Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

תא שלם תיקון מהדק הקלטות עבור קביעת electrophysiological של יון סלקטיביות ב Channelrhodopsins

Published: May 22, 2017 doi: 10.3791/55497
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Experimental Biophysics, Institute of Biology, Humboldt-Universität zu Berlin
* These authors contributed equally

Abstract

במהלך העשור האחרון, channelrhodopsins הפך חיוני במחקר neuroscientific שבו הם משמשים כלים לא פולשני לתפעל תהליכים חשמליים בתאי היעד. בהקשר זה, סלקטיביות יון של channelrhodopsin הוא בעל חשיבות מיוחדת. מאמר זה מתאר את החקירה של סלקטיביות כלוריד עבור לאחרונה זיהו anion-channelrhodopsin ניטור של Proteomonas sulcata באמצעות הקלטות קליפ תיקון אלקטרו על תאים HEK293. ההליך הניסויי למדידת צילומי האור הנשלטים על ידי האור דורש תמסורת מהירה - מונוכרומטית - מקור אור צמוד למיקרוסקופ של תצורת טלאי קונבנציונאלי. ההליכים ההכנה לפני הניסוי מתוארים הכנת פתרונות שנאגרו, שיקולים על פוטנציאל צומת נוזלים, זריעה transfection של תאים, ו משיכת טפיחות תיקון. ההקלטה בפועל של יחסי המתח הנוכחיS כדי לקבוע את הפוטנציאל היפוך עבור ריכוזי כלוריד שונים מתרחש 24 שעות עד 48 שעות לאחר transfection. לבסוף, נתונים אלקטרופיזיולוגיים מנותחים ביחס לשיקולים תיאורטיים של הולכה כלוריד.

Introduction

Channelrhodopsins (CHR) הם ערוצי יון אור מגודלים המתרחשים בנקודת העין של אצות ירוקות נעות, ומשמשים כמחזירים ראשוניים עבור פוטוטקסיס ותגובות פוביות 1 . מאז התיאור הראשון שלהם בשנת 2002, ChRs סללו את הדרך עבור השדה המתעוררים של optogenetics ויכול להיות מיושם במגוון של תאים נרגשים למשל בתוך שרירי השלד, הלב, או את המוח 3 , 4 , 5 . ביטוי של CHRs בתאי היעד גורם חדירות אור יון לשליטה של ​​התא בהתאמה. בהקשר נוירוני, זה מאפשר הפעלה 6 , 7 , 8 או עיכוב 9 , 10 של פעולה פוטנציאליים (AP) ירי - בהתאם יון שנערך - עם הזמן המרחבידיוק של אור המדגיש כיצד סלקטיביות יון של גרסה ChR קובעת יישום optogenetic שלה.

גידולי CHR הראשונים שהתגלו מ - Chlamydomonas reinhardtii ו- Volvox carteri חדירים לפרוטונים, אך גם לקטיונים מונוולנטיים כמו נתרן, אשלגן, ובמידה פחותה גם לקטיונים דו-קלים כגון סידן ומגנזיום 11 , 12 , 13 . כיום, יותר מ -70 קטיונים טבעיים (cCR) 14 , 15 , 16 , 17 וריאנטים מהונדסים שונים 18 , 19 , 20 עם מאפיינים שונים כגון גודל פוטו, רגישות ספקטרלית, קינטיקה, סלקטיביות קטיון זמינים. בעוד בתחום מדעי המוח, CCRs אששימשו להפעלת תאים ומפעילי APPS, משאבות מונעות על ידי אור, היו היריבים הזמינים רק עבור נוירונים משתיקים במשך שנים. בשנת 2014, שתי קבוצות הראו בו זמנית כי CCRs ניתן להמיר anion-conductrhopsops ניצח אניון (ACRs) על ידי שינוי של הקוטביות לאורך יון putative ניצוח באמצעות הנדסה מולקולרית 9 , 21 . לאחר מכן, ACRs טבעיים זוהו בכמה קריפטופיטים 22 , 23 , 24 . והכי חשוב, הפעלה קלה של ACRs מתווכת זרמי כלוריד נוירונים מבוגרים המאפשר עיכוב של הפעילות העצבית בעוצמות האור הרבה יותר נמוך מאשר משאבות מיקרוביאליות כי רק הובלה יחיד חיובי לכל פוטון נספג.

פעילות ChR ניתן לטפל ישירות על ידי אלקטרו קליפ הקלטות אלקטרומגנטית של זרמים האור המושרה בתאים HEK293. מהדק התיקוןהטכניקה פותחה במקור בסוף שנות ה -70 25 ושיפר עוד יותר על ידי Hamill et al. , המאפשר הקלטה של ​​ישות של זרמים מתא קטן (מצב תא שלם) עם רזולוציה גבוהה הנוכחי שליטה ישירה של מתח קרום 26 . יישומי בתרבית תאים, טכניקה זו מספקת שליטה מדויקת של תנאי ההקלטה יונית כמו גם חשמל, ומאפשר לימוד סלקטיביות יון יחד עם התרומה היחסית של יונים לסך הנוכחי. כאן אנו מדגימים את בדיקת סלקטיביות יון עבור anion מנצח transrhodopsin של Proteomonas sulcata (פס ACR1) 22 , 23 באמצעות הקלטה של ​​יחסי מתח הנוכחי תחת ריכוזי כלוריד תאיים שונים כדי להוכיח מוליכות כלוריד גבוהה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

איור 1
איור 1: תיקון ההתקנה של מהדק. (1) אחרים - אחרים - מכשור ספורטיבי (1) מקורות אור, (2) סיבים אופטיים, (3) תריס ניתנת לתכנות, (4) , (10) כלוב faraday, (11) מיקרוסקופ הבמה, (12) כניסת זלוף, (13) שקע זלוף, (14) חדר הקלטה, (15) חיישן ברמה נוזלים, (16) אלקטרודה אמבטיה עם גשר אגר, (19) מיקרוסקופ הפוכה, (21) מיקרוסקופ הפוכה, (21) מיקרוסקופ הפוכה, (21) מנורת מיקרוסקופ, שסתום, (25) שולחן אנטי רטט, (26) מצלמה CCD. ( א ) תמונות ( ב ) ייצוג סכמטי של ההתקנה. אנא לחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותר של tאת דמותו.

