Abstract
Under det senaste decenniet blev kanalrhodopsiner oundgängliga i neurovetenskaplig forskning där de används som verktyg för att icke-invasivt manipulera elektriska processer i målceller. I detta sammanhang är jonselektivitet hos en kanalrhodopsin av särskild betydelse. Denna artikel beskriver undersökningen av kloridselektivitet för ett nyligen identifierat anjonledande kanalrhodopsin av Proteomonas sulcata via elektrofysiologiska patch-clamp-inspelningar på HEK293-celler. Det experimentella förfarandet för mätning av ljusgolvade fotokräm kräver en snabb omkopplingsbar - idealiskt monokromatisk - ljuskälla kopplad i mikroskopet av en annars konventionell patch-clamp setup. Preparativa förfaranden före experimentet beskrivs med beredning av buffrade lösningar, överväganden om vätskeförbindningspotentialer, sådd och transfektion av celler och dra av patchpipetter. Den faktiska inspelningen av strömspänningsrelationenS för att bestämma reverseringspotentialerna för olika kloridkoncentrationer sker 24 h till 48 h efter transfektion. Slutligen analyseras elektrofysiologiska data med avseende på teoretiska överväganden av kloridledning.
Introduction
Channelrhodopsiner (ChR) är lätta gatedjonskanaler som förekommer i ögonplatsen av motila gröna alger och fungerar som primära fotosensorer för fototax och fobsvar 1 . Sedan den första beskrivningen 2002 har ChRs banat vägen för det framväxande området av optogenetik och kan appliceras i en mängd olika excitativa celler, t.ex. inom skelettmusklerna, hjärtat eller hjärnan 3 , 4 , 5 . Uttryck av ChRs i målceller resulterar i ljusstyrbar jonpermeabilitet hos respektive cell. I ett neuronalt sammanhang möjliggör detta aktivering 6 , 7 , 8 eller inhibering 9 , 10 av actionpotential (AP) avfyring - beroende på den genomförda jonen - med rumsliga och tidsmässigaPrecision av ljus som betonar hur jonselektiviteten hos en ChR-variant bestämmer dess optogenetiska tillämpning.
De första upptäckta ChRs från Chlamydomonas reinhardtii och Volvox carteri är permeabla mot protoner, men också till monovalenta katjoner som natrium, kalium och i mindre utsträckning divalenta katjoner såsom kalcium och magnesium 11 , 12 , 13 . Idag har mer än 70 naturliga katjonledande kanalrhodopsiner (CCR) 14 , 15 , 16 , 17 och flera manipulerade varianter 18 , 19 , 20 med olika egenskaper såsom Fotokurrensstorlek, spektral känslighet, kinetik och katjon selektivitet är tillgängliga. I neurovetenskap, CCR aRe används för att aktivera celler och utlösande AP, lättade mikrobiella pumpar var de enda tillgängliga antagonisterna för att tysta neuroner i åratal. Under 2014 visade två grupper samtidigt att CCR kan omvandlas till anjonledande kanalrhodopsiner (ACR) genom förändring av polariteten längs den förmodade jonledande poren via molekylär teknik 9 , 21 . Därefter identifierades naturliga ACR i flera kryptofytealger 22 , 23 , 24 . Viktigast är att ljusaktivering av ACR medierar kloridströmmar i vuxna neuroner som tillåter hämning av neuronaktivitet vid mycket lägre ljusintensiteter än mikrobiella pumpar som endast transporterar enstaka laddningar per absorberad foton.
ChR-aktivitet kan adresseras direkt genom elektrofysiologiska patch-clamp-inspelningar av ljusinducerade strömmar i HEK293-celler. PlåstretTeknik utvecklades ursprungligen i slutet av 1970-talet 25 och ytterligare förbättrats av Hamill et al. , Vilket möjliggör registrering av enheten av strömmar från en liten cell (helcellsmodus) med hög strömupplösning och direkt styrning av membranspänningen 26 . Applicerad i cellodling ger denna teknik noggrann kontroll över de joniska och elektriska inspelningsförhållandena och möjliggör studier av jonselektivitet tillsammans med jonernas relativa bidrag till den totala strömmen. Här exemplifieras undersökningen av jonselektivitet för det anjonledande kanalhormoninet av Proteomonas sulcata ( Ps ACR1) 22 , 23 via inspelning av strömspänningsrelationer under olika extracellulära kloridkoncentrationer för att bevisa högkloridkonduktans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Figur 1: Inställning av patch-clamp. (1) ljuskälla, (2) optisk fiber, (3) programmerbar slutare, (4) digitaliserare, (5) slutardrivrutin, (6) förstärkare, (7) perfusionssystem, (8) persondator, , (10) faraday-bur, (11) mikroskopsteg, (12) perfusionsinlopp, (13) perfusionutlopp, (14) inspelningskammare, (15) vätskenivåsensor, (16) badelektrod med agarbro, Pipetthållare, (18) huvudsteg, (19) mikromanipulator, (20) inverterat mikroskop, (21) mikroskoplampa, (22) mikroskoplampans strömförsörjning, (23) vattenfyllt U-rör, (24) trefas Ventil, (25) anti-vibrationsbord, (26) CCD-kamera. ( A ) Fotografier och ( B ) schematisk representation av inställningen. Vänligen klicka här för att se en större version av tHans figur.
