Abstract
За последнее десятилетие каналодродоксины стали незаменимыми в неврологических исследованиях, где они используются как инструменты для неинвазивного манипулирования электрическими процессами в клетках-мишенях. В этом контексте особенно важна ионная селективность канала -родопсина. В данной статье описывается исследование селективности хлоридов для недавно идентифицированного анион-проводящего канала -родопсина Proteomonas sulcata посредством электрофизиологических записей патч-струбцины на клетках HEK293. Экспериментальная методика измерения светоизлучающих фототоков требует быстро переключаемого - идеально монохроматического - источника света, подключенного к микроскопу обычной установки патч-струбцины. Подготовительные процедуры перед экспериментом описаны с подготовкой буферных растворов, соображениями о потенциалах жидкого соединения, посевом и трансфекцией клеток и вытягиванием пипетки. Фактическая запись отношения напряжение-напряжениеС для определения обратимых потенциалов для различных концентраций хлоридов происходит через 24 ч до 48 ч после трансфекции. Наконец, электрофизиологические данные анализируются по теоретическим соображениям по хлоридной проводимости.
Introduction
Channelrhodopsins (ChR) - световодные ионные каналы, которые происходят в пятне глаз подвижных зеленых водорослей, и служат в качестве первичных фотодатчиков для фототаксиса и фобических ответов 1 . С момента своего первого описания в 2002 году 2 , ChRs проложили путь к появляющейся области оптогенетики и могут применяться во множестве возбудимых клеток, например, в скелетных мышцах, сердце или головном мозге 3 , 4 , 5 . Экспрессия ChRs в клетках-мишенях приводит к светопропусканию ионной проницаемости соответствующей клетки. В нейронном контексте это позволяет активацию 6 , 7 , 8 или торможение 9 , 10 срабатывания потенциала действия (АР), в зависимости от проводимого иона, с пространственным и временнымТочность света, подчеркивающая, как избирательность ионов варианта ChR определяет его оптогенное применение.
Первые обнаруженные ChRs Chlamydomonas reinhardtii и Volvox carteri проницаемы для протонов, но также и с одновалентными катионами, такими как натрий, калий и в меньшей степени с двухвалентными катионами, такими как кальций и магний 11 , 12 , 13 . Сегодня более 70 природных катионопроводящих каналов (CCR) 14 , 15 , 16 , 17 и несколько инженерных вариантов 18 , 19 , 20 с различными свойствами, такими как Размер фототока, спектральная чувствительность, кинетика и селективность по катионам. Тогда как в неврологии CCRs aИспользуемые для активации клеток и запуска AP, световодные микробные насосы были единственными доступными антагонистами для блокирования нейронов в течение многих лет. В 2014 году две группы одновременно показали, что CCRs могут быть преобразованы в анион-проводящий канал -родопсины (ACR) путем изменения полярности вдоль предполагаемой проводящей поры через молекулу 9 , 21 . Впоследствии, природные ACR были идентифицированы в нескольких криптофитных водорослях 22 , 23 , 24 . Самое главное, легкая активация ACR опосредует хлорид-токи у взрослых нейронов, что позволяет ингибировать активность нейронов при гораздо меньшей интенсивности света, чем микробные насосы, которые переносят только отдельные заряды на поглощенный фотон.
Активность ChR может быть непосредственно устранена с помощью электрофизиологических патч-клеточных записей светоиндуцированных токов в клетках НЕК293. Патч-зажимТехника была изначально разработана в конце 1970-х годов 25 и дополнительно улучшена Хамилем и др. , Что позволяет регистрировать сущность токов из малой ячейки (режим цельной ячейки) с высоким текущим разрешением и прямым управлением напряжением 26 мембраны. Применяемый в культуре клеток, этот метод обеспечивает точный контроль как ионных, так и электрических условий регистрации, а также позволяет исследовать селективность ионов наряду с относительным вкладом ионов в общий ток. Здесь мы проиллюстрируем исследование избирательности ионов для анион-проводящего канала rhodopsin Proteomonas sulcata ( Ps ACR1) 22 , 23 посредством регистрации вольт-амперных отношений при различных концентрациях внеклеточного хлорида, чтобы доказать высокую проводимость хлорида.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Рисунок 1: Установка патч-зажима. (1) источник света, (2) оптическое волокно, (3) программируемый затвор, (4) дигитайзер, (5) драйвер затвора, (6) усилитель, (7) перфузионная система, (8) персональный компьютер, (9) монитор , (10) клетка фарадея, (11) ступень микроскопа, (12) перфузионный вход, (13) перфузионный выход, (14) регистрирующая камера, (15) датчик уровня жидкости, (16) электрод ванны с мостиком агара, (17) (19) микроманипулятор, (20) инвертированный микроскоп, (21) корпус лампы микроскопа, (22) источник питания ламп микроскопа, (23) водонаполненная U-образная трубка, (24) трехполосная Клапан, (25) антивибрационный стол, (26) ПЗС-камера. ( A ) Фотографии и ( B ) схематическое представление установки. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию tЕго фигуре.
