Abstract
Au cours de la dernière décennie, les canal-rhodopsines sont devenues indispensables dans la recherche neuro-scientifique où elles sont utilisées comme outils pour manipuler des processus électriques de manière non invasive dans des cellules cibles. Dans ce contexte, la sélectivité ionique d'une canalrhodopsine revêt une importance particulière. Cet article décrit l'étude de la sélectivité des chlorures pour une canalisation de chrysomies de Proteomonas sulcata, récemment identifiée, par des enregistrements électrophysiologiques sur les cellules HEK293. La procédure expérimentale pour la mesure des photocourteurs à lumière modérée nécessite une source de lumière rapide commutable - idéalement monochromatique - couplée au microscope d'une configuration pare-brise conventionnelle. Les procédures préparatoires avant l'expérience sont décrites impliquant la préparation de solutions tamponnées, des considérations sur les potentiels de jonction liquide, l'ensemencement et la transfection des cellules, et le tirage des pipettes patch. L'enregistrement réel de la relation courant-tensionS pour déterminer les potentiels d'inversion pour différentes concentrations de chlorure se déroule de 24 h à 48 h après la transfection. Enfin, les données électrophysiologiques sont analysées en fonction des considérations théoriques de la conduction du chlorure.
Introduction
Les canarhodopsines (ChR) sont des canaux ioniques à lumière qui se produisent dans l'oeil des algues vertes mobiles et servent de photosensors primaires pour la phototaxie et les réponses phobies 1 . Depuis leur première description en 2002 2 , les ChR ont ouvert la voie au domaine émergent de l'optogenèse et peuvent être appliqués dans une variété de cellules excitables, par exemple dans les muscles squelettiques, le cœur ou le cerveau 3 , 4 , 5 . L'expression des ChR dans les cellules cibles entraîne une perméabilité aux ions pouvant être contrôlée par la lumière de la cellule respective. Dans un contexte neuronal, cela permet l'activation 6 , 7 , 8 ou l'inhibition 9 , 10 du déclenchement du potentiel d'action (AP) - en fonction de l'ion conduit - avec l'espace et le tempsPrécision de la lumière en soulignant comment la sélectivité ionique d'un variant de ChR détermine son application optogénétique.
Les premiers ChR découverts de Chlamydomonas reinhardtii et Volvox carteri sont perméables aux protons, mais aussi aux cations monovalents comme le sodium, le potassium et, dans une moindre mesure, les cations divalents tels que le calcium et le magnésium 11 , 12 , 13 . Aujourd'hui, plus de 70 channelrhodopsins (CCR) 14 , 15 , 16 , 17 et plusieurs variantes conçues 18 , 19 , 20 avec des propriétés différentes telles que La taille du photocourant, la sensibilité spectrale, la cinétique et la sélectivité des cations sont disponibles. Alors qu'en neuroscience, les CCR sontSont utilisés pour activer les cellules et déclencher des AP, les pompes microbiennes à lumière ont été les seuls antagonistes disponibles pour faire diminuer les neurones pendant des années. En 2014, deux groupes ont simultanément montré que les CCR peuvent être transformés en canal-triopsines conductrices d'anions (ACR) par altération de la polarité le long du pore porteur d'ions putatif via l'ingénierie moléculaire 9 , 21 . Par la suite, des ACR naturels ont été identifiés dans plusieurs algues cryptophytes 22 , 23 , 24 . Plus important encore, l'activation légère des ACR médiatise les courants de chlorure dans les neurones adultes, ce qui permet d'inhiber l'activité neuronale à des intensités lumineuses beaucoup plus faibles que les pompes microbiennes qui ne transportent que des charges individuelles par photon absorbé.
L'activité ChR peut être directement traitée par des enregistrements électrophysiologiques de pinces de courants induits par la lumière dans des cellules HEK293. Le patch-clampLa technique a d'abord été développée à la fin des années 1970 25 et améliorée par Hamill et al. , Permettant l'enregistrement de l'entité des courants à partir d'une petite cellule (mode cellule entière) avec une résolution de courant élevée et une commande directe de la tension de la membrane 26 . Appliquée dans la culture cellulaire, cette technique assure un contrôle précis des conditions d'enregistrement ioniques et électriques et permet d'étudier la sélectivité ionique ainsi que la contribution relative des ions au courant total. Ici, nous illustrons l'examen de la sélectivité ionique pour la canalodromycine conductrice d'anion de Proteomonas sulcata ( Ps ACR1) 22 , 23 via l'enregistrement des relations tension-tension sous différentes concentrations de chlorure extracellulaire pour prouver une forte conductance du chlorure.
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Protocol
Figure 1: Configuration du patch-clamp. (1) source lumineuse, (2) fibre optique, (3) volet programmable, (4) numériseur, (5) conducteur d'obturateur, (6) amplificateur, (7) système de perfusion, (8) ordinateur personnel, (9) moniteur (10) caisse de Faraday, (11) stade du microscope, (12) entrée de perfusion, (13) sortie de perfusion, (14) chambre d'enregistrement, (15) capteur de niveau de fluide, (16) électrode de bain avec pont agar, (17) Porte-pipettes (18) casque, (19) micromanipulateur, (20) microscope inversé, (21) boîtier de la lampe à microscope, (22) alimentation de la lampe au microscope, (23) tube en U rempli d'eau, (24) à trois voies Valve, (25) table anti-vibration, (26) caméra CCD. ( A ) Photographies et ( B ) représentation schématique de la configuration. Cliquez ici pour voir une version plus grande de tSa figure.
