Abstract
在过去十年中，通道观光素在神经科学研究中成为不可或缺的，它们被用作非侵入性操纵靶细胞电工作的工具。在这方面，通道视紫红质的离子选择性是特别重要的。本文介绍了通过HEK293细胞上的电生理膜片钳记录研究最近鉴定的蛋白质组培养基的阴离子导电通道视紫红质的氯选择性。用于测量光门控光电流的实验程序需要一个快速可切换的 - 理想的单色光源，耦合到另外传统的膜片钳设置的显微镜中。概述实验前的制备方法涉及缓冲溶液的制备，对液体接头电位的考虑，接种和细胞转染以及拉片移植管。实际记录电流 - 电压关系以确定不同氯化物浓度的逆转电位在转染后24小时至48小时。最后，关于氯化物传导的理论考虑分析电生理数据。
Introduction
通道视紫红质（Chr）是发生在运动性绿藻眼睛中的轻门控离子通道，可作为光敏感和恐惧反应的主要感光元件1 。自2002年第一次描述以来，ChR为新兴的光遗传学领域铺平了道路，可以应用于各种兴奋细胞， 如骨骼肌，心脏或大脑3,4,5 。 ChRs在靶细胞中的表达导致相应细胞的光可控离子渗透性。在神经元上下文中，这允许激活6,7,8或抑制作用电位（AP）的9,10（取决于导电离子）与空间和时间光的精度强调了ChR变体的离子选择性如何决定其光遗传应用。
第一个发现的Chlamydomonas reinhardtii和Volvox carteri的ChRs对质子是可渗透的，而且也可以是一钠阳离子，如钠，钾，二来阳离子如钙和镁11,12,13 。今天，超过70种天然阳离子导电通道视紫红质（CCR）14,15,16,17和几种具有不同性质的工程变体18,19,20具有 光电流尺寸，光谱灵敏度，动力学和阳离子选择性。而在神经科学中，CCRs a重新用于激活细胞并触发AP，光驱微生物泵是用于沉默神经元多年的唯一可用的拮抗剂。 2014年，两组同时表明，CCR可以通过分子工程9,21改变推定离子导电孔的极性，将其转化为阴离子导电通道视紫红质（ACR）。随后，在几种密类藻22,23,24中鉴定了自然ACR。最重要的是，ACR的光激活介导成年神经元中的氯化物电流，允许在比仅吸收光子仅传输单个电荷的微生物泵更低的光强度下抑制神经元活性。
ChR活性可以通过HEK293细胞中光诱导电流的电生理膜片钳记录直接解决。膜片夹技术最初是在20世纪70年代末开发的，而且由Hamill 等人进一步改进。允许从高电流分辨率的小电池（全电池模式）记录电流实体，并直接控制膜电压26 。应用于细胞培养，这种技术提供了离子和电记录条件的精确控制，并且能够研究离子选择性以及离子对总电流的相对贡献。这里我们举例说明通过记录各种细胞外氯化物浓度下的电流 - 电压关系来检测蛋白质组学（ Ps ACR1） 22,23的阴离子导电通道视紫红质的离子选择性，以证明高氯化物电导。
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Protocol
图1：跳线钳设置。 （1）光源，（2）光纤，（3）可编程快门，（4）数字化仪，（5）快门驱动器，（6）放大器，（7）灌注系统，（8）个人计算机，（9） ，（10）法拉第笼，（11）显微镜台，（12）灌注入口，（13）灌注出口，（14）记录室，（15）液位传感器，（16）带琼脂桥的浴电极，（17）移液器支架，（18）头灯，（19）显微操纵器，（20）倒置显微镜，（21）显微镜灯罩，（22）显微镜灯电源，（23）充水U型管，（24）三通阀门，（25）防振台，（26）CCD摄像头。 （ A ）照片和（ B ）设置的示意图。 请点击这里查看更大的版本他的身影
1.录音前设置
| 内。 | extra.1 | extra.2 | |
| 高氯化物 | 高氯化物 | 低氯化物 | |
| c [mM] | c [mM] | c [mM] | |
| NA-ASP | 0 | 0 | 140 |
| 氯化钠 | 110 | 140 | 0 |
| 氯化钾 | 1 | 1 | 1 |
| 氯化铯 | 1 | 1 | 1 |
| CaCl 2 | 2 | 2 | 2 |
| MgCl 2 | 2 | 2 | 2 |
| HEPES | 10 | 10 | 10 |
| EGTA | 10 | 0 | 0 |
| pH值 | 7.2 | 7.2 | 7.2 |
| 的渗透压 | 290 mOsm | 320 mOsm | 320 mOsm |
表1：缓冲溶液的离子组成。在HEK细胞中用于氯化物选择性实验的细胞内（内）和胞外（额外）缓冲液的组成。使用的缩写：乙二醇四乙酸（EGTA），4-（2-羟基乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）和天冬氨酸（ASP）。所有浓度均为mM。