1. Inställning före inspelningar
| intra. | extra.1 | extra.2 | |
| Högklorid | Högklorid | Lågklorid | |
| C [mM] | C [mM] | C [mM] | |
| Na-ASP | 0 | 0 | 140 |
| NaCl | 110 | 140 | 0 |
| KCI | 1 | 1 | 1 |
| CsCl | 1 | 1 | 1 |
| CaCl2 | 2 | 2 | 2 |
| MgCl2 | 2 | 2 | 2 |
| HEPES | 10 | 10 | 10 |
| EGTA | 10 | 0 | 0 |
| pH | 7,2 | 7,2 | 7,2 |
| osmolaritet | 290 mOsm | 320 mOsm | 320 mOsm |
Tabell 1: Ionsammansättning av buffertlösningarna. Sammansättning av intracellulära (intra.) Och extracellulära (extra) buffertar för klorid-selektivitetsexperiment i HEK-celler. Förkortningar som användes: etylenglykoltetraättiksyra (EGTA), 4- (2-hydroxietyl) -1-piperazinetansulfonsyra (HEPES) och aspartat (ASP). Alla koncentrationer är i mM.
- Förbered inspelningslösningarna med jonkoncentrationer som anges i Tabell 1.
- Förbered 15 ml 2 M stamlösningar i ultratat vatten för MgCl2, CaCl2, KCl och CsCl.
- Väg de fasta komponenterna för 100 ml av den intracellulära och500 ml av de extracellulära buffrade lösningarna enligt tabell 1 i separata bägare och tillsätt därefter respektive mängd av de beredda stamlösningarna. Till exempel, för den intracellulära bufferten användes 0,3803 g (10 mM) EGTA, 0,2383 g (10 mM) HEPES och 0,6428 g (110 mM) NaCl och tillsätt 100 xl av 2 M MgCl2 och CaCl2 och 50 xl av 2 M KCl och CsCl stamlösningar.
- Tillsätt ultralätt vatten och försiktigt justera pH med syror och baser som inte stör mätningen, det vill säga utförs inte av ChR, såsom citronsyra och N-metyl-D-glukamin (NMG + ).
- Justera osmolariteten till 290 mOsm för intracellulär och till 320 mOsm för de extracellulära lösningarna med glukos.
Obs! Lite hyposmotiska intracellulära lösningar ökar framgångsgraden för patching 26 . - Sterilfiltrera alla lösningar genom 0,22 μm filter. Förvara lösningar vid 4 ° C i två veckorS eller frys vid -20 ° C för långvarig lagring.
- Beräkna vätskeförbindelsepotentialer och förbereda inspelningsprotokoll.
OBS: Byte av extracellulär kloridkoncentration efter att ha etablerat helcells-konfiguration orsakar en signifikant vätskeförbindelsepotential (LJP) som måste korrigeras 27 , 28 . LJP kan mätas direkt eller beräknas, här används det senare alternativet. I det här protokollet kommer onlinekorrigering att användas som kräver ett inspelningsprotokoll för varje extern buffert. För en större uppsättning externa lösningar rekommenderas dock en postkorrigering av LJP för att undvika felkorrigering.- Öppna krysspotentialkalkylatorn (JPC) 27 och öppna dialogrutan "Ny experiment". Välj sedan "Patch-clamp measurements". Välj "helcellsmätningar", "Standard saltlösningselektrod" och ange en temperatur på25 ° C. Mellan varje steg går du vidare genom att acceptera valet genom att trycka på "nästa" -knappen.
OBS: Experiment utförs vid en rumstemperatur på 25 ° C i ett luftkonditionerat laboratorium. Se till att buffertlösningarna har rumstemperatur innan experimenten påbörjas. För att variera provtemperaturen kan ett inkubationssteg eller kammare användas. Badtemperaturen kan mätas ofta med en termometer. - Tillsätt alla individuella anjon- och katjonkoncentrationer av den pipetterade lösningen och högkloridbufferten enligt de koncentrationer som anges i tabell 1 .
OBS: JPC kommer att beräkna ett LJP på -0,5 mV för startförhållandena. - Klicka på "New Bath Solution" för att ange den anjoniska och katjoniska kompositionen av lågkloridbufferten.
OBS! JPC beräknar nu en ny LJP på +12,6 mV enligt den ändrade extracellulära inspelningslösningen. - Förbered två LJP-korrigerade protokoll förTvå mätförhållanden genom att subtrahera det beräknade LJP från den applicerade hållpotentialen; -0,5 mV för den höga och +12,6 mV för lågkloridens yttre lösningar. Således börjar protokollen med -79,5 mV (högklorid) respektive -92,6 mV (låg klorid) för att erhålla en LJP-korrigerad starthållande potential på -80 mV i båda fallen.
OBS! Följande steg gäller för datainsamlingsprogrammet som nämns i materiallistan. - Öppna protokolleditorn i förvärvsprogrammet. Byt till "Mode" -menyn välj "Episodic stimulation" och inkludera 7 svep.
- Byt till "Waveform" -menyn i redigeraren och inkludera en 200 ms period med 0 mV hållpotential följt av en 2 s period med varierande hållbarhet som börjar vid -79,5 mV för högklorid. Inkludera en "Delta-nivå" på 20 mV för den andra perioden för att öka hållpotentialen med 20 mV i varje svep.
- Inom spänningsstegen i vågformen edItor applicera en 500 ms belysningsperiod med 540 nm ljus (3.10 mW / mm²). Ändra det "digitala bitmönstret" för den anslutna slutaren som styr ljuskällan för att vara aktiv 500 ms efter den andra perioden som beskrivits ovan (se 1.2.6).