1. Configuration avant les enregistrements
| Intra. | Extra.1 | Extra.2 | |
| Chlorure élevé | Chlorure élevé | Faible teneur en chlorure | |
| C [mM] | C [mM] | C [mM] | |
| Na-ASP | 0 | 0 | 140 |
| NaCl | 110 | 140 | 0 |
| KCl | 1 | 1 | 1 |
| CsCl | 1 | 1 | 1 |
| CaCl 2 | 2 | 2 | 2 |
| MgCl 2 | 2 | 2 | 2 |
| HEPES | dix | dix | dix |
| EGTA | dix | 0 | 0 |
| Le pH | 7.2 | 7.2 | 7.2 |
| Osmolarité | 290 mOsm | 320 mOsm | 320 mOsm |
Tableau 1: Composition ionique des solutions tamponnées. Composition des tampons intracellulaires (intra) et extracellulaires (extra) pour des expériences de sélectivité en chlorure dans des cellules HEK. Abréviations utilisées: acide tétraacétique d'éthylène glycol (EGTA), acide 4- (2-hydroxyéthyl) -1-pipérazineéthanesulfonique (HEPES) et aspartate (ASP). Toutes les concentrations sont en mM.
- Préparez les solutions d'enregistrement avec les concentrations d'ions comme indiqué dans le tableau 1.
- Préparer 15 ml de solutions stock 2 M dans de l'eau ultrapure pour MgCl 2 , CaCl 2 , KCl et CsCl.
- Peser les composants solides pour 100 ml de l'intracellulaire et500 ml des solutions tampones extracellulaires selon le tableau 1 dans des gobelets distincts et ajouter ensuite la quantité respective des solutions stockées préparées. Par exemple, pour le tampon intracellulaire, utiliser 0,3803 g (10 mM) d'EGTA, 0,2383 g (10 mM) d'HEPES et 0,6428 g (110 mM) de NaCl et ajouter 100 μL de MgCl2 2 M et CaCl2 et 50 μL de 2 M KCl et solutions stock CsCl.
- Ajouter de l'eau ultrapure et ajuster soigneusement le pH en utilisant des acides et des bases, ce qui n'interfère pas avec la mesure, c'est-à-dire ne sont pas conduites par le ChR, comme l'acide citrique et la N-méthyl-D-glucamine (NMG + ).
- Ajuster l'osmolarité à 290 mOsm pour l'intracellulaire et à 320 mOsm pour les solutions extracellulaires avec du glucose.
Note: Des solutions intracellulaires légèrement hypoosmotiques augmentent le taux de réussite du patch 26 . - Filtre stérile toutes les solutions grâce à des filtres de 0,22 μm. Stocker les solutions à 4 ° C pendant deux semainesS ou geler à -20 ° C pour un stockage à long terme.
- Calculez les potentiels de jonction liquide et préparez les protocoles d'enregistrement.
NOTE: Le changement de la concentration de chlorure extracellulaire après l'établissement de la configuration de la cellule entière provoque un potentiel de jonction liquide important (LJP) qui doit être corrigé 27 , 28 . Les LJP peuvent être directement mesurés ou calculés, ici la dernière option est utilisée. Dans ce protocole, la correction en ligne sera utilisée exigeant un protocole d'enregistrement pour chaque tampon externe. Cependant, pour un plus grand ensemble de solutions externes, une correction post de LJP est recommandée pour éviter toute fausse correction.- Ouvrez le calculateur de potentiel de jonction (JPC) 27 et ouvrez le dialogue 'Nouvelle expérience'. Ensuite, sélectionnez "Patch-clamp measures". Sélectionnez "mesures de cellules entières", "Electrode à solution de sel standard" et entrez une température de25 ° C. Entre chaque étape, avancez en acceptant la sélection en appuyant sur le bouton "Suivant".
NOTE: Les expériences sont effectuées à une température ambiante de 25 ° C dans un laboratoire climatisé. Assurez-vous que les solutions tampons ont la température ambiante avant de commencer les expériences. Pour varier la température de l'échantillon, on peut utiliser un stade d'incubation ou une chambre. La température du bain peut être mesurée fréquemment avec un thermomètre. - Ajouter toutes les concentrations individuelles d'anions et de cations de la solution pipetée et du tampon chlorure élevé en fonction des concentrations indiquées dans le tableau 1 .
REMARQUE: Le JPC calculera une LJP de -0,5 mV pour les conditions de départ. - Cliquez sur "Nouvelle solution de bain" pour entrer dans la composition anionique et cationique du tampon à faible teneur en chlorure.
REMARQUE: Le JPC calculera maintenant une nouvelle LJP de +12,6 mV selon la solution d'enregistrement extracellulaire modifiée. - Préparez deux protocoles corrigés par LJP pourDeux conditions de mesure en soustrayant la LJP calculée du potentiel de maintien appliqué; -0,5 mV pour le haut et +12,6 mV pour les solutions externes à faible chlorure. Ainsi, les protocoles commencent par -79,5 mV (chlorure élevé) et -92,6 mV (faible teneur en chlorure), respectivement pour obtenir un potentiel de maintien initial de -80 mV corrigé par LJP dans les deux cas.
REMARQUE: les étapes suivantes s'appliquent au logiciel d'acquisition de données mentionné dans la liste des matériaux. - Ouvrez l'éditeur de protocole dans le logiciel d'acquisition. Passez au menu "Mode" sélectionnez "Stimulation épisodique" et incluez 7 balayages.
- Passez au menu «Forme d'onde» dans l'éditeur et incluez une période de 200 ms avec un potentiel de maintien de 0 mV suivi d'une période de 2 s avec un potentiel de maintien variable à partir de -79,5 mV pour le chlorure élevé. Incluez un "niveau Delta" de 20 mV pour la deuxième période pour augmenter le potentiel de maintien de 20 mV dans chaque balayage.
- Dans les étapes de tension de la forme d'onde éditéeIl faut appliquer une période d'illumination de 500 ms avec une lumière de 540 nm (3,10 mW / mm²). Pour ce faire, modifiez le "motif de bits numérique" de l'obturateur connecté qui contrôle la source de lumière pour être actif 500 ms après la deuxième période décrite ci-dessus (voir 1.2.6).