- 用离子浓度准备记录溶液，如表1所示。
- 在超纯水中制备15 mL 2M储备溶液，用于MgCl 2 ，CaCl 2 ，KCl和CsCl。
- 称量100 mL细胞内固体组分将500mL根据表1的细胞外缓冲溶液分成单独的烧杯，然后加入相应量的制备的储备溶液。例如，对于细胞内缓冲液，使用0.3803g（10mM）EGTA，0.2383g（10mM）HEPES和0.6428g（110mM）NaCl，加入100μL2M MgCl 2和CaCl 2 ，加入50μL 2 M KCl和CsCl储备溶液。
- 添加超纯水，并使用不干扰测量的酸和碱精心调节pH， 即不由ChR进行，如柠檬酸和N-甲基-D-葡萄糖胺（NMG + ）。
- 调节渗透压为290 mOsm为细胞内和320 mOsm细胞外溶液与葡萄糖。
注意：稍微低渗透的细胞内溶液增加修补的成功率26 。 - 无菌过滤所有溶液通过0.22-μm过滤器。将溶液在4°C储存2周或在-20°C下冷冻长时间储存。
- 计算液体结电位并准备记录方案。
注意：建立全细胞配置后细胞外氯化物浓度的变化会导致必须校正的显着液体接合电位（LJP） 27,28 。可以直接测量或计算LJP，这里使用后一个选项。在该协议中，将对每个外部缓冲器使用一个记录协议进行在线校正。然而，对于更大的外部解决方案，建议对LJP进行后期校正，以避免错误纠正。- 打开连接点计算器（JPC） 27并打开“新建实验”对话框。然后选择“贴片钳测量”。选择“全细胞测量”，“标准盐溶液电极”，输入温度25°C。在每个步骤之间，通过按“下一步”按钮接受选择。
注意：实验在室温25摄氏度的空调实验室进行。确保缓冲溶液在开始实验之前具有室温。为了改变样品温度，可以使用孵育阶段或室。浴温可以用温度计频繁测量。 - 根据表1中列出的浓度添加吸移溶液和高氯缓冲液的所有单独阴离子和阳离子浓度。
注意：JPC将计算起始条件为-0.5 mV的LJP。 - 点击“新浴溶液”，输入低氯化物缓冲液的阴离子和阳离子组成。
注意：根据改变的细胞外记录解决方案，JPC现在将计算一个+12.6 mV的新LJP。 - 准备两个LJP校正的协议两个测量条件通过从所施加的保持电位中减去所计算的LJP;对于低氯化物外部溶液，高电平为-0.5 mV，+12.6 mV。因此，协议以-79.5mV（高氯化物）和-92.6mV（低氯化物）开始，以获得在两种情况下为-80mV的LJP校正的起始保持电位。
注意：以下步骤适用于材料列表中提到的数据采集软件。 - 在采集软件中打开协议编辑器。切换到“模式”菜单，选择“特效刺激”，并包括7次扫描。
- 切换到编辑器中的“波形”菜单，包括一个200毫秒的周期，0 mV的保持电位，然后是2秒的周期，对于高氯离子，变化的保持电位从-79.5 mV开始。在第二个周期内包括20 mV的“Delta电平”，以在每次扫描中增加20 mV的保持电位。
- 在波形ed的电压阶段用540nm光（3.10mW / mm 2）施加500ms的照明周期。为此，请在上述第二个周期（参见1.2.6）后，将控制光源的所连接快门的“数字位模式”更改为有效500 ms。
注意：光强度可以影响通道电流的生物物理性质，如振幅或失活。因此，应始终报告光功率密度。要通过所有光学元件和盖玻片后测量光功率，请使用校准的光学计数器。要计算功率密度，通过对象测微计确定物镜的照明场，并将测得的光功率除以确定的照明场。 - 保存高氯离子细胞外溶液的方案。修改协议，并将第一级保持电位替换-92.6 mV（低外部氯化物）。保存第二个方案来测量低氯化物细胞外条件。
- 根据适用的方案29 ，玻璃盖滑盖的赖氨酸涂层。
- 将几百个盖玻片放在玻璃培养皿中，加入250 mL HCl（1 N）。
- 将盖玻片放在线性摇床上的培养皿上，以120rpm振荡72小时以清洁盖子，然后用超纯水冲洗以中和pH。
- 将其浸泡在少量95％乙醇中以进一步清洗。
注意：清洁盖子可以储存在70％乙醇中，然后再继续操作。在层流罩下工作以进行以下步骤。 - 使用本生灯和镊子，每个盖子都会滑动并将其转移到新的培养皿中。
- 在室温下用无菌的50μg/ mL聚-D-赖氨酸溶液孵育至少1小时（或过夜）的玻璃盖玻片，同时用线性振荡器以150rpm摇动。
- 用超纯水清洗盖子以除去多余的聚-D-赖氨酸。
- 将无盖纸上的盖子撕开干燥10分钟，并将其暴露于紫外线下进行灭菌（至少20分钟）。
