Abstract
Gedurende het afgelopen decennium werden channelrhodopsinen onontbeerlijk in neurowetenschappelijk onderzoek waar ze gebruikt worden als hulpmiddelen om niet-invasieve manipulatie van elektrische processen in doelcellen. In deze context is ionen-selectiviteit van een kanaalrhodopsine van bijzonder belang. Dit artikel beschrijft het onderzoek van chloride selectiviteit voor een onlangs geïdentificeerd anion-conducting channelrhodopsin van Proteomonas sulcata via elektrofysiologische patch-clamp opnames op HEK293 cellen. De experimentele procedure voor het meten van lichtgatede fotocromen eist een snelle omschakelbare - ideaal monochromatische - lichtbron die in de microscoop van een anders gebruikelijke patch-klemopstelling is gekoppeld. Voorbereidende procedures voorafgaand aan het experiment worden beschreven met betrekking tot bereiding van gebufferde oplossingen, overwegingen over vloeibare kruisingspotenties, zaaien en transfectie van cellen en het trekken van patchpipetten. De feitelijke opname van stroomspanning relatieS om de omkeringspotentiaal te bepalen voor verschillende chloride concentraties vindt plaats 24 uur na 48 uur na transfectie. Tenslotte worden elektrofysiologische gegevens geanalyseerd met betrekking tot theoretische overwegingen van chlorideleiding.
Introduction
Channelrhodopsins (ChR) zijn lichtgated ion kanalen die zich voordoen in de oogpunt van motiele groene algen, en dienen als primaire fotosensoren voor fototaxis en fobische reacties 1 . Sinds hun eerste beschrijving in 2002 2 hebben ChRs de weg gebaan voor het opkomende veld van optogenetica en kan het worden toegepast in een verscheidenheid aan excitabele cellen, bijv. Binnen de skeletspieren, het hart of de hersenen 3 , 4 , 5 . Expressie van ChRs in doelcellen resulteert in lichtregelbare ionpermeabiliteit van de respectievelijke cel. In een neuronale context laat dit toe met activering 6 , 7 , 8 of remming 9 , 10 van het potentieel van de potentieel (AP) - afhankelijk van het uitgevoerde ion - met de ruimtelijke en temporalePrecisie van licht waarbij wordt benadrukt hoe de ionen selectiviteit van een ChR variant zijn optogenetische toepassing bepaalt.
De eerste ontdekte ChR's van Chlamydomonas reinhardtii en Volvox carteri zijn doorlaatbaar voor protonen, maar ook voor monovalente kationen zoals natrium, kalium en in mindere mate divalente kationen zoals calcium en magnesium 11 , 12 , 13 . Vandaag, meer dan 70 natuurlijke kation-conducterende channelrhodopsins (CCR's) 14 , 15 , 16 , 17 en verschillende gemanipuleerde varianten 18 , 19 , 20 met verschillende eigenschappen zoals Fotocurrentgrootte, spectrale gevoeligheid, kinetiek en kation selectiviteit zijn beschikbaar. Terwijl in de neurowetenschappen CCR's aRe gebruikt om cellen te activeren en AP's te activeren. Lichtgedreven microbiële pompen waren de enige beschikbare antagonisten voor het zwijgen van neuronen. In 2014 lieten twee groepen tegelijkertijd zien dat CCR's kunnen worden omgezet in anion-conducting channelrhodopsins (ACR's) door verandering van de polariteit langs de putatieve ion geleidende porie via moleculaire engineering 9 , 21 . Vervolgens werden natuurlijke ACR's geïdentificeerd in verschillende cryptofyte alg 22 , 23 , 24 . Belangrijker nog, lichtactivering van ACR's bemiddelt chloridestromen in volwassen neuronen waardoor remming van neuronale activiteit bij veel lagere lichtintensiteiten mogelijk is dan microbiële pompen die alleen enkele ladingen per geabsorbeerd foton transporteren.
ChR activiteit kan direct worden aangepakt door elektrofysiologische patch-clamp opnames van licht geïnduceerde stromingen in HEK293 cellen. De patch-klemTechniek werd oorspronkelijk ontwikkeld in de late jaren 1970 en werd verder verbeterd door Hamill et al. , Waardoor de opname van de entiteit van stromen van een kleine cel (hele cel modus) met hoge stroomresolutie en directe controle van de membraanspanning 26 mogelijk is . Toegepast in celcultuur, deze techniek zorgt voor een nauwkeurige controle van de ionische en elektrische opname omstandigheden, en maakt het mogelijk om de ion selectiviteit te bestuderen, samen met de relatieve bijdrage van de ionen tot de totale stroom. Hierbij illustreren we het onderzoek van ionen selectiviteit voor de anion-conducting channelrhodopsin van Proteomonas sulcata ( Ps ACR1) 22 , 23 via de opname van stroomspanning relaties onder verschillende extracellulaire chloride concentraties om high chloride conductance te bewijzen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Figuur 1: Patch-clamp Setup. (1) lichtbron, (2) optische vezel, (3) programmeerbare sluiter, (4) digitizer, (5) sluiter stuurprogramma, (6) versterker, (7) perfusie systeem, (8) personal computer, , (10) faraday kooi, (11) microscoop stadium, (12) perfusie inlaat, (13) perfusie outlet, (14) opname kamer, (15) vloeistof niveau sensor, (16) bad elektrode met agar brug, Pipettehouder, (18) hoofdstok, (19) micromanipulator, (20) omgekeerde microscoop, (21) microscooplampbehuizing, (22) microscooplampvoeding, (23) watergevulde U-buis (24) Klep, (25) anti-trillings tafel, (26) CCD camera. ( A ) Foto's en ( B ) schematische weergave van de installatie. Klik hier om een grotere versie van t te zienZijn figuur
1. Instelling voorafgaand aan opnamen
| intra. | extra.1 | extra.2 | |
| Hoog chloride | Hoog chloride | Laag chloride | |
| C [mM] | C [mM] | C [mM] | |
| Na-ASP | 0 | 0 | 140 |
| NaCl | 110 | 140 | 0 |
| KCl | 1 | 1 | 1 |
| CsCl | 1 | 1 | 1 |
| CaCl2 | 2 | 2 | 2 |
| MgCl2 | 2 | 2 | 2 |
| HEPES | 10 | 10 | 10 |
| EGTA | 10 | 0 | 0 |
| pH | 7.2 | 7.2 | 7.2 |
| osmolariteit | 290 mOsm | 320 mOsm | 320 mOsm |
Tabel 1: Ionische samenstelling van de gebufferde oplossingen. Samenstelling van intracellulaire (intra.) En extracellulaire (extra.) Buffers voor chloride selectiviteit experimenten in HEK cellen. Gebruikte afkortingen: ethyleenglycoltetraazijnzuur (EGTA), 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES) en aspartaat (ASP). Alle concentraties zijn in mM.