NOTE: L'intensité de la lumière peut influencer les propriétés biophysiques des courants de canaux comme l'amplitude ou l'inactivation. Par conséquent, les densités de puissance légères doivent toujours être signalées. Pour mesurer la puissance de la lumière après avoir traversé toutes les optiques et la lamelle, utilisez un optomètre calibré. Pour calculer la densité de puissance, déterminez le champ lumineux de l'objectif par un micromètre d'objet et divisez le pouvoir lumineux mesuré par le champ éclairé déterminé. - Enregistrez le protocole pour la solution extracellulaire élevée en chlorure. Modifiez le protocole et remplacez le potentiel de maintien du premier niveau de -92.6 mV (chlorure externe faible). Enregistrez ce deuxième protocole pour mesurer l'état extracellulaire à faible teneur en chlorure.
- Lysine-coating of glass cover slips selon protocole adapté 29 .
- Placez plusieurs boutons de couverture dans une boîte en Pétri en verre et ajoutez 250 mL de HCl (1 N).
- Placez la boîte à pétri avec les pattes de couverture sur un agitateur linéaire et secouez à 120 tr / min pendant 72 h pour nettoyer les pattes de recouvrement et ensuite rincer avec de l'eau ultrapure pour neutraliser le pH.
- Faites tremper ces derniers dans un petit volume d'éthanol à 95% pour un nettoyage ultérieur.
REMARQUE: Nettoyer les patins de couverture peuvent être stockés dans de l'éthanol à 70% avant de continuer. Travailler sous capot à flux laminaire pour les étapes suivantes. - À l'aide d'un brûleur Bunsen et d'une pince à épiler, faites glisser chaque couvercle et transférez-le dans une nouvelle boîte de Petri.
- Incuber le couvercle de verre glissant avec une solution stérile de 50 μg / mL de poly-D-lysine pendant au moins 1 heure (ou pendant la nuit) à température ambiante tout en secouant avec un agitateur linéaire à 150 tr / min.
- Lavez le couvercle avec de l'eau ultrapure pour enlever l'excès de poly-D-lysine.
- Faites passer les feuilles de couverture sur du papier stérile pour sécher pendant 10 min, et exposez-les à la lumière UV pour la stérilisation (au moins 20 minutes).
- Recueillir les pattes de couverture dans une boîte de Petri stérile recouverte de papier d'aluminium jusqu'à utilisation.
- Préparer l'ADN du gène Ps ACR1 fusionné à mCherry en utilisant des techniques standard de biologie moléculaire.
- Cloner la séquence génétique optimisée par le codon humain codant Ps ACR1 dans un plasmide peGFP-C1 (promoteur CMV, résistance à la kanamycine) en cadre avec le fluorophore mCherry en utilisant des enzymes de restriction ou d'autres méthodes de clonage établies.
Remarque: D'autres fluorophores peuvent également être utilisés, mais assurez-vous d'avoir les groupes de filtres correspondants disponibles pour observer leur fluorescence sous microscope dans la configuration. - Transformer l'ADN plasmidique en cellules chimiométrières XL1Blue E. coli par choc thermique selon protocole standard et les plaquer sur des plaques de gélose (30 μg / ml de kanamycine) 30
- Le lendemain, inoculer 4 ml de milieu de lysogénie additionné de 30 μg / mL de kanamycine avec des cellules provenant de colonies simples et les incuber pendant la nuit à 37 ° C et à 180 tr / min dans un incubateur.
- Après une incubation durant la nuit, purifiez l'ADN plasmidique des cultures en utilisant un kit disponible dans le commerce (voir la Table des matériaux) selon les instructions du fabricant.
- Cloner la séquence génétique optimisée par le codon humain codant Ps ACR1 dans un plasmide peGFP-C1 (promoteur CMV, résistance à la kanamycine) en cadre avec le fluorophore mCherry en utilisant des enzymes de restriction ou d'autres méthodes de clonage établies.
- Graine les cellules
REMARQUE: Effectuez les étapes sous un capot d'écoulement laminaire.- Placez jusqu'à trois garnitures en verre lysinées glissantes côte à côte dans une boîte de Petri de 35 mm.
REMARQUE: appuyez doucement sur le fond du plat pour éviter de glisser l'un sur l'autre. - Graine 1,5 x 10 5 cellules HEK dans un milieu Eagle Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) additionné de 10% de sérum bovin fœtal (FBS) dans chaque plat.
- Compléter tout trans- rétinien auUne concentration finale de 1 μM. Augmentez les cellules pendant au moins un jour avant de passer à l'étape 1.6.
- Placez jusqu'à trois garnitures en verre lysinées glissantes côte à côte dans une boîte de Petri de 35 mm.
- Transférer de manière transitoire les cellules par lipofection 31 .
- Pour chaque plat de cellules, préparer une solution de 2 μg d'ADN plasmidique (préparé à l'étape 1.4) dans 250 μL de DMEM sans FBS et 6 μL de réactif de transfection (voir Tableau des matériaux ).
- Après 15 minutes d'incubation, doucement (goutte à goutte) ajoute la solution aux cellules.
- Préparer des ponts à la gélose
- Ajouter 0,75 g d'agarose à 50 ml de solution stérile de chlorure de sodium (140 mM) et dissoudre le produit par chauffage dans un micro-ondes.
REMARQUE: le KCl 2 à 3 M pour la préparation du pont d'agar réduit encore la LJP en raison d'une concentration plus élevée ( par exemple, une diffusion constante du pont) et une mobilité égale des ions K + et Cl, mais a été évitée pour minimiser les fuites d'ions (notamment Cl - ) En t La solution de bain 32 . - Remplir 10 μL de pipettes (ou un tuyau de petit diamètre) avec la solution d'agarose liquide en utilisant une seringue.