- 将盖子收集到铝箔上的无菌培养皿中，直到使用。
- 使用标准分子生物学技术制备与mCherry融合的Ps ACR1基因的DNA。
- 使用限制酶或其他已建立的克隆方法，使用mCherry荧光团将编码Ps ACR1的人密码子优化的基因序列克隆到peGFP-C1质粒（CMV启动子，卡那霉素抗性）框架中。
注意：也可以使用其他荧光团，但请确保在设置中可以使用相应的过滤器组，以在显微镜下观察其荧光。 - 根据标准方案，通过热休克将质粒DNA转化为化学活性的XL1Blue 大肠杆菌细胞，并将其置于琼脂平板（30μg/ mL卡那霉素） 30上
- 第二天，将来自单个菌落的细胞的补充有30μg/ mL卡那霉素的4mL溶菌酵母培养基接种，并在37℃和180rpm下在培养箱中孵育过夜。
- 孵育过夜后，使用市售的试剂盒（参见材料表 ），根据制造商的说明从培养物中纯化质粒DNA。
- 使用限制酶或其他已建立的克隆方法，使用mCherry荧光团将编码Ps ACR1的人密码子优化的基因序列克隆到peGFP-C1质粒（CMV启动子，卡那霉素抗性）框架中。
- 种细胞
注意：在层流罩下执行步骤。- 在35 mm的陪替氏培养皿中并排放置三根赖氨酸涂层的玻璃盖。
注意：轻轻地将它们压在盘子的底部，以防彼此滑动。 - 在每个培养皿中补充有10％胎牛血清（FBS）的2mL标准Dulbecco's Modified Eagle培养基（DMEM）中种子1.5×10 5个 HEK细胞。
- 补充全反式视网膜最终浓度为1μM。生长细胞至少一天，然后再进行步骤1.6。
- 在35 mm的陪替氏培养皿中并排放置三根赖氨酸涂层的玻璃盖。
- 通过脂转染瞬时转染细胞31 。
- 对于每个细胞皿，在250μL不含FBS和6μL转染试剂的DMEM（参见材料表 ）中制备2μg质粒DNA（如步骤1.4中制备）的溶液 。
- 孵育15分钟后，轻轻（滴加）将溶液加入细胞。
- 准备琼脂桥
- 向50ml无菌氯化钠溶液（140mM）中加入0.75g琼脂糖，并通过在微波中加热溶解。
注意：2 - 3 M KCl用于琼脂桥制备由于较高的浓度（ 例如来自桥的恒定扩散）和K +和Cl -离子的相等迁移率而进一步降低了LJP，但是避免了使离子（特别是Cl - ）泄漏最小化进入t他洗澡液32 。 - 使用注射器用液体琼脂糖溶液填充10μL移液器吸头（或小直径软管）。
注意：避免桥梁中的气泡。 - 琼脂桥已经冷却并固化后，将其储存在无菌的140mM氯化钠溶液中。
- 向50ml无菌氯化钠溶液（140mM）中加入0.75g琼脂糖，并通过在微波中加热溶解。
- 准备录音和浴缸电极。
- 取出金属丝和贴片夹设置的记录电极。
- 用砂纸擦拭线，以从以前的实验中除去氯化银。将干净的银线浸入3 M KCl中，并将其连接到1.5 V电池的正极上，用氯化银电解涂层。
注意：可以使用实验室电源代替电池。
- 用微量吸管拔出器从玻璃毛细管拉出低电阻贴片移液器（1.5-3.0MΩ），并按照Brown 等lass =“xref”> 33。储存移液器无尘，用于测量当天。
- 打开所有设置组件，加热到工作温度30分钟前录制。确保缓冲液在室温下。
2.选择性测量
- 在1.6中描述的细胞瞬时转染后24至48小时开始记录。
- 将一个盖板放在测量室中，并用硅密封，以防止外部缓冲液泄漏。将培养皿与其他盖子一起存放在孵化器中进行下一组实验。
- 小心地用细胞外缓冲液（高[Cl - ]）填充室以防止细胞分离，然后将其置于显微镜下，并使用40X物镜进行细胞可视化。
- 将琼脂桥放在浴电极上，并与液位传感器和浴液处理器的灌注出口一起放入室内。
- 交换前微量溶液用1 mL新鲜外部溶液（高[Cl - ]）洗涤两次，以除去残留的培养基和分离的细胞。
- 使细胞聚焦并搜索需要从其他细胞分离的转染（荧光）细胞。使用三波段滤光片和橙色光（590nm;带宽15nm; 100％强度）来激发和可视化mCherry。
注意：HEK电池可以通过间隙连接34电耦合到它们的邻居，导致全电池配置中的低电阻。 - 用细胞内溶液填充一个拉出的移液器，并通过翻转移液管多次去除气泡。
- 将移液器安装在移液器支架上，并施加一些正压力以防止尖端堵塞。
- 在显微镜下找到补片移液管的尖端，并使用显微操纵器将其靠近细胞。
注意：以下步骤适用于a材料清单中提到的数据采集和评估软件。 - 在数据采集软件中启动“膜测试”，并在运行“膜测试”的同时，通过指定的软件使用“浴模式”手动或自动应用电压阶跃（测试脉冲， 例如 5 ms，10 ms，基线为0 mV）在数据采集软件中。
- 检查移液器电阻是否在所需的范围内（1.5-3.0MΩ）。