OBS: Ljusintensiteten kan påverka biofysiska egenskaper hos kanalströmmar som amplitud eller inaktivering. Därför bör ljusdensiteter alltid rapporteras. För att mäta ljusstyrkan efter att ha passerat alla optik och täckglaset, använd en kalibrerad optometer. För att beräkna effektdensiteten bestämmer du det upplysta fältet för objektivet med en objektmikrometer och delar upp uppmätt ljusstyrka med det bestämda upplysta fältet. - Spara protokollet för högklorid extracellulär lösning. Ändra protokollet och byta ut den första nivån på hållbarheten med -92,6 mV (låg extern klorid). Spara detta andra protokoll för att mäta extrakylärt tillstånd med lågklorid.
- Lysinbeläggning av glasskyddsplattor enligt anpassat protokoll 29 .
- Placera flera 100 täckglas i en glas petriskål och tillsätt 250 ml HCl (1 N).
- Placera petriskålen med täckglasen på en linjär shaker och skaka vid 120 varv per minut i 72 timmar för att rengöra täckglasen och skölj därefter med ultralätt vatten för att neutralisera pH.
- Blötlägg dessa i en liten volym av 95% etanol för ytterligare rengöring.
ANMÄRKNING: Skyddslocken kan lagras i 70% etanol innan du fortsätter. Arbeta under laminärflödeskåpa för följande steg. - Med en Bunsen-brännare och pincett glider flamma varje lock och överför det till en ny petriskål.
- Inkubera glasskyddsglasen med en steril 50 μg / ml poly-D-lysinlösning under minst 1 h (eller över natten) vid rumstemperatur under skakning med en linjär skakning vid 150 rpm.
- Tvätta täckglasen med ultralätt vatten för att avlägsna överskott av poly-D-lysin.
- Sprid täckplattorna på sterilt papper för att torka i 10 minuter och exponera dem för UV-ljus för sterilisering (minst 20 minuter).
- Samla täckglasen i en steril petriskål täckt av aluminiumfolie tills användning.
- Förbered DNA av Ps ACRl-genen fuserad till mCherry med användning av standardmolekylära biologitekniker.
- Klon den humana kodonoptimerade gensekvensen som kodar för Ps ACR1 i en peGFP-C1-plasmid (CMV-promotor, kanamycinresistens) i ram med mCherry-fluoroforen med användning av restriktionsenzymer eller andra etablerade kloningsmetoder.
Obs! Andra fluoroforer kan också användas, men se till att de motsvarande filteruppsättningarna är tillgängliga för att observera deras fluorescens under mikroskopet i inställningen. - Transformera plasmid-DNA i kemokompetenta XL1Blue E. coli- celler via värmchock enligt standardprotokoll och plåta dem på agarplattor (30 μg / ml kanamycin) 30
- Nästa dag, ympa 4 ml lysogenybuljongmedium kompletterad med 30 μg / ml kanamycin med celler från enkla kolonier och inkubera dem över natten vid 37 ° C och 180 rpm i en inkubator.
- Efter inkubation över natten, rena plasmid-DNA från odlingarna med användning av ett kommersiellt tillgängligt kit (se materialtabell ) enligt tillverkarens instruktioner.
- Klon den humana kodonoptimerade gensekvensen som kodar för Ps ACR1 i en peGFP-C1-plasmid (CMV-promotor, kanamycinresistens) i ram med mCherry-fluoroforen med användning av restriktionsenzymer eller andra etablerade kloningsmetoder.
- Säd cellerna
OBS: Utför steg under en laminär flödeskåpa.- Placera upp till tre lysinbelagda glaslockssidor sida vid sida i en 35 mm petriskål.
OBS: Tryck försiktigt dem mot botten av skålen för att förhindra att du glider på varandra. - Frö 1,5 x 10 5 HEK-celler i 2 ml standard Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) i varje maträtt.
- Supplement all- trans retinal hosEn slutkoncentration av 1 uM. Växa cellerna i minst en dag innan du fortsätter med steg 1.6.
- Placera upp till tre lysinbelagda glaslockssidor sida vid sida i en 35 mm petriskål.
- Transient transfektera cellerna via lipofektion 31 .
- För varje cellrätter, bereda en lösning av 2 μg plasmid-DNA (som framställt i steg 1.4) i 250 μl DMEM utan FBS och 6 μl transfektionsreagens (se materialtabell ).
- Efter 15 min inkubation tillsätt försiktigt (droppvis) lösningen till cellerna.
- Förbered agarbroar
- Tillsätt 0,75 g agaros till 50 ml steril natriumkloridlösning (140 mM) och lösa upp den genom upphettning i en mikrovågsugn.
OBS: 2 - 3 M KCl för agarbroberedning minskar LJP ytterligare på grund av högre koncentration ( t.ex. konstant diffusion från bron) och lika rörlighet för K + och Cl - joner, men undviks för att minimera jon- (särskilt Cl) läckage In i t Han badlösning 32 . - Fyll 10 μl pipettspetsar (eller en slang med liten diameter) med flytande agaroslösningen med en spruta.
OBS: Undvik luftbubblor i bron. - När agarbroarna har kylts och stelnat, förvara dem i steril 140 mM natriumkloridlösning.
- Tillsätt 0,75 g agaros till 50 ml steril natriumkloridlösning (140 mM) och lösa upp den genom upphettning i en mikrovågsugn.
- Förbered inspelning och badelektroder.
- Ta bort silvertrådarna i badet och inspelningselektroden i patch-clamp-inställningen.
- Polera trådarna med sandpapper för att avlägsna silverklorid från tidigare experiment. Sänk den rena silvertråden i 3 M KCl och anslut den till en positiv pol på ett 1,5 V batteri för elektrolytbeläggning med silverklorid.