REMARQUE: Évitez les bulles d'air dans le pont. - Une fois que les ponts de gélose ont été refroidis et solidifiés, les stocker dans une solution stérile de chlorure de sodium de 140 mM.
- Ajouter 0,75 g d'agarose à 50 ml de solution stérile de chlorure de sodium (140 mM) et dissoudre le produit par chauffage dans un micro-ondes.
- Préparez l'enregistrement et les électrodes de bain.
- Retirer les fils en argent du bain et l'électrode d'enregistrement de la configuration du patch-clamp.
- Polir les fils avec du papier de verre pour éliminer le chlorure d'argent des expériences précédentes. Immergez le fil d'argent propre dans le KCl 3 M et connectez-le au pôle positif d'une batterie de 1,5 V pour le revêtement électrolytique avec du chlorure d'argent.
REMARQUE: une alimentation de laboratoire peut être utilisée à la place d'une batterie.
- Tirez des pipettes de patch de faible résistance (1.5-3.0 MΩ) à partir de capillaires en verre avec un extracteur à micropipette et essorez-les comme décrit par Brown et alLass = "xref"> 33. Stocker les pipettes sans poussière pour le jour de la mesure.
- Allumez tous les composants de configuration pour chauffer à la température de fonctionnement 30 minutes d'enregistrements antérieurs. Assurez-vous que les tampons sont à température ambiante.
2. Mesures de sélectivité
- Commencez les enregistrements 24 à 48 h après la transfection transitoire des cellules décrites en 1.6.
- Placez un couvercle dans la chambre de mesure et scellez-le avec du silicium pour éviter les fuites du tampon externe. Rangez la boîte à pétri avec les autres pattes de couverture dans un incubateur pour la prochaine série d'expériences.
- Remplissez soigneusement la chambre avec un tampon extracellulaire (haut [Cl - ]) pour éviter le détachement des cellules, puis placez-le sous le microscope et utilisez l'objectif 40X pour la visualisation cellulaire.
- Mettez un pont de gélose sur l'électrode de bain et placez-le dans la chambre avec le capteur de niveau de fluide et la sortie de perfusion du manipulateur de bain.
- Échanger l'exSolution tracellulaire deux fois avec 1 ml de solution externe fraîche (haute [Cl - ]) pour éliminer le milieu de culture résiduel et les cellules détachées.
- Amener les cellules à se concentrer et rechercher une cellule transfectée (fluorescente), qui doit être isolée d'autres cellules. Utilisez un filtre à trois bandes et une lumière orange (590 nm; bande passante 15 nm, 100% d'intensité) pour exciter et visualiser mCherry.
NOTE: Les cellules HEK peuvent être couplées électriquement à leurs voisins par des jonctions d'espace 34, ce qui entraîne une faible résistance à la membrane dans la configuration de la cellule entière. - Remplissez une des pipettes tirées avec une solution intracellulaire et retirez les bulles d'air en retournant plusieurs fois la pipette.
- Monter la pipette sur le porte-pipette et appliquer une pression positive pour empêcher le colmatage de la pointe.
- Localisez le bout de la pipette patch au microscope et naviguez-la près de la cellule à l'aide du micromanipulateur.
REMARQUE: les étapes suivantes s'appliquent à la aMplifier, logiciel d'acquisition de données et d'évaluation mentionné dans la liste des matériaux. - Démarrez le "test de membrane" dans le logiciel d'acquisition de données et appliquez une étape de tension (impulsion de test, par exemple 5 mV pour 10 ms, ligne de base à 0 mV), manuellement ou automatiquement via un logiciel spécifié utilisant "mode de bain" en cours d'exécution "test de membrane" Dans le logiciel d'acquisition de données.
- Vérifiez que la résistance de la pipette est dans la plage souhaitée (1,5-3,0 MΩ).
- Courants de décalage zéro en ajustant le potentiel de la pipette en tournant le bouton de décalage de la pipette à l'amplificateur tout en travaillant en mode "bain" du "test de membrane".
- Établissez un patch dans la configuration de cellule complète 26 .
REMARQUE: Les étapes suivantes nécessitent l'application d'une pression positive et négative sur le port latéral du support de pipette utilisé. Cela peut se faire en utilisant soit une seringue, soit par une embouchure, soit par voie électronique.Régulateur de pression piloté. Dans ce protocole, la pression positive et négative est appliquée par une embouchure.- Approchez lentement la cellule avec la pipette patch du haut et libérez la pression positive avant de la toucher.
REMARQUE: lorsque la pointe est proche de la cellule, la résistance augmentera légèrement; Ceci est indiqué par une taille réduite de la impulsion de test. - Modifiez le "test de membrane" du "mode bain" au "mode patch" et donc le potentiel de maintien du potentiel de repos attendu des cellules (-30 à -40 mV).
- Dans certains cas, la configuration attachée à une cellule se forme après la libération de la pression positive (2.13.1), sinon, applique doucement une pression négative pour aider à la formation de gigase.
REMARQUE: la configuration attachée à une cellule est établie lorsque l'impulsion de test est réduite à deux petits pics capacitifs au début et à la fin de l'impulsion et que la résistance de la membrane est dans la gamme GΩ; Tensions négatives jusqu'à -60 mV mCela facilite la formation de gigase. - Compenser la capacité de la pipette en tournant les boutons "compensation de la capacité de la pipette" pour obtenir une réponse plate de l'impulsion de test.
- Rupturez le patch sans détruire le joint d'étanchéité en appliquant de courtes impulsions de pression négative ou de pression négative avec une résistance croissante, pour obtenir une conformation de cellules entières.
REMARQUE: la transition réussie de la configuration cellulaire à la cellule entière est indiquée par une augmentation des pics capacitifs. - Appliquer une compensation de résistance en série en réglant le paramètre de cellule entière et les réglages de compensation de l'amplificateur utilisé pour un serrage précis du potentiel de la membrane à la tension de maintien souhaitée.
