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Neuroscience

चैनलरहादोपिस में आयन की चुनिंदा के इलेक्ट्रोफिज़ियोलोजिकल निर्धारण के लिए पूरे सेल पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग

Published: May 22, 2017 doi: 10.3791/55497
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Experimental Biophysics, Institute of Biology, Humboldt-Universität zu Berlin
* These authors contributed equally

Abstract

पिछले दशक के दौरान, चैनलरहादोपिस तंत्रिका विज्ञान के अनुसंधान में अपरिहार्य बन गए थे, जहां लक्ष्य कोशिकाओं में विद्युत प्रक्रियाओं में गैर-इनवेस्टीज से हेरफेर करने के लिए उन्हें उपकरण के रूप में उपयोग किया जाता है। इस संदर्भ में, चैनलरहादोपसिन की आयन की चुनिंदा विशेष महत्व है। यह लेख एचईके 2 9 3 कोशिकाओं पर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग के माध्यम से प्रोमोमिनस सल्काटा के एक हाल ही में पहचान किए गए आयनों-संचालन चैनलरहादोपसिन के लिए क्लोराइड चयनात्मकता की जांच का वर्णन करता है। हल्के गेट वाले फोटोक्र्रेनों को मापने के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रिया तेजी से स्विच करने की मांग करती है - आदर्श रूप से मोनोक्रैमैटिक-प्रकाश स्रोत जो अन्यथा पारंपरिक पैच-दबाना सेटअप के माइक्रोस्कोप में जुड़ा हुआ है। प्रयोग से पहले की तैयारी प्रक्रियाओं को बफर किए गए समाधान की तैयारी, तरल जंक्शन क्षमता पर विचार, बीज लगाने और कोशिकाओं के अभिकर्मक, और पैचिपिपेट्स खींचने में शामिल किया गया है। वर्तमान-वोल्टेज संबंध की वास्तविक रिकॉर्डिंगएस अलग-अलग क्लोराइड सांद्रता के लिए प्रतिवर्ती क्षमता निर्धारित करने के लिए अभिकर्मक के बाद 24 घंटे से 48 घंटे लगते हैं। अंत में, क्लोराइड प्रवाहकत्त्व के सैद्धांतिक विचारों के संबंध में इलेक्ट्रोफिजिकल डेटा का विश्लेषण किया जाता है।

Introduction

चैनलरहादोपिस (सीआरआर) हल्के गठित आयन चैनल होते हैं जो मोटीइल हरे शैवाल की आंखों में आते हैं, और फोटॉटैक्सिस और फ़ोबिक प्रतिक्रियाओं के लिए प्राथमिक फोटोसर्स के रूप में काम करते हैं I 2002 2 में अपने पहले विवरण के बाद से, ChRs ने ऑप्टोजेनेटिक्स के उभरते क्षेत्र के लिए मार्ग प्रशस्त किया है और विभिन्न प्रकार के उत्तेजनात्मक कोशिकाओं में लागू किया जा सकता है जैसे कंकाल की मांसपेशियों, हृदय या मस्तिष्क 3 , 4 , 5 । लक्ष्य कोशिकाओं में ChRs का अभिव्यक्ति संबंधित सेल के प्रकाश-नियंत्रणीय आयन पारगम्यता में परिणाम करता है। एक न्यूरॉन संबंधी संदर्भ में, यह क्रियान्वयन 6 , 7 , 8 या अवरोध 9 , एक्शन क्षमता (एपी) फायरिंग के 10 - आयन पर निर्भर करता है - स्थानिक और लौकिक के साथ अनुमति देता हैप्रकाश की सटीकता यह बताती है कि चआर वैरिएशन का आयन चयनात्मकता अपने ऑप्टोजेनेटिक अनुप्रयोग को निर्धारित करता है।

क्लैमाडोमोनस रेनहार्तिय और वोल्वोक्स कार्टरि की पहली खोज की गई चीआर प्रोटॉन के लिए प्रचलित हैं, लेकिन यह भी कैल्शियम और मैग्नीशियम 11 , 12 , 13 जैसे द्विपक्षीय अंशों जैसे सोडियम, पोटेशियम और मोटे तौर पर मोनोएटलेंट कॉमेंट्स के लिए है। आज, 70 से अधिक प्राकृतिक ऋषि-संचालन चैनलरहादोपिस (सीसीआर) 14 , 15 , 16 , 17 और कई इंजीनियर संस्करण 18 , 1 9 , 20 विभिन्न गुणों के साथ जैसे Photocurrent आकार, वर्णक्रमीय संवेदनशीलता, कैनेटीक्स, और cation चयनात्मकता उपलब्ध हैं। जबकि तंत्रिका विज्ञान में, सीसीआर एकफिर कोशिकाओं को सक्रिय करने और एपी को ट्रिगर करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है, प्रकाश-संचालित माइक्रोबियल पंप वर्षों तक न्यूरॉन्स को मुंह बंद करने के लिए केवल उपलब्ध विरोधी थे। 2014 में, दो समूहों ने एक साथ दिखाया कि सीसीआर को एनायन-संचालन चैनलरहादोपिस (एसीआर) में परिवर्तित किया जा सकता है, जो पोटिविटी आयन के साथ आणविक इंजीनियरिंग 9 , 21 के माध्यम से छिद्र को नियंत्रित करते हैं। इसके बाद, प्राकृतिक एसीआर की पहचान कई क्रिप्टोफाइट अल्गा 22 , 23 , 24 में हुई थी । सबसे महत्वपूर्ण बात, एसीआर के प्रकाश सक्रियण वयस्क न्यूरॉन्स में क्लोराइड धाराओं की मध्यस्थता करता है, जो न्यूरोनल गतिविधि के निषेचन की अनुमति देता है, जो माइक्रोइबियल पंपों की तुलना में बहुत कम प्रकाश तीव्रता पर होता है, जो केवल प्रति आरोपित फोटान के लिए एकल शुल्क परिवहन करते हैं।