- 通过在“膜测试”的“浴模式”工作时，通过转动放大器上的移液器偏移旋钮来调整移液管电位来实现零偏移电流。
- 在全细胞配置26中建立补丁。
注意：以下步骤需要使用传递到使用过的移液器支架侧端的正压和负压。这可以通过使用注射器，通过口件或电子连接器来完成拖曳压力调节器。在这个协议中，正压和负压是通过一个口件施加的。- 用顶部的补片移液器缓慢接近细胞，并在触摸之前缓解正压。
注意：当尖端靠近电池时，电阻将略微上升;这由测试脉冲的尺寸减小来表示。 - 将“膜测试”从“浴模式”更改为“贴片模式”，从而保持细胞预期静息电位（-30至-40 mV）的潜力。
- 在一些情况下，释放正压（2.13.1）后，细胞附着的形状本身就会形成，否则，轻轻地施加负压来协助气泡形成。
注意：当脉冲开始和结束时测试脉冲降低到两个小电容峰值，膜电阻处于GΩ范围内时，建立电池连接配置;负电压高达-60 mV m这样可以促进。al形成。 - 通过转动“移液器电容补偿”旋钮来补偿移液管电容，以获得测试脉冲的平坦响应。
- 通过用增加的强度施加负压或负压的短脉冲来破坏贴片而不破坏密封，以获得全细胞构象。
注意：从电池连接到全电池配置的成功转换由电容峰值的增加表示。 - 通过设置全频率参数和使用的放大器的补偿调整来应用串联电阻补偿，以将膜电位精确夹紧到所需的保持电压。
- 将“膜测试”切换为“全电池”模式，在“串联电阻补偿”面板中，打开“预测”和“校正”达90％，可以避免电容响应的过大和振荡，补偿开关，并以相反的方式使用相应的前面板旋钮（“全单元容量”和“串联电阻”）调整整个单元参数，以获得理想的平面测试密封响应。
注：有关串联电阻补偿和校正的详细说明，请参考放大器手册或指南，因为不同制造商之间的程序不同。
- 将“膜测试”切换为“全电池”模式，在“串联电阻补偿”面板中，打开“预测”和“校正”达90％，可以避免电容响应的过大和振荡，补偿开关，并以相反的方式使用相应的前面板旋钮（“全单元容量”和“串联电阻”）调整整个单元参数，以获得理想的平面测试密封响应。
- 建立全细胞配置后，在记录前至少等待2分钟，以确保通过贴片移液器35充分更换细胞内溶液。
- 用顶部的补片移液器缓慢接近细胞，并在触摸之前缓解正压。
- 通过使用以前设置的协议（1.2）记录不同保持电位的光诱导电流。
- 将细胞外缓冲液至室内交换至低[Cl - ]至少五次，而不破坏贴片，并记录另一个电流 - 电压关系（ 参见步骤1.2）t他新氯化物浓度。
注意：用于自动缓冲区交换的灌注系统有助于此过程，但不是必需的。 - 重复2.15。对于要测试的每个离子条件，但是通过上述“膜测试”重复检查测量之间的贴片的质量。
注意：为了保证精确的膜电压和稳定的细胞内离子组成，膜电阻应大于500MΩ，而访问电阻不应超过10MΩ 。 2.12.6）。不要忘记切换全单元参数补偿以进行膜测试。 - 重复2.2。至2.15。对于几个细胞，但为每个测试系列采取新的封面，以确保细胞的健康。
3.数据评估
- 通过减去照明前的平均电流来调整每个电流曲线的基线。
- 计算平均固定光电流I s （
- 对所有测试条件和不同细胞重复步骤3.1）和3.2）。
- 绘制确定的光电流与相应的保持电位。
注意：如果将多个测量值进行平均，则可以将单个记录归一化为指定条件或单元格的电容。 - 电流 - 电压关系与电压轴的交点表示反向电位（净电流为零）。通过两个相邻数据点之间的线性插值来确定它。
注意：如果光电流没有极性反转，则从接近零的最后两点线性推断，以获得交点的近似值。 - 平均确定r在相同条件下的电位电位和它们对抗外部缓冲溶液的氯化物浓度（ 参见 图2B ）。
- 打开连接点计算器（JPC） 27并打开“新建实验”对话框。然后选择“贴片钳测量”。选择“全细胞测量”，“标准盐溶液电极”，输入温度25°C。在每个步骤之间，通过按“下一步”按钮接受选择。
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Representative Results
图2示出了根据所述方案从测量获得的代表性结果。在用绿光照明时， Ps ACR1具有快速衰减到稳定电流水平的快速瞬态电流。光线关闭后，光电流在几毫秒内就会衰减到零（ 图2A ）。交换细胞外氯离子浓度会导致在获得的光电流迹线中可以直接看到的反转电位的偏移。从多次测量的反转电位的评估量化了由外部氯化物浓度的变化引起的剧烈的反转电位漂移（ 图2B ）。显着地，测量的反转电位直接对应于氯化物的计算能斯特电位（ 图2C ），证实了Ps ACR1的高氯选择性。