1. הגדרה לפני ההקלטות

תוֹך. .1 תוספת
כלוריד גבוה כלוריד גבוה כלוריד נמוך
ג [mM] C [mM] C [mM]
Na-ASP 0 0 140
NaCl 110 140 0
KCl 1 1 1
CsCl 1 1 1
CaCl 2 2 2 2
MgCl 2 2 2 2
HEPES 10 10 10
EGTA 10 0 0
PH 7.2 7.2 7.2
אוסמולריות 290 mOsm 320 mOsm 320 mOsm

טבלה 1: הרכב יוני של פתרונות שנאגרו. הרכב של תאים תאיים (תוך) ו תאיים (תוספת) buffers עבור כלוריד סלקטיביות ניסויים בתאי HEK. קיצורים בשימוש: אתילן גליקול tetraacetic חומצה (EGTA), 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic חומצה (HEPES) ו aspartate (ASP). כל הריכוזים נמצאים mM.

  1. הכן את פתרונות ההקלטה בריכוז יון, כפי שמצוין בטבלה 1.
    1. הכן 15 מ"ל של 2 פתרונות מלאי M במים ultrapure עבור MgCl 2 , CaCl 2 , KCl ו CsCl.
    2. לשקול את מרכיבי מוצק עבור 100 מ"ל של תאיים ו500 מ"ל של הפתרונות שנאגרו תאיים בהתאם לטבלה 1 לתוך כוסות נפרדות ולהוסיף את הכמות המתאימה של פתרונות המניות מוכן לאחר מכן. לדוגמה, עבור חיץ תאיים, השתמש 0.3803 גרם (10 מ"מ) EGTA, 0.2383 גרם (10 מ"מ) HEPES ו 0.6428 גרם (110 מ"מ) NaCl ולהוסיף 100 μL של M 2 MgCl 2 ו CaCl 2 ו 50 μL של 2 M KCl ו CsCl פתרונות המניות.
    3. מוסיפים מים אולטרה ופועלים בזהירות את החומציות באמצעות חומצות ובסיסים, אשר אינם מפריעים למדידה, כלומר אינם מבוצעים על ידי ה- CHR, כגון חומצת לימון ו- N-methyl-D-glucamine (NMG + ).
    4. התאם את osmolarity ל 290 mOsm עבור תאיים ל 320 mOsm עבור פתרונות תאיים עם גלוקוז.
      הערה: מעט פתרונות היפוכוטיים תוך תאיים מגדילים את שיעור ההצלחה של תיקון.
    5. סטרילי לסנן את כל הפתרונות באמצעות 0.22 מיקרומטר מסננים. פתרונות חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך שבועייםS או להקפיא ב -20 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך.
  2. חישוב הפוטנציאל צומת נוזלי ולהכין פרוטוקולים הקלטה.
    הערה: שינוי ריכוז כלוריד תאיים לאחר קביעת תצורה של תא שלם גורם לצומת נוזלי משמעותי (LJP) שיש לתקן 27 , 28 . LJPs ניתן למדוד ישירות או מחושב, כאן האפשרות השנייה משמש. בפרוטוקול זה, תיקון on-line ישמש בדרישה פרוטוקול הקלטה אחת עבור כל חיץ חיצוני. עם זאת, עבור קבוצה גדולה יותר של פתרונות חיצוניים תיקון פוסט של LJP מומלץ להימנע תיקון שקר.
    1. פתח את המחשבון הפוטנציאלי לצומת (JPC) 27 ופתח את הדו-שיח 'ניסוי חדש'. לאחר מכן בחר "תיקון מדידות מהדק". בחר "מדידות התא כולו", "תקן מלח פתרון אלקטרודה" ולהיכנס טמפרטורה של25 ° C. בין כל צעד, קדימה על ידי קבלת הבחירה על ידי לחיצה על כפתור "הבא".
      הערה: הניסויים מבוצעים בטמפרטורת החדר של 25 ° C במעבדה ממוזגת. ודא כי פתרונות חיץ יש טמפרטורת החדר לפני תחילת הניסויים. כדי לשנות את הטמפרטורה המדגם בשלב הדגירה או קאמרית ניתן להשתמש. טמפרטורת אמבט ניתן למדוד לעתים קרובות עם מדחום.
    2. מוסיפים את כל ריבועי אניון וקטיון הפרט של הפתרון pipetted ואת חיץ כלוריד גבוהה על פי הריכוזים המפורטים בטבלה 1 .
      הערה: ה- JPC יחשב LJP של -0.5 mV לתנאי ההתחלה.
    3. לחץ על "פתרון אמבטיה חדש" כדי להזין את הרכב אניוניק קטיוני של חיץ כלוריד נמוך.
      הערה: ה- JPC יחשב כעת LJP חדש של 12.6 mV בהתאם לפתרון ההקלטה החוץ תאגידי.
    4. הכן שני LJP תיקון פרוטוקולים עבורשני תנאי מדידה על ידי הפחתת LJP מחושב מן הפוטנציאל מחזיק מוחל; -0.5 mV עבור גבוה +12.6 mV עבור פתרונות כלוריד חיצוני נמוך. כך פרוטוקולים להתחיל עם -79.5 mV (כלוריד גבוהה) ו -92.6 mV (כלוריד נמוך), בהתאמה כדי להשיג LJP- תוקן החל פוטנציאל ההחזקה של -80 mV בשני המקרים.
      הערה: השלבים הבאים חלים על תוכנת רכישת הנתונים המוזכרת ברשימת החומרים.
    5. פתח את עורך הפרוטוקול בתוכנה הרכישה. עבור לתפריט "מצב" בחר "גירוי אפיזודי" וכולל 7 מטאטא.
    6. עבור לתפריט "Waveform" בעורך וכולל 200 ms תקופה עם 0 mV מחזיק פוטנציאל ואחריו תקופה של 2 עם משתנה פוטנציאל החזקת החל ב -79.5 mV עבור כלוריד גבוהה. כלול "רמת דלתא" של 20 mV עבור התקופה השנייה כדי להגדיל את פוטנציאל החזקה על ידי 20 mV בכל לטאטא.
    7. בתוך הצעדים מתח של waveform edזה להחיל 500 ms תקופה של תאורה עם 540 ננומטר אור (3.10 mW / mm²). לשם כך, שנה את "תבנית הסיביות הדיגיטלית" של התריס המחובר השולט במקור האור כדי להיות פעיל ב - ms 500 לאחר התקופה השנייה המתוארת לעיל (ראה סעיף 1.2.6).
      הערה: עוצמת האור יכולה להשפיע על תכונות ביופיסיקליות של זרמי ערוצים כמו משרעת או אי-פעילות. לכן, צפיפות הספק האור תמיד צריך להיות מדווח. כדי למדוד את עוצמת האור לאחר שעבר את כל אופטיקה ו coverslip, השתמש אופטומטר מכויל. כדי לחשב את צפיפות הספק, לקבוע את השדה המואר של המטרה על ידי מיקרומטר אובייקט ולחלק את עוצמת האור נמדדת על ידי שדה מואר נחוש.