1. Настройка перед записью
| внутри. | extra.1 | extra.2 | |
| Высокий хлорид | Высокий хлорид | Низкий хлорид | |
| C [мМ] | C [мМ] | C [мМ] | |
| Na-АСП | 0 | 0 | 140 |
| NaCl | 110 | 140 | 0 |
| KCl | 1 | 1 | 1 |
| CsCl | 1 | 1 | 1 |
| CaCl 2 | 2 | 2 | 2 |
| MgCl 2 | 2 | 2 | 2 |
| HEPES | 10 | 10 | 10 |
| EGTA | 10 | 0 | 0 |
| pH | 7,2 | 7,2 | 7,2 |
| осмолярность | 290 мОсм | 320 мОсм | 320 мОсм |
Таблица 1: Ионный состав буферных растворов. Состав внутриклеточных (внутриклеточных) и внеклеточных (экстра.) Буферов для экспериментов с хлоридной селективностью в клетках НЕК. Используемые сокращения: этиленгликольтетрауксусная кислота (ЭГТА), 4- (2-гидроксиэтил) -1-пиперазинэтансульфоновая кислота (HEPES) и аспартат (ASP). Все концентрации указаны в мМ.
- Подготовьте регистрирующие растворы с концентрациями ионов, как указано в таблице 1.
- Готовят 15 мл 2 М исходных растворов в сверхчистой воде для MgCl 2 , CaCl 2 , KCl и CsCl.
- Взвешивают твердые компоненты для 100 мл внутриклеточного и500 мл внеклеточных буферных растворов в соответствии с таблицей 1 в отдельные мензурки и после этого добавить соответствующее количество приготовленных исходных растворов. Например, для внутриклеточного буфера используют 0,3803 г (10 мМ) EGTA, 0,2383 г (10 мМ) HEPES и 0,6428 г (110 мМ) NaCl и добавляют 100 мкл 2 M MgCl 2 и CaCl 2 и 50 мкл 2 М KCl и CsCl.
- Добавьте сверхчистую воду и тщательно отрегулируйте рН с помощью кислот и оснований, которые не влияют на измерение, т.е. не проводятся ChR, такие как лимонная кислота и N-метил-D-глюкамин (NMG + ).
- Отрегулируйте осмолярность до 290 мОсм для внутриклеточного и до 320 мОсм для внеклеточных растворов с глюкозой.
Примечание: Немного гипоосмотические внутриклеточные растворы увеличивают частоту успешного применения патчей 26 . - Стерильный фильтр фильтрует все растворы через фильтры 0,22 мкм. Хранить растворы при температуре 4 ° C в течение двух недельС или замораживать при -20 ° C для длительного хранения.
- Рассчитайте потенциалы жидкого соединения и подготовьте протоколы записи.
ПРИМЕЧАНИЕ: Изменение концентрации внеклеточного хлорида после создания цельноклеточной конфигурации приводит к существенному переходу в жидкий контакт (LJP), который необходимо скорректировать 27 , 28 . LJP могут быть напрямую измерены или рассчитаны, здесь используется последний вариант. В этом протоколе будет использоваться онлайн-коррекция, требующая одного протокола записи для каждого внешнего буфера. Однако для большего набора внешних решений рекомендуется коррекция позы LJP во избежание ложной коррекции.- Откройте калькулятор потенциала соединения (JPC) 27 и откройте диалог «Новый эксперимент». Затем выберите «Patch-clamp measurements». Выберите «целые ячейки измерений», «Стандартный электрод солей раствор» и введите температуру25oC. Между каждым шагом идите вперед, принимая выбор, нажав кнопку «Далее».
ПРИМЕЧАНИЕ. Эксперименты проводятся при комнатной температуре 25 ° С в лаборатории с кондиционированием воздуха. Перед запуском экспериментов убедитесь, что буферные растворы имеют комнатную температуру. Для изменения температуры образца можно использовать стадию инкубации или камеру. Температуру ванны можно часто измерять с помощью термометра. - Добавьте все индивидуальные концентрации анионов и катионов пипетированного раствора и буфера с высоким содержанием хлора в соответствии с концентрациями, перечисленными в таблице 1 .
ПРИМЕЧАНИЕ: JPC рассчитает LJP -0,5 мВ для начальных условий. - Нажмите «New Bath Solution», чтобы ввести анионный и катионный состав хлорида с низким содержанием хлоридов.
ПРИМЕЧАНИЕ: JPC теперь рассчитает новый LJP +12,6 мВ в соответствии с измененным внеклеточным решением для записи. - Подготовьте два протокола с исправлением LJP дляДва условия измерения путем вычитания рассчитанного LJP из приложенного удерживающего потенциала; -0,5 мВ для высоких и +12,6 мВ для низких хлоридных внешних растворов. Таким образом, протоколы начинаются с -79,5 мВ (высокий хлорид) и -92,6 мВ (низкий хлорид), соответственно, чтобы получить LJP-скорректированный начальный потенциал удержания -80 мВ в обоих случаях.
ПРИМЕЧАНИЕ. Следующие шаги относятся к программному обеспечению сбора данных, указанному в списке материалов. - Откройте редактор протокола в программе сбора данных. Перейдите в меню «Режим» выберите «Эпизодическая стимуляция» и включите 7 разверток.
- Переключитесь в меню «Waveform» в редакторе и включите период 200 мс с потенциалом удержания 0 мВ с последующим периодом 2 с с переменным потенциалом удержания, начиная с -79,5 мВ для высокого хлорида. Включите «Дельта-уровень» 20 мВ для второго периода, чтобы увеличить удерживающий потенциал на 20 мВ в каждом прогоне.
- В пределах шагов напряжения сигнала edItor применяют 500 мс период освещения с 540 нм света (3,10 мВт / мм²). Для этого измените «цифровую комбинацию битов» подключенного затвора, которая управляет источником света, чтобы быть активным 500 мс после второго периода, описанного выше (см. 1.2.6).