OBS! En nätaggregat kan användas istället för ett batteri.
- Dra patchpipetter med låg resistans (1,5-3,0 MΩ) från glaskapillärer med en mikropipettdragare och brandpannor enligt beskrivningen av Brown et al.Lass = "xref"> 33. Förvara pipetterna dammfria för måttdagen.
- Slå på alla inställningskomponenter för att värma upp till arbetstemperatur 30 min tidigare inspelningar. Se till att buffertarna är vid rumstemperatur.
2. Selectivity Measurements
- Starta inspelningarna 24 till 48 timmar efter övergående transfektion av cellerna som beskrivs i 1.6.
- Placera ett lock i mätkammaren och täta det med kisel för att förhindra läckage av den externa bufferten. Förvara petriskålen med de andra locket i en inkubator för nästa uppsättning experiment.
- Fyll kammaren noggrant med extracellulär buffert (hög [Cl - ]) för att förhindra att celler avlägsnas, placera det under mikroskopet och använd 40X-målet för cellvisualisering.
- Lägg en agarbro över badelektroden och placera den i kammaren tillsammans med vätskenivånsgivaren och badhandtagets perfusionutlopp.
- Byt exTracellulär lösning två gånger med 1 ml frisk extern lösning (hög [Cl - ]) för att avlägsna kvarvarande odlingsmedium och separerade celler.
- Ta cellerna i fokus och leta efter en transfekterad (fluorescerande) cell, som behöver isoleras från andra celler. Använd ett trippelfilterfilter och orange ljus (590 nm, bandbredd 15 nm, 100% intensitet) för att excitera och visualisera mCherry.
OBS! HEK-celler kan kopplas elektriskt till sina grannar genom gapskikt 34 vilket resulterar i låg membranresistens i hela cellkonfigurationen. - Fyll en av de drapade pipetterna med intracellulär lösning och avlägsna luftbubblor genom att vrida pipetten flera gånger.
- Montera pipetten på pipetthållaren och använd lite positivt tryck för att förhindra täppning av spetsen.
- Placera pipettens pipett under mikroskopet och navigera det nära cellen med hjälp av mikromekanipulatorn.
OBS! Följande steg gäller för aFörstärkare, datainsamling och utvärderingsprogram som nämns i materiallistan. - Starta "membrantestet" i datainsamlingsprogrammet och använd ett spänningssteg (testpuls, t.ex. 5 mV i 10 ms, baslinje vid 0 mV), manuellt eller automatiskt via specifik programvara med "badläge" under körning av "membranstest" I datainsamlingsprogrammet.
- Kontrollera att pipettmotståndet ligger i önskat område (1,5-3,0 MΩ).
- Nollförskjutningsströmmar genom att justera pipettpotentialen genom att vrida pipettens offsetvred vid förstärkaren medan man arbetar i "badläget" av "membranstestet".
- Upprätta en patch i hela cellkonfigurationen 26 .
OBSERVERA: Följande steg kräver applicering av positivt och negativt tryck som levereras till sidoporten på den använda pipetthållaren. Detta kan göras genom att använda antingen en spruta, via en munstycke eller en elektronisk konTrolled tryckregulator. I detta protokoll appliceras positivt och negativt tryck via ett munstycke.- Långsamt närma sig cellen med patchpipetten från toppen och lindra det positiva trycket direkt innan du rör det.
OBS! När spetsen är nära cellen kommer motståndet att stiga något; Detta indikeras av en reducerad storlek på testpulsen. - Ändra "membrantestet" från "badläge" till "patch-läge", sålunda hållpotentialen till cellernas förväntade vilopotential (-30 till -40 mV).
- I vissa fall bildas den cellbundna konfigurationen efter frisättning av positivt tryck (2.13.1), om inte försiktigt applicera negativt tryck för att hjälpa gigasbildning.
ANMÄRKNING: Cellbindad konfiguration är etablerad när testpulsen reduceras till två små kapacitiva toppar vid början och slutet av pulsen och membranmotståndet ligger i GΩ-intervallet. Negativa spänningar upp till -60 mV mIght underlätta gigasalbildning. - Kompensera pipettkapacitansen genom att vrida "pipettkapacitans kompensation" -knapparna för att få en platt respons av testpulsen.
- Bryt plåstret utan att förstöra tätningen genom att applicera korta pulser av negativt tryck eller negativt tryck med ökande styrka för att erhålla helcellsconformation.
OBS! Framgångsrikt övergång från cellbindad till helcells konfiguration indikeras av en ökning av kapacitiva toppar. - Applicera seriemotståndskompensation genom att ställa in helcellsparametern och kompensationsjusteringar av den använda förstärkaren för noggrann spänning av membranpotentialen till önskad hållspänning.
- Byt "membrantestet" till "helcells" -läget, i "Serie-motståndskompensation" -panelen aktivera "prediktion" och "korrigering" upp till 90% för att undvika överskott och svängning av det kapacitiva svaret, vrid hela cellenKompenseringsknappen på och justera helcellsparametrar med lämpliga frontpanelvred ("helcellsförmåga" och "serieresistens") på förstärkaren på ett iterativt sätt för att erhålla ett idealiskt platt testförseglingssvar.
OBS! För detaljerad beskrivning av seriemotståndskompensation och -korrigering hänvisas till förstärkarhandboken eller riktlinjen, eftersom detta förfarande varierar mellan olika tillverkare.