    8. שמור את הפרוטוקול עבור הפתרון כלוריד תאיים גבוהה. לשנות את הפרוטוקול ולהחליף את הרמה הראשונה מחזיק פוטנציאל ידי -92.6 mV (כלוריד חיצוני נמוך). שמור פרוטוקול זה השני כדי למדוד את המצב כלורי נמוך תאיים.
    9. ציפוי ליזין של כיסוי זכוכית מחליק לפי פרוטוקול מותאם 29 .
      1. המקום כמה מחליק 100 מחליק בצלחת פטרי זכוכית להוסיף 250 מ"ל HCl (1 N).
      2. מניחים את צלחת פטרי עם כיסוי להחליק על שייקר ליניארי לנער בסל"ד 120 עבור 72 שעות כדי לנקות את מחליק לכסות ולאחר מכן לשטוף עם מים ultrapure לנטרל pH.
      3. משרים אלה בנפח קטן של אתנול 95% לניקוי נוסף.
        הערה: מחליק כיסוי מחליק יכול להיות מאוחסן באתנול 70% לפני שתמשיך. עבודה מתחת למכסה המנוע זרימה למינרית עבור השלבים הבאים.
      4. באמצעות מבער בונזן ו פינצטה, להבה כל כיסוי להחליק ולהעביר אותו לתוך צלחת פטרי חדש.
      5. דגירה את מכסה זכוכית מחליק עם סטרילי 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​פולי- D- ליזין פתרון לפחות 1 שעות (או לילה) בטמפרטורת החדר תוך רועד עם שייקר ליניארי בסל"ד 150.
      6. שטפו את כיסוי מחליק עם מים ultrapure להסיר עודף poly-D- ליזין.
      7. מורחים את מחליק לכסות על נייר סטרילי להתייבש במשך 10 דקות, ולחשוף אותם לאור UV עבור עיקור (לפחות 20 דקות).
      8. אסוף את החלקים המכסים לתוך צלחת פטרי סטרילית מכוסה בנייר אלומיניום עד לשימוש.
    10. הכן DNA של Ps ACR1 הגן התמזגו mCherry באמצעות טכניקות ביולוגיה מולקולרית סטנדרטית.
      1. לשכפל את קודון האדם אופטימיזציה רצף הגן קידוד פס ACR1 לתוך peGFP-C1 פלסמיד (CMV promotor, התנגדות kanamycin) במסגרת עם fluorophore mCherry באמצעות אנזימים הגבלה או שיטות שיבוט הוקמה אחרים.
        הערה: fluorophores אחרים יכולים לשמש גם, אבל הקפד לקבל את המסנן המתאים קובע זמין כדי לצפות הקרינה שלהם תחת מיקרוסקופ ההתקנה.
      2. להפוך את ה- DNA פלסמיד לתוך chemocompetent XL1Blue E. תאים coli באמצעות הלם חום לפי פרוטוקול סטנדרטי צלחת אותם על צלחות אגר (30 מיקרוגרם / mL kanamycin) 30
      3. למחרת, לחסן 4 מ"ל lysogeny מרק בינוני בתוספת 30 מיקרוגרם / מ"ל ​​kanamycin עם תאים מושבות בודדות דגירה אותם במשך הלילה ב 37 ° C ו 180 סל"ד בחממה.
      4. לאחר הדגירה לילה, לטהר את ה- DNA פלסמיד מן התרבויות באמצעות ערכת זמין מסחרית (ראה טבלה חומרים) על פי הוראות היצרן.
    11. זרע את התאים
      הערה: בצע צעדים תחת מכסה המנוע זרימה למינרית.
      1. מקום עד שלוש ליזין מצופה זכוכית מחליק זה לצד זה בצלחת פטרי 35 מ"מ.
        הערה: לחץ בעדינות על החלק התחתון של התבנית כדי למנוע החלקה זו על זו.
      2. זרע 1.5 x 10 5 תאים HEK ב 2 מ"ל רגיל Dulbecco השתנה הנשר בינוני (DMEM) בתוספת 10% בסרום שור עוברית (FBS) בכל מנה.
      3. להשלים את כל הרשתית טרנס בריכוז סופי של 1 מיקרומטר. לגדל את התאים לפחות יום אחד לפני שתמשיך עם שלב 1.6.
    12. Transinterly transfect את התאים באמצעות lipofection 31 .
      1. עבור כל מנה של תאים, להכין פתרון של 2 מיקרוגרם של DNA פלסמיד (כפי שהוכנו בשלב 1.4) ב 250 DML μL ללא FBS ו 6 מגיב transfection μL (ראה טבלה חומרים ).
      2. לאחר 15 דקות הדגירה, בעדינות (dropwise) להוסיף את הפתרון לתאים.
    13. הכן גשרים אגר
      1. הוסף 0.75 גרם agarose ל 50 מ"ל תמיסת נתרן סטרילי כלורי (140 מ"מ) ו לפזר אותו על ידי חימום במיקרוגל.
        הערה: 2 - 3 M KCl להכנת גשר אגר מפחית עוד יותר את LJP עקב ריכוז גבוה יותר ( למשל דיפוזיה מתמדת מהגשר) וניידות שווה של K + ו - Clions, אך נמנעה למזער את הדליפה של יון (במיוחד Cl - ) לתוך פתרון
      2. מלא 10 טיפים פיפטה μL (או צינור קוטר קטן) עם פתרון agarose נוזלי באמצעות מזרק.
        הערה: הימנע בועות אוויר בגשר.
      3. לאחר גשרים אגר כבר מקורר ומוצק, לאחסן אותם ב סטרילית 140 מ"מ פתרון נתרן כלורי.
    14. הכינו הקלטה ו אלקטרודות אמבטיה.
      1. הסר חוטי כסף של אמבטיה הקלטה האלקטרודה של ההתקנה מהדק תיקון.
      2. פולנית החוטים עם נייר זכוכית כדי להסיר כלוריד כסף מניסויים קודמים. לטבול את חוט הכסף נקי ב 3 M KCl ולחבר אותו מוט חיובי של סוללה 1.5 V עבור ציפוי אלקטרוליטי עם כלוריד כסף.
        הערה: ניתן להשתמש באספקת חשמל במעבדה במקום בסוללה.
    15. משוך בטמפרטורות נמוך תיקון התנגדות (1.5-3.0 MΩ) מ נימים זכוכית עם משיכה micropipette אש פולנית אותם כפי שתואר על ידי בראון et alLass = "xref"> 33. חנות טפטפות ללא אבק ליום המדידה.
    16. הפעל את כל רכיבי ההתקנה כדי לחמם עד טמפרטורת עבודה 30 דקות לפני הקלטות. ודא כי מאגרים נמצאים בטמפרטורת החדר.