सीएचआर गतिविधि को सीधे HEK293 कोशिकाओं में प्रकाश-प्रेरित धाराओं के इलेक्ट्रोफिजिकल पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग द्वारा संबोधित किया जा सकता है। पैच-दबानातकनीक मूल रूप से 1 9 70 के दशक के अंत में विकसित हुई थी और आगे हामिल एट अल , उच्च मौजूदा संकल्प और झिल्ली वोल्टेज 26 के प्रत्यक्ष नियंत्रण के साथ एक छोटे से सेल (पूरे सेल मोड) से धाराओं की इकाई की रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है। सेल संस्कृति में लागू, यह तकनीक ईओणिक के साथ-साथ विद्युत रिकॉर्डिंग स्थितियों के सटीक नियंत्रण प्रदान करती है, और आयनों के सापेक्ष योगदान के साथ कुल वर्तमान के साथ आयन चयनात्मकता का अध्ययन करने में सक्षम बनाता है। यहाँ हम उच्च क्लोराइड प्रवाहकत्त्व को साबित करने के लिए विभिन्न कोशिकी क्लोराइड सांद्रता के तहत वर्तमान-वोल्टेज संबंधों की रिकॉर्डिंग के माध्यम से प्रोटोनोमोनस सल्काटा (पीसी एसीआर 1) 22 , 23 के आयनों-संचालन चैनलरहादोपसिन के लिए आयन चयनात्मकता की जांच करते हैं।

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Protocol

आकृति 1
चित्रा 1: पैच क्लैंप सेटअप (1) प्रकाश स्रोत, (2) ऑप्टिक फाइबर, (3) प्रोग्राम शटर, (4) अंकीयकरण, (5) शटर चालक, (6) प्रवर्धक, (7) छिड़काव प्रणाली, (8) व्यक्तिगत कंप्यूटर, (9) मॉनिटर (10) फार्डेय पिंजरे (11) खुर्दबीन मंच, (12) छिड़काव इनलेट, (13) छिड़काव आउटलेट, (14) रिकॉर्डिंग चैम्बर, (15) द्रव स्तर सेंसर, (16) अगर ब्रिज के साथ बाथ इलेक्ट्रोड, (17) सूक्ष्मदर्शी दीपक आवास, (22) माइक्रोस्कोप दीपक बिजली की आपूर्ति, (23) पानी से भरी हुई यू-ट्यूब, (24) तीन-तरफ, (18) माइक्रोसेप्पुलेटर, (20) उल्टे माइक्रोस्कोप, (21) माइक्रोस्कोप दीपक आवास, वाल्व, (25) विरोधी कंपन तालिका, (26) सीसीडी कैमरा। ( ए ) फोटो और ( बी ) सेटअप का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। टी के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करेंउसका आंकड़ा

1. रिकॉर्डिंग से पहले सेटअप

इंट्रा। extra.1 extra.2
उच्च क्लोराइड उच्च क्लोराइड कम क्लोराइड
सी [एमएम] सी [एमएम] सी [एमएम]
ना-एएसपी 0 0 140
सोडियम क्लोराइड 110 140 0
KCl 1 1 1
CsCl 1 1 1
CaCl 2 2 2 2
एमजीसीएल 2 2 2 2
HEPES 10 10 10
EGTA 10 0 0
पीएच 7.2 7.2 7.2
परासारिता 290 एमओएसएम 320 एमओएसएम 320 एमओएसएम

तालिका 1: बुफोर्ड सॉल्यूशन के आयनिक संरचना। एचईके कोशिकाओं में क्लोराइड चयनात्मक प्रयोगों के लिए इंटरासेल्युलर (इंट्रा।) और बाह्य (अतिरिक्त) बफ़र्स की संरचना संकेताक्षर प्रयोग किया जाता है: इथाइलीन ग्लाइकोल टेट्राएसिटिक एसिड (ईजीटीए), 4- (2-हाइड्रोक्सिथाइल) -1-पिपारजीथेनसल्फोनिक एसिड (एचईपीईएस) और एस्पेरेटेट (एएसपी)। सभी सांद्रता मिमी में हैं