ПРИМЕЧАНИЕ. Интенсивность света может влиять на биофизические свойства канальных токов, таких как амплитуда или инактивация. Поэтому всегда следует сообщать о плотности мощности света. Чтобы измерить силу света после прохождения через всю оптику и покровное стекло, используйте откалиброванный оптометр. Чтобы вычислить плотность мощности, определите освещенное поле объектива микрометром объекта и разделите измеренную мощность света на определенное освещенное поле. - Сохраните протокол для высокохлоридного внеклеточного раствора. Измените протокол и замените потенциал удержания первого уровня на -92,6 мВ (низкий внешний хлорид). Сохраните этот второй протокол для измерения низкого уровня внеклеточного состояния хлорида.
- Лизиновое покрытие стеклянной крышки скользит согласно адаптированному протоколу 29 .
- Поместите несколько 100 покровных листов в стеклянную чашку Петри и добавьте 250 мл HCl (1 N).
- Поместите чашку Петри с крышкой на линейный шейкер и встряхивайте со скоростью 120 об / мин в течение 72 часов, чтобы очистить чехлы на крышке, а затем ополосните сверхчистой водой, чтобы нейтрализовать pH.
- Замочите их в небольшом объеме 95% этанола для дальнейшей очистки.
ПРИМЕЧАНИЕ. Перед тем, как приступать к работе, очистите покровные стекла перед хранением в 70% этаноле. Работайте под ламинарным колпаком для следующих этапов. - Используя горелку и пинцет Бунзена, пламените каждую покровную пленку и перенесите ее в новую чашку Петри.
- Инкубируйте прокладки стеклянной крышки стерильным раствором поли-D-лизина в концентрации 50 мкг / мл в течение по меньшей мере 1 ч (или в течение ночи) при комнатной температуре при встряхивании с помощью линейного шейкера со скоростью 150 об / мин.
- Промыть покрытие скользит с помощью сверхчистой воды для удаления избытка поли-D-лизина.
- Распределите повязку на стерильной бумаге, чтобы она высохла в течение 10 минут, и предоставьте их ультрафиолетовому свету для стерилизации (не менее 20 минут).
- Соберите покровную ложку в стерильную чашку Петри, покрытую алюминиевой фольгой, до использования.
- Подготовьте ДНК гена Ps ACR1, слитого с mCherry, используя стандартные методы молекулярной биологии.
- Клон оптимизированной человеческим кодоном генной последовательности, кодирующей Ps ACR1, в плазмиду peGFP-C1 (промотор CMV, резистентность к канамицину) в рамке с флуорофором mCherry с использованием рестрикционных ферментов или других установленных методов клонирования.
Примечание. Могут использоваться и другие флуорофоры, но убедитесь, что имеются соответствующие наборы фильтров для наблюдения за их флуоресценцией под микроскопом в установке. - Трансформируют плазмидную ДНК в хемокомпетентные клетки XL1Blue E. coli посредством теплового шока согласно стандартному протоколу и накладывают их на чашки с агаром (30 мкг / мл канамицина) 30
- На следующий день инокулируют среду бульона с 4 мл лизогениза, дополненную канамицином 30 мкг / мл, клетками из одиночных колоний и инкубируют их в течение ночи при 37 ° С и 180 об / мин в инкубаторе.
- После инкубации в течение ночи очищают плазмидную ДНК культур с использованием коммерчески доступного набора (см. Таблицу материалов ) в соответствии с инструкциями производителя.
- Клон оптимизированной человеческим кодоном генной последовательности, кодирующей Ps ACR1, в плазмиду peGFP-C1 (промотор CMV, резистентность к канамицину) в рамке с флуорофором mCherry с использованием рестрикционных ферментов или других установленных методов клонирования.
- Посадить клетки
ПРИМЕЧАНИЕ. Выполните шаги под ламинарным потоком.- В 35-мм чашку Петри рядом помещается до трех стеклянных крышек с лизином.
ПРИМЕЧАНИЕ. Аккуратно прижмите их к нижней части тарелки, чтобы избежать скольжения друг на друга. - Семя 1,5 × 10 5 клеток НЭК в 2 мл стандартной модифицированной Дульбекко среды Игла (DMEM), дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) в каждой чашке.
- Дополнение all- trans сетчатки приКонечная концентрация 1 мкМ. Выращивайте клетки, по крайней мере, за один день до перехода на шаг 1.6.
- В 35-мм чашку Петри рядом помещается до трех стеклянных крышек с лизином.
- Временно трансфекция клеток через lipofection 31 .
- Для каждой чашки клеток готовят раствор 2 мкг плазмидной ДНК ( приготовленной на стадии 1.4) в 250 мкл DMEM без FBS и 6 мкл трансфекционного реагента (см. Таблицу материалов ).
- После 15 минут инкубации осторожно (по каплям) добавляют раствор к клеткам.
- Подготовьте агаровые мосты
- Добавить 0,75 г агарозы в 50 мл стерильного раствора хлорида натрия (140 мМ) и растворить его нагреванием в микроволновой печи.
ПРИМЕЧАНИЕ: 2 - 3 М KCl для подготовки агарового моста дополнительно уменьшает LJP из-за более высокой концентрации ( например, постоянной диффузии от мостика) и равной подвижности ионов K + и Cl - , но избегался, чтобы минимизировать утечку ионов (особенно Cl - ) В t Раствор для ванны 32 . - Заполните 10 мкл наконечников пипетки (или шланга малого диаметра) жидким раствором агарозы с помощью шприца.
ПРИМЕЧАНИЕ. Избегайте воздушных пузырьков в мосте. - После охлаждения агаровых мостиков и отверждения их хранят в стерильном 140 мМ растворе хлорида натрия.
- Добавить 0,75 г агарозы в 50 мл стерильного раствора хлорида натрия (140 мМ) и растворить его нагреванием в микроволновой печи.