    2. מדידות סלקטיביות

    1. התחל את הקלטות 24 עד 48 שעות לאחר transfection חולף של התאים המתוארים 1.6.
    2. במקום אחד לכסות להחליק בתא מדידה וחותמת אותו עם סיליקון כדי למנוע דליפה של חיץ חיצוני. חנות צלחת פטרי עם מחליק אחרים מחליק באינקובטור עבור קבוצה הבאה של ניסויים.
    3. בזהירות למלא את החדר עם חיץ תאיים (גבוהה [Cl - ]) כדי למנוע ניתוק של תאים, ואז למקם אותו תחת מיקרוסקופ ולהשתמש המטרה 40X להדמיה תא.
    4. שים גשר אגר על האלקטרודה אמבטיה ומכניסים אותו לתוך החדר יחד עם חיישן רמת הנוזל ואת השקע זלוף של המטפל באמבטיה.
    5. להחליף את לשעברפתרון תאיים פעמיים עם 1 מ"ל של תמיסה חיצונית טריים (גבוהה [CL - ]) כדי להסיר תרבות שיורית בינוני מנותקת.
    6. תביא את התאים להתמקד ולחפש תא transfected (פלואורסצנטי), אשר צריך להיות מבודד תאים אחרים. השתמש משולש הלהקה להגדיר מסנן אור כתום (590 ננומטר, רוחב פס 15 ננומטר, עוצמת 100%) כדי לעורר לדמיין mCherry.
      הערה: תאים HEK יכול להיות מצורף חשמלית לשכנים שלהם על ידי צמתים הפער 34 וכתוצאה מכך התנגדות הממברנה נמוכה בתצורה של כל התא.
    7. מילוי אחד pipettes משוך עם פתרון תאיים ולהסיר בועות אוויר על ידי מרפרף פיפטה כמה פעמים.
    8. הר פיפטה על בעל פיפטה ולהחיל כמה לחץ חיובי כדי למנוע clogging של קצה.
    9. אתר את קצה פיפטה תיקון מתחת למיקרוסקופ ונווט אותו קרוב לתא באמצעות micromanipulator.
      הערה: השלבים הבאים חלים על aמגבר, רכישת נתונים ותוכנה להערכה המוזכרים ברשימת החומרים.
    10. הפעל את "בדיקת הממברנה" בתוכנת רכישת הנתונים וליישם שלב מתח (הדופק הבדיקה, למשל 5 mV עבור 10 אלפיות השנייה, הבסיס ב 0 mV), באופן ידני או אוטומטי באמצעות תוכנה שצוין באמצעות "מצב אמבטיה" בעת הפעלת "מבחן הממברנה" בתוכנה רכישת נתונים.
    11. בדוק כי ההתנגדות פיפטה הוא בטווח הרצוי (1.5-3.0 MΩ).
    12. אפס קיזוז זרמים על ידי התאמת הפוטנציאל פיפטה על ידי הפיכת הידוק פיפטה לקזז על מגבר תוך כדי עבודה במצב "אמבטיה" של "מבחן הממברנה".
    13. יצירת תיקון בתצורה של כל התא 26 .
      הערה: השלבים הבאים דורשים יישום של לחץ חיובי ושלילי הנמסר ליציאת הצד של בעל פיפטה בשימוש. זה יכול להיעשות באמצעות מזרק, דרך חתיכת הפה או אלקטרונית conרגולטור לחץ טרולי. בפרוטוקול זה לחץ חיובי ושלילי מוחל באמצעות חתיכת הפה.
      1. לאט לגשת לתא עם פיפטה תיקון מלמעלה ולהפחית את הלחץ החיובי ממש לפני לגעת בו.
        הערה: כאשר קצה קרוב לתא, ההתנגדות תעלה מעט; זה מסומן על ידי גודל מופחת של הדופק הבדיקה.
      2. לשנות את "מבחן הממברנה" מ "מצב אמבטיה" ל "מצב תיקון" ובכך מחזיק פוטנציאל פוטנציאל הצפוי של התאים הצפוי (-30 ל -40 mV).
      3. במקרים מסוימים תצורת התא המצורפת יוצרת את עצמה לאחר שחרור לחץ חיובי (2.13.1), אם לא, לחול בעדינות לחץ שלילי כדי לסייע היווצרות gigaseal.
        הערה: תצורה המצורפת לתא נקבעה כאשר דופק הבדיקה מצטמצם לשני פסגות קיבוליות קטנות בתחילת ובדופק של הדופק, ועמידות הממברנה נמצאת בטווח GΩ; מתח שלילי עד -60 mV mIght להקל על היווצרות gigaseal.
      4. לפצות את קיבול פיפטה על ידי הפיכת "פיפטה קיבול פיצוי" ידיות כדי לקבל תגובה שטוחה של הדופק הבדיקה.
      5. קרע את התיקון מבלי להרוס את החותם על ידי הפעלת פולסים קצרים של לחץ שלילי או לחץ שלילי עם כוח הולך וגדל, כדי לקבל קונפורמציה שלמה התא.
        הערה: מעבר מוצלח מתא הצמוד לתצורה של כל התא מסומן על ידי עלייה של הפסגות הקיבולות.
      6. החל פיצוי התנגדות סדרה על ידי הגדרת פרמטר שלם תא התאמות פיצוי של מגבר בשימוש עבור clamping מדויק של פוטנציאל הממברנה למתח מחזיק הרצוי.
        1. החלף את "בדיקת הממברנה" למצב "תא שלם", בלוח "פיצוי סדרה סדרה" להפעיל "חיזוי" ו "תיקון" עד 90% הימנעות overshots ו תנודה של תגובה קיבולי, להפוך את כל תאפיצוי מתג ולהתאים פרמטרים תא שלם עם הכפתורים הקדמיים בלוח הקדמי ("קיבולת תא שלם" ו "התנגדות סדרה") של המגבר באופן איטרטיבי כדי להשיג תגובה שטוחה אידיאלי חותם התגובה.
          הערה: לקבלת תיאור מפורט של פיצוי ההתנגדות לסדרה ותיקון, עיין במדריך המגבר או בהנחיה כאשר הליך זה משתנה בין יצרנים שונים.
      7. לאחר הקמת תצורה תא שלם, לחכות לפחות 2 דקות לפני ההקלטה כדי להבטיח החלפה מספקת של פתרון תאיים באמצעות פיפטה תיקון 35 .
    14. הקלט אור המושרה זרמים על הפוטנציאל החזקה שונים באמצעות פרוטוקולים שהוגדרו בעבר (ב 1.2).
    15. החלף את המאגר תאיים נמוך [CL - ] בחדר לפחות חמש פעמים מבלי להרוס את התיקון להקליט עוד יחס מתח הנוכחי ( cf שלב 1.2) בשעה tהוא ריכוז כלוריד חדש.
      הערה: מערכת זלוף עבור חילופי חיץ אוטומטי מקלה על תהליך זה, אבל אין צורך.
    16. חזור על 2.15. עבור כל מצב יונית להיבדק, אבל שוב ושוב לבדוק את איכות המדבקה בין המדידות על ידי "מבחן הממברנה" שתואר לעיל.
      הערה: כדי להבטיח מתח קרום מדויק יציבות יון הרכב התאורה קרום התא צריך להיות מעל 500 MΩ ואילו ההתנגדות גישה לא יעלה על 10 MΩ, ראה . 2.12.6). אל תשכח להחליף את הפרמטר כולו תא פיצוי כבוי עבור הממברנה הבדיקה.
    17. חזור על 2.2. 2.15. עבור מספר תאים, אבל לקחת כיסוי חדש להחליק עבור כל סדרת הבדיקה כדי להבטיח את בריאותם של תאים.