  1. तालिका 1 में बताए अनुसार आयन सांद्रता के साथ रिकॉर्डिंग समाधान तैयार करें।
    1. एमजीसीएल 2 , CaCl 2 , केएलएल और सीएससीएल के लिए अतिपरंपरी के पानी में 15 एमएल 2 एम स्टॉक समाधान तैयार करें।
    2. Intracellular के 100 एमएल के लिए ठोस घटक वजन औरअलग-अलग बीकर में तालिका 1 के अनुसार बाह्य बफर समाधानों के 500 एमएल और बाद में तैयार किए गए शेयर समाधानों की संबंधित राशि जोड़ते हैं। उदाहरण के लिए, इंट्रासेल्युलर बफर के लिए, 0.3803 ग्राम (10 मिमी) ईजीटीए, 0.2383 ग्राम (10 मिमी) इफेस और 0.6428 ग्राम (110 मिमी) NaCl का उपयोग करें और 2 एम एमजीसीएल 2 और CaCl 2 और 50 μL के 100 μL जोड़ें 2 एम केएलएल और सीएससीएल स्टॉक समाधान।
    3. अल्ट्रापायर का पानी जोड़ें और पीएच एसिड और कुर्सियां ​​का उपयोग करके सावधानी से समायोजित करें, जो माप के साथ हस्तक्षेप न करें, अर्थात सीआरआर, जैसे कि साइट्रिक एसिड और एन-मिथाइल-डी-ग्लूकामाइन (एनएमजी + ) द्वारा नहीं किया जाता है।
    4. ग्लोकोस के साथ बाह्य समाधान के लिए इंट्रासेल्युलर के लिए ऑब्ज़ोलॉरिटी 290 एमओएसएम और 320 एमओएसएम को समायोजित करें।
      नोट: थोड़ा सा hypoosmotic intracellular समाधान 26 patching की सफलता दर में वृद्धि
    5. 0.22-माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से सभी समाधान बाँझ फ़िल्टर। स्टोर दो सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर समाधान करेंएस या लंबी अवधि के भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज।
  2. तरल जंक्शन क्षमता की गणना करें और रिकॉर्डिंग प्रोटोकॉल तैयार करें।
    नोट: पूरे सेल कॉन्फ़िगरेशन की स्थापना के बाद बाह्य क्लोराइड एकाग्रता में परिवर्तन एक महत्वपूर्ण तरल जंक्शन क्षमता (एलजेपी) का कारण बनता है जिसे 27 , 28 को ठीक करना है । एलजेपीएस को सीधे मापा या गणना किया जा सकता है, यहां पर बाद का विकल्प उपयोग किया जाता है। इस प्रोटोकॉल में, प्रत्येक बाहरी बफर के लिए एक रिकॉर्डिंग प्रोटोकॉल की मांग करने पर ऑन लाइन सुधार का उपयोग किया जाएगा। हालांकि, बाह्य समाधानों के एक बड़े सेट के लिए, एलजेपी के बाद के सुधार की अनुशंसा है कि गलत सुधार से बचने के लिए।
    1. जंक्शन संभावित कैलकुलेटर (जेपीसी) खोलें और 'नई प्रयोग' संवाद को खोलें। फिर "पैच क्लैंप मापन" का चयन करें "पूरे सेल माप", "मानक नमक-समाधान इलेक्ट्रोड" का चयन करें और एक तापमान दर्ज करें25 डिग्री सेल्सियस प्रत्येक चरण के बीच, "अगला" बटन दबाकर चयन स्वीकार करके आगे बढ़ो।
      नोट: प्रयोगों को वातानुकूलित प्रयोगशाला में 25 डिग्री सेल्सियस के कमरे के तापमान पर किया जाता है। प्रयोगों को शुरू करने से पहले सुनिश्चित करें कि बफर समाधान के पास कमरे का तापमान है। नमूना तापमान भिन्न करने के लिए एक ऊष्मायन चरण या कक्ष का उपयोग किया जा सकता है। स्नान तापमान को अक्सर थर्मामीटर से मापा जा सकता है
    2. तालिका 1 में सूचीबद्ध सांद्रता के अनुसार सभी व्यक्तिगत आयनों और पाइपेटेड समाधान और उच्च क्लोराइड बफर के सीमेंट सांद्रता को जोड़ें
      नोट: जेपीसी प्रारंभिक स्थितियों के लिए -0.5 एमवी के एलजेपी की गणना करेगा।
    3. कम क्लोराइड बफर के एनोनिक और cationic संरचना में प्रवेश करने के लिए "नया स्नान समाधान" पर क्लिक करें।
      नोट: जेपीसी अब बदले हुए बाह्य रिकॉर्डिंग समाधान के अनुसार + 12.6 एमवी के एक नए एलजेपी की गणना करेगा।
    4. इसके लिए दो एलजेपी-सही प्रोटोकॉल तैयार करेंलागू होल्डिंग क्षमता से गणना वाली LJP को घटाकर दो माप की शर्तें; उच्च क्लोराइड बाहरी समाधान के लिए -5.5 एमवी और + 12.6 एम वी। इस प्रकार प्रोटोकॉल क्रमशः -79.5 एमवी (उच्च क्लोराइड) और -92.6 एमवी (कम क्लोराइड) के साथ शुरू होता है- दोनों मामलों में एलजेपी-सही शुरू करने वाली क्षमता -80 एमवी की क्षमता।
      नोट: सामग्री सूची में उल्लिखित डेटा अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर के लिए निम्न चरण लागू होते हैं।
    5. अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में प्रोटोकॉल संपादक खोलें। "मोड" मेनू पर स्विच करें "एपिसोडिक उत्तेजना" का चयन करें और 7 sweeps शामिल करें
    6. संपादक में "वेवफॉर्म" मेनू पर स्विच करें और 200 एमएस की अवधि में 0 एमवी के साथ संभावित क्षमता रखो और 2 एस की अवधि के साथ-साथ उच्च क्लोराइड के लिए -79.5 एमवीआर से शुरू होने वाले क्षमता को अलग करना। प्रत्येक स्वीप में 20 एमवी तक होल्डिंग क्षमता बढ़ाने के लिए दूसरी अवधि के लिए 20 एमवी का "डेल्टा स्तर" शामिल करें
    7. तरंग एड के वोल्टेज चरणों के भीतरयह 540 एनएम प्रकाश (3.10 मेगावाट / मिमी²) के साथ 500 एमएस की रोशनी की अवधि लागू करता है। ऐसा करने के लिए, जुड़ा शटर के "डिजिटल बिट पैटर्न" को बदल दें जो प्रकाश स्रोत को ऊपर वर्णित दूसरी अवधि के बाद 500 एमएस सक्रिय करने के लिए नियंत्रित करता है (1.2.6 देखें)।
      नोट: प्रकाश की तीव्रता चैनल प्रवाह के बायोफिजिकल गुणों जैसे आयाम या निष्क्रियता को प्रभावित कर सकती है। इसलिए, प्रकाश शक्ति घनत्व हमेशा सूचित किया जाना चाहिए। सभी प्रकाशिकी और कंसलिप के माध्यम से जाने के बाद प्रकाश की शक्ति को मापने के लिए, एक कैलिब्रेटेड ऑप्टोमीटर का उपयोग करें शक्ति घनत्व की गणना करने के लिए, वस्तु के प्रबुद्ध क्षेत्र का पता लगाने के लिए किसी ऑब्जेक्ट माइक्रोमीटर को निर्धारित करें और निर्धारित प्रबुद्ध क्षेत्र में मापा प्रकाश शक्ति को विभाजित करें।
    8. उच्च क्लोराइड कोशिकी समाधान के लिए प्रोटोकॉल को बचाएं। प्रोटोकॉल को संशोधित करें और -92.6 एमवी (कम बाहरी क्लोराइड) की क्षमता वाले पहले स्तर को बदल दें। कम क्लोराइड कोशिकीय स्थिति को मापने के लिए यह दूसरा प्रोटोकॉल सहेजें।