- Подготовьте записывающие и электроды для ванн.
- Удалите серебряные провода ванны и регистрирующий электрод установки патч-струбцины.
- Отполируйте провода наждачной бумагой, чтобы удалить хлорид серебра из предыдущих экспериментов. Погрузите чистый серебряный провод в 3 М KCl и подключите его к положительному полюсу батареи 1,5 В для электролитического покрытия с хлоридом серебра.
ПРИМЕЧАНИЕ. Вместо батареи может использоваться источник питания лаборатории.
- Вытяните пипетки с низким сопротивлением (1,5-3,0 МОм) из стеклянных капилляров с помощью съемника микропипетки и полируйте их, как описано Brown et al.Lass = "xref"> 33. Храните пипетки без пыли в течение дня измерения.
- Включите все компоненты настройки, чтобы нагреться до рабочей температуры за 30 минут до начала записи. Убедитесь, что буферы находятся при комнатной температуре.
2. Измерение избирательности
- Начните запись через 24-48 часов после временной трансфекции клеток, описанных в 1.6.
- Поместите одну крышку в измерительную камеру и запечатайте ее с помощью кремния, чтобы предотвратить утечку внешнего буфера. Храните чашку Петри с другими обложками в инкубаторе для следующего набора экспериментов.
- Тщательно заполните камеру внеклеточным буфером (высокая [Cl - ]), чтобы предотвратить отделение клеток, затем поместите его под микроскоп и используйте 40X объектив для визуализации клеток.
- Поместите агаровый мост над электродом ванны и поместите его в камеру вместе с датчиком уровня жидкости и перфузионным выходом обработчика ванны.
- Обменять бывшиеТрацеллюлярного раствора дважды с 1 мл свежего наружного раствора (высокий [Cl - ]) для удаления остаточной культуральной среды и отдельных клеток.
- Приведите клетки в фокус и ищите трансфицированную (флуоресцентную) клетку, которую нужно изолировать от других клеток. Используйте трехполосный фильтр-набор и оранжевый свет (590 нм, ширина полосы 15 нм, 100% интенсивность), чтобы возбудить и визуализировать mCherry.
ПРИМЕЧАНИЕ. Клетки НЭК могут быть электрически соединены со своими соседями с помощью щелевых контактов 34, что приводит к низкому мембранному сопротивлению в цельноклеточной конфигурации. - Заполните одну из вытащенных пипеток внутриклеточным раствором и удалите пузырьки воздуха, несколько раз щелкнув пипеткой.
- Установите пипетку на держатель пипетки и приложите некоторое положительное давление, чтобы предотвратить забивание наконечника.
- Найдите наконечник пипетки патчей под микроскопом и перемещайте его рядом с клеткой, используя микроманипулятор.
ПРИМЕЧАНИЕ. Следующие шаги относятся кMplifier, программное обеспечение для сбора и оценки данных, указанное в списке материалов. - Запустите «мембранный тест» в программе сбора данных и примените шаг напряжения (испытательный импульс, например, 5 мВ в течение 10 мс, базовый уровень при 0 мВ), вручную или автоматически через указанное программное обеспечение с использованием «режима ванны» при выполнении «теста мембраны», В программе сбора данных.
- Убедитесь, что сопротивление пипетки находится в необходимом диапазоне (1,5-3,0 МОм).
- Токи нулевого смещения, регулируя потенциал пипетки, поворачивая рукоятку смещения пипетки на усилителе, работая в «режиме ванны» «мембранного теста».
- Установите патч в конфигурации целых ячеек 26 .
ПРИМЕЧАНИЕ. Следующие этапы требуют применения положительного и отрицательного давления, подаваемого в боковой порт используемого держателя пипетки. Это можно сделать, используя либо шприц, через рот кусок или электронным ConРегулируемый регулятор давления. В этом протоколе положительное и отрицательное давление прикладывается через рот.- Медленно приближайтесь к камере с помощью пипетки для патчей сверху и снижайте положительное давление прямо перед тем, как прикасаться к нему.
ПРИМЕЧАНИЕ. Когда наконечник находится близко к ячейке, сопротивление немного повысится; На это указывает уменьшенный размер испытательного импульса. - Измените «мембранный тест» с «режима ванны» на «режим патча», таким образом, удерживая потенциал для ожидаемого потенциала покоя клеток (от -30 до -40 мВ).
- В некоторых случаях конфигурация, связанная с клетками, образуется после высвобождения положительного давления (2.13.1), если нет, осторожно применяйте отрицательное давление для облегчения формирования гигазы.
ПРИМЕЧАНИЕ. Конфигурация, привязанная к клетке, устанавливается, когда тестовый импульс уменьшается до двух малых емкостных пиков в начале и в конце импульса, а сопротивление мембраны находится в диапазоне GΩ; Отрицательное напряжение до -60 мВ мОблегчают формирование гигазы. - Компенсируйте емкость пипетки, поворачивая ручки «Компенсация пипетки», чтобы получить плоский отклик тестового импульса.
- Разрыв пластыря без разрушения уплотнения путем приложения коротких импульсов отрицательного давления или отрицательного давления с увеличением силы, чтобы получить целостную конформацию.
ПРИМЕЧАНИЕ. Успешный переход от ячейки, присоединенной к конфигурации целых ячеек, обозначается увеличением емкостных пиков. - Примените последовательную компенсацию сопротивления, установив параметр целой ячейки и отрегулируйте компенсацию используемого усилителя для точного зажима мембранного потенциала до желаемого удерживающего напряжения.