    3. הערכת נתונים

    1. התאם את קו הבסיס של כל עקבות הנוכחי על ידי הפחתת הנוכחי מתכוון לפני תאורה.
    2. חישוב ממוצע photocurrent נייח אני ( הערה: נתח את צלמי השיא או שנה את אורך המינוח כדי לקבוע את הצילום הפוטוגרפי הנייח בהתאם לפרוטוקול או לשאלה המדעית.
    3. חזור על שלבים 3.1) 3.2) עבור כל התנאים שנבדקו ותאים שונים.
    4. קבעו את הצילומים שנקבעו מול פוטנציאל ההחזקה המתאים.
      הערה: אם מדידות מרובות ממוצעות, ניתן להקפיא הקלטות בודדות למצב מוגדר או לקיבול התא.
    5. הצומת של מתח המתח הנוכחי עם ציר המתח מייצג את פוטנציאל ההיפוך (זרם נטו הוא אפס). קבע את זה על ידי אינטרפולציה ליניארית בין שתי נקודות נתונים סמוכים.
      הערה: אם אין היפוך קוטביות של photocurrents, אקסטרפולציה ליניארית מן שתי הנקודות האחרונות קרוב לאפס כדי לקבל קירוב של נקודת הצומת.
    6. ממוצע r שנקבעפוטנציאל eversal עבור אותם תנאים ומזימות אותם נגד ריכוז כלוריד של פתרונות חיץ חיצוניים ( ראה איור 2 ב ).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 2 מציג תוצאות מייצגות המתקבלות ממדידות בעקבות הפרוטוקול המתואר. במהלך התאורה עם אור ירוק, Ps ACR1 תכונות זרם חולף מהיר אשר דועך במהירות לרמה הנוכחית נייח. לאחר כיבוי האור, התאים מתפרקים לאפס בתוך אלפיות השנייה ( איור 2 א ). החלפת הריכוז כלוריד תאיים גורם לשינוי של פוטנציאל היפוך כי ניתן לראות ישירות את עקבות פוטו נרכשים. הערכת הפוטנציאל היפוך ממדידות מרובות מכמת את השינוי הפוטנציאלי דרמטי היפוך שנגרם על ידי וריאציה של ריכוז כלוריד חיצוני ( איור 2 ב ). במובהק, פוטנציאל היפוך נמדד ישירות להתאים את הפוטנציאל Nernst מחושב עבור כלוריד ( איור 2C ) המאשר את הסלקטיביות כלוריד גבוהה של Ps ACR1.