    9. अनुकूली प्रोटोकॉल 29 के अनुसार कांच के आवरण की लसिन-कोटिंग
      1. एक ग्लास पेट्री डिश में कई 100 कवर फिसलने रखें और 250 एमएल एचसीएल (1 एन) जोड़ें।
      2. कवर के साथ पेट्री डिश रखें एक रैखिक प्रकार के बरतन पर फिसल जाता है और 72 घने के लिए 120 rpm पर आच्छादन को कवर करने के लिए फिसल जाता है और बाद में पीएच को बेअसर करने के लिए ultrapure पानी से कुल्ला।
      3. आगे की सफाई के लिए इन्हें 95% इथेनॉल की एक छोटी मात्रा में भिगोएँ।
        नोट: आगे बढ़ने से पहले साफ कवर स्लिप्स 70% इथेनॉल में संग्रहीत किया जा सकता है। निम्न चरणों के लिए लामिना का प्रवाह हुड के तहत काम
      4. बन्सन बर्नर और चिमटी का उपयोग करना, प्रत्येक कवर पर्ची की लौ और उसे एक नया पेट्री डिश में स्थानांतरित करना।
      5. 150 आरपीएम पर एक रैखिक प्रकार के बरतन के साथ मिलाते हुए कमरे के तापमान पर कम से कम 1 घंटे (या रात भर) के लिए एक बाँझ 50 माइक्रोग्राम / एमएल पॉली-डी-लाइसिन समाधान के साथ ग्लास आवरण फिसल जाता है।
      6. अतिरिक्त पाली-डी-लाइसिन को हटाने के लिए आवरण पानी के साथ ढक्कन धो लें।
      7. 10 मिनट तक सूखने के लिए बाँझ कागज पर कवर फिसल जाता है, और उन्हें नसबंदी (कम से कम 20 मिनट) के लिए यूवी प्रकाश में उजागर करें।
      8. इकट्ठा कवर का उपयोग करने तक एल्यूमीनियम पन्नी में कवर बाँझ पेट्री डिश में फिसल जाता है।
    10. पीएस एसीआर 1 जीन के डीएनए को मानक आणविक जीव विज्ञान तकनीकों का उपयोग कर एमकेरी में जोड़ा गया।
      1. मानव कोडोन-अनुकूलित जीन अनुक्रम एपीपीएसी एन्कोडिंग पीजीएफपी-सी 1 प्लास्मिड (सीएमवी प्रोमोटर, कनामाइसीन प्रतिरोध) में एमसीररी फ्लोरोफोरे के साथ प्रतिबंध एंजाइम या अन्य स्थापित क्लोनिंग विधियों का उपयोग करते हैं।
        नोट: अन्य फ्लोरोफोर्स का प्रयोग भी किया जा सकता है, लेकिन सेटअप में सूक्ष्मदर्शी के तहत उनके प्रतिदीप्ति का निरीक्षण करने के लिए संबंधित फिल्टर-सेट उपलब्ध कराने का ध्यान रखें।
      2. मानक प्रोटोकॉल के अनुसार गर्मी झटका के माध्यम से रसायनज्ञ डीएनए में चेमोकापेटेंट एक्सएल 1 ब्लू ई कोली कोशिकाओं में बदलना और उन्हें अगर प्लेट (30 माइक्रोग्राम / एमएल कनामाईसीन) 30
      3. अगले दिन, एकल कॉलोनियों से कोशिकाओं के साथ 30 मिलीग्राम / एमएल कानामीस्किन के साथ 4 एमएल लाइज़ोजनी शोरबा मध्यम को टीका लगाना और रात में उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस और इनक्यूबेटर में 180 आरपीएम पर सेवन करना चाहिए।
      4. रातोंरात ऊष्मायन के बाद, निर्माता के निर्देशों के अनुसार व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट ( सामग्री तालिका देखें) का उपयोग करके संस्कृतियों के प्लाज्मिड डीएनए को शुद्ध करें।
    11. कोशिकाओं बीज
      नोट: लामिना का प्रवाह हुड के तहत कदम उठाएं।
      1. 35 लीमीटर वाली पेट्री डिश में तीन लीसेन-लेपित कांच के आवरण तक तरफ रखें।
        नोट: धीरे-धीरे उन्हें एक दूसरे पर फिसलकर रोकने के लिए पकवान के नीचे से दबाएं
      2. प्रत्येक डिश में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के साथ पूरक 2 एमएल मानक डल्बेकेडो के संशोधित ईगल मध्यम (डीएमईएम) में बीज 1.5 एक्स 10 5 एचईके कोशिकाओं।
      3. अनुपूरक सब- ट्रांस रेटिना पर1 माइक्रोन का अंतिम एकाग्रता चरण 1.6 से आगे बढ़ने से पहले कम से कम एक दिन के लिए कोशिकाओं को बढ़ाना।
    12. लिपॉफिटेशन 31 के माध्यम से कोशिकाओं को ट्रांस-ट्रांसरीट ट्रांसफ़ेक्ट किया जाता है
      1. कोशिकाओं के प्रत्येक डिश के लिए, एफडीएस के बिना 250 μL डीएमईएम और 6 μL अभिकर्मक अभिकर्मक ( सामग्री तालिका देखें) में प्लाज्मिड डीएनए (चरण 1.4 में तैयार) के 2 माइक्रोग्राम का समाधान तैयार करें।
      2. ऊष्मायन के 15 मिनट के बाद, धीरे (ड्रॉप डाउन) कोशिकाओं के समाधान जोड़ें
    13. अगर पुल तैयार करें
      1. 0.75 जी agarose 50 एमएल बाँझ सोडियम क्लोराइड समाधान (140 मिमी) जोड़ें और एक माइक्रोवेव में हीटिंग द्वारा इसे भंग।
        नोट: अगर 2 से 3 एम केएल के लिए एगर पुल तैयारी अधिक एकाग्रता (पुल से लगातार प्रसार) और के + और सीएल आयनों की समान गतिशीलता के कारण एलजेपी कम कर देता है, लेकिन आयन कम करने से बचा जाता है (विशेषकर सीएल-) रिसाव टी में वह स्नान समाधान 32
      2. एक सिरिंज का उपयोग करते हुए तरल एगरोज़ समाधान के साथ 10 μL विंदुक युक्तियाँ (या एक छोटा व्यास नली) भरें।
        नोट: पुल में हवाई बुलबुले से बचें
      3. अगर पुल को ठंडा और मजबूत किया जाता है, तो उन्हें बाँझ 140 एमएम सोडियम क्लोराइड समाधान में रखें।
    14. रिकॉर्डिंग और बाथ इलेक्ट्रोड तैयार करें
      1. पैच क्लैंप सेटअप के स्नान और रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के चांदी के तार हटा दें।
      2. पिछले प्रयोगों से चांदी क्लोराइड को हटाने के लिए सैंडपेपर के साथ तारों को पोलिश करें। 3 एम केएलएल में साफ चांदी के तार को विसर्जित करें और चांदी क्लोराइड के साथ इलेक्ट्रोलाइटिक कोटिंग के लिए 1.5 वी बैटरी के सकारात्मक ध्रुव से कनेक्ट करें।
        नोट: किसी लैब की बिजली की आपूर्ति का उपयोग किसी बैटरी के बजाय किया जा सकता है।
    15. एक माइक्रोप्रिप्ले पुल के साथ गिलास केशिका से कम प्रतिरोध पैच pipettes (1.5-3.0 एम.यू.) खींचो और ब्राउन एट अलLass = "xref"> 33 माप के दिन के लिए धूल-मुक्त स्टोर pipettes।
    16. काम करने के तापमान 30 मिनट पूर्व रिकॉर्डिंग तक गर्म करने के लिए सभी सेटअप घटकों को चालू करें। सुनिश्चित करें कि बफ़र्स कमरे के तापमान पर हैं