- Включите «мембранный тест» в режим «целые ячейки», в панели «Последовательная компенсация сопротивления» включите «предсказание» и «коррекцию» до 90%, избегая овершотов и колебаний емкостного отклика, включите целую ячейкуВключите компенсацию и отрегулируйте параметры всей ячейки с помощью соответствующих кнопок на передней панели («целостность целых элементов» и «последовательное сопротивление») усилителя итерационным способом, чтобы получить идеально плоский отпечаток пробного отпечатка.
ПРИМЕЧАНИЕ. Подробное описание последовательной компенсации сопротивления и коррекции см. В руководстве или руководстве по усилителю, так как эта процедура различается у разных производителей.
- Включите «мембранный тест» в режим «целые ячейки», в панели «Последовательная компенсация сопротивления» включите «предсказание» и «коррекцию» до 90%, избегая овершотов и колебаний емкостного отклика, включите целую ячейкуВключите компенсацию и отрегулируйте параметры всей ячейки с помощью соответствующих кнопок на передней панели («целостность целых элементов» и «последовательное сопротивление») усилителя итерационным способом, чтобы получить идеально плоский отпечаток пробного отпечатка.
- После установки цельноклеточной конфигурации подождите не менее 2 мин перед записью, чтобы обеспечить достаточную замену внутриклеточного раствора с помощью пипетки 35 .
- Медленно приближайтесь к камере с помощью пипетки для патчей сверху и снижайте положительное давление прямо перед тем, как прикасаться к нему.
- Регистрируйте индуцированные светом токи при разных потенциалах удержания, используя ранее настроенные протоколы (в 1.2).
- Обменивайте внеклеточный буфер на низкий уровень [Cl - ] в камере не менее пяти раз, не разрушая пластырь, и запишите другое отношение тока к напряжению ( см. Шаг 1.2) при tНовая хлоридная концентрация.
ПРИМЕЧАНИЕ. Система перфузии для автоматизированного обмена буферами облегчает этот процесс, но это необязательно. - Повторите пункт 2.15. Для каждого испытуемого ионного состояния, но повторно проверьте качество накладки между измерениями с помощью «мембранного теста», описанного выше.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения точного мембранного напряжения и стабильного внутриклеточного ионного состава мембранное сопротивление должно быть выше 500 МОм, в то время как сопротивление доступа не должно превышать 10 МОм, см . 2.12.6). Не забудьте выключить компенсацию параметров цельной ячейки для теста мембраны. - Повторите 2.2. До 2,15. Для нескольких ячеек, но возьмите новую обложку для каждой серии тестов, чтобы обеспечить здоровость клеток.
3. Оценка данных
- Отрегулируйте базовую линию каждого текущего следа, вычитая средний ток перед освещением.
- Вычислить средний стационарный фототок I s (
- Повторите шаги 3.1) и 3.2) для всех протестированных условий и разных ячеек.
- Выделите определенные фототоки в зависимости от соответствующего удерживающего потенциала.
ПРИМЕЧАНИЕ. Если несколько измерений усредняются, отдельные записи могут быть нормализованы в соответствии с заданным условием или емкостью ячейки. - Пересечение отношения напряжение-напряжение с осью напряжения представляет собой потенциал разворота (чистый ток равен нулю). Определите это путем линейной интерполяции между двумя соседними точками данных.
ПРИМЕЧАНИЕ. Если инверсия полярности фототоков отсутствует, экстраполируйте линейно из последних двух точек близко к нулю, чтобы получить приближение точки пересечения. - Среднее значение rЭверсальных потенциалов для тех же условий и строить их с концентрацией хлоридов внешних буферных растворов ( см. Рис. 2В ).
- Откройте калькулятор потенциала соединения (JPC) 27 и откройте диалог «Новый эксперимент». Затем выберите «Patch-clamp measurements». Выберите «целые ячейки измерений», «Стандартный электрод солей раствор» и введите температуру25oC. Между каждым шагом идите вперед, принимая выбор, нажав кнопку «Далее».
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 2 представлены репрезентативные результаты, полученные из измерений, следующих за описанным протоколом. При освещении зеленым светом Ps ACR1 имеет быстрый переходный ток, который быстро распадается до уровня стационарного тока. После выключения света фототоки затухают до нуля в миллисекундах ( рис. 2А ). Обмен концентрации внеклеточного хлорида вызывает сдвиг потенциала реверсии, который может быть непосредственно замечен в полученных следах фототока. Оценка обратных потенциалов из нескольких измерений количественно объясняет резкое изменение потенциала разворота, вызванное изменением концентрации внешнего хлорида ( рис. 2В ). Поразительно, измеренные потенциалы обратного вращения непосредственно соответствуют рассчитанным потенциалам Нернста для хлорида ( рисунок 2C ), подтверждающим высокую селективность по хлориду Ps ACR1.
T "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Рисунок 2: Хлоридная избирательность Ps ACR1 . ( A ) Репрезентативные следы тока Ps ACR1 в клетках НЕК293. Концентрацию внутриклеточного хлорида поддерживали на уровне 120 мМ, тогда как внеклеточная концентрация варьировалась от 150 мМ (зеленый) до 10 мМ (пурпурный) хлорид путем частичной замены NaCl на Na-аспартат. Удерживающий потенциал был увеличен с шагом 20 мВ от -80 мВ до +40 мВ (LJP исправлен). ( В ) Усредненные зависимости вольт-амперной характеристики (п = 6, соответствующие условиям в А). ( C ) Потенциалы разворота (центральные линии обозначают медиан, границы прямоугольника показывают 25-й и 75-й перцентилы, усы расширяются в 2 раза по отношению к стандартным отклонениям, а кружки указывают единичные точки данных), извлеченные из отношений напряжение-напряжение. Для высокой концентрации хлоридаDing (зеленый) значение было линейно интерполировано между потенциалом удержания от -20 мВ до 0 мВ, тогда как значение линейно экстраполировалось выше +40 мВ (фиолетовый, пунктирная линия, панель В). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Определение потенциалов реверсии при определенных ионных и электрических условиях дает информацию об ионах, транспортируемых после легкой активации ChRs. Если в сложной физиологической среде изменяется только один ионный вид, а полученный потенциал разворота изменяется в соответствии с теоретическим потенциалом Нернста, то этот вид ионов является единственным транспортируемым.