- Byt "membrantestet" till "helcells" -läget, i "Serie-motståndskompensation" -panelen aktivera "prediktion" och "korrigering" upp till 90% för att undvika överskott och svängning av det kapacitiva svaret, vrid hela cellenKompenseringsknappen på och justera helcellsparametrar med lämpliga frontpanelvred ("helcellsförmåga" och "serieresistens") på förstärkaren på ett iterativt sätt för att erhålla ett idealiskt platt testförseglingssvar.
- Efter att ha etablerat helcells konfiguration vänta minst 2 minuter före inspelning för att säkerställa tillräcklig ersättning av intracellulär lösning genom patchpipetten 35 .
- Långsamt närma sig cellen med patchpipetten från toppen och lindra det positiva trycket direkt innan du rör det.
- Registrera ljusinducerade strömmar vid olika hållpotentialer genom att använda de protokoll som tidigare var inställda (i 1.2).
- Byt ut den extracellulära bufferten till låg [Cl - ] i kammaren minst fem gånger utan att förstöra plåstret och spela in en annan strömspänningsrelation ( se steg 1.2) vid tHan ny kloridkoncentration.
OBS! Ett perfusionssystem för automatiserad buffertutbyte underlättar denna process, men är inte nödvändig. - Upprepa 2,15. För att varje joniskt tillstånd ska testas, men upprepade gånger kontrollera kvaliteten på plåstret mellan mätningarna med ett "membranstest" som beskrivits ovan.
ANMÄRKNING: För att garantera noggrann membranspänning och stabil intracellulär jonkomposition bör membransäkerheten vara över 500 MΩ, medan åtkomstmotståndet inte får överstiga 10 MΩ, se . 2.12.6). Glöm inte att ersätta helcellsparameterns kompensation för membranstestet. - Upprepa 2.2. Till 2,15. För flera celler, men ta en ny skyddslista för varje testserie för att säkerställa hälsan hos celler.
3. Datautvärdering
- Justera baslinjen för varje aktuellt spår genom att subtrahera medelströmmen före belysning.
- Beräkna den genomsnittliga stationära fotokretsen I s (
- Upprepa steg 3.1) och 3.2) för alla testade förhållanden och olika celler.
- Rita de bestämda fotokromenna mot respektive hållpotential.
OBS! Om flera mätningar är genomsnittliga kan individuella inspelningar normaliseras till ett angivet tillstånd eller cellens kapacitans. - Korsningen av strömspänningsrelationen med spänningsaxeln representerar reverseringspotentialen (nätspänningen är noll). Bestäm det genom linjär interpolering mellan de två närliggande datapunkterna.
OBS! Om det inte finns någon polaritetsinversion av fotokurrenter extrapoleras linjärt från de två sista punkterna nära noll för att få en approximation av skärningspunkten. - Medelvärdet av den bestämda rEversala potentialer för samma förhållanden och plottar dem mot kloridkoncentrationen av de externa buffertlösningarna ( se figur 2B ).
- Öppna krysspotentialkalkylatorn (JPC) 27 och öppna dialogrutan "Ny experiment". Välj sedan "Patch-clamp measurements". Välj "helcellsmätningar", "Standard saltlösningselektrod" och ange en temperatur på25 ° C. Mellan varje steg går du vidare genom att acceptera valet genom att trycka på "nästa" -knappen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 visar representativa resultat erhållna från mätningar som följer det beskrivna protokollet. Under ljuset med grönt ljus har Ps ACR1 en snabb övergående ström som snabbt faller till en stationär strömnivå. När ljuset är avstängt försvinner fotokretsen till noll inom millisekunder ( figur 2A ). Utbyte av extracellulärkloridkoncentrationen orsakar en förskjutning av den reverseringspotential som kan ses direkt i de förvärvade fotokurrensspåren. Utvärdering av reverseringspotentialer från multipla mätningar kvantifierar det dramatiska reverseringspotentialskiftet som orsakas av variationen av den yttre kloridkoncentrationen ( Figur 2B ). Påtagligt motsvarar uppmätta reverseringspotentialer direkt beräknade Nernst-potentialer för klorid ( Figur 2C ) som bekräftar högklorid-selektiviteten hos Ps ACR1.
T "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figur 2: Klorid selektivitet av Ps ACR1 . ( A ) Representativa nuvarande spår av Ps ACRl i HEK293-celler. Intracellulärkloridkoncentrationen hölls vid 120 mM, medan extracellulär koncentration varierade från 150 mM (grön) till 10 mM (lila) klorid genom partiell ersättning av NaCl med Na-aspartat. Hållpotentialen ökades i 20 mV steg från -80 mV till +40 mV (LJP korrigerad). ( B ) Medelvärda strömspänningsrelationer (n = 6 som motsvarar villkoren i A). ( C ) Reversionspotentialer (mittlinjer anger medianer, lådgränser anger 25 och 75 procentenheter, whiskers sträcker sig 2 gånger standardavvikelsen och cirklar indikerar enstaka datapunkter) extraherade från strömspänningsrelationerna. För högkloridkoncentrationenDition (grön) värdet linjärt interpolerade mellan -20 mV och 0 mV hållpotential, medan värdet linjärt extrapolerades över +40 mV (lila streckad linje, panel B). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bestämning av reverseringspotentialer vid definierade joniska och elektriska betingelser ger information om jonarten transporterad efter ljusaktivering av ChRs. Om exklusivt en jonart varieras i ett komplext fysiologiskt medium och de erhållna reverseringspotentialskiften enligt den teoretiska Nernst-potentialen är denna jonart den enda transporterade.