    2. चयन मापन

    1. 1.6 में वर्णित कोशिकाओं के क्षणिक अभिकर्मक के बाद रिकॉर्डिंग 24 से 48 घंटे शुरू करें
    2. मापने के कक्ष में एक कवर पर्ची रखें और बाहरी बफर के रिसाव को रोकने के लिए सिलिकॉन के साथ इसे सील करें। प्रयोगों के अगले सेट के लिए इनक्यूबेटर में अन्य कवर के साथ पेट्री डिश स्टोर करें।
    3. कक्षों को अलग करने से रोकने के लिए बाह्य बफर (उच्च [सीएल - ]) के साथ कक्ष को ध्यान से भरें, फिर इसे माइक्रोस्कोप के नीचे रखें और सेल विज़ुअलाइज़ेशन के लिए 40X उद्देश्य का उपयोग करें।
    4. बाथ इलेक्ट्रोड के ऊपर एक एगर पुल डालें और तरल स्तर संवेदक और बाथ हैंडलर के छिड़काव आउटलेट के साथ चैंबर में रखें।
    5. एक्सचेंज एक्सअवशिष्ट संस्कृति माध्यम और पृथक कोशिकाओं को हटाने के लिए दोहरी समाधान के साथ दो बार ताजा बाहरी समाधान (उच्च [सीएल-]) के 1 एमएल।
    6. कोशिकाओं को फोकस में लाएं और ट्रांसफ़ेक्ट (फ्लोरोसेंट) सेल की खोज करें, जिसे अन्य कोशिकाओं से पृथक होना चाहिए। MCherry को उत्तेजित और कल्पना करने के लिए ट्रिपल-बैंड फ़िल्टर-सेट और ऑरेंज लाइट (590 एनएम बैंडविड्थ 15 एनएम; 100% तीव्रता) का उपयोग करें
      नोट: एचईके कोशिकाओं को गैप जंक्शन जंक्शन 34 द्वारा अपने पड़ोसियों के लिए विद्युत रूप से जोड़ा जा सकता है जिससे पूरे सेल कॉन्फ़िगरेशन में कम झिल्ली प्रतिरोध हो।
    7. इंट्रासेल्युलर समाधान वाले खींचा गए पाइपटेप्स में से एक को भरें और पिपेट को कई बार फ्लिप करके हवा के बुलबुले को हटा दें।
    8. पिपेट धारक पर पिपेट को माउंट करें और टिप को पकड़ने से रोकने के लिए कुछ सकारात्मक दबाव डालें।
    9. सूक्ष्मदर्शी के नीचे पैच विंदुक की नोक का पता लगाएं और माइक्रोमैनेइपुलेटर का उपयोग करके सेल के पास उसे नेविगेट करें।
      नोट: निम्न चरणों का पालन करें aसामग्री सूची में उल्लिखित, प्रवर्धक, डाटा अधिग्रहण और मूल्यांकन सॉफ्टवेयर।
    10. डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में "झिल्ली परीक्षण" प्रारंभ करें और "झिल्ली परीक्षण" चलाने के दौरान "बाथ मोड" का उपयोग करके मैन्युअल रूप से स्वचालित रूप से स्वचालित रूप से स्वचालित रूप से एक स्वचालित वोल्टेज चरण (परीक्षण पल्स, 10 एमएस के लिए 5 एमवी, 0 एमवी पर बेसलाइन) को लागू करें डाटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में
    11. जांच करें कि विंदुक प्रतिरोध वांछित श्रेणी में है (1.5-3.0 एमयू)।
    12. "झिल्ली परीक्षण" के "स्नान मोड" में काम करते समय प्रक्षेपक पर पिपेट ऑफसेट घुंडी बदलकर विंदुक क्षमता को समायोजित करके शून्य ऑफसेट धाराएं।
    13. संपूर्ण-सेल कॉन्फ़िगरेशन 26 में एक पैच स्थापित करें
      नोट: निम्न चरणों में प्रयुक्त पिपेट धारक की ओर की बंदरगाह को दिया सकारात्मक और नकारात्मक दबाव के आवेदन की आवश्यकता होती है। यह एक सिरिंज का उपयोग करके, मुंह का टुकड़ा या इलेक्ट्रॉनिक रूप से जुड़ा हो सकता हैTrolled दबाव नियामक इस प्रोटोकॉल में एक मुंह टुकड़ा के माध्यम से सकारात्मक और नकारात्मक दबाव लागू किया जाता है।
      1. धीरे से ऊपर से पैच विंदुक के साथ सेल दृष्टिकोण और इसे छूने से पहले सकारात्मक दबाव सही दूर।
        नोट: जब टिप सेल के नजदीक होती है, तो प्रतिरोध थोड़ा ऊपर उठता है; यह परीक्षण पल्स के एक कम आकार से संकेत मिलता है।
      2. "बाथ मोड" से "पैच मोड" में "झिल्ली परीक्षण" को बदलें, इस प्रकार कोशिकाओं की उम्मीद की आराम करने की संभावना (-30 से -40 एमवी) के लिए होल्डिंग की क्षमता।