- Bereid de opnameoplossingen op met ionconcentraties zoals aangegeven in tabel 1.
- Bereid 15 ml 2 M voorraadoplossingen in ultravure water voor MgCl2, CaCl2, KCl en CsCl.
- Weeg de vaste componenten voor 100 ml van de intracellulaire en500 ml van de extracellulaire gebufferde oplossingen volgens tabel 1 in afzonderlijke bekers en voeg vervolgens de respectieve hoeveelheid van de bereide voorraadoplossingen toe. Bijvoorbeeld, voor de intracellulaire buffer, gebruik 0,3803 g (10 mM) EGTA, 0,2383 g (10 mM) HEPES en 0,6428 g (110 mM) NaCl en voeg 100 μL van de 2 M MgCl2 en CaCl2 en 50 μl van de 2 M KCl en CsCl voorraadoplossingen.
- Voeg ultravat water toe en pas de pH zorgvuldig aan met behulp van zuren en basen die de meting niet storen, dwz niet uitgevoerd door de ChR, zoals citroenzuur en N-methyl-D-glucamine (NMG + ).
- Pas de osmolariteit aan op 290 mOsm voor de intracellulaire en tot 320 mOsm voor de extracellulaire oplossingen met glucose.
Opmerking: Lichte hypoosmotische intracellulaire oplossingen verhogen succesfrequentie van patchen 26 . - Steriele filter alle oplossingen door 0,22 μm filters. Bewaar oplossingen bij 4 ° C gedurende twee wekenS of bevriezen bij -20 ° C voor langdurige opslag.
- Bereken de vloeibare koppelingspotentia en berei registratieprotocollen op.
OPMERKING: Verandering van de extracellulaire chloride concentratie na het oprichten van de volledige celconfiguratie zorgt voor een significant vloeibaar verbindingspotentieel (LJP) dat moet worden gecorrigeerd 27 , 28 . LJP's kunnen direct gemeten of berekend worden, hier wordt de laatste optie gebruikt. In dit protocol wordt online-correctie gebruikt die een opnameprotocol vereist voor elke externe buffer. Voor een groter aantal externe oplossingen wordt echter een postcorrectie van LJP aanbevolen om valse correctie te vermijden.- Open de junction potential calculator (JPC) 27 en open de dialoog 'Nieuwe Experiment'. Selecteer dan "Patch-clamp metingen". Selecteer "hele celmetingen", "Standaard zoutoplossingselektrode" en voer een temperatuur van25 ° C. Tussen elke stap gaat u door door de selectie te accepteren door op de "volgende" knop te drukken.
OPMERKING: Experimenten worden uitgevoerd bij kamertemperatuur van 25 ° C in een airconditioned laboratorium. Zorg ervoor dat de bufferoplossingen kamertemperatuur hebben voordat u met experimenten begint. Om de voorbeeldtemperatuur te variëren kan een incubatietrap of -kamer gebruikt worden. Badtemperatuur kan vaak met een thermometer worden gemeten. - Voeg alle individuele anion- en kationconcentraties van de gepipetteerde oplossing en de hoge chloridebuffer toe volgens de in tabel 1 vermelde concentraties.
OPMERKING: De JPC zal een LJP van -0,5 mV berekenen voor de startomstandigheden. - Klik op "Nieuwe Bad Oplossing" om de anionische en kationische samenstelling van de lage chloride buffer in te voeren.
OPMERKING: De JPC berekent nu een nieuwe LJP van +12,6 mV volgens de gewijzigde extracellulaire opname oplossing. - Bereid twee LJP-gecorrigeerde protocollen voor deTwee meetvoorwaarden door het berekende LJP van het toegepaste vasthoudpotentiaal af te trekken; -0,5 mV voor de hoge en +12,6 mV voor de lage chloride externe oplossingen. Zo beginnen de protocollen met respectievelijk -79,5 mV (hoog chloride) en -92,6 mV (laag chloride) om een LJP-gecorrigeerd startvolume van -80 mV in beide gevallen te verkrijgen.
OPMERKING: De volgende stappen zijn van toepassing op de gegevensverzamelingssoftware die vermeld staat in de materiaallijst. - Open de protocol editor in de acquisitie software. Overschakelen naar het menu "Mode" selecteer "Episodische stimulatie" en bevat 7 sweeps.
- Schakel over naar het menu 'Waveform' in de editor en sluit een 200 ms periode met 0 mV vasthoudpotentiaal gevolgd door een 2 s periode met wisselend vasthoudpotentieel vanaf -79,5 mV voor hoog chloride. Inclusief een "Delta level" van 20 mV voor de tweede periode om het vasthoudpotentieel te verhogen met 20 mV in elke sweep.
- Binnen de spanningsstappen van de golfvorm edItor past een verlichtingsperiode van 500 ms toe met 540 nm licht (3.10 mW / mm²). Om dit te doen, verander het "digitale bitpatroon" van de aangesloten sluiter die de lichtbron activeert 500 ms na de tweede periode die hierboven is beschreven (zie 1.2.6).