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图2： Ps ACR1的 氯化物 选择性 。 （ A ）HEK293细胞中Ps ACR1的代表性电流迹线。细胞内氯化物浓度保持在120mM，而细胞外浓度通过用天冬氨酸钠部分替换NaCl而从150mM（绿色）变化到10mM（紫色）氯化物。保持电位从-80 mV增加到+40 mV（LJP校正）的20 mV步长。 （ B ）平均电流 - 电压关系（对应于A中的条件n = 6）。 （ C ）从电流 - 电压关系中提取的反转电位（中心线表示中值，盒限制表示第25和第75百分位数，晶须延伸2倍标准偏差，圆指示单个数据点）。对于高氯化物（绿色），该值在-20 mV和0 mV保持电位之间线性插值，而该值在+40 mV以上线性外插（紫色，虚线，图B）。 请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
在确定的离子和电气条件下的反转电位的测定提供了关于在光激活ChR之后传输的离子物种的信息。如果在复杂的生理介质中仅排除一种离子种类，并且根据理论能斯特电位，获得的反转电势发生变化，则该离子种类是唯一传播的离子。
然而，对于ChRs，由于对不同离子物质的渗透性以及导电离子之间的竞争，反向电位偏移通常不如从恩斯特方程所预期的那么明显。在这种情况下，情况变得更加复杂，并且所有潜在的离子必须分开交换要求各种测量解决方案。此外，大多数CCR和第一个人造ACR 9,10,21对于质子但是质子浓度变化是导电的因为质子浓度不仅可以转移反转电位，而且还可能由于氢键网络的改变而影响离子电导9 ，光电流动力学21,36和光谱光灵敏度11,37，质子化态个体残留和二级结构变化。质子电导可以通过减少所有其他可能导电的离子如Na + ，Ca 2+或Cl - 的 浓度来解决 ，同时保持pH恒定，以避免上述蛋白质变化。非导电替代物通常是体积大的带电分子，如阳离子12的 NMG +和阴离子的葡萄糖酸盐，2-（ N-吗啉代）乙磺酸盐（MES-）或天冬氨酸盐。比较不同的逆转电位onic解决方案然后允许通过Goldman-Hodgkin-Katz电压方程计算在平衡条件下的相对离子渗透率。然而，考虑离子竞争超过平衡条件，量化不同离子对净光电流的确切贡献，需要复杂的数学模型12,38。
了解由ChR运输的离子的组成有助于阐明由ChR应用引起的可能的副作用，特别是在神经生理学环境中。例如，延长的ChR活化可引起细胞内酸化39或导致Ca 2+可能触发突触释放和第二信使途径40 。由于细胞通常紧密堆积在组织内，所以微生物视紫红质的活化不仅可以影响细胞内的离子组成，还能影响细胞外腔，从而影响n相邻单元41 。
尽管离子选择性，ChR的其他生物物理特征如光电流振幅，失活，光谱或光敏感性和动力学性质通常涉及进行，设计和解释涉及光遗传技术的实验。这些性质中的一些也可以从上述方案确定，如其他地方18,37,42所述。为了研究ChR表达细胞的光敏度，可以通过调整光源的功率或通过用中性密度滤光片衰减活化光来改变光强度。为了获得光谱灵敏度，需要多色光源，并且必须将强度调整为相等于所有波长的光子通量和带宽。高强度光谱仅类似于感光体的吸收光谱，如果短光脉冲或使用激光闪光灯，否则会发生适应现象和光化学反射反应。可以通过在两个光脉冲之间增加较暗的间隔应用双脉冲协议来探测从部分灭活到完全活动的ChR（整体照相循环周期）的恢复。上述ChR的生物物理特性对于选择符合实验需要的合适的ChR重要40 。
通过电生理技术获得这些生物物理特性直接类似蛋白质功能，几乎不被光谱学方法所覆盖。成功建立电压钳测量后，该技术可以与蛋白质工程方法结合，如定点诱变9,11,43,44，螺旋洗牌37 ，
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Acknowledgments
我们感谢Maila Reh，Tharsana Tharmalingam，特别是Altina Klein，为您提供卓越的技术帮助。这项工作得到德国研究基金会（DFG）（SFB1078 B2，FOR1279 SPP1665至PH）和催化，UniCat，BIG-NSE（JV）和E4（PH）的卓越统一概念支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK293 cells | Sigma Aldrich | 85120602 | Human embryonic kidney cells |