      3. कुछ मामलों में, सेल से सम्बद्ध विन्यास सकारात्मक दबाव (2.13.1) के रिलीज होने के बाद ही बना रहता है, यदि नहीं, तो धीरे-धीरे गिग्जियल गठन की सहायता के लिए नकारात्मक दबाव लागू करें।
        नोट: सेल से जुड़ी विन्यास स्थापित किया जाता है जब परीक्षण पल्स को दो छोटी कैपेसिटिव चोटियों तक नाड़ी की शुरुआत और अंत में कम किया जाता है और झिल्ली प्रतिरोध GΩ रेंज में होता है; -60 एमवी मी तक नकारात्मक वोल्टेजIgeseal गठन की सुविधा।
      4. परीक्षण पल्स की एक सपाट प्रतिक्रिया पाने के लिए "पिपेट कैपेसिटेंस मुआवजा" knobs मोड़ के द्वारा पिपेट समाई क्षतिपूर्ति।
      5. पैच को बिना किसी दबाव के छोटे दालों या बढ़ती ताकत के साथ नकारात्मक दबाव को लागू करने के लिए सील को नष्ट करने के बिना, पूरे सेल की संरचना प्राप्त करने के लिए पैच को तोड़ना।
        नोट: सेल-अनुलग्नक से पूरे सेल कॉन्फ़िगरेशन में सफल संक्रमण को कैपेसिटिव चोटियों की वृद्धि से दर्शाया गया है।
      6. वांछित धारण वोल्टेज के झिल्ली की क्षमता के सटीक क्लैंपिंग के लिए प्रयुक्त एम्पलीफायर के पूरे सेल पैरामीटर और मुआवजा समायोजन सेट करके श्रृंखला प्रतिरोध मुआवजा लागू करें।
        1. "श्रृंखला प्रतिरोध मुआवजा" पैनल में "झिलमिलन परीक्षण" को "भविष्यवाणी" और "सुधार" पर 90% तक के मोर्चे से बचने और कैपेसिटिव प्रतिक्रिया की दोलन से "पूरे सेल" मोड पर स्विच करें, पूरे सेल को चालू करेंमुआवजा स्विच और एक उपयुक्त फ्लैट परीक्षण सील प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए एक पुनरावृत्त रास्ते में एम्पलीफायर के उचित सामने-पैनल knobs ("पूरे सेल क्षमता" और "श्रृंखला प्रतिरोध") के साथ पूरे सेल पैरामीटर समायोजित करें।
          नोट: श्रृंखला प्रतिरोध मुआवजे और सुधार के विस्तृत विवरण के लिए एम्पलीफायर मैनुअल या दिशानिर्देश देखें, क्योंकि यह प्रक्रिया अलग-अलग बनाती है।
      7. पूरे सेल कॉन्फ़िगरेशन की स्थापना के बाद, पैच विंदुक 35 के माध्यम से intracellular समाधान के लिए पर्याप्त प्रतिस्थापन सुनिश्चित करने के लिए रिकॉर्डिंग से कम से कम 2 मिनट प्रतीक्षा करें।
    14. पूर्व निर्धारित प्रोटोकॉल का प्रयोग करके अलग-अलग होल्डिंग क्षमताओं पर प्रकाश-प्रेरित धाराओं को रिकॉर्ड करें (1.2 में)।
    15. पैच को नष्ट किए बिना कम से कम पांच बार कक्ष में कम [सीएल - ] के बाह्य बफर को एक्सचेंज करें और किसी अन्य वर्तमान-वोल्टेज संबंध ( सीएफ चरण 1.2) को रिकॉर्ड करें।वह नए क्लोराइड एकाग्रता
      नोट: स्वचालित बफ़र विनिमय के लिए एक छिड़काव प्रणाली इस प्रक्रिया की सुविधा देती है, लेकिन आवश्यक नहीं है।
    16. दोहराएं 2.15 प्रत्येक आयनिक स्थिति की जांच के लिए, लेकिन ऊपर वर्णित "झिल्ली परीक्षण" के माप के बीच पैच की गुणवत्ता को बार-बार जांचें।
      नोट: सटीक झिल्ली वोल्टेज की गारंटी के लिए और स्थिर इंट्रासेल्युलर आयन संरचना झिल्ली प्रतिरोध 500 एम.ओ. से ​​ऊपर होना चाहिए, जबकि पहुंच प्रतिरोध 10 एमई को पार नहीं करना चाहिए, देखें । 2.12.6)। झिल्ली परीक्षण के लिए पूरे सेल पैरामीटर मुआवजा बंद करने के लिए मत भूलना।
    17. दोहराएँ 2.2 2.15 के लिए कई कोशिकाओं के लिए, लेकिन कोशिकाओं की स्वस्थता सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक परीक्षण श्रृंखला के लिए एक नया कवर पर्ची ले।