OPMERKING: De lichtintensiteit kan de biofysische eigenschappen van kanaalstromen beïnvloeden, zoals amplitude of inactivering. Daarom dienen de lichtdichtheiden altijd te worden gemeld. Om de lichtsterkte te meten na het doorlopen van alle optiek en de deklaag, gebruik een gekalibreerde optometer. Om de vermogensdichtheid te berekenen, bepaal het verlichte veld van het object door een object micrometer en verdeel de gemeten lichtstroom door het bepaalde verlichte veld. - Sla het protocol op voor de hoge chloride extracellulaire oplossing. Wijzig het protocol en vervang het eerste niveau vasthoudpotentieel met -92,6 mV (laag extern chloride). Bewaar dit tweede protocol voor het meten van de lage chloride extracellulaire conditie.
- Lysine-coating van glazen dekselstrookjes volgens aangepast protocol 29 .
- Plaats meerdere 100 deksels in een glazen petrischaal en voeg 250 ml HCl (1 N) toe.
- Plaats de petrischaal met de deklaagjes op een lineaire shaker en schud 72 uur om 120 uur bij 120 ° C om de deksels te reinigen en daarna met ultravater water te spoelen om de pH te neutraliseren.
- Zacht deze in een klein volume van 95% ethanol voor verdere reiniging.
OPMERKING: Schone dekjes kunnen in 70% ethanol opgeslagen worden voordat u verder gaat. Werk onder de laminarstromkap voor de volgende stappen. - Met een Bunsen-brander en een pincet, vlam elk deksel en verplaats het in een nieuwe petrischaal.
- Incubeer de glazen dekselstrips met een steriele 50 μg / ml poly-D-lysineoplossing gedurende ten minste 1 uur (of overnacht) bij kamertemperatuur terwijl u schudt met een lineaire shaker bij 150 rpm.
- Was de deklagen met ultrauw water om overtollig poly-D-lysine te verwijderen.
- Spread de deksels op steriel papier om 10 minuten te drogen en bloot te stellen aan UV-licht voor sterilisatie (tenminste 20 minuten).
- Verzamel de dekselglazen in een steriele petrischaal, bedekt met aluminiumfolie tot aan het gebruik.
- Bereid DNA op van het Ps ACR1 gen gefuseerd aan mCherry met behulp van standaard moleculaire biologie technieken.
- Kloneer de menselijke codon-geoptimaliseerde gensequentie die codeert voor Ps ACR1 in een peGFP-C1 plasmide (CMV promotor, kanamycine resistentie) in frame met de mCherry fluorofoor met behulp van restrictie enzymen of andere gevestigde kloneringsmethoden.
Opmerking: Andere fluorophoren kunnen ook gebruikt worden, maar zorg ervoor dat de bijbehorende filtersets beschikbaar zijn om hun fluorescentie onder de microscoop in de setup te waarnemen. - Transformeer het plasmide-DNA in chemocompetente XL1Blue E. coli cellen via hitte schok volgens standaard protocol en plaat ze op agarplaten (30 μg / mL kanamycine) 30
- De volgende dag inoculeer 4 ml lysogeny bouillonmedium aangevuld met 30 μg / ml kanamycine met cellen uit enkele kolonies en incubeer hen gedurende de nacht bij 37 ° C en 180 rpm in een incubator.
- Na de incubatie overnachten, zuivert het plasmide-DNA uit de culturen met behulp van een in de handel verkrijgbare kit (zie Material Table ) volgens de instructies van de fabrikant.
- Kloneer de menselijke codon-geoptimaliseerde gensequentie die codeert voor Ps ACR1 in een peGFP-C1 plasmide (CMV promotor, kanamycine resistentie) in frame met de mCherry fluorofoor met behulp van restrictie enzymen of andere gevestigde kloneringsmethoden.
- Zaad de cellen
OPMERKING: Voer de stappen uit onder een laminaire stroomkap.- Leg tot drie lysine bedekte glazen deksels naast elkaar in een 35 mm petrischaal.
OPMERKING: Druk ze voorzichtig tegen de bodem van de schotel om te voorkomen dat ze op elkaar glijden. - Zaad 1,5 x 10 5 HEK cellen in 2 ml standaard Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runder serum (FBS) in elke schotel.
- Supplement all- trans retinale atEen uiteindelijke concentratie van 1 μM. Groei de cellen gedurende minstens één dag voordat u verder gaat met stap 1.6.
- Leg tot drie lysine bedekte glazen deksels naast elkaar in een 35 mm petrischaal.
- Transfereer de cellen transversaal via lipofectie 31 .
- Bereid voor elke schotel van cellen een oplossing van 2 μg plasmide-DNA (zoals bereid in stap 1.4) in 250 μl DMEM zonder FBS en 6 μl transfectie-reagens (zie Materialetabel ).
- Na 15 minuten incubatie, voeg de oplossing zachtjes (druppelsgewijs) toe aan de cellen.
- Bereid agarbruggen op
- Voeg 0,75 g agarose toe aan 50 ml steriele natriumchloride oplossing (140 mM) en los het op door op te warmen in een magnetron.
OPMERKING: 2 - 3 M KCl voor agarbrugbereiding vermindert LJP verder door hogere concentratie ( bijv. Constante diffusie van de brug) en gelijke mobiliteit van K + en Cl - ionen, maar werd vermeden om ion- (vooral Cl - ) lekkage te minimaliseren In t Hij badoplossing 32 . - Vul 10 μL pipetpunten (of een slang met kleine diameter) met de vloeibare agarose-oplossing met een spuit.
OPMERKING: Vermijd luchtbellen in de brug. - Nadat de agarbruggen zijn afgekoeld en gestolen, bewaar ze ze in een steriele 140 mM natriumchloride oplossing.
- Voeg 0,75 g agarose toe aan 50 ml steriele natriumchloride oplossing (140 mM) en los het op door op te warmen in een magnetron.
- Voorbereid opnemen en badelektroden.