| Retinal | Sigma Aldrich | R2500 | all-trans retinal |
| FuGENE HD | Promega | E2312 | Transfection reagent |
| DMEM | Biochrome | FG 0445 | Dulbecco's Modified Eagle Medium |
| Agarose | Roth | 3810 | Agar bridges |
| CaCl2 | Roth | 5239 | CaCl2 2H2O |
| CsCl | Biomol | 2452 | |
| EGTA | Roth | 3054 | |
| FBS | Biochrome | S0615 | Cell culture |
| Glucose | Roth | HN06 | D(+)-Glucose |
| KCl | Roth | 6781 | |
| MgCl2 | Roth | 2189 | MgCl2 6H2O |
| NaCl | Roth | 3957 | |
| NMG | Sigma Aldrich | M2004 | N-Methyl-D-glucamine |
| Na-Aspartate | Sigma Aldrich | A6683 | L-Aspartic acid sodium salt monohydrate |
| Citric acid | Roth | 6490 | |
| AgeI | ThermoFischerScientific | ER1462 | Restriction enzyme |
| XhoI | ThermoFischerScientific | ER0695 | Restriction enzyme |
| NheI | ThermoFischerScientific | ER0975 | Restriction enzyme |
| XL1Blue E. coli | Agilent Technologies | 200249 | Chemocompetent E. coli |
| Kanamycin | Roth | T832 | |
| Lysogeny broth medium | Roth | X964 | |
| Agar-Agar | Roth | 6494 | Agar plates |
| Plasmid purification kit | Marchery-Nagel | 740727.25 | |
| Penicilin/Streptomycin | Biochrome | A 2213 | Cell culture |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma Aldrich | P6407-5MG | Cover slip coating |
| Microforge | Custom made | Fire polishing | |
| Serological pipettes | TPP | Different sizes | |
| Clean bench | Kojair | Biowizard SL130 | |
| Stirrer | IKA | RCT classic | |
| Silver wire | Science Products | AG-T25; AG-T10 | Electrodes, 0.64 mm (bath); 0.25 mm (electrode) |
| pH-meter | Knick | 765 Calimetric | |
| Osmometer | Vogel | OM 815 | |
| Microscope | Carl Zeiss | ID03 | Fire polishing |
| CO2 incubator | Binder | CB150 | |
| Cell culture dishes | TPP | 93040 | 34 mm internal diameter |
| Cover slips | Roth | P232 | 15 mm diameter |
| Thermometer | Rössel Messtechnik | MTM12 | |
| Beamsplitter | Chroma | 21011 | 90/10 transmission |
| Pipette holder | ALA Scientific Instruments | PPH-1P-AXU-0-1.5 | |