    3. डेटा मूल्यांकन

    1. रोशनी से पहले मतलब वर्तमान को घटाकर प्रत्येक वर्तमान ट्रेस की आधार रेखा समायोजित करें।
    2. औसत स्थिर photocurrant I एस की गणना करें ( नोट: प्रोटोकॉल या वैज्ञानिक प्रश्न के आधार पर स्थिर फोटोकॉर्चंट निर्धारित करने के लिए पीक फोटोकरेन्ट्स का विश्लेषण करें या औसत की लंबाई भिन्न करें।
    3. सभी परीक्षणित परिस्थितियों और विभिन्न कोशिकाओं के लिए चरण 3.1) और 3.2 को दोहराएं।
    4. निर्धारित होल्डिंग क्षमता बनाम निर्धारित फोटोक्रेट्स प्लॉट करें
      नोट: यदि एकाधिक माप औसत हो, तो व्यक्तिगत रिकॉर्डिंग को एक निर्दिष्ट शर्त या सेल की समाई के लिए सामान्यीकृत किया जा सकता है।
    5. वोल्टेज अक्ष के साथ वर्तमान वोल्टेज संबंध के प्रतिच्छेदन प्रतिवर्ती क्षमता का प्रतिनिधित्व करता है (शुद्ध वर्तमान शून्य है)। दो पड़ोसी डेटा बिंदुओं के बीच रैखिक प्रक्षेप द्वारा इसे निर्धारित करें।
      नोट: अगर फोटोकरेन्ट्स का कोई विरोधाभास नहीं है, तो अंतराल बिंदु के सन्निकटन को प्राप्त करने के लिए शून्य के करीब पिछले दो बिंदुओं से रैखिक रूप से एक्सट्रपोल करें।
    6. निर्धारित निर्धारित औसतएक ही परिस्थितियों के लिए उत्पीड़न क्षमता और बाहरी बफर समाधान ( सीएफ। चित्रा 2 बी ) की क्लोराइड एकाग्रता के खिलाफ उन्हें साजिश करें।

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Representative Results

चित्रा 2 चित्रा 2 वर्णित प्रोटोकॉल निम्नलिखित मापन से प्राप्त प्रतिनिधि परिणाम दिखाता है। हरे रंग की रोशनी के साथ रोशनी के दौरान, पीसी एसीआर 1 एक त्वरित क्षणिक वर्तमान सुविधाएँ पेश करता है जो एक स्थिर वर्तमान स्तर को तेजी से घटा देता है। प्रकाश बंद होने के बाद, फोटोकरेन्स मिसाइल के भीतर शून्य से क्षय ( चित्रा 2 ए )। बाहरी क्लोराइड एकाग्रता का आदान-प्रदान, उत्परिवर्तनीय क्षमता की एक शिफ्ट का कारण बनता है जिसे प्रत्यक्ष रूप से हासिल किए गए फोटोकॉर्टर निशान में देखा जा सकता है। कई मापों से परावर्तन क्षमता का मूल्यांकन, बाह्य क्लोराइड एकाग्रता ( चित्रा 2 बी ) के भिन्नरूप के कारण नाटकीय उत्क्रमण की संभावित पारी का मात्रा देता है। Strikingly, मापा रिवर्सल क्षमता सीधे क्लोराइड ( चित्रा 2 सी ) के लिए गिने गए Nernst क्षमताओं से मेल खाते हैं जो एसीआर 1 की उच्च क्लोराइड चयनात्मकता की पुष्टि करते हैं।

टी "के लिए: रख-एक साथ। अंदर-पेज =" 1 "> चित्र 2
चित्रा 2: पीएस एसीआर 1 की क्लोराइड चयनात्मकता ( ए ) HEK293 कोशिकाओं में पीसी एसीआर 1 के प्रतिनिधि वर्तमान निशान। इंट्राससेल्युलर क्लोराइड एकाग्रता को 120 मिमी में रखा गया था, जबकि बाह्य सांद्रता Na-Aspartate के साथ NaCl के आंशिक प्रतिस्थापन से 150 मिमी (हरी) से 10 मिमी (बैंगनी) क्लोराइड से भिन्न है। होल्डिंग क्षमता 20 एमवी चरण में -80 एमवी से +40 एमवी (एलजेपी सही) में बढ़ी थी। ( बी ) औसतन मौजूदा-वोल्टेज संबंध (ए = 6 की स्थितियों के अनुरूप) ( सी ) रिवर्सल पॉजिलेन्स (मध्य रेखाएं माध्यिकाएं इंगित करती हैं, बॉक्स की सीमा 25 वें और 75 वें प्रतिशतियों से संकेत देती है, कंधों में 2-बार मानक विचलन होता है और सर्कल एक डाटा पॉइंट्स को दर्शाता है) जो वर्तमान-वोल्टेज संबंधों से निकाले जाते हैं। उच्च क्लोराइड कॉन के लिएडायशन (हरा) वैल्यू रैखिक रूप से -20 एमवी और 0 एमवी होल्डिंग क्षमता के बीच अंतरित किया गया था, जबकि मूल्य रैखिक रूप से +40 एमवी (बैंगनी, डैश्ड लाइन, पैनल बी) के ऊपर एक्सट्रापोलाटेड था। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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Discussion

परिभाषित आयनिक और विद्युत परिस्थितियों में प्रतिवर्ती क्षमता का निर्धारण, आयन प्रजातियों के बारे में जानकारी प्रदान करता है जो कि ChRs के प्रकाश सक्रियण के बाद ले जाया जाता है। यदि विशेष रूप से एक आयन प्रजातियों के एक जटिल शारीरिक माध्यम में भिन्नता है और सैद्धांतिक Nernst क्षमता के अनुसार प्राप्त उलटा संभावित बदलाव, यह आयन प्रजातियों केवल परिवहन किया गया एक है।