T "fo: keep-together.within-page =" 1 "> איור 2
איור 2: סלקטיביות כלור של Ps ACR1 . ( א ) נציג הנוכחי עקבות של Ps ACR1 ב HEK293 תאים. ריכוז כלוריד תאיים נשמר ב 120 מ"מ, בעוד ריכוז תאיים נע בין 150 מ"מ (ירוק) ל 10 מ"מ (סגול) כלוריד על ידי החלפת חלקית של NaCl עם Na-aspartate. החזקת פוטנציאל גדל ב 20 מדרגות מ -80 mV ל +40 mV (תיקון LJP). ( ב ) יחסי מתח נוכחי ממוצעים (n = 6 המקביל לתנאים A). ( C ) פוטנציאלים היפוך (קווי המרכז מציינים חציונים, גבולות התיבה מצביעים על אחוזונים 25 ו 75, שפם להאריך 2 פעמים סטיית תקן וחוגים מצביעים על נקודות נתונים בודדים) המופקמת מן יחסי המתח הנוכחי. עבור con כלוריד גבוהה(ירוק) הערך היה interpolated ליניארית בין 20 mV ל 0 mV מחזיק פוטנציאל, ואילו הערך היה extrolated ליניארי מעל 40 mV (קו סגול, מקווקו, פאנל B). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

קביעת הפוטנציאלים היפוך בתנאים יוניים וחשמליים מוגדר מספק מידע על מינים יון מועבר לאחר הפעלה קלה של CHR. אם באופן בלעדי יון אחד הוא מגוון במדיום פיזיולוגי מורכב ואת השינויים הפוטנציאליים היפוך המתקבל על פי הפוטנציאל Nernst תיאורטית, זה מין יון הוא היחיד מועבר אחד.

עם זאת, עבור ChRs, שינויים פוטנציאליים היפוך הם בדרך כלל פחות בולט מהצפוי משוואת Nernst בשל חדירות מינים יוניים שונים כמו גם התחרות בין יונים שנערך. במקרה זה, המצב הופך להיות מורכב יותר וכל יונים פוטנציאליים חייב להיות מוחלף בנפרד בדרישה מגוון של פתרונות מדידה. בנוסף, רוב CCRs ואת ACRs מלאכותיים 1 , 10 , 21 הם מוליכים עבור פרוטונים אבל פרוטון קונצ 'Tion דורש ניתוח מעמיק במיוחד, שכן ריכוז פרוטון לא יכול רק לשנות את הפוטנציאל היפוך, אבל יכול גם להשפיע על מוליכות יון 9 , פוטוקיאנט קינטיקה 21 , 36 ורגישות אור ספקטראלית 11 , 37 עקב שינוי של רשתות מליטה מימן, מצב protonation של שאריות בודדים ושינויים במבנה משני. פרוטון המוליכות ניתן לטפל על ידי הפחתת ריכוזים של כל יונים אחרים שעשויים להיות פוטנציאליים כגון Na + , Ca 2 + או Cl - תוך שמירה על קבוע pH על מנת למנוע שינויים חלבון שהוזכרו לעיל. תחליפים שאינם מתוצרתם הם בדרך כלל מולקולות מגושמות, כמו NMG + עבור קטיונים 12 ו- gluconate, 2- ( N- morpholino) ethansulfonate (MES - ) או אספרטט לאניונים. השוואת הפוטנציאלים היפוך שונים iOnic פתרונות מכן מאפשר חישוב של חדירות יון היחסי בתנאים שיווי המשקל על ידי גולדמן-הודג'קין-כץ המשוואה. לכמת את התרומה המדויקת של יונים שונים כדי photocurrents נטו בהתחשב תחרות יון מעבר לתנאי שיווי משקל עם זאת, דורש מודלים מתמטיים מורכבים 12 , 38 .

לדעת את הרכב יונים מועבר על ידי CHRs מסייע להבהיר תופעות לוואי אפשריות הנובעות יישום ChR במיוחד בהקשר נוירופיזיולוגי. לדוגמה, הפעלת ChR ממושכת עלולה לגרום לחמצון תאיים 39 או לבצע - Ca 2 + עשוי להפעיל שחרור סינפטי ומסילות שליח שני 40 . כמו תאים הם בדרך כלל ארוז בחוזקה בתוך הרקמות, הפעלה של rhodopsins מיקרוביאלית לא רק להשפיע על הרכב יון תאיים אלא גם לומן תאיים, ובכך להשפיע על neighboring תאים 41.

למרות סלקטיביות יון, תכונות ביופיזי אחרות של CHRs כמו אמפליטודות פוטו, חוסר פעילות, רגישות ספקטראלית או אור ותכונות קינטיות הם לעתים קרובות עניין לנהל, לעצב ולפרש ניסויים הכוללים טכניקות optogenetic. חלק מן המאפיינים הללו ניתן גם לקבוע מן הפרוטוקול לעיל כפי שתואר במקום אחר 18 , 37 , 42 . כדי לחקור את רגישות האור של תא הבעת ChR, עוצמת האור יכולה להיות מגוונת על ידי התאמת העוצמה של מקור האור או על ידי הקטנת אור ההפעלה עם מסננים צפיפות ניטרלית. כדי להשיג את הרגישות הספקטראלית, יש צורך במקור אור רב-שכבתי, ועוצמות צריך להיות מותאם לשטף פוטון שווה ולרוחב פס לכל אורכי הגל. ספקטרום בעוצמה גבוהה דומה לספקטרום ספיגה של photoreceptor אם פולסים אור קצר אומבזקי לייזר משמשים, תופעות הסתגלות אחרות ותגובות לאחור פוטוכימיים יכולים להתרחש. ההתאוששות מ - Inactivated חלקית כדי ChR פעיל לחלוטין (מחזור מחזור הכולל זמן) ניתן לבדוק על ידי יישום פרוטוקול כפול הדופק עם מרווחי כהה הגוברת בין שתי פעימות אור. התכונות הביופיסיקליות של CHRs שנדונו לעיל הם חשובים לבחירת ChR מתאים התאמה לצרכים ניסיוניים 40 .