Однако для ChR сдвиги потенциала обратного хода обычно менее выражены, чем ожидалось из уравнения Нернста из-за проницаемости для разных ионных частиц, а также для конкуренции между проводимыми ионами. В этом случае ситуация становится более сложной, и все потенциально проводимые ионы должны обмениваться по отдельности, требуя разнообразных измерительных решений. Кроме того, большинство CCR и первые искусственные ACR 9 , 10 , 21 являются проводящими для протонов, но изменяя концентрацию протоновПоскольку концентрация протонов может не только сдвигать потенциалы реверсии, но также может влиять на проводимость ионов 9 , кинетику фототоков 21 , 36 и спектральную светочувствительность 11 , 37 из-за изменения сетей водородной связи, состояние протонирования Отдельные остатки и изменения вторичной структуры. Протонная проводимость может быть устранена путем снижения концентраций всех других потенциально проводимых ионов, таких как Na + , Ca 2+ или Cl , при поддержании постоянного рН, чтобы избежать упомянутых выше изменений белка. Не проводимые заменители обычно представляют собой громоздкие заряженные молекулы, такие как NMG + для катионов 12 и глюконат, 2- ( N- морфолино) этансульфонат (MES-) или аспартат для анионов. Сравнение потенциалов разворота в разных iА затем позволяет рассчитать относительную ионную проницаемость в равновесных условиях по уравнению напряжения Голдмана-Ходжкина-Каца. Однако количественное определение точного вклада различных ионов в чистые фототоки, рассматривающие конкуренцию ионов за пределами условий равновесия, требует сложных математических моделей 12 , 38 .
Знание состава ионов, переносимых ChRs, помогает выявить возможные побочные эффекты, связанные с применением ChR, особенно в нейрофизиологическом контексте. Например, длительная активация ChR может вызывать внутриклеточное подкисление 39 или проводимое-Ca 2+ может инициировать высвобождение синапса и пути второго мессенджера 40 . Поскольку клетки обычно плотно упакованы в тканях, активация микробных родопсинов может не только влиять на внутриклеточный ионный состав, но и на внеклеточный просвет, влияя, таким образом, на nСоседей 41 .
Несмотря на избирательность ионов, другие биофизические особенности ChRs, такие как амплитуды фототока, инактивация, спектральная или светочувствительность и кинетические свойства, часто представляют интерес для проведения, проектирования и интерпретации экспериментов с использованием оптогенетических методов. Некоторые из этих свойств можно также определить по протоколу выше, как описано в других статьях 18 , 37 , 42 . Чтобы исследовать светочувствительность клетки, экспрессирующей ChR, интенсивность света можно варьировать, регулируя мощность источника света или ослабляя свет активации фильтрами нейтральной плотности. Для получения спектральной чувствительности необходим полихроматический источник света, и необходимо регулировать интенсивности, чтобы обеспечить равный поток фотонов и ширину полосы для всех длин волн. Спектры высокой интенсивности только напоминают спектры поглощения фоторецептора, если короткие импульсы света илиИспользуются лазерные вспышки, в противном случае могут возникать явления адаптации и фотохимические обратные реакции. Восстановление от частично инактивированного до полностью активного ChR (общее время оборота фотоцикла) можно исследовать, применяя протокол двойных импульсов с увеличением темных интервалов между двумя импульсами света. Биофизические свойства ChR, рассмотренных выше, важны для выбора подходящего ChR, соответствующего экспериментальным потребностям 40 .