- Verwijder zilveren draden van het bad en opnemen elektrode van de patch-klem setup.
- Pool de draden met schuurpapier om zilverchloride uit vorige experimenten te verwijderen. Dompel de schone zilverdraad in 3 M KCl en sluit deze aan op de positieve pool van een 1,5 V batterij voor elektrolytische coating met zilverchloride.
OPMERKING: een laboratoriumtoevoer kan in plaats van een batterij worden gebruikt.
- Trek patchpipetten met lage weerstand (1,5-3,0 MΩ) uit glazen capillairen met een micropipettractor en vuurpoetsmiddel zoals beschreven door Brown et al.Lass = "xref"> 33. Bewaar pipetten stofvrij voor de dag van meting.
- Schakel alle installatiecomponenten in om op te warmen tot de werk temperatuur 30 minuten voorafgaande opnamen. Zorg ervoor dat buffers bij kamertemperatuur zijn.
2. Selectiviteitsmetingen
- Begin de opnames 24 tot 48 uur na transient transfectie van de cellen beschreven in 1.6.
- Plaats een afdekplaatje in de meetkamer en sluit het met silicium aan om lekkage van de externe buffer te voorkomen. Bewaar de petri schotel met de andere deksels in een incubator voor de volgende reeks experimenten.
- Vul de kamer voorzichtig met extracellulaire buffer (hoog [Cl - ]) om te voorkomen dat cellen worden losgemaakt, plaats het dan onder de microscoop en gebruik de 40X-doelstelling voor celvisualisatie.
- Zet een agarbrug over de badelektrode en plaats deze samen met de vloeistofniveausensor en de perfusie-uitlaat van de badhandler in de kamer.
- Wissel de exTracellulaire oplossing tweemaal met 1 ml verse externe oplossing (hoog [Cl-]) om residueel kweekmedium en losstaande cellen te verwijderen.
- Breng de cellen in focus en zoek naar een getransfecteerde (fluorescerende) cel, die van andere cellen moet worden geïsoleerd. Gebruik een triple-band filter-set en oranje licht (590 nm, bandbreedte 15 nm, 100% intensiteit) om mCherry opgewonden en te visualiseren.
OPMERKING: HEK-cellen kunnen elektrisch gekoppeld worden aan hun buren door gatverbindingen 34, wat resulteert in lage membraanweerstand in de volledige celconfiguratie. - Vul een van de getrokken pipetten met een intracellulaire oplossing en verwijder luchtbellen door het pipet meerdere malen te draaien.
- Monteer de pipet op de pipethouder en gebruik een paar positieve druk om verstopping van de punt te voorkomen.
- Zoek de punt van de patchpipet onder de microscoop en navigeer het dicht bij de cel met behulp van de micromanipulator.
OPMERKING: De volgende stappen zijn van toepassing op de aMplifier, data acquisitie en evaluatie software genoemd in de materiaal lijst. - Start de "membraan test" in de data acquisition software en gebruik een spanningstap (testpuls, bijvoorbeeld 5 mV voor 10 ms, basislijn bij 0 mV), handmatig of automatisch via gespecificeerde software met "badmodus" tijdens het uitvoeren van "membraan test" In de data acquisition software.
- Controleer of de pipetweerstand in het gewenste bereik ligt (1,5-3,0 MΩ).
- Zero offsetstromen door het pipetpotentiaal aan te passen door de pipettoffsetknop bij de versterker te draaien terwijl u in de "badmodus" van de "membraan test" werkt.
- Zet een patch in de volledige celconfiguratie 26 .
OPMERKING: De volgende stappen vereisen de toepassing van positieve en negatieve druk die wordt afgeleverd aan de zijpoort van de gebruikte pipethouder. Dit kan gedaan worden met behulp van een spuit, via een mondstuk of een elektronische conTrolled drukregelaar. In dit protocol wordt positieve en negatieve druk aangebracht via een mondstuk.- Langzaam de cel met de patchpipet vanaf de bovenkant naderbij komen en de positieve druk vrijmaken voordat u het aanraakt.
OPMERKING: wanneer de punt dicht bij de cel ligt, zal de weerstand licht stijgen; Dit wordt aangegeven door een verminderde grootte van de testpuls. - Verander de "membraan test" van "badmodus" naar "patch mode", dus het vasthoudpotentieel naar het verwachte rustpotentieel van de cellen (-30 tot -40 mV).
- In sommige gevallen vormt de celverbonden configuratie zich na het loslaten van de positieve druk (2.13.1), zo niet zachtjes negatieve druk aanbrengen om gigase-vorming te ondersteunen.
OPMERKING: Cell-attached configuratie wordt vastgesteld wanneer de testpuls wordt verminderd tot twee kleine capacitieve pieken aan het begin en einde van de puls en de membraanweerstand is in het GΩ bereik; Negatieve spanningen tot -60 mV mIght faciliteren gigaseale vorming. - Vergoed de pipetcapaciteit door de "pipet capacitance compensation" knoppen te draaien om een platte respons van de testpuls te krijgen.
- Ruptureer de patch zonder de zeehond te vernietigen door korte pulsen van negatieve druk of negatieve druk toe te passen met toenemende kracht om volledige celconformatie te verkrijgen.
OPMERKING: Succesvolle overgang van celbevestigde tot volledige celconfiguratie wordt aangegeven door een toename van de capacitieve pieken. - Serie weerstand compensatie toepassen door het instellen van de hele cel parameter en compensatie aanpassingen van de gebruikte versterker voor nauwkeurig vastklemmen van het membraanpotentiaal naar de gewenste vastspanning.
- Schakel de "membraan test" in de "full-cell" modus, in het panel "Serie weerstand weerstand compensatie" zet "voorspelling" en "corrigeren" tot 90% op, zodat overschot en oscillatie van het capacitieve antwoord worden vermeden, draai de hele celCompensatie schakel de volledige celparameters in en gebruik de juiste frontpaneelknoppen ("volledige celcapaciteit" en "serieweerstand") van de versterker op een iteratieve manier aan om een ideaal vlakke testafdichting te verkrijgen.