För ChRs är reverseringspotentialskiftet vanligen mindre uttalade än förväntat från Nernst-ekvationen på grund av permeabilitet för olika jonarter samt konkurrens bland genomförda joner. I det här fallet blir situationen mer komplex och alla potentiellt genomförda joner måste bytas separat och kräva olika mätlösningar. Dessutom är de flesta CCR och de första artificiella ACR 9 , 10 , 21 ledande för protoner men varierande protonkoncentraNing kräver en särskilt noggrann analys, eftersom protonkoncentrationen inte bara kan skifta omvändningspotentialer men också kan påverka jonledningsförmågan 9 , fotokurrentkinetiken 21 , 36 och spektral ljuskänslighet 11 , 37 på grund av förändring av vätebindningsnätverk, protoneringstillståndet hos Individuella rester och sekundär struktur förändras. Protonkonduktivitet kan åtgärdas genom att reducera koncentrationer av alla andra potentiellt genomförda joner, såsom Na + , Ca 2+ eller Cl - samtidigt som pH-värdet hålls konstant för att undvika proteinförändringar som nämns ovan. Ej genomförda substitut är vanligtvis skrymmande, laddade molekyler som NMG + för katjoner 12 och glukonat, 2- ( N- morfolin) etansulfonat (MES-) eller aspartat för anjoner. Jämförande reverseringspotential i olika iOniska lösningar tillåter sedan beräkningen av de relativa jonpermeabiliteterna vid jämviktsbetingelser av Goldman-Hodgkin-Katz-spänningsekvationen. Kvantifiering av det exakta bidraget från olika joner till nätfotokurrenter med tanke på jonkonkurrens utöver jämviktsförhållanden kräver emellertid komplexa matematiska modeller 12 , 38 .
Att känna till sammansättningen av joner som transporteras av ChRs bidrar till att belysa eventuella biverkningar som härrör från ChR-applikationen, särskilt i ett neurofysiologiskt sammanhang. Till exempel kan förlängd ChR-aktivering orsaka intracellulär försurning 39 eller genomförd-Ca2 + kan utlösa synaptisk frisättning och andra budbärarvägar 40 . Eftersom celler vanligtvis är tätt packade i vävnader kan aktivering av mikrobiella rhodopsiner inte bara påverka den intracellulära jonkompositionen utan även det extracellulära lumenet och på så sätt påverka nGrannceller 41 .
Trots jonselektivitet är andra biofysiska egenskaper hos ChRs som fotokurrent amplituder, inaktivering, spektral eller ljuskänslighet och kinetiska egenskaper ofta av intresse för att utföra, designa och tolka experiment som involverar optogenetiska tekniker. Några av dessa egenskaper kan också bestämmas från protokollet ovan som beskrivits någon annanstans 18 , 37 , 42 . För att undersöka ljuskänsligheten hos den ChR-uttryckande cellen kan ljusintensiteten varieras genom att justera ljuskällans kraft eller genom att dämpa aktiveringsljuset med neutrala densitetsfilter. För att erhålla spektral känslighet behövs en polychromatisk ljuskälla och intensiteterna måste anpassas till lika fotonflöde och bandbredd för alla våglängder. Högintensitetsspektra liknar bara absorptionsspektra hos fotoreceptorn om korta ljuspulser ellerLaserfläckar används, annars kan anpassningsfenomen och fotokemiska bakreaktioner uppstå. Återhämtningen från delvis inaktiverad till fullt aktiv ChR (övergripande fotocykelomsättningstid) kan undersökas genom att man tillämpar ett dubbelpulsprotokoll med ökande mörka intervaller mellan de två ljuspulserna. De biofysiska egenskaperna hos ChRs som diskuteras ovan är viktiga för att välja en lämplig ChR som matchar de experimentella behoven 40 .
Att avleda dessa biofysiska egenskaper genom elektrofysiologiska tekniker liknar direkt proteinfunktionen, som knappt omfattas av spektroskopiska metoder. Efter framgångsrik inrättande av spänningsklemmemätningar kan tekniken kombineras med proteintekniska tillvägagångssätt som platsriktad mutagenes 9 , 11 , 43 , 44 , helix-shuffling 37 ,
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi tackar Maila Reh, Tharsana Tharmalingam och särskilt Altina Klein för utmärkt tekniskt bistånd. Detta arbete stöddes av den tyska forskningsstiftelsen (DFG) (SFB1078 B2, FOR1279 SPP1665 till PH) och Cluster of Excellence Unifying Concepts i Catalysis, UniCat, BIG-NSE (JV) och E4 (PH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK293 cells | Sigma Aldrich | 85120602 | Human embryonic kidney cells |
| Retinal | Sigma Aldrich | R2500 | all-trans retinal |
| FuGENE HD | Promega | E2312 | Transfection reagent |
| DMEM | Biochrome | FG 0445 | Dulbecco's Modified Eagle Medium |
| Agarose | Roth | 3810 | Agar bridges |
| CaCl2 | Roth | 5239 | CaCl2 2H2O |
| CsCl | Biomol | 2452 | |
| EGTA | Roth | 3054 | |
| FBS | Biochrome | S0615 | Cell culture |
| Glucose | Roth | HN06 | D(+)-Glucose |
| KCl | Roth | 6781 | |
| MgCl2 | Roth | 2189 | MgCl2 6H2O |
| NaCl | Roth | 3957 | |
| NMG | Sigma Aldrich | M2004 | N-Methyl-D-glucamine |
| Na-Aspartate | Sigma Aldrich | A6683 | L-Aspartic acid sodium salt monohydrate |
| Citric acid | Roth | 6490 | |