Получение этих биофизических свойств электрофизиологическими методами непосредственно напоминает функцию белка, которая едва покрыта спектроскопическими методами. После успешного установления измерений напряжения-зажима этот метод можно комбинировать с инженерными подходами белков, такими как сайт-направленный мутагенез 9 , 11 , 43 , 44 , перемещение спирали 37 ,
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы благодарим Майлу Рех, Тарсану Тармалингам и особенно Altina Klein за отличную техническую помощь. Эта работа была поддержана Немецким исследовательским фондом (DFG) (SFB1078 B2, FOR1279 SPP1665 - PH) и Кластером совершенства, объединяющим концепции в области катализа, UniCat, BIG-NSE (JV) и E4 (PH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK293 cells | Sigma Aldrich | 85120602 | Human embryonic kidney cells |
| Retinal | Sigma Aldrich | R2500 | all-trans retinal |
| FuGENE HD | Promega | E2312 | Transfection reagent |
| DMEM | Biochrome | FG 0445 | Dulbecco's Modified Eagle Medium |
| Agarose | Roth | 3810 | Agar bridges |
| CaCl2 | Roth | 5239 | CaCl2 2H2O |
| CsCl | Biomol | 2452 | |
| EGTA | Roth | 3054 | |
| FBS | Biochrome | S0615 | Cell culture |
| Glucose | Roth | HN06 | D(+)-Glucose |
| KCl | Roth | 6781 | |
| MgCl2 | Roth | 2189 | MgCl2 6H2O |
| NaCl | Roth | 3957 | |
| NMG | Sigma Aldrich | M2004 | N-Methyl-D-glucamine |
| Na-Aspartate | Sigma Aldrich | A6683 | L-Aspartic acid sodium salt monohydrate |
| Citric acid | Roth | 6490 | |
| AgeI | ThermoFischerScientific | ER1462 | Restriction enzyme |
| XhoI | ThermoFischerScientific | ER0695 | Restriction enzyme |
| NheI | ThermoFischerScientific | ER0975 | Restriction enzyme |
| XL1Blue E. coli | Agilent Technologies | 200249 | Chemocompetent E. coli |
| Kanamycin | Roth | T832 | |
| Lysogeny broth medium | Roth | X964 | |
| Agar-Agar | Roth | 6494 | Agar plates |
| Plasmid purification kit | Marchery-Nagel | 740727.25 | |
| Penicilin/Streptomycin | Biochrome | A 2213 | Cell culture |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma Aldrich | P6407-5MG | Cover slip coating |
| Microforge | Custom made | Fire polishing | |
| Serological pipettes | TPP | Different sizes | |
| Clean bench | Kojair | Biowizard SL130 | |
| Stirrer | IKA | RCT classic | |
| Silver wire | Science Products | AG-T25; AG-T10 | Electrodes, 0.64 mm (bath); 0.25 mm (electrode) |
| pH-meter | Knick | 765 Calimetric | |
| Osmometer | Vogel | OM 815 | |
| Microscope | Carl Zeiss | ID03 | Fire polishing |
| CO2 incubator | Binder | CB150 | |
| Cell culture dishes | TPP | 93040 | 34 mm internal diameter |
| Cover slips | Roth | P232 | 15 mm diameter |
| Thermometer | Rössel Messtechnik | MTM12 | |
| Beamsplitter | Chroma | 21011 | 90/10 transmission |
| Pipette holder | ALA Scientific Instruments | PPH-1P-AXU-0-1.5 | |
| Headstage | Molecular Devices | CV203BU | |
| Amplifier | Molecular Devices | AxoPatch200B | |
| Digitizer | Molecular Devices | DigiData1400 | Digital analog converter |
| Lightsource | TILL Photonics | Polychrome V | Set to 540 nm full intensity |
| Microscope | Carl Zeiss | Axiovert 100 | |
| Shutter | Vincent Associates | VS25 | |
| Shutter driver | Vincent Associates | VCM-D1 | |
| Glass capilarries | Warner Instruments | G150F-3 | Boresilicate capillaries with fire polished ends OD 1.5 mm ID 0.86 mm |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P1000 | |
| Bath handler | Lorenz Messgerätebau | MPCU | |
| Tripleband filterset | Chroma | 69008 | Fluorescence filter ECFP/EYFP/mCherry |
| CCD camera | Watec | Wat-221SCCD | |
| Optometer | Gigahertz Optik | P9710 | Measure light intensities |
| Objective | Carl Zeiss | 421462-9900-000 | W Plan-Apochromat 40X/1.0 DIC |
| Micromanipulator | Scientifica | PatchStar | |
| Recording chamber | Custom made | ||
| Power supply | Manson | HCS-3202 | Avoids electrical noise from microscope built-in power supply |
| Vibration isolated table | Newport | M-VW-3636-OPT-01 | |
| Faraday cage | Custom made or any commercial matching table | ||
| Hoses | Any comercial; e.g. Roth | Different sizes and materials for bath handling and application of pipette pressure; agar bridges | |
| Linear shaker | Sunlab Instruments | SU 1000 | |
| Liquid junction potential calculator | Molecular Devices or directly from Peter H. Barry | Program is included in the Clampex aquisition software or can be obtained from p.barry@unsw.edu.au | |
| Data acquisition software | Molecular Devices | Clampex 10.X | |
| Data evaluation software | Molecular Devices | Clampfit 10.X | |
| PsACR1 | GenBank or Addgene | KF992074.1 or Addgene plasmid #85465 | Gene encoding for PsACR1 |
| Amplifier guide | Molecular Devices | The Axon Guide |
References
- Hegemann, P. Algal sensory photoreceptors. Annu. Rev. Plant Biol. 59, 167-189 (2008).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae. Science. 296 (5577), 2395-2398 (2002).
- Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of contractile function in skeletal muscle. Nat. Commun. 6 (7153), 1-8 (2015).
- Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo. Nat. Methods. 7 (11), 897-900 (2010).
- Zhang, F., et al. The microbial opsin family of optogenetic tools. Cell. 147 (7), 1446-1457 (2011).
- Nagel, G., et al. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr. Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
- Li, X., et al. Fast noninvasive activation and inhibition of neural and network activity by vertebrate rhodopsin and green algae channelrhodopsin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (49), 17816-17821 (2005).
- Ishizuka, T., Kakuda, M., Araki, R., Yawo, H. Kinetic evaluation of photosensitivity in genetically engineered neurons expressing green algae light-gated channels. Neurosci. Res. 54 (2), 85-94 (2006).
- Wietek, J., et al. Conversion of channelrhodopsin into a light-gated chloride channel. Science. 344 (6182), 409-412 (2014).
- Berndt, A., et al. Structural foundations of optogenetics: Determinants of channelrhodopsin ion selectivity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 113 (4), 822-829 (2016).
- Tsunoda, S. P., Hegemann, P. Glu 87 of Channelrhodopsin-1 Causes pH-dependent Color Tuning and Fast Photocurrent Inactivation. Photochem. Photobiol. 85 (2), 564-569 (2009).
- Schneider, F., Gradmann, D., Hegemann, P. Ion selectivity and competition in channelrhodopsins. Biophys. J. 105 (1), 91-100 (2013).