OPMERKING: Voor een gedetailleerde beschrijving van de serieweerstandcompensatie en -correctie, verwijzen wij u naar de versterkerhandleiding of richtlijn, aangezien deze procedure varieert tussen verschillende fabrikanten.
- Schakel de "membraan test" in de "full-cell" modus, in het panel "Serie weerstand weerstand compensatie" zet "voorspelling" en "corrigeren" tot 90% op, zodat overschot en oscillatie van het capacitieve antwoord worden vermeden, draai de hele celCompensatie schakel de volledige celparameters in en gebruik de juiste frontpaneelknoppen ("volledige celcapaciteit" en "serieweerstand") van de versterker op een iteratieve manier aan om een ideaal vlakke testafdichting te verkrijgen.
- Wacht na tenminste 2 minuten voor opname na het opstellen van de volledige celconfiguratie om voldoende intracellulaire oplossing te verzekeren via de patchpipette 35 .
- Langzaam de cel met de patchpipet vanaf de bovenkant naderbij komen en de positieve druk vrijmaken voordat u het aanraakt.
- Record lichtgestroomde stromingen op verschillende vasthoudmogelijkheden door gebruik te maken van de eerder ingestelde protocollen (in 1.2).
- Vervang de extracellulaire buffer tot een lage [Cl - ] in de kamer ten minste vijf keer zonder de patch te vernietigen en een andere stroomspanningrelatie op te nemen ( zie stap 1.2) bij tHij nieuwe chloride concentratie.
OPMERKING: Een perfusie systeem voor geautomatiseerde bufferuitwisseling vergemakkelijkt dit proces, maar is niet nodig. - Herhaal 2,15. Voor elke ionische conditie die moet worden getest, maar herhaaldelijk controleer de kwaliteit van de patch tussen de metingen door een hierboven beschreven membraan test.
OPMERKING: Om de nauwkeurige membraanspanning en de stabiele intracellulaire ionen samenstelling te garanderen, moet de weerstand van de membraan hoger zijn dan 500 MΩ, terwijl de toegangsweerstand niet 10 MΩ mag overschrijden, zie . 2.12.6). Vergeet niet om de volledige-celparametercompensatie uit te schakelen voor de membraan test. - Herhaal 2.2. Naar 2,15. Voor meerdere cellen, maar neem een nieuwe afdekplaatje voor elke testreeks om de gezondheid van cellen te waarborgen.
3. Data-evaluatie
- Pas de basislijn van elk stroomspoor aan door de gemiddelde stroom voor verlichting af te trekken.
- Bereken de gemiddelde stationaire fotocurrent I s (
- Herhaal stappen 3.1) en 3.2) voor alle geteste condities en verschillende cellen.
- Bepaal de vastgestelde fotocurranten ten opzichte van het respectieve vasthoudpotentieel.
OPMERKING: Indien meerdere metingen gemiddeld zijn, kunnen individuele opnamen worden genormaliseerd naar een bepaalde conditie of de capaciteit van de cel. - Het snijpunt van de spanningsrelatie met de spanningsas vertegenwoordigt het omkeringspotentieel (netto stroom is nul). Bepaal het door lineaire interpolatie tussen de twee naburige data punten.
OPMERKING: als er geen polariteit inversie van fotocurranten is, extrapoleren lineair van de laatste twee punten dicht bij nul om een benadering van het kruispunt te verkrijgen. - Gemiddeld de vastgestelde rEversale potenties voor dezelfde omstandigheden en plot ze tegen de chloride concentratie van de externe buffer oplossingen ( zie figuur 2B ).
- Open de junction potential calculator (JPC) 27 en open de dialoog 'Nieuwe Experiment'. Selecteer dan "Patch-clamp metingen". Selecteer "hele celmetingen", "Standaard zoutoplossingselektrode" en voer een temperatuur van25 ° C. Tussen elke stap gaat u door door de selectie te accepteren door op de "volgende" knop te drukken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 2 toont representatieve resultaten verkregen uit metingen volgens het beschreven protocol. Tijdens verlichting met groen licht, heeft Ps ACR1 een snelle transientstroom die snel afneemt op een stationair stroomniveau. Nadat het licht is uitgeschakeld, vervallen de fotocellen binnen millisekonden tot nul ( Figuur 2A ). Het uitwisselen van de extracellulaire chloride concentratie zorgt voor een verschuiving van het omkeringspotentieel dat direct kan worden gezien in de verkregen fotocurrentsporen. Evaluatie van omkeerpotentiaal uit meerdere metingen kwantificeert de dramatische omkeringspotentiaalverschuiving veroorzaakt door de variatie van de externe chloride concentratie ( Figuur 2B ). Opvallend, gemeten omkeringspotenties komen direct overeen met berekende Nernst-potenties voor chloride ( Figuur 2C ) die de hoge chloride selectiviteit van Ps ACR1 bevestigt.
T 'fo: keep-together.within-page = "1">
Figuur 2: Chloride selectiviteit van Ps ACR1 . ( A ) Representatieve huidige sporen van Ps ACR1 in HEK293 cellen. Intracellulaire chloride concentratie werd op 120 mM gehouden, terwijl de extracellulaire concentratie van 150 mM (groen) tot 10 mM (paars) chloride varieerde door gedeeltelijke vervanging van NaCl met Na-aspartaat. Het potentieel van de opslag werd verhoogd in stappen van 20 mV van -80 mV tot +40 mV (LJP gecorrigeerd). ( B ) Gemiddelde stroomspanning relaties (n = 6 overeenkomende met de omstandigheden in A). ( C ) Terugkeerpotentiaal (middenlijnen geven medianen aan, doosgrenswaarden geven de 25ste en 75ste percentielen aan, de whiskers verlopen 2 keer de standaardafwijking en de cirkels geven enkele gegevenspunten aan) uit de stroomspanningsrelaties. Voor de high chloride conDition (groen) werd de waarde lineair geïnterpoleerd tussen -20 mV en 0 mV vasthoudpotentieel, terwijl de waarde lineair geëxtrapoleerd werd boven +40 mV (paars, streeplijn, paneel B). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bepaling van omkeerpotentiaal bij gedefinieerde ionische en elektrische omstandigheden geeft informatie over de ionen die worden vervoerd na lichtactivering van ChRs. Als uitsluitend één ionensoort in een complex fysiologisch medium wordt gevarieerd en de verkregen omkeerpotentiaalverschuivingen volgens het theoretische Nernst-potentieel, is deze ionensoort de enige vervoerde.