הנגזרת תכונות ביופיסיקליות אלה על ידי טכניקות אלקטרופיזיולוגיות דומה באופן ישיר לתפקוד חלבונים אשר בקושי מכוסה על ידי שיטות ספקטרוסקופיות. לאחר הקמת מוצלח של מדידות מתח-מהדק, הטכניקה יכולה להיות משולבת עם גישות הנדסה חלבון כמו האתר מכוונת mutagenesis 9 , 11 , 43 , 44 , סליל- shuffling 37 , 46 או היתוך עם חלבונים אחרים 41 , 47 . זה הגדיל את הידע המולקולרי על CHRs ואת מצב הפעולה שלהם ויצר מגוון גבוה של גרסאות CHR עם קינטיקה שונה, מוליכות, רגישות ספקטרלית סלקטיביות יון 40 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

אנו מודים Maila Reh, Tharsana Tharmalingam ובמיוחד Altina Klein לעזרה טכנית מעולה. עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר הגרמנית (DFG) (SFB1078 B2, FOR1279 SPP1665 ל- PH) ואשכול המצוינות המאחד קונספטים בקטליזה, UniCat, BIG-NSE (JV) ו- E4 (PH).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEK293 cells Sigma Aldrich 85120602 Human embryonic kidney cells
Retinal Sigma Aldrich R2500 all-trans retinal
FuGENE HD Promega E2312 Transfection reagent
DMEM Biochrome FG 0445 Dulbecco's Modified Eagle Medium
Agarose Roth 3810 Agar bridges
CaCl2 Roth 5239 CaCl2 2H2O
CsCl Biomol 2452
EGTA Roth 3054
FBS Biochrome S0615 Cell culture
Glucose Roth HN06 D(+)-Glucose
KCl Roth 6781
MgCl2 Roth 2189 MgCl2 6H2O
NaCl Roth 3957
NMG Sigma Aldrich M2004 N-Methyl-D-glucamine
Na-Aspartate Sigma Aldrich A6683 L-Aspartic acid sodium salt monohydrate
Citric acid Roth 6490
AgeI ThermoFischerScientific ER1462 Restriction enzyme
XhoI ThermoFischerScientific ER0695 Restriction enzyme
NheI ThermoFischerScientific ER0975 Restriction enzyme
XL1Blue E. coli Agilent Technologies 200249 Chemocompetent E. coli
Kanamycin Roth T832
Lysogeny broth medium Roth X964
Agar-Agar Roth 6494 Agar plates
Plasmid purification kit Marchery-Nagel 740727.25
Penicilin/Streptomycin Biochrome A 2213 Cell culture
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma Aldrich P6407-5MG Cover slip coating
Microforge Custom made Fire polishing
Serological pipettes TPP Different sizes
Clean bench Kojair Biowizard SL130
Stirrer IKA RCT classic
Silver wire Science Products AG-T25; AG-T10 Electrodes, 0.64 mm (bath); 0.25 mm (electrode)
pH-meter Knick 765 Calimetric
Osmometer Vogel OM 815
Microscope Carl Zeiss ID03 Fire polishing
CO2 incubator Binder CB150
Cell culture dishes TPP 93040 34 mm internal diameter
Cover slips Roth P232 15 mm diameter
Thermometer Rössel Messtechnik MTM12
Beamsplitter Chroma 21011 90/10 transmission
Pipette holder ALA Scientific Instruments PPH-1P-AXU-0-1.5
Headstage Molecular Devices CV203BU
Amplifier Molecular Devices AxoPatch200B
Digitizer Molecular Devices DigiData1400 Digital analog converter
Lightsource TILL Photonics Polychrome V Set to 540 nm full intensity
Microscope Carl Zeiss Axiovert 100
Shutter Vincent Associates VS25
Shutter driver Vincent Associates VCM-D1
Glass capilarries Warner Instruments G150F-3 Boresilicate capillaries with fire polished ends OD 1.5 mm ID  0.86 mm
Micropipette puller Sutter Instruments P1000
Bath handler Lorenz Messgerätebau MPCU
Tripleband filterset Chroma 69008 Fluorescence filter  ECFP/EYFP/mCherry 
CCD camera Watec Wat-221SCCD
Optometer Gigahertz Optik P9710 Measure light intensities
Objective Carl Zeiss 421462-9900-000 W Plan-Apochromat 40X/1.0 DIC
Micromanipulator Scientifica PatchStar
Recording chamber Custom made
Power supply Manson HCS-3202 Avoids electrical noise from microscope built-in power supply
Vibration isolated table Newport M-VW-3636-OPT-01
Faraday cage Custom made or any commercial matching table
Hoses Any comercial; e.g. Roth Different sizes and materials for bath handling and application of pipette pressure; agar bridges
Linear shaker Sunlab Instruments SU 1000
Liquid junction potential calculator Molecular Devices or directly from Peter H. Barry Program is included in the Clampex aquisition software or can be obtained from  p.barry@unsw.edu.au
Data acquisition software Molecular Devices Clampex 10.X
Data evaluation software Molecular Devices Clampfit 10.X
PsACR1 GenBank or Addgene KF992074.1 or Addgene plasmid #85465 Gene encoding for PsACR1
Amplifier guide Molecular Devices The Axon Guide