- Passez le "test de membrane" au mode "cellule entière", dans le panneau "Résistance de la résistance de la série" activez "prédiction" et "correction" jusqu'à 90% en évitant les dépassements et l'oscillation de la réponse capacitive, tournez la cellule entièreLa compensation commute et ajoute les paramètres de la cellule entière avec les boutons du panneau avant appropriés ("capacité de cellule entière" et "résistance en série") de l'amplificateur de manière itérative pour obtenir une réponse d'étanchéité de test idéalement plane.
REMARQUE: Pour une description détaillée de la compensation et de la correction de la résistance en série, reportez-vous au manuel ou à la directive de l'amplificateur, car cette procédure varie selon les différents fabricants.
- Passez le "test de membrane" au mode "cellule entière", dans le panneau "Résistance de la résistance de la série" activez "prédiction" et "correction" jusqu'à 90% en évitant les dépassements et l'oscillation de la réponse capacitive, tournez la cellule entièreLa compensation commute et ajoute les paramètres de la cellule entière avec les boutons du panneau avant appropriés ("capacité de cellule entière" et "résistance en série") de l'amplificateur de manière itérative pour obtenir une réponse d'étanchéité de test idéalement plane.
- Après avoir établi la configuration de la cellule entière, attendez au moins 2 min avant l'enregistrement pour assurer un remplacement suffisant de la solution intracellulaire à travers la pipette 35 .
- Approchez lentement la cellule avec la pipette patch du haut et libérez la pression positive avant de la toucher.
- Enregistrez les courants induits par la lumière à différents potentiels de maintien en utilisant les protocoles précédemment configurés (en 1.2).
- Échangez le tampon extracellulaire vers le bas [Cl - ] dans la chambre au moins cinq fois sans détruire le patch et enregistrez une autre relation tension-tension ( voir étape 1.2) à tLa nouvelle concentration de chlorure.
REMARQUE: Un système de perfusion pour l'échange de tampons automatisé facilite ce processus, mais n'est pas nécessaire. - Répétez 2.15. Pour chaque condition ionique à tester, mais vérifie à plusieurs reprises la qualité du patch entre les mesures par un "test de membrane" décrit ci-dessus.
REMARQUE: Pour garantir une tension précise de la membrane et une résistance à la membrane intracellulaire stable, la résistance de la membrane devrait être supérieure à 500 MΩ alors que la résistance d'accès ne devrait pas dépasser 10 MΩ, voir . 2.12.6). N'oubliez pas de désactiver la compensation du paramètre de la cellule entière pour le test de la membrane. - Répétez 2.2. À 2.15. Pour plusieurs cellules, mais prenez un nouveau capot pour chaque série de test afin d'assurer la salubrité des cellules.
3. Évaluation des données
- Réglez la ligne de base de chaque trace en soustrayant le courant moyen avant l'illumination.
- Calculer le photocourant stationnaire moyen I s (
- Répétez les étapes 3.1) et 3.2) pour toutes les conditions testées et différentes cellules.
- Tracez les photocourents déterminés par rapport au potentiel de maintien respectif.
REMARQUE: si plusieurs mesures sont en moyenne, les enregistrements individuels peuvent être normalisés à une condition spécifiée ou à la capacité de la cellule. - L'intersection de la relation tension-tension avec l'axe de tension représente le potentiel d'inversion (le courant net est nul). Déterminez-le par interpolation linéaire entre les deux points de données voisins.
REMARQUE: s'il n'y a pas d'inversion de polarité des photocourges, extrapoler linéairement des deux derniers points proches de zéro pour obtenir une approximation du point d'intersection. - Moyenne du déterminé rDes potentiels différents pour les mêmes conditions et les tracer contre la concentration en chlorure des solutions tampons externes ( voir figure 2B ).
- Ouvrez le calculateur de potentiel de jonction (JPC) 27 et ouvrez le dialogue 'Nouvelle expérience'. Ensuite, sélectionnez "Patch-clamp measures". Sélectionnez "mesures de cellules entières", "Electrode à solution de sel standard" et entrez une température de25 ° C. Entre chaque étape, avancez en acceptant la sélection en appuyant sur le bouton "Suivant".
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Representative Results
La figure 2 montre les résultats représentatifs obtenus à partir des mesures suivant le protocole décrit. Pendant l'illumination avec lumière verte, Ps ACR1 comporte un courant transitoire rapide qui se décompose rapidement en un niveau de courant stationnaire. Une fois la lumière éteinte, les photocourents se décomposent à zéro en millisecondes ( Figure 2A ). L'échange de la concentration de chlorure extracellulaire entraîne un décalage du potentiel d'inversion qui peut être vu directement dans les traces photocourues acquises. L'évaluation des potentiels d'inversion à partir de multiples mesures quantifie le changement de potentiel d'inversion dramatique causé par la variation de la concentration de chlorure externe ( figure 2B ). D'une manière frappante, les potentiels d'inversion mesurés correspondent directement aux potentiels Nernst calculés pour le chlorure ( Figure 2C ) confirmant la sélectivité élevée en chlorure de Ps ACR1.
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Figure 2: sélectivité au chlorure de Ps ACR1 . ( A ) Traces actuelles représentatives de Ps ACR1 dans les cellules HEK293. La concentration en chlorure intracellulaire a été maintenue à 120 mM, alors que la concentration extracellulaire variait de 150 mM (vert) à 10 mM de chlorure (violet) par remplacement partiel de NaCl par Na-aspartate. Le potentiel de maintien a été augmenté dans les étapes de 20 mV de -80 mV à +40 mV (LJP corrigé). ( B ) Relation tension-tension moyenne (n = 6 correspondant aux conditions en A). ( C ) Les potentiels d'inversion (les lignes centrales indiquent les médianes, les limites de la boîte indiquent les 25e et 75e percentiles, les moustaches prolongent 2 fois l'écart-type et les cercles indiquent des points de données individuels) extraits des relations courant-tension. Pour la forte teneur en chlorureDition (vert), la valeur a été interpolée linéairement entre -20 mV et 0 mV, alors que la valeur a été linéairement extrapolée au-dessus de +40 mV (violet, ligne pointillée, panneau B). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
La détermination des potentiels de renversement dans des conditions ioniques et électriques définies fournit des informations sur les espèces d'ions transportées après activation légère de ChRs. Si exclusivement, une espèce d'ions varie dans un milieu physiologique complexe et les changements de potentiel d'inversion obtenus selon le potentiel théorique de Nernst, cette espèce ionique est la seule transportée.
Cependant, pour les ChR, les changements de potentiel d'inversion sont généralement moins prononcés que prévu de l'équation de Nernst en raison de la perméabilité à différentes espèces ioniques ainsi que de la concurrence entre les ions conduits. Dans ce cas, la situation devient plus complexe et tous les ions potentiellement menés doivent être échangés séparément demandant une variété de solutions de mesure. En outre, la plupart des CCR et les premiers ACR artificiels 9 , 10 , 21 sont conducteurs pour les protons, mais la concentration de protons variableIl faut une analyse particulièrement approfondie, car la concentration de protons peut non seulement changer les potentiels d'inversion, mais aussi influencer la conductance ionique 9 , la cinétique des photocourteurs 21 , 36 et la sensibilité à la lumière spectrale 11 , 37 en raison de l'altération des réseaux de liaison hydrogène, l'état de protonation de Les résidus individuels et les changements de structure secondaire. La conductance du proton peut être résolue en réduisant les concentrations de tous les autres ions potentiellement conduisibles tels que Na + , Ca 2+ ou Cl - tout en maintenant le pH constant afin d'éviter les changements de protéines mentionnés ci-dessus. Les substituts non réalisés sont habituellement des molécules volumineuses chargées comme NMG + pour les cations 12 et le gluconate, l'éthanesulfonate de 2- ( N- morpholino) (MES) ou l'aspartate pour les anions. Comparer les potentiels d'inversion dans différents iOnic permet alors de calculer les perméabilités ioniques relatives aux conditions d'équilibre par l'équation de tension Goldman-Hodgkin-Katz. La quantification de la contribution exacte des ions différents aux photocourdes nets, compte tenu de la concurrence des ions au-delà des conditions d'équilibre, exige des modèles mathématiques complexes 12 , 38 .
La connaissance de la composition des ions transportés par ChR aide à élucider les effets secondaires possibles résultant de l'application de ChR, en particulier dans un contexte neurophysiologique. Par exemple, l'activation prolongée de la ChR peut provoquer une acidification intracellulaire 39 ou conduite-Ca 2+ peut déclencher la libération synaptique et les voies du second messager 40 . Comme les cellules sont habituellement emballées de manière étroite dans les tissus, l'activation des rhodopsines microbiennes peut non seulement influencer la composition ionique intracellulaire, mais aussi la lumière extracellulaire, affectant ainsi nCellules éloignées 41 .
Malgré la sélectivité ionique, d'autres caractéristiques biophysiques des ChR comme les amplitudes photorébrales, l'inactivation, la sensibilité spectrale ou légère et les propriétés cinétiques sont souvent intéressantes pour mener, concevoir et interpréter des expériences impliquant des techniques opto-génétiques. Certaines de ces propriétés peuvent également être déterminées à partir du protocole ci-dessus, comme décrit ailleurs 18 , 37 , 42 . Pour étudier la sensibilité à la lumière de la cellule exprimant ChR, l'intensité de la lumière peut varier en ajustant la puissance de la source lumineuse ou en atténuant la lumière d'activation avec des filtres à densité neutre. Pour obtenir la sensibilité spectrale, une source de lumière polychromatique est nécessaire et les intensités doivent être ajustées à un flux de photons égal et à une bande passante pour toutes les longueurs d'ondes. Les spectres d'intensité élevée ne ressemblent que aux spectres d'absorption du photorécepteur si des impulsions lumineuses courtes ouDes flashs laser sont utilisés, sinon des phénomènes d'adaptation et des réactions photochimiques arrières peuvent se produire. La récupération de l'inactivation partielle à la ChR entièrement active (temps global de rotation des photocycles) peut être sondée en appliquant un double protocole d'impulsion avec des intervalles sombres croissants entre les deux impulsions lumineuses. Les propriétés biophysiques des ChR décrites ci-dessus sont importantes pour choisir un ChR approprié correspondant aux besoins expérimentaux 40 .
La dérivation de ces propriétés biophysiques par des techniques électrophysiologiques ressemble directement à une fonction protéique qui est à peine couverte par des méthodes spectroscopiques. Après avoir réussi à établir des mesures de tension-clamp, la technique peut être combinée avec des approches d'ingénierie de protéines comme la mutagenèse dirigée par site 9 , 11 , 43 , 44 , l'hélice de brassage 37 ,
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Acknowledgments
Nous remercions Maila Reh, Tharsana Tharmalingam et surtout Altina Klein pour une excellente assistance technique. Ce travail a été soutenu par la Fondation de recherche allemande (DFG) (SFB1078 B2, FOR1279 SPP1665 à PH) et le Cluster of Excellence Unifying Concepts in Catalysis, UniCat, BIG-NSE (JV) et E4 (PH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK293 cells | Sigma Aldrich | 85120602 | Human embryonic kidney cells |
| Retinal | Sigma Aldrich | R2500 | all-trans retinal |
| FuGENE HD | Promega | E2312 | Transfection reagent |
| DMEM | Biochrome | FG 0445 | Dulbecco's Modified Eagle Medium |
| Agarose | Roth | 3810 | Agar bridges |
| CaCl2 | Roth | 5239 | CaCl2 2H2O |
| CsCl | Biomol | 2452 | |
| EGTA | Roth | 3054 | |
| FBS | Biochrome | S0615 | Cell culture |
| Glucose | Roth | HN06 | D(+)-Glucose |
| KCl | Roth | 6781 | |
| MgCl2 | Roth | 2189 | MgCl2 6H2O |
| NaCl | Roth | 3957 | |
| NMG | Sigma Aldrich | M2004 | N-Methyl-D-glucamine |
| Na-Aspartate | Sigma Aldrich | A6683 | L-Aspartic acid sodium salt monohydrate |
| Citric acid | Roth | 6490 | |
| AgeI | ThermoFischerScientific | ER1462 | Restriction enzyme |
| XhoI | ThermoFischerScientific | ER0695 | Restriction enzyme |
| NheI | ThermoFischerScientific | ER0975 | Restriction enzyme |
| XL1Blue E. coli | Agilent Technologies | 200249 | Chemocompetent E. coli |
| Kanamycin | Roth | T832 | |
| Lysogeny broth medium | Roth | X964 | |
| Agar-Agar | Roth | 6494 | Agar plates |
| Plasmid purification kit | Marchery-Nagel | 740727.25 | |
| Penicilin/Streptomycin | Biochrome | A 2213 | Cell culture |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma Aldrich | P6407-5MG | Cover slip coating |
| Microforge | Custom made | Fire polishing | |
| Serological pipettes | TPP | Different sizes | |
| Clean bench | Kojair | Biowizard SL130 | |
| Stirrer | IKA | RCT classic | |
| Silver wire | Science Products | AG-T25; AG-T10 | Electrodes, 0.64 mm (bath); 0.25 mm (electrode) |
| pH-meter | Knick | 765 Calimetric | |
| Osmometer | Vogel | OM 815 | |
| Microscope | Carl Zeiss | ID03 | Fire polishing |
| CO2 incubator | Binder | CB150 | |
| Cell culture dishes | TPP | 93040 | 34 mm internal diameter |
| Cover slips | Roth | P232 | 15 mm diameter |
| Thermometer | Rössel Messtechnik | MTM12 | |
| Beamsplitter | Chroma | 21011 | 90/10 transmission |
| Pipette holder | ALA Scientific Instruments | PPH-1P-AXU-0-1.5 | |
| Headstage | Molecular Devices | CV203BU | |
| Amplifier | Molecular Devices | AxoPatch200B | |
| Digitizer | Molecular Devices | DigiData1400 | Digital analog converter |
| Lightsource | TILL Photonics | Polychrome V | Set to 540 nm full intensity |
| Microscope | Carl Zeiss | Axiovert 100 | |
| Shutter | Vincent Associates | VS25 | |
| Shutter driver | Vincent Associates | VCM-D1 | |
| Glass capilarries | Warner Instruments | G150F-3 | Boresilicate capillaries with fire polished ends OD 1.5 mm ID 0.86 mm |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P1000 | |
| Bath handler | Lorenz Messgerätebau | MPCU | |
| Tripleband filterset | Chroma | 69008 | Fluorescence filter ECFP/EYFP/mCherry |
| CCD camera | Watec | Wat-221SCCD | |
| Optometer | Gigahertz Optik | P9710 | Measure light intensities |
| Objective | Carl Zeiss | 421462-9900-000 | W Plan-Apochromat 40X/1.0 DIC |
| Micromanipulator | Scientifica | PatchStar | |
| Recording chamber | Custom made | ||
| Power supply | Manson | HCS-3202 | Avoids electrical noise from microscope built-in power supply |
| Vibration isolated table | Newport | M-VW-3636-OPT-01 | |
| Faraday cage | Custom made or any commercial matching table | ||
| Hoses | Any comercial; e.g. Roth | Different sizes and materials for bath handling and application of pipette pressure; agar bridges | |
| Linear shaker | Sunlab Instruments | SU 1000 | |
| Liquid junction potential calculator | Molecular Devices or directly from Peter H. Barry | Program is included in the Clampex aquisition software or can be obtained from p.barry@unsw.edu.au | |
| Data acquisition software | Molecular Devices | Clampex 10.X | |
| Data evaluation software | Molecular Devices | Clampfit 10.X | |
| PsACR1 | GenBank or Addgene | KF992074.1 or Addgene plasmid #85465 | Gene encoding for PsACR1 |
| Amplifier guide | Molecular Devices | The Axon Guide |
References
- Hegemann, P. Algal sensory photoreceptors. Annu. Rev. Plant Biol. 59, 167-189 (2008).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae. Science. 296 (5577), 2395-2398 (2002).
- Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of contractile function in skeletal muscle. Nat. Commun. 6 (7153), 1-8 (2015).
- Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo. Nat. Methods. 7 (11), 897-900 (2010).
- Zhang, F., et al. The microbial opsin family of optogenetic tools. Cell. 147 (7), 1446-1457 (2011).
- Nagel, G., et al. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr. Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
- Li, X., et al. Fast noninvasive activation and inhibition of neural and network activity by vertebrate rhodopsin and green algae channelrhodopsin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (49), 17816-17821 (2005).
- Ishizuka, T., Kakuda, M., Araki, R., Yawo, H. Kinetic evaluation of photosensitivity in genetically engineered neurons expressing green algae light-gated channels. Neurosci. Res. 54 (2), 85-94 (2006).
- Wietek, J., et al. Conversion of channelrhodopsin into a light-gated chloride channel. Science. 344 (6182), 409-412 (2014).
- Berndt, A., et al. Structural foundations of optogenetics: Determinants of channelrhodopsin ion selectivity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 113 (4), 822-829 (2016).
- Tsunoda, S. P., Hegemann, P. Glu 87 of Channelrhodopsin-1 Causes pH-dependent Color Tuning and Fast Photocurrent Inactivation. Photochem. Photobiol. 85 (2), 564-569 (2009).
- Schneider, F., Gradmann, D., Hegemann, P. Ion selectivity and competition in channelrhodopsins. Biophys. J. 105 (1), 91-100 (2013).
- Prigge, M. Über die elektrophysiologische Untersuchung und Entwicklung von farbverschobenen Kanalrhodopsinchimären aus der Grünalge Volvox carteri. , Diss. Humboldt-Universität zu Berlin. Available from: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:11-100203476 (2012).
- Govorunova, E. G., Spudich, E. N., Lane, C. E., Sineshchekov, O. A., Spudich, J. L. New Channelrhodopsin with a Red-Shifted Spectrum and Rapid Kinetics from Mesostigma viride. MBio. 2 (3), 1-9 (2011).
- Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Li, H., Janz, R., Spudich, J. L. Characterization of a highly efficient blue-shifted channelrhodopsin from the marine alga Platymonas subcordiformis. J. Biol. Chem. 288 (41), 29911-29922 (2013).
- Hou, S. -Y., et al. Diversity of Chlamydomonas Channelrhodopsins. Photochem. Photobiol. 88 (1), 119-128 (2012).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat. Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophys. J. 96 (5), 1803-1814 (2009).
- Yizhar, O., et al. Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction. Nature. 477 (7363), 171-178 (2011).
- Berndt, A., Yizhar, O., Gunaydin, L. a, Hegemann, P., Deisseroth, K. Bi-stable neural state switches. Nat. Neurosci. 12 (2), 229-234 (2009).
- Berndt, A., Lee, S. Y., Ramakrishnan, C., Deisseroth, K. Structure-Guided Transformation of Channelrhodopsin into a Light-Activated Chloride Channel. Science. 344 (6182), 420-424 (2014).
- Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Spudich, J. L. Proteomonas sulcata ACR1: A Fast Anion Channelrhodopsin. Photochem. Photobiol. 92 (2), 257-263 (2016).
- Wietek, J., Broser, M., Krause, B. S., Hegemann, P. Identification of a Natural Green Light Absorbing Chloride Conducting Channelrhodopsin from Proteomonas sulcata. J. Biol. Chem. 291 (8), 4121-4127 (2016).
- Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Janz, R., Liu, X., Spudich, J. L. Natural light-gated anion channels: A family of microbial rhodopsins for advanced optogenetics. Science. 349 (6248), 647-650 (2015).
- Neher, E., Sakmann, B., Steinbach, J. H. The extracellular patch clamp: A method for resolving currents through individual open channels in biological membranes. Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. 375 (2), 219-228 (1978).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. Arch. Eur. J. Physiol. 391 (2), 85-100 (1981).
- Barry, P. H. JPCalc, a software package for calculating liquid junction potential corrections in patch-clamp, intracellular, epithelial and bilayer measurements and for correcting junction potential measurements. J. Neurosci. Methods. 51 (1), 107-116 (1994).
- Amtmann, A., Sanders, D. A unified procedure for the correction of liquid junction potentials in patch clamp experiments on endo- and plasma membranes. J. Exp. Bot. 48, (Special) 361-364 (1997).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).
- Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. J. Vis. Exp. (63), e1-e18 (2012).
- Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 84 (21), 7413-7417 (1987).
- Halliwell, J., Whitaker, M., Ogden, D. Using microelectrodes. Microelectrode Tech. Plymouth Work. Handb. 3, 1-15 (1949).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J. Vis. Exp. (20), e1-e2 (2008).
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
- Pusch, M., Neher, E. Rates of diffusional exchange between small cells and a measuring patch pipette. Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. 411 (2), 204-211 (1988).
- Berndt, A. Mechanismus und anwendungsbezogene Optimierung von Channelrhodopsin-2. , Diss Humboldt-Universität zu Berlin. Available from: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:11-100191266 (2011).
- Prigge, M., et al. Color-tuned channelrhodopsins for multiwavelength optogenetics. J. Biol. Chem. 287 (38), 31804-31812 (2012).
- Gradmann, D., Berndt, A., Schneider, F., Hegemann, P. Rectification of the channelrhodopsin early conductance. Biophys. J. 101 (5), 1057-1068 (2011).
- Beppu, K., et al. Optogenetic countering of glial acidosis suppresses glial glutamate release and ischemic brain damage. Neuron. 81 (2), 314-320 (2014).
- Wietek, J., Prigge, M. Enhancing Channelrhodopsins: An Overview. Methods Mol. Biol. 1408, 141-165 (2016).
- Ferenczi, E. A., et al. Optogenetic approaches addressing extracellular modulation of neural excitability. Sci. Rep. 6, 1-20 (2016).
- Zhang, F., et al. Red-shifted optogenetic excitation: a tool for fast neural control derived from Volvox carteri. Nat. Neurosci. 11 (6), 631-633 (2008).
- Sugiyama, Y., et al. Photocurrent attenuation by a single polar-to-nonpolar point mutation of channelrhodopsin-2. Photochem. Photobiol. Sci. 8 (3), 328-336 (2009).
- Kleinlogel, S., et al. Ultra light-sensitive and fast neuronal activation with the Ca2+-permeable channelrhodopsin CatCh. Nat. Neurosci. 14 (4), 513-518 (2011).
- Wang, H., et al. Molecular determinants differentiating photocurrent properties of two channelrhodopsins from chlamydomonas. J. Biol. Chem. 284 (9), 5685-5696 (2009).
- Gradinaru, V., Thompson, K. R., Deisseroth, K. eNpHR: a Natronomonas halorhodopsin enhanced for optogenetic applications. Brain Cell Biol. 36 (1-4), 129-139 (2008).
- Berglund, K., et al. Luminopsins integrate opto- and chemogenetics by using physical and biological light sources for opsin activation. Proc. Natl. Acad. Sci. 113 (3), 358-367 (2016).