Voor ChR's zijn reversibele potentiële verschuivingen echter meestal minder uitgesproken dan verwacht van de Nernst-vergelijking door de doorlaatbaarheid van verschillende ionische soorten, evenals de concurrentie tussen uitgevoerde ionen. In dit geval wordt de situatie complexer en worden alle eventueel uitgevoerde ionen afzonderlijk uitgewisseld, waarbij verschillende meetoplossingen worden gevraagd. Bovendien zijn de meeste CCR's en de eerste kunstmatige ACR's 9 , 10 , 21 geleidend voor protonen, maar variërende protonconcentraDe protonconcentratie kan niet alleen de omkeringspotentiaal veranderen, maar kan ook de ionconductie 9 , de fotokinetiekinetiek 21 , 36 en de spectrale lichtgevoeligheid 11 , 37 beïnvloeden door verandering van de waterstofbindende netwerken, de protonatietoestand van Individuele residuen en secundaire structuur veranderen. Protonconductie kan worden aangepakt door concentraties van alle andere potentieel uitgevoerde ionen zoals Na + , Ca 2+ of Cl te verminderen, terwijl de pH constant blijft om de bovengenoemde eiwitveranderingen te vermijden. Niet-uitgevoerde substituten zijn gewoonlijk omvangrijke, geladen moleculen zoals NMG + voor kationen 12 , en gluconaat, 2- ( N- morpholino) ethaansulfonaat (MES-) of aspartaat voor anionen. Vergelijkende omkeringspotenties in verschillende iOnische oplossingen laat de berekening van de relatieve ionpermeabiliteit bij evenwichtstoestanden door de Goldman-Hodgkin-Katz spanningsvergelijking toe. Het kwantificeren van de exacte bijdrage van verschillende ionen aan netto-fotocromen, gezien ionconcurrentie buiten evenwichtsomstandigheden, vraagt echter complexe wiskundige modellen 12 , 38 .
Het kennen van de samenstelling van ionen die door ChR's worden vervoerd, helpt bij het uitlichten van mogelijke bijwerkingen die voortvloeien uit ChR-applicatie, vooral in een neurofysiologische context. Bijvoorbeeld kan langdurige ChR-activering intracellulaire verzuring 39 veroorzaken of dat Ca 2+ kan leiden tot synaptische vrijlating en tweede messenger pathways 40 . Aangezien cellen gewoonlijk strak verpakt zijn in weefsels, kan de activatie van microbiële rhodopsinen niet alleen de intracellulaire ionensamenstelling beïnvloeden maar ook het extracellulaire lumen, waardoor nNaburige cellen 41 .
Ondanks ionen selectiviteit zijn andere biofysische eigenschappen van ChRs zoals fotocurrent amplitude, inactivering, spectrale of lichtgevoeligheid en kinetische eigenschappen vaak van belang om experimenten met optogenetische technieken te voeren, te ontwerpen en te interpreteren. Sommige van deze eigenschappen kunnen ook worden bepaald uit het bovenstaande protocol zoals beschreven elders 18 , 37 , 42 . Om de lichtgevoeligheid van de ChR-expressieve cel te onderzoeken, kan de lichtintensiteit worden gevarieerd door de kracht van de lichtbron aan te passen of door het activeringslicht te dempen met neutrale dichtheidsfilters. Om de spectrale gevoeligheid te verkrijgen is een polychromatische lichtbron nodig en moet intensiteiten worden ingesteld op gelijke fotonflux en bandbreedte voor alle golflengten. Hoge intensiteitsspectra lijken alleen op absorptiespectra van de fotoreceptor als korte lichtimpulsen ofLaserflitsen worden gebruikt, anders kunnen aanpassingsverschijnselen en fotochemische terugreacties optreden. Het herstel van gedeeltelijk geïnactiveerd tot volledig actieve ChR (totale fotocyclische omzettijd) kan worden nagegaan door een dubbelpulsprotocol toe te passen met toenemende donkere intervallen tussen de twee lichtpulsen. De biofysische eigenschappen van ChRs die hierboven zijn besproken, zijn belangrijk voor het kiezen van een geschikt ChR dat overeenstemt met de experimentele behoeften 40 .