| AgeI | ThermoFischerScientific | ER1462 | Restriction enzyme |
| XhoI | ThermoFischerScientific | ER0695 | Restriction enzyme |
| NheI | ThermoFischerScientific | ER0975 | Restriction enzyme |
| XL1Blue E. coli | Agilent Technologies | 200249 | Chemocompetent E. coli |
| Kanamycin | Roth | T832 | |
| Lysogeny broth medium | Roth | X964 | |
| Agar-Agar | Roth | 6494 | Agar plates |
| Plasmid purification kit | Marchery-Nagel | 740727.25 | |
| Penicilin/Streptomycin | Biochrome | A 2213 | Cell culture |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma Aldrich | P6407-5MG | Cover slip coating |
| Microforge | Custom made | Fire polishing | |
| Serological pipettes | TPP | Different sizes | |
| Clean bench | Kojair | Biowizard SL130 | |
| Stirrer | IKA | RCT classic | |
| Silver wire | Science Products | AG-T25; AG-T10 | Electrodes, 0.64 mm (bath); 0.25 mm (electrode) |
| pH-meter | Knick | 765 Calimetric | |
| Osmometer | Vogel | OM 815 | |
| Microscope | Carl Zeiss | ID03 | Fire polishing |
| CO2 incubator | Binder | CB150 | |
| Cell culture dishes | TPP | 93040 | 34 mm internal diameter |
| Cover slips | Roth | P232 | 15 mm diameter |
| Thermometer | Rössel Messtechnik | MTM12 | |
| Beamsplitter | Chroma | 21011 | 90/10 transmission |
| Pipette holder | ALA Scientific Instruments | PPH-1P-AXU-0-1.5 | |
| Headstage | Molecular Devices | CV203BU | |
| Amplifier | Molecular Devices | AxoPatch200B | |
| Digitizer | Molecular Devices | DigiData1400 | Digital analog converter |
| Lightsource | TILL Photonics | Polychrome V | Set to 540 nm full intensity |
| Microscope | Carl Zeiss | Axiovert 100 | |
| Shutter | Vincent Associates | VS25 | |
| Shutter driver | Vincent Associates | VCM-D1 | |
| Glass capilarries | Warner Instruments | G150F-3 | Boresilicate capillaries with fire polished ends OD 1.5 mm ID 0.86 mm |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P1000 | |
| Bath handler | Lorenz Messgerätebau | MPCU | |
| Tripleband filterset | Chroma | 69008 | Fluorescence filter ECFP/EYFP/mCherry |
| CCD camera | Watec | Wat-221SCCD | |
| Optometer | Gigahertz Optik | P9710 | Measure light intensities |
| Objective | Carl Zeiss | 421462-9900-000 | W Plan-Apochromat 40X/1.0 DIC |
| Micromanipulator | Scientifica | PatchStar | |
| Recording chamber | Custom made | ||
| Power supply | Manson | HCS-3202 | Avoids electrical noise from microscope built-in power supply |
| Vibration isolated table | Newport | M-VW-3636-OPT-01 | |
| Faraday cage | Custom made or any commercial matching table | ||
| Hoses | Any comercial; e.g. Roth | Different sizes and materials for bath handling and application of pipette pressure; agar bridges | |
| Linear shaker | Sunlab Instruments | SU 1000 | |
| Liquid junction potential calculator | Molecular Devices or directly from Peter H. Barry | Program is included in the Clampex aquisition software or can be obtained from p.barry@unsw.edu.au | |
| Data acquisition software | Molecular Devices | Clampex 10.X | |
| Data evaluation software | Molecular Devices | Clampfit 10.X | |
| PsACR1 | GenBank or Addgene | KF992074.1 or Addgene plasmid #85465 | Gene encoding for PsACR1 |
| Amplifier guide | Molecular Devices | The Axon Guide |
References
- Hegemann, P. Algal sensory photoreceptors. Annu. Rev. Plant Biol. 59, 167-189 (2008).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae. Science. 296 (5577), 2395-2398 (2002).
- Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of contractile function in skeletal muscle. Nat. Commun. 6 (7153), 1-8 (2015).
- Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo. Nat. Methods. 7 (11), 897-900 (2010).
- Zhang, F., et al. The microbial opsin family of optogenetic tools. Cell. 147 (7), 1446-1457 (2011).
- Nagel, G., et al. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr. Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
- Li, X., et al. Fast noninvasive activation and inhibition of neural and network activity by vertebrate rhodopsin and green algae channelrhodopsin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (49), 17816-17821 (2005).
- Ishizuka, T., Kakuda, M., Araki, R., Yawo, H. Kinetic evaluation of photosensitivity in genetically engineered neurons expressing green algae light-gated channels. Neurosci. Res. 54 (2), 85-94 (2006).
- Wietek, J., et al. Conversion of channelrhodopsin into a light-gated chloride channel. Science. 344 (6182), 409-412 (2014).
- Berndt, A., et al. Structural foundations of optogenetics: Determinants of channelrhodopsin ion selectivity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 113 (4), 822-829 (2016).
- Tsunoda, S. P., Hegemann, P. Glu 87 of Channelrhodopsin-1 Causes pH-dependent Color Tuning and Fast Photocurrent Inactivation. Photochem. Photobiol. 85 (2), 564-569 (2009).
- Schneider, F., Gradmann, D., Hegemann, P. Ion selectivity and competition in channelrhodopsins. Biophys. J. 105 (1), 91-100 (2013).