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hegemann, P. Algal sensory photoreceptors. Annu. Rev. Plant Biol. 59, 167-189 (2008).
  2. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae. Science. 296 (5577), 2395-2398 (2002).
  3. Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of contractile function in skeletal muscle. Nat. Commun. 6 (7153), 1-8 (2015).
  4. Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo. Nat. Methods. 7 (11), 897-900 (2010).
  5. Zhang, F., et al. The microbial opsin family of optogenetic tools. Cell. 147 (7), 1446-1457 (2011).
  6. Nagel, G., et al. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr. Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
  7. Li, X., et al. Fast noninvasive activation and inhibition of neural and network activity by vertebrate rhodopsin and green algae channelrhodopsin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (49), 17816-17821 (2005).
  8. Ishizuka, T., Kakuda, M., Araki, R., Yawo, H. Kinetic evaluation of photosensitivity in genetically engineered neurons expressing green algae light-gated channels. Neurosci. Res. 54 (2), 85-94 (2006).
  9. Wietek, J., et al. Conversion of channelrhodopsin into a light-gated chloride channel. Science. 344 (6182), 409-412 (2014).
  10. Berndt, A., et al. Structural foundations of optogenetics: Determinants of channelrhodopsin ion selectivity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 113 (4), 822-829 (2016).
  11. Tsunoda, S. P., Hegemann, P. Glu 87 of Channelrhodopsin-1 Causes pH-dependent Color Tuning and Fast Photocurrent Inactivation. Photochem. Photobiol. 85 (2), 564-569 (2009).
  12. Schneider, F., Gradmann, D., Hegemann, P. Ion selectivity and competition in channelrhodopsins. Biophys. J. 105 (1), 91-100 (2013).
  13. Prigge, M. Über die elektrophysiologische Untersuchung und Entwicklung von farbverschobenen Kanalrhodopsinchimären aus der Grünalge Volvox carteri. , Diss. Humboldt-Universität zu Berlin. Available from: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:11-100203476 (2012).
  14. Govorunova, E. G., Spudich, E. N., Lane, C. E., Sineshchekov, O. A., Spudich, J. L. New Channelrhodopsin with a Red-Shifted Spectrum and Rapid Kinetics from Mesostigma viride. MBio. 2 (3), 1-9 (2011).
  15. Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Li, H., Janz, R., Spudich, J. L. Characterization of a highly efficient blue-shifted channelrhodopsin from the marine alga Platymonas subcordiformis. J. Biol. Chem. 288 (41), 29911-29922 (2013).
  16. Hou, S. -Y., et al. Diversity of Chlamydomonas Channelrhodopsins. Photochem. Photobiol. 88 (1), 119-128 (2012).
  17. Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat. Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
  18. Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophys. J. 96 (5), 1803-1814 (2009).
  19. Yizhar, O., et al. Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction. Nature. 477 (7363), 171-178 (2011).
  20. Berndt, A., Yizhar, O., Gunaydin, L. a, Hegemann, P., Deisseroth, K. Bi-stable neural state switches. Nat. Neurosci. 12 (2), 229-234 (2009).
  21. Berndt, A., Lee, S. Y., Ramakrishnan, C., Deisseroth, K. Structure-Guided Transformation of Channelrhodopsin into a Light-Activated Chloride Channel. Science. 344 (6182), 420-424 (2014).
  22. Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Spudich, J. L. Proteomonas sulcata ACR1: A Fast Anion Channelrhodopsin. Photochem. Photobiol. 92 (2), 257-263 (2016).
  23. Wietek, J., Broser, M., Krause, B. S., Hegemann, P. Identification of a Natural Green Light Absorbing Chloride Conducting Channelrhodopsin from Proteomonas sulcata. J. Biol. Chem. 291 (8), 4121-4127 (2016).
  24. Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Janz, R., Liu, X., Spudich, J. L. Natural light-gated anion channels: A family of microbial rhodopsins for advanced optogenetics. Science. 349 (6248), 647-650 (2015).
  25. Neher, E., Sakmann, B., Steinbach, J. H. The extracellular patch clamp: A method for resolving currents through individual open channels in biological membranes. Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. 375 (2), 219-228 (1978).
  26. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. Arch. Eur. J. Physiol. 391 (2), 85-100 (1981).
  27. Barry, P. H. JPCalc, a software package for calculating liquid junction potential corrections in patch-clamp, intracellular, epithelial and bilayer measurements and for correcting junction potential measurements. J. Neurosci. Methods. 51 (1), 107-116 (1994).
  28. Amtmann, A., Sanders, D. A unified procedure for the correction of liquid junction potentials in patch clamp experiments on endo- and plasma membranes. J. Exp. Bot. 48, (Special) 361-364 (1997).
  29. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).
  30. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. J. Vis. Exp. (63), e1-e18 (2012).
  31. Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 84 (21), 7413-7417 (1987).
  32. Halliwell, J., Whitaker, M., Ogden, D. Using microelectrodes. Microelectrode Tech. Plymouth Work. Handb. 3, 1-15 (1949).
  33. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J. Vis. Exp. (20), e1-e2 (2008).
  34. Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
  35. Pusch, M., Neher, E. Rates of diffusional exchange between small cells and a measuring patch pipette. Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. 411 (2), 204-211 (1988).
  36. Berndt, A. Mechanismus und anwendungsbezogene Optimierung von Channelrhodopsin-2. , Diss Humboldt-Universität zu Berlin. Available from: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:11-100191266 (2011).
  37. Prigge, M., et al. Color-tuned channelrhodopsins for multiwavelength optogenetics. J. Biol. Chem. 287 (38), 31804-31812 (2012).
  38. Gradmann, D., Berndt, A., Schneider, F., Hegemann, P. Rectification of the channelrhodopsin early conductance. Biophys. J. 101 (5), 1057-1068 (2011).
  39. Beppu, K., et al. Optogenetic countering of glial acidosis suppresses glial glutamate release and ischemic brain damage. Neuron. 81 (2), 314-320 (2014).
  40. Wietek, J., Prigge, M. Enhancing Channelrhodopsins: An Overview. Methods Mol. Biol. 1408, 141-165 (2016).
  41. Ferenczi, E. A., et al. Optogenetic approaches addressing extracellular modulation of neural excitability. Sci. Rep. 6, 1-20 (2016).
  42. Zhang, F., et al. Red-shifted optogenetic excitation: a tool for fast neural control derived from Volvox carteri. Nat. Neurosci. 11 (6), 631-633 (2008).
  43. Sugiyama, Y., et al. Photocurrent attenuation by a single polar-to-nonpolar point mutation of channelrhodopsin-2. Photochem. Photobiol. Sci. 8 (3), 328-336 (2009).
  44. Kleinlogel, S., et al. Ultra light-sensitive and fast neuronal activation with the Ca2+-permeable channelrhodopsin CatCh. Nat. Neurosci. 14 (4), 513-518 (2011).
  45. Wang, H., et al. Molecular determinants differentiating photocurrent properties of two channelrhodopsins from chlamydomonas. J. Biol. Chem. 284 (9), 5685-5696 (2009).
  46. Gradinaru, V., Thompson, K. R., Deisseroth, K. eNpHR: a Natronomonas halorhodopsin enhanced for optogenetic applications. Brain Cell Biol. 36 (1-4), 129-139 (2008).
  47. Berglund, K., et al. Luminopsins integrate opto- and chemogenetics by using physical and biological light sources for opsin activation. Proc. Natl. Acad. Sci. 113 (3), 358-367 (2016).

Tags

Neuroscience גיליון 123 ביופיסיקה יחיד מתח מתח אלקטרודה תצורה של כל התא HEK293 התא optogenetics channelrhodopsin photocurrent סלקטיביות פוטנציאל היפוך פוטנציאל צומת כלוריד אניון
תא שלם תיקון מהדק הקלטות עבור קביעת electrophysiological של יון סלקטיביות ב Channelrhodopsins
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Grimm, C., Vierock, J., Hegemann,… More

Grimm, C., Vierock, J., Hegemann, P., Wietek, J. Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins. J. Vis. Exp. (123), e55497, doi:10.3791/55497 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter