Abstract
Det siste tiåret har kanalrhodopsiner blitt uunnværlig i nevrovitenskapelig forskning, der de brukes som verktøy for ikke-invasiv manipulering av elektriske prosesser i målceller. I denne sammenheng er ion selektivitet av en kanalrhodopsin av særlig betydning. Denne artikkelen beskriver undersøkelsen av klorid-selektivitet for en nylig identifisert anion-ledende kanalhodopsin av Proteomonas sulcata via elektrofysiologiske patch-clamp-opptak på HEK293-celler. Forsøksprosedyren for måling av lysgatede fotokrenser krever en rask omskiftelig - ideelt monokromatisk - lyskilde koblet inn i mikroskopet av en ellers vanlig patch-clamp-oppsett. Preparative prosedyrer før forsøket er skissert med fremstilling av bufrede løsninger, overveielser på væskeforbindelsespotensialer, seeding og transfeksjon av celler og trekking av patchpipetter. Den faktiske opptak av strømspenningsforholdS for å bestemme reverseringspotensialene for forskjellige kloridkonsentrasjoner finner sted 24 timer til 48 timer etter transfeksjon. Til slutt analyseres elektrofysiologiske data i forhold til teoretiske hensyn til kloridledning.
Introduction
Channelrhodopsins (ChR) er lette gatedjonskanaler som forekommer i øyepunktet av motile grønne alger, og fungerer som primære fotosensorer for fototaksier og fobiske responser 1 . Siden deres første beskrivelse i 2002 2 har ChRs banet vei for det fremvoksende feltet av optogenetikk og kan brukes i en rekke eksklusive celler, for eksempel innenfor skjelettmuskler, hjerte eller hjerne 3 , 4 , 5 . Ekspresjon av ChRs i målceller resulterer i lysstyrbar ionpermeabilitet av den respektive cellen. I en nevronkontekst tillater dette aktivering 6 , 7 , 8 eller inhibering 9 , 10 av potensialpotensial (AP) avfyring - avhengig av den utførte ion - med romlige og tidsmessigePresisjon av lys understreker hvordan ion-selektiviteten til en ChR-variant bestemmer dens optogenetiske anvendelse.
De første oppdagede ChRs fra Chlamydomonas reinhardtii og Volvox carteri er permeable mot protoner, men også til monovalente kationer som natrium, kalium og i mindre grad divalente kationer som kalsium og magnesium 11 , 12 , 13 . I dag har mer enn 70 naturlige kation-ledende kanalrhodopsiner (CCR) 14 , 15 , 16 , 17 og flere konstruerte varianter 18 , 19 , 20 med forskjellige egenskaper som f.eks. Fotokurrensstørrelse, spektral følsomhet, kinetikk og kation selektivitet er tilgjengelig. Mens i nevrovitenskap, er CCR aBrukes til å aktivere celler og utløse AP, var lysdrevne mikrobielle pumper de eneste tilgjengelige antagonister for å silere nevroner i årevis. I 2014 viste to grupper samtidig at CCRer kan omdannes til anion-ledende kanalrhodopsiner (ACR) ved endring av polariteten langs den formodnede ionledende pore via molekylærteknikk 9 , 21 . Deretter ble naturlige ACRer identifisert i flere kryptofyte alger 22 , 23 , 24 . Viktigst er at lysaktivering av ACRer medierer kloridstrømmer i voksne neuroner som tillater inhibering av nevronaktivitet ved mye lavere lysintensiteter enn mikrobielle pumper som bare transporterer enkeltladninger per absorbert foton.
ChR-aktivitet kan adresseres direkte ved elektrofysiologiske patch-clamp-opptak av lysinducerte strømmer i HEK293-celler. LåsklemmenTeknikken ble opprinnelig utviklet på slutten av 1970-tallet og ble ytterligere forbedret av Hamill et al. , Slik at innspillingen av enheten av strømmer fra en liten celle (helcelle-modus) med høy strømoppløsning og direkte styring av membranspenningen 26 . Anvendt i cellekultur, gir denne teknikken nøyaktig kontroll over ioniske og elektriske opptakssituasjoner, og muliggjør å studere ionselektivitet sammen med det relative bidrag av ionene til totalstrømmen. Her eksemplifiserer vi undersøkelsen av ion selektivitet for anion-ledende kanalrhodopsin av Proteomonas sulcata ( Ps ACR1) 22 , 23 via opptak av strømspenningsforhold under forskjellige ekstracellulære kloridkonsentrasjoner for å bevise høy kloridkonduktans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Figur 1: Patch-clamp Setup. (1) lyskilde, (2) optisk fiber, (3) programmerbar lukker, (4) digitizer, (5) lukkerdriver, (6) forsterker, (7) perfusjonssystem, , (10) faraday bur, (11) mikroskop stadium, (12) perfusjon innløp, (13) perfusjon utløp, (14) opptakskammer, (15) fluid nivå sensor, (16) badelektrode med agar bro, Pipettholder, (18) headstage, (19) mikromanipulator, (20) invertert mikroskop, (21) mikroskoplampehus, (22) mikroskoplampeforsyning, (23) vannfylt U-rør, (24) treveis Ventil, (25) anti-vibrasjonstabell, (26) CCD kamera. ( A ) Fotografier og ( B ) skjematisk representasjon av oppsettet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av tHans figur.
1. Oppsett før opptak
| intra. | extra.1 | extra.2 | |
| Høy klorid | Høy klorid | Lavklorid | |
| C [mM] | C [mM] | C [mM] | |
| Na-ASP | 0 | 0 | 140 |
| NaCl | 110 | 140 | 0 |
| KCl | 1 | 1 | 1 |
| CsCl | 1 | 1 | 1 |
| CaCl2 | 2 | 2 | 2 |
| MgCl2 | 2 | 2 | 2 |
| HEPES | 10 | 10 | 10 |
| EGTA | 10 | 0 | 0 |
| pH- | 7.2 | 7.2 | 7.2 |
| osmolaritet | 290 mOsm | 320 mOsm | 320 mOsm |
Tabell 1: Jonisk sammensetning av bufferte løsninger. Sammensetning av intracellulære (intra.) Og ekstracellulære (ekstra.) Buffere for klorid selektivitetsforsøk i HEK-celler. Forkortelser som brukes: etylenglykoltetraeddiksyre (EGTA), 4- (2-hydroksyetyl) -1-piperazinetansulfonsyre (HEPES) og aspartat (ASP). Alle konsentrasjoner er i mM.
- Forbered opptaksløsningene med ionkoncentrasjoner som angitt i tabell 1.
- Tilbered 15 ml 2 M stamopløsninger i ultralitt vann for MgCl2, CaCl2, KCl og CsCl.
- Veid de faste komponentene for 100 ml av den intracellulære og500 ml av de ekstracellulære bufrede løsningene i henhold til tabell 1 i separate beger og tilsett den respektive mengde av de beregnede stamløsninger etterpå. For eksempel, for den intracellulære buffer, bruk 0,3803 g (10 mM) EGTA, 0,2383 g (10 mM) HEPES og 0,6428 g (110 mM) NaCl og tilsett 100 ul av 2 M MgCl2 og CaCl2 og 50 μl av 2 M KCl og CsCl stamopløsninger.
- Tilsett ultralitt vann og nøye juster pH med syrer og baser, som ikke forstyrrer måling, det vil si ikke utført av ChR, som sitronsyre og N-metyl-D-glukamin (NMG + ).
- Juster osmolariteten til 290 mOsm for intracellulær og til 320 mOsm for de ekstracellulære løsningene med glukose.
Merk: Litt hypoosmotiske intracellulære løsninger øker suksessgraden av patching 26 . - Sterilfiltrer alle løsninger gjennom 0,22 μm filter. Oppbevar løsninger ved 4 ° C i to ukerS eller frys ved -20 ° C for langtidsoppbevaring.
- Beregn væskeovergangspotensialer og lag forberedelsesprotokoller.
MERK: Endring av ekstracellulær kloridkonsentrasjon etter etablering av helcellekonfigurasjon forårsaker et signifikant flytende krysspotensial (LJP) som må korrigeres 27 , 28 . LJPs kan måles eller beregnes direkte, her brukes sistnevnte alternativ. I denne protokollen vil onlinekorrigering bli brukt, krevende en opptaksprotokoll for hver ekstern buffer. For et større sett med eksterne løsninger anbefales imidlertid en postkorrigering av LJP å unngå falsk korreksjon.- Åpne krysspotensialkalkulatoren (JPC) 27 og åpne dialogboksen "Ny eksperiment". Velg deretter "Patch-klemme målinger". Velg "helcellemålinger", "Standard saltløsningselektrode" og angi en temperatur på25 ° C. Mellom hvert steg går du videre ved å akseptere valget ved å trykke på "neste" -knappen.
MERK: Eksperimenter utføres ved romtemperatur på 25 ° C i et luftkondisjonert laboratorium. Forsikre deg om at bufferløsninger har romtemperatur før du starter eksperimenter. For å variere prøvetemperaturen kan et inkubasjonstrinn eller kammer brukes. Badtemperaturen kan ofte måles med et termometer. - Tilsett alle individuelle anion- og kationkonsentrasjoner av den pipetterte løsningen og høykloridbufferen i henhold til konsentrasjoner oppført i tabell 1 .
MERK: JPC vil beregne et LJP på -0,5 mV for startforholdene. - Klikk på "New Bath Solution" for å gå inn i den anioniske og kationiske sammensetningen av lavkloridbufferen.
MERK: JPC vil nå beregne et nytt LJP på +12,6 mV i henhold til den endrede ekstracellulære opptaksløsningen. - Klargjør to LJP-korrigerte protokoller forTo måleforhold ved å subtrahere det beregnede LJP fra det påførte holdepotensialet; -0,5 mV for høye og +12,6 mV for de lave kloridens eksterne løsninger. Protokollene starter således med henholdsvis -79,5 mV (høyklorid) og -92,6 mV (lavklorid) for å oppnå et LJP-korrigert startholdingspotensial på -80 mV i begge tilfeller.
MERK: Følgende trinn gjelder for datainnsamlingsprogramvaren som er nevnt i materialelisten. - Åpne protokolleditoren i oppkjøpsprogramvaren. Bytt til "Mode" -menyen velg "Episodic stimulation" og inkludere 7 feier.
- Bytt til "Waveform" -menyen i redigeringsprogrammet og inkludere en 200 ms periode med 0 mV holdingspotensial etterfulgt av en 2 s periode med varierende holdingspotensial som starter ved -79,5 mV for høyklorid. Inkluder et "Delta nivå" på 20 mV for den andre perioden for å øke holdepotensialet med 20 mV i hvert feie.
- Innenfor spenningstrinnene til bølgeformen edItor gjelder en belysning på 500 ms med 540 nm lys (3.10 mW / mm²). For å gjøre det, bytt det "digitale bitmønsteret" til den tilkoblede lukkeren som styrer lyskilden for å være aktiv 500 ms etter den andre perioden som er beskrevet ovenfor (se 1.2.6).
MERK: Lysintensiteten kan påvirke biofysiske egenskaper av kanalstrømmer som amplitude eller inaktivering. Derfor bør lysdensiteter alltid rapporteres. For å måle lyskraften etter å ha passert gjennom all optikk og dekselglasset, bruk et kalibrert optometer. For å beregne effektdensiteten skal du bestemme det opplyste feltet for objektivet med en objektmikrometer og dele den målte lysstyrken med det bestemte belysede feltet. - Lagre protokollen for ekstrakolulær løsning med høy klorid. Endre protokollen og erstatt holdingspotensialet på første nivå med -92,6 mV (lavt eksternklorid). Lagre denne andre protokollen for å måle ekstracellulær tilstanden med lav klorid.
- Lysin-belegget av glassdeksel glider som per tilpasset protokoll 29 .
- Plasser flere 100 dekselglass i en glass petriskål og tilsett 250 ml HCl (1 N).
- Plasser petriskålen med dekselet på en lineær rister og rist ved 120 rpm i 72 timer for å rengjøre dekselet og deretter skyll med ultralitt vann for å nøytralisere pH.
- Soak disse i et lite volum på 95% etanol for videre rengjøring.
MERK: Rene dekselglass kan lagres i 70% etanol før du fortsetter. Arbeid under laminær hette for følgende trinn. - Ved å bruke en Bunsen-brenner og pincett, flamme hvert deksel, og overfør den til en ny petriskål.
- Inkubér glassdekselglassene med en steril 50 μg / ml poly-D-lysinløsning i minst 1 time (eller over natten) ved romtemperatur under risting med en lineær rysting ved 150 rpm.
- Vask dekselet med ultrapure vann for å fjerne overflødig poly-D-lysin.
- Spred dekselet på sterilt papir for å tørke i 10 minutter, og avslør dem til UV-lys for sterilisering (minst 20 minutter).
- Samle dekselet i en steril petriskål som er dekket av aluminiumsfolie til bruk.
- Klargjør DNA fra Ps ACR1 genet fusjonert til mCherry ved bruk av standard molekylærbiologi teknikker.
- Klon den humane kodonoptimaliserte gen-sekvensen som koder for Ps ACR1 i et peGFP-C1-plasmid (CMV-promotor, kanamycinresistens) i ramme med mCherry-fluoroforet ved hjelp av restriksjonsenzymer eller andre etablerte kloningsmetoder.
Merk: Andre fluorforer kan også brukes, men sørg for at de tilhørende filtersettene er tilgjengelige for å observere fluorescens under mikroskopet i oppsettet. - Transform plasmid-DNA til kjemokompetente XL1Blue E. coli- celler via varmestokk som i standardprotokoll og plater dem på agarplater (30 μg / ml kanamycin) 30
- Neste dag, inokuler 4 ml lysogen-kjøttmedium tilsatt 30 μg / ml kanamycin med celler fra enkle kolonier og inkuber dem over natten ved 37 ° C og 180 rpm i en inkubator.
- Etter inkubasjon over natten, rens plasmid DNA fra kulturer ved å bruke et kommersielt tilgjengelig kit (se Materialebord ) i henhold til produsentens anvisninger.
- Klon den humane kodonoptimaliserte gen-sekvensen som koder for Ps ACR1 i et peGFP-C1-plasmid (CMV-promotor, kanamycinresistens) i ramme med mCherry-fluoroforet ved hjelp av restriksjonsenzymer eller andre etablerte kloningsmetoder.
- Sæd cellene
MERK: Utfør trinnene under en laminær hette.- Plasser opptil tre lysinbelagte glassdeksler på side i en 35 mm petriskål.
MERK: Trykk forsiktig dem mot bunnen av fatet for å unngå å glide på hverandre. - Frø 1,5 x 10 5 HEK-celler i 2 ml standard Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) tilsatt 10% føtalt bovint serum (FBS) i hver tallerken.
- Supplement all- trans retinal påEn endelig konsentrasjon på 1 μM. Vokse cellene i minst en dag før du fortsetter med trinn 1.6.
- Plasser opptil tre lysinbelagte glassdeksler på side i en 35 mm petriskål.
- Transient transfektere cellene via lipofeksjon 31 .
- For hver tallerken av celler, lag en løsning av 2 μg plasmid-DNA (som fremstilt i trinn 1.4) i 250 μl DMEM uten FBS og 6 μl transfeksjonsreagens (se Materialetabell ).
- Etter 15 min inkubasjon, legg forsiktig (dråpevis) løsningen til cellene.
- Forbered agarbroer
- Tilsett 0,75 g agarose til 50 ml steril natriumkloridoppløsning (140 mM) og oppløs den ved oppvarming i en mikrobølgeovn.
MERK: 2 - 3 M KCl for agarbro forberedelse reduserer LJP ytterligere på grunn av høyere konsentrasjon ( f.eks. Konstant diffusjon fra broen) og like mobilitet av K + og Cl - ioner, men ble unngått for å minimere ion - (spesielt Cl - ) lekkasje Inn i t Han badløsning 32 . - Fyll 10 μl pipettespisser (eller en liten diameter slange) med væskeagaroseoppløsningen ved hjelp av en sprøyte.
MERK: Unngå luftbobler i broen. - Etter at agarbroene er avkjølt og størknet, oppbevar dem i steril 140 mM natriumkloridoppløsning.
- Tilsett 0,75 g agarose til 50 ml steril natriumkloridoppløsning (140 mM) og oppløs den ved oppvarming i en mikrobølgeovn.
- Forbered opptak og badelektroder.
- Fjern sølvtrådene i badekaret og innspill elektroden av patch-clamp-oppsettet.
- Poler ledningene med sandpapir for å fjerne sølvklorid fra tidligere eksperimenter. Demp den rene sølvtråden i 3 M KCl og koble den til den positive polen på et 1,5 V batteri for elektrolytisk belegg med sølvklorid.
MERK: En strømforsyning kan brukes i stedet for et batteri.
- Trekk pipetter med lav motstandsplaster (1,5-3,0 MΩ) fra glasskapillærene med en mikropipettdrakker og brannpolere dem som beskrevet av Brown et al.Lass = "xref"> 33. Oppbevar pipetter støvfri for måledagen.
- Slå på alle oppsettkomponenter for å varme opp til arbeidstemperatur 30 min. Tidligere opptak. Kontroller at buffere er ved romtemperatur.
2. Selectivity Measurements
- Start opptakene 24 til 48 timer etter forbigående transfeksjon av cellene beskrevet i 1.6.
- Plasser ett deksel i målekammeret og tett det med silisium for å hindre lekkasje av den eksterne bufferen. Oppbevar petriskålen med de andre dekselet i en inkubator for neste sett med eksperimenter.
- Fyll kammeret forsiktig med ekstracellulær buffer (høy [Cl - ]) for å forhindre at celler løsnes, plasser det under mikroskopet og bruk 40X-målet for cellevisualisering.
- Sett en agarbro over badelektroden og legg den inn i kammeret sammen med væskenivåføleren og perfusjonsutløpet til badhandleren.
- Bytt exTracellulær oppløsning to ganger med 1 ml frisk ekstern oppløsning (høy [Cl - ]) for å fjerne gjenværende dyrkningsmedium og løsne celler.
- Ta cellene i fokus og søk etter en transfektert (fluorescerende) celle, som må isoleres fra andre celler. Bruk et trippelbåndsfilter og oransje lys (590 nm, båndbredde 15 nm, 100% intensitet) for å opphisse og visualisere mCherry.
MERK: HEK-celler kan kobles elektrisk til sine naboer ved mellomrom 34, noe som resulterer i lav membranmotstand i helcellekonfigurasjonen. - Fyll en av de trekkede pipetter med intracellulær løsning og fjern luftbobler ved å bla pipetten flere ganger.
- Monter pipetten på pipettholderen og bruk noe positivt trykk for å hindre tettingen av spissen.
- Finn spissen av patchpipetten under mikroskopet og naviger den nær cellen ved hjelp av mikromanipulatoren.
MERK: Følgende trinn gjelder for aMplifier, datainnsamling og evalueringsprogramvare nevnt i materiallisten. - Start "membranstesten" i datainnsamlingsprogramvaren og bruk et spenningstrinn (testpuls, f.eks. 5 mV for 10 ms, baseline på 0 mV), manuelt eller automatisk via spesifisert programvare ved bruk av "badmodus" mens du kjører "membranstest" I datainnsamlingsprogramvaren.
- Kontroller at pipettmotstanden er i ønsket område (1,5-3,0 MΩ).
- Nullstillingsstrømmer ved å justere pipettpotensialet ved å dreie pipetteforskyvningsknappen på forsterkeren mens du arbeider i "badmodus" av "membranprøven".
- Opprett en oppdatering i hele cellekonfigurasjonen 26 .
MERK: Følgende trinn krever bruk av positivt og negativt trykk som leveres til sideporten på den brukte pipettholderen. Dette kan gjøres ved å bruke enten en sprøyte, via et munnstykke eller en elektronisk konTrolled trykkregulator. I denne protokollen påføres positivt og negativt trykk via et munnstykke.- Langsomt nærmer cellen med patchpipetten fra toppen og lind det positive trykket rett før du berører det.
MERK: Når spissen er nær cellen, vil motstanden stige litt; Dette indikeres med en redusert størrelse på testpulsen. - Endre "membranprøven" fra "badmodus" til "patchmodus" og holdingspotensialet til cellernes forventede hvilepotensial (-30 til -40 mV).
- I noen tilfeller danner den cellebundne konfigurasjonen seg etter frigjøring av det positive trykket (2.13.1), hvis ikke, forsiktig påfør negativt trykk for å bistå gigaseformasjon.
MERK: Cellefestet konfigurasjon er etablert når testpulsen reduseres til to små kapasitive toppene ved begynnelsen og slutten av pulsen, og membranmotstanden er i GΩ-området; Negative spenninger opp til -60 mV mIght forenkle gigaseformasjon. - Kompensere pipettkapasitansen ved å dreie "pipettkapasitans kompensasjon" -knappene for å få en flat respons av testpulsen.
- Bryt plasten uten å ødelegge tetningen ved å bruke korte pulser av negativt trykk eller negativt trykk med økende styrke for å oppnå fullcellekonformasjon.
MERK: Vellykket overgang fra cellefestet til helcellekonfigurasjon er indikert ved en økning av kapasitive toppene. - Bruk seriemotstandskompensasjon ved å sette helcelleparameter og kompensasjonsjusteringer av den brukte forsterkeren for nøyaktig klemming av membranpotensialet til ønsket holdspenning.
- Bytt "membrantest" til "helcelle" -modus. Slå på "prediksjon" og "korreksjon" opptil 90% i "Serie motstandskompensasjon" -panelet. Unngå overskudd og svingning av kapasitiv respons, skru hele cellenKompensasjonsbryter på og juster hele celleparametere med passende frontpanelknapper ("helcellekapasitet" og "seriemotstand") på forsterkeren på en iterativ måte for å oppnå en ideell flat testforseglingsrespons.
MERK: For detaljerte beskrivelser av seriemotstandskompensasjon og korreksjon referer til forsterkerhåndboken eller veiledningen, da denne prosedyren varierer mellom forskjellige produsenter.
- Bytt "membrantest" til "helcelle" -modus. Slå på "prediksjon" og "korreksjon" opptil 90% i "Serie motstandskompensasjon" -panelet. Unngå overskudd og svingning av kapasitiv respons, skru hele cellenKompensasjonsbryter på og juster hele celleparametere med passende frontpanelknapper ("helcellekapasitet" og "seriemotstand") på forsterkeren på en iterativ måte for å oppnå en ideell flat testforseglingsrespons.
- Etter å ha etablert helcellekonfigurasjon, vent minst 2 min før innspilling for å sikre tilstrekkelig utskifting av intracellulær løsning gjennom patchpipetten 35 .
- Langsomt nærmer cellen med patchpipetten fra toppen og lind det positive trykket rett før du berører det.
- Ta opp lysinducerte strømmer ved forskjellige holdepotensialer ved å bruke protokollene som ble konfigurert tidligere (i 1.2).
- Bytt den ekstracellulære bufferen til lavt [Cl - ] i kammeret minst fem ganger uten å ødelegge lappen og ta opp en annen strømspenningsrelasjon ( se trinn 1.2) ved tHan ny kloridkonsentrasjon.
MERK: Et perfusjonssystem for automatisert bufferutveksling letter denne prosessen, men er ikke nødvendig. - Gjenta 2,15. For hver jonisk tilstand som skal testes, men kontroller gjentatte ganger kvaliteten på lappen mellom målingene ved hjelp av en "membranstest" beskrevet ovenfor.
MERK: For å garantere nøyaktig membran spenning og stabil intracellulær ionsammensetning bør membranmotstanden være over 500 MΩ, mens aksessmotstanden ikke skal overstige 10 MΩ, se . 2.12.6). Ikke glem å bytte helcelleparametre kompensasjon for membrantesten. - Gjenta 2.2. Til 2,15. For flere celler, men ta et nytt dekselglass for hver testserie for å sikre helse av celler.
3. Data Evaluering
- Juster grunnlinjen for hvert nåværende spor ved å subtrahere gjennomsnittlig strøm før belysning.
- Beregn gjennomsnittlig stasjonær fotokurrent I s (
- Gjenta trinn 3.1) og 3.2) for alle testede forhold og forskjellige celler.
- Plot de bestemte fotokrørene mot det respektive holdpotensialet.
MERK: Hvis flere målinger er gjennomsnittlige, kan individuelle opptak normaliseres til en spesifisert tilstand eller kapasitansen til cellen. - Krysset mellom strømspenningsforholdet med spenningsaksen representerer reverseringspotensialet (nettstrømmen er null). Bestem det ved lineær interpolering mellom de to nabopunktene.
MERK: Hvis det ikke er noen polaritet inversjon av fotokoblinger, ekstrapolere lineært fra de to siste punktene nær null for å oppnå en tilnærming av skjæringspunktet. - Gjennomsnittlig bestemt rEversale potensialer for de samme forholdene og plotte dem mot kloridkonsentrasjonen av de eksterne bufferløsninger ( jf. Figur 2B ).
- Åpne krysspotensialkalkulatoren (JPC) 27 og åpne dialogboksen "Ny eksperiment". Velg deretter "Patch-klemme målinger". Velg "helcellemålinger", "Standard saltløsningselektrode" og angi en temperatur på25 ° C. Mellom hvert steg går du videre ved å akseptere valget ved å trykke på "neste" -knappen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 viser representative resultater oppnådd fra målinger som følger den beskrevne protokoll. Under lyset med grønt lys har Ps ACR1 en rask forbigående strøm som raskt faller til et stasjonært strømnivå. Etter at lyset er slått av, forringes fotokoblingen til null innen millisekunder ( figur 2A ). Utveksling av ekstracellulærkloridkonsentrasjonen forårsaker et skifte av reverseringspotensialet som kan ses direkte i de oppkjøpte fotokurrentsporene. Evaluering av reverseringspotensialer fra flere målinger kvantifiserer det dramatiske reverseringspotensialskiftet forårsaket av variasjonen av den eksterne kloridkonsentrasjonen ( figur 2B ). Påfallende, målt reverserte potensialer korresponderer direkte med beregnede Nernst-potensialer for klorid ( figur 2C ) som bekrefter høyklorid-selektiviteten av Ps ACR1.
T "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figur 2: Klorid selektivitet av Ps ACR1 . ( A ) Representative nåværende spor av Ps ACR1 i HEK293 celler. Intracellulærkloridkonsentrasjon ble holdt ved 120 mM, mens ekstracellulær konsentrasjon varierte fra 150 mM (grønn) til 10 mM (lilla) klorid ved delvis erstatning av NaCl med Na-aspartat. Holdpotensialet ble økt i 20 mV trinn fra -80 mV til +40 mV (LJP korrigert). ( B ) Gjennomsnittlig spenningsforhold (n = 6 som samsvarer med betingelsene i A). ( C ) Reverseringspotensialer (senterlinjene indikerer medianer, boksgrenser indikerer 25 og 75 prosent, whiskers strekker seg 2 ganger standardavviket og sirkler indikerer enkelte datapunkter) hentet fra strømspenningsforholdene. For den høye kloridkonstruksjonenDition (grønn) verdien var lineært interpolert mellom -20 mV og 0 mV holdingspotensial, mens verdien var lineært ekstrapolert over +40 mV (lilla, strekket linje, panel B). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bestemmelse av reverseringspotensialer ved definerte ioniske og elektriske forhold gir informasjon om ionartene transportert etter lysaktivering av ChRs. Hvis utelukkende en ionart varieres i et komplekst fysiologisk medium og de oppnådde reverseringspotensialforskyvninger i henhold til det teoretiske Nernst-potensialet, er denne ionart den eneste transporterte.
For ChRs er reverseringspotensialforskyvninger vanligvis mindre uttalt enn forventet fra Nernst-ligningen på grunn av permeabilitet for forskjellige ioniske arter, samt konkurranse mellom utførte ioner. I dette tilfellet blir situasjonen mer kompleks og alle potensielt gjennomførte ioner må byttes separat og krever en rekke måleløsninger. I tillegg er de fleste CCR og de første kunstige ACRene 9 , 10 , 21 ledende for protoner, men varierende protonkonsentrasjonerDet krever en særlig grundig analyse, da protonkonsentrasjonen ikke bare kan skifte reverseringspotensialer, men kan også påvirke ionkonduktans 9 , fotokurrentkinetikk 21 , 36 og spektral lysfølsomhet 11 , 37 på grunn av endring av hydrogenbindingsnettene, protoneringstilstanden til Individuelle rester og sekundære strukturendringer. Proton konduktivitet kan adresseres ved å redusere konsentrasjoner av alle andre potensielt utførte ioner som Na + , Ca 2+ eller Cl - mens pH holdes konstant for å unngå proteinendringer nevnt ovenfor. Ikke-gjennomførte substitusjoner er vanligvis store, ladede molekyler som NMG + for kationer 12 og glukonat, 2- ( N- morfolin) etansulfonat (MES-) eller aspartat for anioner. Sammenligne reverseringspotensialer i forskjellige iOniske løsninger tillater deretter beregning av de relative ionpermeabilitetene ved likevektsbetingelser ved Goldman-Hodgkin-Katz spenningsligningen. Kvantifisering av nøyaktige bidrag av forskjellige ioner til nettfotokurrenter med tanke på ionkonkurranse utover likevektsbetingelser krever imidlertid komplekse matematiske modeller 12 , 38 .
Å vite sammensetningen av ioner transportert av ChRs bidrar til å belyse mulige bivirkninger som skyldes ChR-applikasjon, spesielt i en nevrofysiologisk sammenheng. For eksempel kan langvarig ChR-aktivering forårsake intracellulær forsuring 39 eller utført-Ca 2+ kan utløse synaptisk frigjøring og andre messengerbaner 40 . Som celler er vanligvis tett pakket i vev, kan aktivering av mikrobielle rhodopsiner ikke bare påvirke den intracellulære ion-sammensetningen, men også det ekstracellulære lumen, og påvirker dermed nNabo celler 41 .
Til tross for ion selektivitet er andre biofysiske egenskaper av ChRs som fotokurrente amplituder, inaktivering, spektral eller lysfølsomhet og kinetiske egenskaper ofte av interesse for å utføre, designe og tolke eksperimenter som involverer optogenetiske teknikker. Noen av disse egenskapene kan også bestemmes fra protokollen ovenfor som beskrevet andre steder 18 , 37 , 42 . For å undersøke lysfølsomheten til den ChR-uttrykkende cellen, kan lysintensiteten varieres ved å justere lyskildens kraft eller ved å dempe aktiveringslyset med nøytrale tetthetsfiltre. For å oppnå spektral følsomhet er det nødvendig med en polykromatisk lyskilde og intensiteter må justeres til lik fotonfløm og båndbredde for alle bølgelengder. Høyintensitetsspektre ligner bare absorpsjonsspektraene til fotoreceptoren dersom korte lyspulser ellerLaser blinker brukes, ellers kan tilpasningsfenomener og fotokjemiske tilbakereaksjoner forekomme. Gjenoppretting fra delvis inaktivert til fullt aktiv ChR (total fotocyklusomsetningstid) kan undersøkes ved å påføre en dobbeltpulsprotokoll med økende mørke intervaller mellom de to lyspulser. De biofysiske egenskapene til ChRs som er omtalt ovenfor, er viktige for å velge en passende ChR som matcher de eksperimentelle behovene 40 .
Avleiring av disse biofysiske egenskapene ved elektrofysiologiske teknikker ligner direkte proteinfunksjon som knapt dekkes av spektroskopiske metoder. Etter vellykket etablering av spenningsklemmemålinger kan teknikken kombineres med proteintekniske tilnærminger som stedrettet mutagenese 9 , 11 , 43 , 44 , helix-shuffling 37 ,
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi takker Maila Reh, Tharsana Tharmalingam og spesielt Altina Klein for utmerket teknisk assistanse. Dette arbeidet ble støttet av German Research Foundation (DFG) (SFB1078 B2, FOR1279 SPP1665 til PH) og Cluster of Excellence Unifying Concepts i Catalysis, UniCat, BIG-NSE (JV) og E4 (PH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK293 cells | Sigma Aldrich | 85120602 | Human embryonic kidney cells |
| Retinal | Sigma Aldrich | R2500 | all-trans retinal |
| FuGENE HD | Promega | E2312 | Transfection reagent |
| DMEM | Biochrome | FG 0445 | Dulbecco's Modified Eagle Medium |
| Agarose | Roth | 3810 | Agar bridges |
| CaCl2 | Roth | 5239 | CaCl2 2H2O |
| CsCl | Biomol | 2452 | |
| EGTA | Roth | 3054 | |
| FBS | Biochrome | S0615 | Cell culture |
| Glucose | Roth | HN06 | D(+)-Glucose |
| KCl | Roth | 6781 | |
| MgCl2 | Roth | 2189 | MgCl2 6H2O |
| NaCl | Roth | 3957 | |
| NMG | Sigma Aldrich | M2004 | N-Methyl-D-glucamine |
| Na-Aspartate | Sigma Aldrich | A6683 | L-Aspartic acid sodium salt monohydrate |
| Citric acid | Roth | 6490 | |
| AgeI | ThermoFischerScientific | ER1462 | Restriction enzyme |
| XhoI | ThermoFischerScientific | ER0695 | Restriction enzyme |
| NheI | ThermoFischerScientific | ER0975 | Restriction enzyme |
| XL1Blue E. coli | Agilent Technologies | 200249 | Chemocompetent E. coli |
| Kanamycin | Roth | T832 | |
| Lysogeny broth medium | Roth | X964 | |
| Agar-Agar | Roth | 6494 | Agar plates |
| Plasmid purification kit | Marchery-Nagel | 740727.25 | |
| Penicilin/Streptomycin | Biochrome | A 2213 | Cell culture |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma Aldrich | P6407-5MG | Cover slip coating |
| Microforge | Custom made | Fire polishing | |
| Serological pipettes | TPP | Different sizes | |
| Clean bench | Kojair | Biowizard SL130 | |
| Stirrer | IKA | RCT classic | |
| Silver wire | Science Products | AG-T25; AG-T10 | Electrodes, 0.64 mm (bath); 0.25 mm (electrode) |
| pH-meter | Knick | 765 Calimetric | |
| Osmometer | Vogel | OM 815 | |
| Microscope | Carl Zeiss | ID03 | Fire polishing |
| CO2 incubator | Binder | CB150 | |
| Cell culture dishes | TPP | 93040 | 34 mm internal diameter |
| Cover slips | Roth | P232 | 15 mm diameter |
| Thermometer | Rössel Messtechnik | MTM12 | |
| Beamsplitter | Chroma | 21011 | 90/10 transmission |
| Pipette holder | ALA Scientific Instruments | PPH-1P-AXU-0-1.5 | |
| Headstage | Molecular Devices | CV203BU | |
| Amplifier | Molecular Devices | AxoPatch200B | |
| Digitizer | Molecular Devices | DigiData1400 | Digital analog converter |
| Lightsource | TILL Photonics | Polychrome V | Set to 540 nm full intensity |
| Microscope | Carl Zeiss | Axiovert 100 | |
| Shutter | Vincent Associates | VS25 | |
| Shutter driver | Vincent Associates | VCM-D1 | |
| Glass capilarries | Warner Instruments | G150F-3 | Boresilicate capillaries with fire polished ends OD 1.5 mm ID 0.86 mm |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P1000 | |
| Bath handler | Lorenz Messgerätebau | MPCU | |
| Tripleband filterset | Chroma | 69008 | Fluorescence filter ECFP/EYFP/mCherry |
| CCD camera | Watec | Wat-221SCCD | |
| Optometer | Gigahertz Optik | P9710 | Measure light intensities |
| Objective | Carl Zeiss | 421462-9900-000 | W Plan-Apochromat 40X/1.0 DIC |
| Micromanipulator | Scientifica | PatchStar | |
| Recording chamber | Custom made | ||
| Power supply | Manson | HCS-3202 | Avoids electrical noise from microscope built-in power supply |
| Vibration isolated table | Newport | M-VW-3636-OPT-01 | |
| Faraday cage | Custom made or any commercial matching table | ||
| Hoses | Any comercial; e.g. Roth | Different sizes and materials for bath handling and application of pipette pressure; agar bridges | |
| Linear shaker | Sunlab Instruments | SU 1000 | |
| Liquid junction potential calculator | Molecular Devices or directly from Peter H. Barry | Program is included in the Clampex aquisition software or can be obtained from p.barry@unsw.edu.au | |
| Data acquisition software | Molecular Devices | Clampex 10.X | |
| Data evaluation software | Molecular Devices | Clampfit 10.X | |
| PsACR1 | GenBank or Addgene | KF992074.1 or Addgene plasmid #85465 | Gene encoding for PsACR1 |
| Amplifier guide | Molecular Devices | The Axon Guide |
References
- Hegemann, P. Algal sensory photoreceptors. Annu. Rev. Plant Biol. 59, 167-189 (2008).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae. Science. 296 (5577), 2395-2398 (2002).
- Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of contractile function in skeletal muscle. Nat. Commun. 6 (7153), 1-8 (2015).
- Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo. Nat. Methods. 7 (11), 897-900 (2010).
- Zhang, F., et al. The microbial opsin family of optogenetic tools. Cell. 147 (7), 1446-1457 (2011).
- Nagel, G., et al. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr. Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
- Li, X., et al. Fast noninvasive activation and inhibition of neural and network activity by vertebrate rhodopsin and green algae channelrhodopsin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (49), 17816-17821 (2005).
- Ishizuka, T., Kakuda, M., Araki, R., Yawo, H. Kinetic evaluation of photosensitivity in genetically engineered neurons expressing green algae light-gated channels. Neurosci. Res. 54 (2), 85-94 (2006).
- Wietek, J., et al. Conversion of channelrhodopsin into a light-gated chloride channel. Science. 344 (6182), 409-412 (2014).
- Berndt, A., et al. Structural foundations of optogenetics: Determinants of channelrhodopsin ion selectivity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 113 (4), 822-829 (2016).
- Tsunoda, S. P., Hegemann, P. Glu 87 of Channelrhodopsin-1 Causes pH-dependent Color Tuning and Fast Photocurrent Inactivation. Photochem. Photobiol. 85 (2), 564-569 (2009).
- Schneider, F., Gradmann, D., Hegemann, P. Ion selectivity and competition in channelrhodopsins. Biophys. J. 105 (1), 91-100 (2013).