- Prigge, M. Über die elektrophysiologische Untersuchung und Entwicklung von farbverschobenen Kanalrhodopsinchimären aus der Grünalge Volvox carteri. , Diss. Humboldt-Universität zu Berlin. Available from: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:11-100203476 (2012).
- Govorunova, E. G., Spudich, E. N., Lane, C. E., Sineshchekov, O. A., Spudich, J. L. New Channelrhodopsin with a Red-Shifted Spectrum and Rapid Kinetics from Mesostigma viride. MBio. 2 (3), 1-9 (2011).
- Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Li, H., Janz, R., Spudich, J. L. Characterization of a highly efficient blue-shifted channelrhodopsin from the marine alga Platymonas subcordiformis. J. Biol. Chem. 288 (41), 29911-29922 (2013).
- Hou, S. -Y., et al. Diversity of Chlamydomonas Channelrhodopsins. Photochem. Photobiol. 88 (1), 119-128 (2012).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat. Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophys. J. 96 (5), 1803-1814 (2009).
- Yizhar, O., et al. Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction. Nature. 477 (7363), 171-178 (2011).
- Berndt, A., Yizhar, O., Gunaydin, L. a, Hegemann, P., Deisseroth, K. Bi-stable neural state switches. Nat. Neurosci. 12 (2), 229-234 (2009).
- Berndt, A., Lee, S. Y., Ramakrishnan, C., Deisseroth, K. Structure-Guided Transformation of Channelrhodopsin into a Light-Activated Chloride Channel. Science. 344 (6182), 420-424 (2014).
- Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Spudich, J. L. Proteomonas sulcata ACR1: A Fast Anion Channelrhodopsin. Photochem. Photobiol. 92 (2), 257-263 (2016).
- Wietek, J., Broser, M., Krause, B. S., Hegemann, P. Identification of a Natural Green Light Absorbing Chloride Conducting Channelrhodopsin from Proteomonas sulcata. J. Biol. Chem. 291 (8), 4121-4127 (2016).
- Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Janz, R., Liu, X., Spudich, J. L. Natural light-gated anion channels: A family of microbial rhodopsins for advanced optogenetics. Science. 349 (6248), 647-650 (2015).
- Neher, E., Sakmann, B., Steinbach, J. H. The extracellular patch clamp: A method for resolving currents through individual open channels in biological membranes. Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. 375 (2), 219-228 (1978).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. Arch. Eur. J. Physiol. 391 (2), 85-100 (1981).
- Barry, P. H. JPCalc, a software package for calculating liquid junction potential corrections in patch-clamp, intracellular, epithelial and bilayer measurements and for correcting junction potential measurements. J. Neurosci. Methods. 51 (1), 107-116 (1994).
- Amtmann, A., Sanders, D. A unified procedure for the correction of liquid junction potentials in patch clamp experiments on endo- and plasma membranes. J. Exp. Bot. 48, (Special) 361-364 (1997).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).
- Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. J. Vis. Exp. (63), e1-e18 (2012).
- Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 84 (21), 7413-7417 (1987).
- Halliwell, J., Whitaker, M., Ogden, D. Using microelectrodes. Microelectrode Tech. Plymouth Work. Handb. 3, 1-15 (1949).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J. Vis. Exp. (20), e1-e2 (2008).
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
- Pusch, M., Neher, E. Rates of diffusional exchange between small cells and a measuring patch pipette. Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. 411 (2), 204-211 (1988).
- Berndt, A. Mechanismus und anwendungsbezogene Optimierung von Channelrhodopsin-2. , Diss Humboldt-Universität zu Berlin. Available from: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:11-100191266 (2011).
- Prigge, M., et al. Color-tuned channelrhodopsins for multiwavelength optogenetics. J. Biol. Chem. 287 (38), 31804-31812 (2012).
- Gradmann, D., Berndt, A., Schneider, F., Hegemann, P. Rectification of the channelrhodopsin early conductance. Biophys. J. 101 (5), 1057-1068 (2011).
- Beppu, K., et al. Optogenetic countering of glial acidosis suppresses glial glutamate release and ischemic brain damage. Neuron. 81 (2), 314-320 (2014).
- Wietek, J., Prigge, M. Enhancing Channelrhodopsins: An Overview. Methods Mol. Biol. 1408, 141-165 (2016).
- Ferenczi, E. A., et al. Optogenetic approaches addressing extracellular modulation of neural excitability. Sci. Rep. 6, 1-20 (2016).
- Zhang, F., et al. Red-shifted optogenetic excitation: a tool for fast neural control derived from Volvox carteri. Nat. Neurosci. 11 (6), 631-633 (2008).
- Sugiyama, Y., et al. Photocurrent attenuation by a single polar-to-nonpolar point mutation of channelrhodopsin-2. Photochem. Photobiol. Sci. 8 (3), 328-336 (2009).
- Kleinlogel, S., et al. Ultra light-sensitive and fast neuronal activation with the Ca2+-permeable channelrhodopsin CatCh. Nat. Neurosci. 14 (4), 513-518 (2011).
- Wang, H., et al. Molecular determinants differentiating photocurrent properties of two channelrhodopsins from chlamydomonas. J. Biol. Chem. 284 (9), 5685-5696 (2009).
- Gradinaru, V., Thompson, K. R., Deisseroth, K. eNpHR: a Natronomonas halorhodopsin enhanced for optogenetic applications. Brain Cell Biol. 36 (1-4), 129-139 (2008).
- Berglund, K., et al. Luminopsins integrate opto- and chemogenetics by using physical and biological light sources for opsin activation. Proc. Natl. Acad. Sci. 113 (3), 358-367 (2016).