Het afleiden van deze biofysische eigenschappen door elektrofysiologische technieken lijkt op eiwitfunctie, die nauwelijks door spectroscopische methoden wordt gedekt. Na succesvolle opstelling van spannings-klemmetingen kan de techniek gecombineerd worden met eiwit engineering benaderingen zoals plaatsgerichte mutagenese 9 , 11 , 43 , 44 , helix-shuffling 37 ,
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Wij danken Maila Reh, Tharsana Tharmalingam en vooral Altina Klein voor uitstekende technische bijstand. Dit werk werd ondersteund door de Duitse Onderzoeksstichting (DFG) (SFB1078 B2, FOR1279 SPP1665 tot PH) en de Cluster of Excellence Unifying Concepts in Catalysis, UniCat, BIG-NSE (JV) en E4 (PH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK293 cells | Sigma Aldrich | 85120602 | Human embryonic kidney cells |
| Retinal | Sigma Aldrich | R2500 | all-trans retinal |
| FuGENE HD | Promega | E2312 | Transfection reagent |
| DMEM | Biochrome | FG 0445 | Dulbecco's Modified Eagle Medium |
| Agarose | Roth | 3810 | Agar bridges |
| CaCl2 | Roth | 5239 | CaCl2 2H2O |
| CsCl | Biomol | 2452 | |
| EGTA | Roth | 3054 | |
| FBS | Biochrome | S0615 | Cell culture |
| Glucose | Roth | HN06 | D(+)-Glucose |
| KCl | Roth | 6781 | |
| MgCl2 | Roth | 2189 | MgCl2 6H2O |
| NaCl | Roth | 3957 | |
| NMG | Sigma Aldrich | M2004 | N-Methyl-D-glucamine |
| Na-Aspartate | Sigma Aldrich | A6683 | L-Aspartic acid sodium salt monohydrate |
| Citric acid | Roth | 6490 | |
| AgeI | ThermoFischerScientific | ER1462 | Restriction enzyme |
| XhoI | ThermoFischerScientific | ER0695 | Restriction enzyme |
| NheI | ThermoFischerScientific | ER0975 | Restriction enzyme |
| XL1Blue E. coli | Agilent Technologies | 200249 | Chemocompetent E. coli |
| Kanamycin | Roth | T832 | |
| Lysogeny broth medium | Roth | X964 | |
| Agar-Agar | Roth | 6494 | Agar plates |
| Plasmid purification kit | Marchery-Nagel | 740727.25 | |
| Penicilin/Streptomycin | Biochrome | A 2213 | Cell culture |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma Aldrich | P6407-5MG | Cover slip coating |
| Microforge | Custom made | Fire polishing | |
| Serological pipettes | TPP | Different sizes | |
| Clean bench | Kojair | Biowizard SL130 | |
| Stirrer | IKA | RCT classic | |
| Silver wire | Science Products | AG-T25; AG-T10 | Electrodes, 0.64 mm (bath); 0.25 mm (electrode) |
| pH-meter | Knick | 765 Calimetric | |
| Osmometer | Vogel | OM 815 | |
| Microscope | Carl Zeiss | ID03 | Fire polishing |
| CO2 incubator | Binder | CB150 | |
| Cell culture dishes | TPP | 93040 | 34 mm internal diameter |
| Cover slips | Roth | P232 | 15 mm diameter |
| Thermometer | Rössel Messtechnik | MTM12 | |
| Beamsplitter | Chroma | 21011 | 90/10 transmission |
| Pipette holder | ALA Scientific Instruments | PPH-1P-AXU-0-1.5 | |
| Headstage | Molecular Devices | CV203BU | |
| Amplifier | Molecular Devices | AxoPatch200B | |
| Digitizer | Molecular Devices | DigiData1400 | Digital analog converter |
| Lightsource | TILL Photonics | Polychrome V | Set to 540 nm full intensity |
| Microscope | Carl Zeiss | Axiovert 100 | |
| Shutter | Vincent Associates | VS25 | |
| Shutter driver | Vincent Associates | VCM-D1 | |
| Glass capilarries | Warner Instruments | G150F-3 | Boresilicate capillaries with fire polished ends OD 1.5 mm ID 0.86 mm |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P1000 | |
| Bath handler | Lorenz Messgerätebau | MPCU | |
| Tripleband filterset | Chroma | 69008 | Fluorescence filter ECFP/EYFP/mCherry |
| CCD camera | Watec | Wat-221SCCD | |
| Optometer | Gigahertz Optik | P9710 | Measure light intensities |
| Objective | Carl Zeiss | 421462-9900-000 | W Plan-Apochromat 40X/1.0 DIC |
| Micromanipulator | Scientifica | PatchStar | |
| Recording chamber | Custom made | ||
| Power supply | Manson | HCS-3202 | Avoids electrical noise from microscope built-in power supply |
| Vibration isolated table | Newport | M-VW-3636-OPT-01 | |
| Faraday cage | Custom made or any commercial matching table | ||
| Hoses | Any comercial; e.g. Roth | Different sizes and materials for bath handling and application of pipette pressure; agar bridges | |
| Linear shaker | Sunlab Instruments | SU 1000 | |
| Liquid junction potential calculator | Molecular Devices or directly from Peter H. Barry | Program is included in the Clampex aquisition software or can be obtained from p.barry@unsw.edu.au | |
| Data acquisition software | Molecular Devices | Clampex 10.X | |
| Data evaluation software | Molecular Devices | Clampfit 10.X | |
| PsACR1 | GenBank or Addgene | KF992074.1 or Addgene plasmid #85465 | Gene encoding for PsACR1 |
| Amplifier guide | Molecular Devices | The Axon Guide |
References
- Hegemann, P. Algal sensory photoreceptors. Annu. Rev. Plant Biol. 59, 167-189 (2008).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae. Science. 296 (5577), 2395-2398 (2002).
- Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of contractile function in skeletal muscle. Nat. Commun. 6 (7153), 1-8 (2015).
- Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo. Nat. Methods. 7 (11), 897-900 (2010).
- Zhang, F., et al. The microbial opsin family of optogenetic tools. Cell. 147 (7), 1446-1457 (2011).
- Nagel, G., et al. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr. Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
- Li, X., et al. Fast noninvasive activation and inhibition of neural and network activity by vertebrate rhodopsin and green algae channelrhodopsin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (49), 17816-17821 (2005).
- Ishizuka, T., Kakuda, M., Araki, R., Yawo, H. Kinetic evaluation of photosensitivity in genetically engineered neurons expressing green algae light-gated channels. Neurosci. Res. 54 (2), 85-94 (2006).
- Wietek, J., et al. Conversion of channelrhodopsin into a light-gated chloride channel. Science. 344 (6182), 409-412 (2014).
- Berndt, A., et al. Structural foundations of optogenetics: Determinants of channelrhodopsin ion selectivity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 113 (4), 822-829 (2016).
- Tsunoda, S. P., Hegemann, P. Glu 87 of Channelrhodopsin-1 Causes pH-dependent Color Tuning and Fast Photocurrent Inactivation. Photochem. Photobiol. 85 (2), 564-569 (2009).
- Schneider, F., Gradmann, D., Hegemann, P. Ion selectivity and competition in channelrhodopsins. Biophys. J. 105 (1), 91-100 (2013).
- Prigge, M. Über die elektrophysiologische Untersuchung und Entwicklung von farbverschobenen Kanalrhodopsinchimären aus der Grünalge Volvox carteri. , Diss. Humboldt-Universität zu Berlin. Available from: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:11-100203476 (2012).
- Govorunova, E. G., Spudich, E. N., Lane, C. E., Sineshchekov, O. A., Spudich, J. L. New Channelrhodopsin with a Red-Shifted Spectrum and Rapid Kinetics from Mesostigma viride. MBio. 2 (3), 1-9 (2011).
- Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Li, H., Janz, R., Spudich, J. L. Characterization of a highly efficient blue-shifted channelrhodopsin from the marine alga Platymonas subcordiformis. J. Biol. Chem. 288 (41), 29911-29922 (2013).
- Hou, S. -Y., et al. Diversity of Chlamydomonas Channelrhodopsins. Photochem. Photobiol. 88 (1), 119-128 (2012).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat. Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophys. J. 96 (5), 1803-1814 (2009).
- Yizhar, O., et al. Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction. Nature. 477 (7363), 171-178 (2011).
- Berndt, A., Yizhar, O., Gunaydin, L. a, Hegemann, P., Deisseroth, K. Bi-stable neural state switches. Nat. Neurosci. 12 (2), 229-234 (2009).
- Berndt, A., Lee, S. Y., Ramakrishnan, C., Deisseroth, K. Structure-Guided Transformation of Channelrhodopsin into a Light-Activated Chloride Channel. Science. 344 (6182), 420-424 (2014).
- Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Spudich, J. L. Proteomonas sulcata ACR1: A Fast Anion Channelrhodopsin. Photochem. Photobiol. 92 (2), 257-263 (2016).
- Wietek, J., Broser, M., Krause, B. S., Hegemann, P. Identification of a Natural Green Light Absorbing Chloride Conducting Channelrhodopsin from Proteomonas sulcata. J. Biol. Chem. 291 (8), 4121-4127 (2016).
- Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Janz, R., Liu, X., Spudich, J. L. Natural light-gated anion channels: A family of microbial rhodopsins for advanced optogenetics. Science. 349 (6248), 647-650 (2015).
- Neher, E., Sakmann, B., Steinbach, J. H. The extracellular patch clamp: A method for resolving currents through individual open channels in biological membranes. Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. 375 (2), 219-228 (1978).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. Arch. Eur. J. Physiol. 391 (2), 85-100 (1981).
- Barry, P. H. JPCalc, a software package for calculating liquid junction potential corrections in patch-clamp, intracellular, epithelial and bilayer measurements and for correcting junction potential measurements. J. Neurosci. Methods. 51 (1), 107-116 (1994).
- Amtmann, A., Sanders, D. A unified procedure for the correction of liquid junction potentials in patch clamp experiments on endo- and plasma membranes. J. Exp. Bot. 48, (Special) 361-364 (1997).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).
- Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. J. Vis. Exp. (63), e1-e18 (2012).
- Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 84 (21), 7413-7417 (1987).
- Halliwell, J., Whitaker, M., Ogden, D. Using microelectrodes. Microelectrode Tech. Plymouth Work. Handb. 3, 1-15 (1949).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J. Vis. Exp. (20), e1-e2 (2008).
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
- Pusch, M., Neher, E. Rates of diffusional exchange between small cells and a measuring patch pipette. Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. 411 (2), 204-211 (1988).
- Berndt, A. Mechanismus und anwendungsbezogene Optimierung von Channelrhodopsin-2. , Diss Humboldt-Universität zu Berlin. Available from: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:11-100191266 (2011).
- Prigge, M., et al. Color-tuned channelrhodopsins for multiwavelength optogenetics. J. Biol. Chem. 287 (38), 31804-31812 (2012).
- Gradmann, D., Berndt, A., Schneider, F., Hegemann, P. Rectification of the channelrhodopsin early conductance. Biophys. J. 101 (5), 1057-1068 (2011).
- Beppu, K., et al. Optogenetic countering of glial acidosis suppresses glial glutamate release and ischemic brain damage. Neuron. 81 (2), 314-320 (2014).
- Wietek, J., Prigge, M. Enhancing Channelrhodopsins: An Overview. Methods Mol. Biol. 1408, 141-165 (2016).
- Ferenczi, E. A., et al. Optogenetic approaches addressing extracellular modulation of neural excitability. Sci. Rep. 6, 1-20 (2016).
- Zhang, F., et al. Red-shifted optogenetic excitation: a tool for fast neural control derived from Volvox carteri. Nat. Neurosci. 11 (6), 631-633 (2008).
- Sugiyama, Y., et al. Photocurrent attenuation by a single polar-to-nonpolar point mutation of channelrhodopsin-2. Photochem. Photobiol. Sci. 8 (3), 328-336 (2009).
- Kleinlogel, S., et al. Ultra light-sensitive and fast neuronal activation with the Ca2+-permeable channelrhodopsin CatCh. Nat. Neurosci. 14 (4), 513-518 (2011).
- Wang, H., et al. Molecular determinants differentiating photocurrent properties of two channelrhodopsins from chlamydomonas. J. Biol. Chem. 284 (9), 5685-5696 (2009).
- Gradinaru, V., Thompson, K. R., Deisseroth, K. eNpHR: a Natronomonas halorhodopsin enhanced for optogenetic applications. Brain Cell Biol. 36 (1-4), 129-139 (2008).
- Berglund, K., et al. Luminopsins integrate opto- and chemogenetics by using physical and biological light sources for opsin activation. Proc. Natl. Acad. Sci. 113 (3), 358-367 (2016).