- Prigge, M. Über die elektrophysiologische Untersuchung und Entwicklung von farbverschobenen Kanalrhodopsinchimären aus der Grünalge Volvox carteri. , Diss. Humboldt-Universität zu Berlin. Available from: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:11-100203476 (2012).
- Govorunova, E. G., Spudich, E. N., Lane, C. E., Sineshchekov, O. A., Spudich, J. L. New Channelrhodopsin with a Red-Shifted Spectrum and Rapid Kinetics from Mesostigma viride. MBio. 2 (3), 1-9 (2011).
- Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Li, H., Janz, R., Spudich, J. L. Characterization of a highly efficient blue-shifted channelrhodopsin from the marine alga Platymonas subcordiformis. J. Biol. Chem. 288 (41), 29911-29922 (2013).
- Hou, S. -Y., et al. Diversity of Chlamydomonas Channelrhodopsins. Photochem. Photobiol. 88 (1), 119-128 (2012).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat. Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophys. J. 96 (5), 1803-1814 (2009).
- Yizhar, O., et al. Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction. Nature. 477 (7363), 171-178 (2011).
- Berndt, A., Yizhar, O., Gunaydin, L. a, Hegemann, P., Deisseroth, K. Bi-stable neural state switches. Nat. Neurosci. 12 (2), 229-234 (2009).
- Berndt, A., Lee, S. Y., Ramakrishnan, C., Deisseroth, K. Structure-Guided Transformation of Channelrhodopsin into a Light-Activated Chloride Channel. Science. 344 (6182), 420-424 (2014).
- Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Spudich, J. L. Proteomonas sulcata ACR1: A Fast Anion Channelrhodopsin. Photochem. Photobiol. 92 (2), 257-263 (2016).
- Wietek, J., Broser, M., Krause, B. S., Hegemann, P. Identification of a Natural Green Light Absorbing Chloride Conducting Channelrhodopsin from Proteomonas sulcata. J. Biol. Chem. 291 (8), 4121-4127 (2016).
- Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Janz, R., Liu, X., Spudich, J. L. Natural light-gated anion channels: A family of microbial rhodopsins for advanced optogenetics. Science. 349 (6248), 647-650 (2015).
- Neher, E., Sakmann, B., Steinbach, J. H. The extracellular patch clamp: A method for resolving currents through individual open channels in biological membranes. Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. 375 (2), 219-228 (1978).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. Arch. Eur. J. Physiol. 391 (2), 85-100 (1981).
- Barry, P. H. JPCalc, a software package for calculating liquid junction potential corrections in patch-clamp, intracellular, epithelial and bilayer measurements and for correcting junction potential measurements. J. Neurosci. Methods. 51 (1), 107-116 (1994).
- Amtmann, A., Sanders, D. A unified procedure for the correction of liquid junction potentials in patch clamp experiments on endo- and plasma membranes. J. Exp. Bot. 48, (Special) 361-364 (1997).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).
- Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. J. Vis. Exp. (63), e1-e18 (2012).
- Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 84 (21), 7413-7417 (1987).
- Halliwell, J., Whitaker, M., Ogden, D. Using microelectrodes. Microelectrode Tech. Plymouth Work. Handb. 3, 1-15 (1949).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J. Vis. Exp. (20), e1-e2 (2008).
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
- Pusch, M., Neher, E. Rates of diffusional exchange between small cells and a measuring patch pipette. Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. 411 (2), 204-211 (1988).
- Berndt, A. Mechanismus und anwendungsbezogene Optimierung von Channelrhodopsin-2. , Diss Humboldt-Universität zu Berlin. Available from: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:11-100191266 (2011).
- Prigge, M., et al. Color-tuned channelrhodopsins for multiwavelength optogenetics. J. Biol. Chem. 287 (38), 31804-31812 (2012).
- Gradmann, D., Berndt, A., Schneider, F., Hegemann, P. Rectification of the channelrhodopsin early conductance. Biophys. J. 101 (5), 1057-1068 (2011).
- Beppu, K., et al. Optogenetic countering of glial acidosis suppresses glial glutamate release and ischemic brain damage. Neuron. 81 (2), 314-320 (2014).
- Wietek, J., Prigge, M. Enhancing Channelrhodopsins: An Overview. Methods Mol. Biol. 1408, 141-165 (2016).
- Ferenczi, E. A., et al. Optogenetic approaches addressing extracellular modulation of neural excitability. Sci. Rep. 6, 1-20 (2016).
- Zhang, F., et al. Red-shifted optogenetic excitation: a tool for fast neural control derived from Volvox carteri. Nat. Neurosci. 11 (6), 631-633 (2008).
- Sugiyama, Y., et al. Photocurrent attenuation by a single polar-to-nonpolar point mutation of channelrhodopsin-2. Photochem. Photobiol. Sci. 8 (3), 328-336 (2009).
- Kleinlogel, S., et al. Ultra light-sensitive and fast neuronal activation with the Ca2+-permeable channelrhodopsin CatCh. Nat. Neurosci. 14 (4), 513-518 (2011).
- Wang, H., et al. Molecular determinants differentiating photocurrent properties of two channelrhodopsins from chlamydomonas. J. Biol. Chem. 284 (9), 5685-5696 (2009).
- Gradinaru, V., Thompson, K. R., Deisseroth, K. eNpHR: a Natronomonas halorhodopsin enhanced for optogenetic applications. Brain Cell Biol. 36 (1-4), 129-139 (2008).
- Berglund, K., et al. Luminopsins integrate opto- and chemogenetics by using physical and biological light sources for opsin activation. Proc. Natl. Acad. Sci. 113 (3), 358-367 (2016).
