 또는 Cl - 와 같은 잠재적으로 전도 된 다른 모든 이온의 농도를 줄임으로써 해결할 수 있습니다. 비 전도성 대용 물은 일반적으로 양이온 12의 경우 NMG + , 음이온의 경우 글루코 네이트, 2- ( N- 모르 폴리 노) 에탄 설포 네이트 (MES - ) 또는 아스 파르 테이트와 같이 부피가 크고 대전 된 분자입니다. 다른 i에서 전위 역전 비교onic solution은 Goldman-Hodgkin-Katz 전압 방정식에 의해 평형 조건에서 상대 이온 투과성의 계산을 허용한다. 그러나 평형 조건을 넘어선 이온 경쟁을 고려하여 순 광전류에 대한 다양한 이온의 정확한 기여를 정량화하기 위해서는 복잡한 수학적 모델이 필요하다.
ChR에 의해 운반되는 이온의 조성을 아는 것은 특히 신경 생리 학적 맥락에서 ChR 적용으로 인한 부작용을 밝혀내는 데 도움이됩니다. 예를 들어, 장기간 ChR 활성화는 세포 내 산성화를 유발할 수 있거나 또는 수행 된 칼슘 2+ 는 시냅스 방출과 이차 전달 경로를 유발할 수있다. 세포는 일반적으로 조직 내에 단단히 싸여 있기 때문에 미생물 로돕 신의 활성화는 세포 내 이온 조성뿐만 아니라 세포 외 관강에도 영향을 미쳐 n에 영향을 미친다주변 셀 41 .
이온 선택성에도 불구하고, 광전류 진폭, 불활 화, 불투명, 광 감도 및 운동 특성과 같은 ChR의 다른 생물 물리학 적 특징은 종종 광 생성 기술을 포함하는 실험을 수행하고, 설계하고 해석하는 데 관심이있다. 이러한 속성 중 일부는 위의 프로토콜 18 , 37 , 42에 설명 된 프로토콜에서 확인할 수도 있습니다. ChR 발현 세포의 빛 감도를 조사하기 위해, 빛의 세기는 광원의 힘을 조절하거나 중립 밀도 필터로 활성 광선을 감쇠시킴으로써 변화 될 수있다. 분광 감도를 얻으려면 다색광 광원이 필요하며 강도는 모든 파장에 대해 동일한 광자 유속 및 대역폭으로 조정되어야합니다. 고강도 스펙트럼은 짧은 광 펄스 또는 광 감응 기의 경우 광 수용체의 흡수 스펙트럼과 유사합니다.레이저 플래시가 사용됩니다. 그렇지 않으면 적응 현상과 광 화학적 역행이 발생할 수 있습니다. 완전히 비활성화 된 ChR (전체 photocycle 회전 시간)에서 부분적으로 비활성화 된 상태에서의 복구는 두 개의 광 펄스 사이에 어두운 간격이 증가하는 이중 펄스 프로토콜을 적용하여 조사 할 수 있습니다. 위에 논의 된 ChR의 생물 물리학 적 특성은 실험적 요구 사항에 적합한 ChR을 선택하는 데 중요합니다.