| Headstage | Molecular Devices | CV203BU | |
| Amplifier | Molecular Devices | AxoPatch200B | |
| Digitizer | Molecular Devices | DigiData1400 | Digital analog converter |
| Lightsource | TILL Photonics | Polychrome V | Set to 540 nm full intensity |
| Microscope | Carl Zeiss | Axiovert 100 | |
| Shutter | Vincent Associates | VS25 | |
| Shutter driver | Vincent Associates | VCM-D1 | |
| Glass capilarries | Warner Instruments | G150F-3 | Boresilicate capillaries with fire polished ends OD 1.5 mm ID 0.86 mm |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P1000 | |
| Bath handler | Lorenz Messgerätebau | MPCU | |
| Tripleband filterset | Chroma | 69008 | Fluorescence filter ECFP/EYFP/mCherry |
| CCD camera | Watec | Wat-221SCCD | |
| Optometer | Gigahertz Optik | P9710 | Measure light intensities |
| Objective | Carl Zeiss | 421462-9900-000 | W Plan-Apochromat 40X/1.0 DIC |
| Micromanipulator | Scientifica | PatchStar | |
| Recording chamber | Custom made | ||
| Power supply | Manson | HCS-3202 | Avoids electrical noise from microscope built-in power supply |
| Vibration isolated table | Newport | M-VW-3636-OPT-01 | |
| Faraday cage | Custom made or any commercial matching table | ||
| Hoses | Any comercial; e.g. Roth | Different sizes and materials for bath handling and application of pipette pressure; agar bridges | |
| Linear shaker | Sunlab Instruments | SU 1000 | |
| Liquid junction potential calculator | Molecular Devices or directly from Peter H. Barry | Program is included in the Clampex aquisition software or can be obtained from p.barry@unsw.edu.au | |
| Data acquisition software | Molecular Devices | Clampex 10.X | |
| Data evaluation software | Molecular Devices | Clampfit 10.X | |
| PsACR1 | GenBank or Addgene | KF992074.1 or Addgene plasmid #85465 | Gene encoding for PsACR1 |
| Amplifier guide | Molecular Devices | The Axon Guide |
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