- Prigge, M. Über die elektrophysiologische Untersuchung und Entwicklung von farbverschobenen Kanalrhodopsinchimären aus der Grünalge Volvox carteri. , Diss. Humboldt-Universität zu Berlin. Available from: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:11-100203476 (2012).
- Govorunova, E. G., Spudich, E. N., Lane, C. E., Sineshchekov, O. A., Spudich, J. L. New Channelrhodopsin with a Red-Shifted Spectrum and Rapid Kinetics from Mesostigma viride. MBio. 2 (3), 1-9 (2011).
- Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Li, H., Janz, R., Spudich, J. L. Characterization of a highly efficient blue-shifted channelrhodopsin from the marine alga Platymonas subcordiformis. J. Biol. Chem. 288 (41), 29911-29922 (2013).
- Hou, S. -Y., et al. Diversity of Chlamydomonas Channelrhodopsins. Photochem. Photobiol. 88 (1), 119-128 (2012).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat. Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophys. J. 96 (5), 1803-1814 (2009).
- Yizhar, O., et al. Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction. Nature. 477 (7363), 171-178 (2011).
- Berndt, A., Yizhar, O., Gunaydin, L. a, Hegemann, P., Deisseroth, K. Bi-stable neural state switches. Nat. Neurosci. 12 (2), 229-234 (2009).
- Berndt, A., Lee, S. Y., Ramakrishnan, C., Deisseroth, K. Structure-Guided Transformation of Channelrhodopsin into a Light-Activated Chloride Channel. Science. 344 (6182), 420-424 (2014).
- Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Spudich, J. L. Proteomonas sulcata ACR1: A Fast Anion Channelrhodopsin. Photochem. Photobiol. 92 (2), 257-263 (2016).
- Wietek, J., Broser, M., Krause, B. S., Hegemann, P. Identification of a Natural Green Light Absorbing Chloride Conducting Channelrhodopsin from Proteomonas sulcata. J. Biol. Chem. 291 (8), 4121-4127 (2016).
- Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Janz, R., Liu, X., Spudich, J. L. Natural light-gated anion channels: A family of microbial rhodopsins for advanced optogenetics. Science. 349 (6248), 647-650 (2015).
- Neher, E., Sakmann, B., Steinbach, J. H. The extracellular patch clamp: A method for resolving currents through individual open channels in biological membranes. Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. 375 (2), 219-228 (1978).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. Arch. Eur. J. Physiol. 391 (2), 85-100 (1981).
- Barry, P. H. JPCalc, a software package for calculating liquid junction potential corrections in patch-clamp, intracellular, epithelial and bilayer measurements and for correcting junction potential measurements. J. Neurosci. Methods. 51 (1), 107-116 (1994).
- Amtmann, A., Sanders, D. A unified procedure for the correction of liquid junction potentials in patch clamp experiments on endo- and plasma membranes. J. Exp. Bot. 48, (Special) 361-364 (1997).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).
- Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. J. Vis. Exp. (63), e1-e18 (2012).
- Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 84 (21), 7413-7417 (1987).
- Halliwell, J., Whitaker, M., Ogden, D. Using microelectrodes. Microelectrode Tech. Plymouth Work. Handb. 3, 1-15 (1949).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J. Vis. Exp. (20), e1-e2 (2008).
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
- Pusch, M., Neher, E. Rates of diffusional exchange between small cells and a measuring patch pipette. Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. 411 (2), 204-211 (1988).
- Berndt, A. Mechanismus und anwendungsbezogene Optimierung von Channelrhodopsin-2. , Diss Humboldt-Universität zu Berlin. Available from: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:11-100191266 (2011).
- Prigge, M., et al. Color-tuned channelrhodopsins for multiwavelength optogenetics. J. Biol. Chem. 287 (38), 31804-31812 (2012).
- Gradmann, D., Berndt, A., Schneider, F., Hegemann, P. Rectification of the channelrhodopsin early conductance. Biophys. J. 101 (5), 1057-1068 (2011).
- Beppu, K., et al. Optogenetic countering of glial acidosis suppresses glial glutamate release and ischemic brain damage. Neuron. 81 (2), 314-320 (2014).
- Wietek, J., Prigge, M. Enhancing Channelrhodopsins: An Overview. Methods Mol. Biol. 1408, 141-165 (2016).
- Ferenczi, E. A., et al. Optogenetic approaches addressing extracellular modulation of neural excitability. Sci. Rep. 6, 1-20 (2016).
- Zhang, F., et al. Red-shifted optogenetic excitation: a tool for fast neural control derived from Volvox carteri. Nat. Neurosci. 11 (6), 631-633 (2008).
- Sugiyama, Y., et al. Photocurrent attenuation by a single polar-to-nonpolar point mutation of channelrhodopsin-2. Photochem. Photobiol. Sci. 8 (3), 328-336 (2009).
- Kleinlogel, S., et al. Ultra light-sensitive and fast neuronal activation with the Ca2+-permeable channelrhodopsin CatCh. Nat. Neurosci. 14 (4), 513-518 (2011).
- Wang, H., et al. Molecular determinants differentiating photocurrent properties of two channelrhodopsins from chlamydomonas. J. Biol. Chem. 284 (9), 5685-5696 (2009).
- Gradinaru, V., Thompson, K. R., Deisseroth, K. eNpHR: a Natronomonas halorhodopsin enhanced for optogenetic applications. Brain Cell Biol. 36 (1-4), 129-139 (2008).
- Berglund, K., et al. Luminopsins integrate opto- and chemogenetics by using physical and biological light sources for opsin activation. Proc. Natl. Acad. Sci. 113 (3), 358-367 (2016).