전기 생리 학적 기법을 통해 이러한 생물 물리학 적 특성을 도출하는 것은 분광학 방법으로는 거의 다루지 않는 단백질 기능과 직접적으로 유사합니다. 전압 클램프 측정을 성공적으로 수행 한 후에는이 기술을 부위 지정 돌연변이 유발 9 , 11 , 43 , 44 , 헬릭스 - 셔플 링 37 ,
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Acknowledgments
우수한 기술 지원을 위해 Maila Reh, Tharsana Tharmalingam, 특히 Altina Klein에게 감사드립니다. 이 연구는 독일 연구 재단 (DFG) (SFB1078 B2, FOR1279 SPP1665 to PH)과 Catalysis, UniCat, BIG-NSE (JV) 및 E4 (PH)의 우수 통합 클러스터 개념에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK293 cells | Sigma Aldrich | 85120602 | Human embryonic kidney cells |
| Retinal | Sigma Aldrich | R2500 | all-trans retinal |
| FuGENE HD | Promega | E2312 | Transfection reagent |
| DMEM | Biochrome | FG 0445 | Dulbecco's Modified Eagle Medium |
| Agarose | Roth | 3810 | Agar bridges |
| CaCl2 | Roth | 5239 | CaCl2 2H2O |
| CsCl | Biomol | 2452 | |
| EGTA | Roth | 3054 | |
| FBS | Biochrome | S0615 | Cell culture |
| Glucose | Roth | HN06 | D(+)-Glucose |
| KCl | Roth | 6781 | |
| MgCl2 | Roth | 2189 | MgCl2 6H2O |
| NaCl | Roth | 3957 | |
| NMG | Sigma Aldrich | M2004 | N-Methyl-D-glucamine |
| Na-Aspartate | Sigma Aldrich | A6683 | L-Aspartic acid sodium salt monohydrate |
| Citric acid | Roth | 6490 | |
| AgeI | ThermoFischerScientific | ER1462 | Restriction enzyme |
| XhoI | ThermoFischerScientific | ER0695 | Restriction enzyme |
| NheI | ThermoFischerScientific | ER0975 | Restriction enzyme |
| XL1Blue E. coli | Agilent Technologies | 200249 | Chemocompetent E. coli |
| Kanamycin | Roth | T832 | |
| Lysogeny broth medium | Roth | X964 | |
| Agar-Agar | Roth | 6494 | Agar plates |
| Plasmid purification kit | Marchery-Nagel | 740727.25 | |
| Penicilin/Streptomycin | Biochrome | A 2213 | Cell culture |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma Aldrich | P6407-5MG | Cover slip coating |
| Microforge | Custom made | Fire polishing | |
| Serological pipettes | TPP | Different sizes | |
| Clean bench | Kojair | Biowizard SL130 | |
| Stirrer | IKA | RCT classic | |
| Silver wire | Science Products | AG-T25; AG-T10 | Electrodes, 0.64 mm (bath); 0.25 mm (electrode) |
| pH-meter | Knick | 765 Calimetric | |
| Osmometer | Vogel | OM 815 | |
| Microscope | Carl Zeiss | ID03 | Fire polishing |
| CO2 incubator | Binder | CB150 | |
| Cell culture dishes | TPP | 93040 | 34 mm internal diameter |
| Cover slips | Roth | P232 | 15 mm diameter |
| Thermometer | Rössel Messtechnik | MTM12 | |
| Beamsplitter | Chroma | 21011 | 90/10 transmission |
| Pipette holder | ALA Scientific Instruments | PPH-1P-AXU-0-1.5 | |
| Headstage | Molecular Devices | CV203BU | |
| Amplifier | Molecular Devices | AxoPatch200B | |
| Digitizer | Molecular Devices | DigiData1400 | Digital analog converter |
| Lightsource | TILL Photonics | Polychrome V | Set to 540 nm full intensity |
| Microscope | Carl Zeiss | Axiovert 100 | |
| Shutter | Vincent Associates | VS25 | |
| Shutter driver | Vincent Associates | VCM-D1 | |
| Glass capilarries | Warner Instruments | G150F-3 | Boresilicate capillaries with fire polished ends OD 1.5 mm ID 0.86 mm |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P1000 | |
| Bath handler | Lorenz Messgerätebau | MPCU | |
| Tripleband filterset | Chroma | 69008 | Fluorescence filter ECFP/EYFP/mCherry |
| CCD camera | Watec | Wat-221SCCD | |
| Optometer | Gigahertz Optik | P9710 | Measure light intensities |
| Objective | Carl Zeiss | 421462-9900-000 | W Plan-Apochromat 40X/1.0 DIC |
| Micromanipulator | Scientifica | PatchStar | |
| Recording chamber | Custom made | ||
| Power supply | Manson | HCS-3202 | Avoids electrical noise from microscope built-in power supply |
| Vibration isolated table | Newport | M-VW-3636-OPT-01 | |
| Faraday cage | Custom made or any commercial matching table | ||
| Hoses | Any comercial; e.g. Roth | Different sizes and materials for bath handling and application of pipette pressure; agar bridges | |
| Linear shaker | Sunlab Instruments | SU 1000 | |
| Liquid junction potential calculator | Molecular Devices or directly from Peter H. Barry | Program is included in the Clampex aquisition software or can be obtained from p.barry@unsw.edu.au | |
| Data acquisition software | Molecular Devices | Clampex 10.X | |
| Data evaluation software | Molecular Devices | Clampfit 10.X | |
| PsACR1 | GenBank or Addgene | KF992074.1 or Addgene plasmid #85465 | Gene encoding for PsACR1 |
| Amplifier guide | Molecular Devices | The Axon Guide |
References
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