हालांकि, सीआरआर के लिए, रिवर्सल संभावित बदलावों को आम तौर पर कम से कम स्पष्ट किया जाता है क्योंकि एनर्नस्ट समीकरण से उम्मीद की जाती है क्योंकि अलग-अलग ईओण प्रजातियों के लिए पारगम्यता के साथ-साथ आयोजित आयनों के बीच प्रतियोगिता भी होती है। इस मामले में, स्थिति अधिक जटिल हो जाती है और सभी संभावित रूप से आयोजित आयनों को अलग-अलग तरीके से मापने के लिए अलग-अलग विमर्श किया जाना चाहिए। इसके अलावा, अधिकांश सीसीआर और पहले कृत्रिम एसीआर 9 , 10 , 21 प्रोटॉन के लिए प्रवाहकीय हैं , लेकिन प्रोटोन ध्यान केंद्रितटीयन को एक विशेष रूप से गहन विश्लेषण की आवश्यकता होती है, क्योंकि प्रोटॉन एकाग्रता न केवल प्रत्यावर्तन क्षमता को बदल सकती है, लेकिन हाइड्रोजन बंधन नेटवर्क के परिवर्तन के कारण आयन प्रवाहकत्त्व 9 , फोटोकरेनेट की कैनेटीक्स 21 , 36 और वर्णक्रमीय प्रकाश संवेदनशीलता 11 , 37 को प्रभावित कर सकती है, प्रोटोनेशन स्टेट व्यक्तिगत अवशेषों और माध्यमिक संरचना परिवर्तन प्रोटॉन के प्रवाहकत्त्व को अन्य संभावित संभावित आयनों जैसे ना + , सीए 2+ या सीएल के सांद्रता को कम करके संबोधित किया जा सकता है - उपरोक्त उल्लिखित प्रोटीन परिवर्तनों से बचने के लिए पीएच निरंतरता को बनाए रखते हुए। गैर-संचालित विकल्प आमतौर पर भारी होते हैं, एनएमजी + 12 के लिए एनएमजी + और ग्लूकोनेट, 2- ( एन- मॉर्फोलिनो) ईथेनसफोणेट (एमईएस - ) या आयनों के लिए aspartate जैसे अणुओं का आरोप है। अलग-अलग i में उलटा संभावितता की तुलना करनाओनिक सॉल्यूशंस तो गोल्डमैन-हॉजकिन-काटज वोल्टेज समीकरण द्वारा संतुलन की स्थिति में सापेक्ष आयन पारगम्यता की गणना की अनुमति देता है। समतुल्य स्थितियों से परे आयन प्रतियोगिता पर विचार करने वाले नेट फोटोकरेन्ट्स के विभिन्न आयनों की सटीक योगदान को जटिल गणितीय मॉडल 12 , 38 की आवश्यकता है ।

ChRs द्वारा ले जाया गया आयनों की संरचना को जानने से, विशेष रूप से न्यूरोफिज़ियोलॉजिकल संदर्भ में, ChR अनुप्रयोग से उत्पन्न संभावित साइड इफेक्ट्स को स्पष्ट करने में मदद मिलती है। उदाहरण के लिए, लंबे समय तक चआर सक्रियण के कारण इंट्रासेल्युलर एसिडिफिकेशन 39 हो सकता है या सीए -2 + को अनियंत्रित रिलीज और दूसरा मैसेन्जर मार्ग 40 चूंकि कोशिकाओं को आमतौर पर ऊतकों में कसकर पैक किया जाता है, माइक्रोबियल रोडोप्सिन की सक्रियता केवल इंट्रासेल्युलर आयन संरचना को प्रभावित नहीं कर सकती है बल्कि बाहरी ल्यूमन को भी प्रभावित करती है, इस प्रकार यह प्रभावित करती है nअघोषित कोशिकाओं 41

आयन चयनात्मकता के बावजूद, फोटोकॉर्टर अम्प्लीट्यूड्स, निष्क्रियता, वर्णक्रमीय या हल्के संवेदनशीलता और गतिज गुण जैसे ChRs के अन्य जैव-भौतिक सुविधाओं अक्सर ऑप्टोजेनेटिक तकनीकों से जुड़े प्रयोगों का संचालन, डिजाइन और व्याख्या करने में रुचि होती है। इन गुणों में से कुछ को ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल से भी निर्धारित किया जा सकता है 18 , 37 , 42 । सीआरआर एक्सप्रेस व्यक्त की प्रकाश संवेदनशीलता की जांच करने के लिए, प्रकाश की तीव्रता को प्रकाश स्रोत की शक्ति का समायोजन या तटस्थ घनत्व फिल्टर के साथ सक्रियण प्रकाश को कम करके अलग-अलग किया जा सकता है। वर्णक्रमीय संवेदनशीलता प्राप्त करने के लिए, एक रंगीन प्रकाश स्रोत की आवश्यकता होती है और तीव्रता को सभी तरंग दैर्ध्यों के लिए बराबर फोटोन फ्लक्स और बैंडविड्थ में समायोजित किया जाना चाहिए। उच्च तीव्रता वाले स्पेक्ट्रा केवल फोटोरिसेप्टर के अवशोषण स्पेक्ट्रा के समान होते हैं यदि कम प्रकाश दालों यालेजर फ्लैश का इस्तेमाल किया जाता है, अन्यथा अनुकूलन घटनाएं और फोटोकिकल बैक रिएक्शन हो सकते हैं। आंशिक रूप से पूरी तरह सक्रिय CHR (समग्र फोटोकॉकेकल टर्नओवर समय) से पुनर्प्राप्ति की जांच से दो हल्के दालों के बीच गहरे अंतराल बढ़ने के साथ एक डबल पल्स प्रोटोकॉल लागू करके जांच की जा सकती है। प्रायोगिक आवश्यकताओं के अनुरूप उपयुक्त CHR चुनने के लिए ऊपर चर्चा किए गए ChRs के बायोफिजिकल गुण महत्वपूर्ण हैं।

इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल तकनीकों द्वारा इन बायोफिजिकल गुणों को सीधे प्राप्त करना प्रोटीन फ़ंक्शन जैसा दिखता है जो कि स्पेक्ट्रोस्कोपिक विधियों से बहुत कम है। वोल्टेज-क्लैम्प माप की सफलतापूर्वक स्थापना के बाद, इस तकनीक को साइट-निर्देशित उत्परिवर्तन 9 , 11 , 43 , 44 , हेलिक्स-फेरबदल 37 जैसे प्रोटीन इंजीनियरिंग दृष्टिकोण के साथ जोड़ा जा सकता है । 46 का परिचय या अन्य प्रोटीन 41 , 47 के साथ संलयन। इसने सीआरआर और आपरेशन के उनके मोड के बारे में आणविक ज्ञान बढ़ा दिया है और बदलती कैनेटीक्स, प्रवाहकत्त्व, वर्णक्रमीय संवेदनशीलता और आयन चयनात्मकता 40 के साथ सीएचआर वेरिएंट्स की एक उच्च विविधता बनाई है।

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Acknowledgments

उत्कृष्ट सहयोग के लिए हम मेला रेह, थारसेना थर्मिंगम और विशेष रूप से अल्टीना क्लेन का धन्यवाद करते हैं यह काम जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (डीएफजी) (एसएफबी 1078 बी 2, फॉर 1279 एसपीपी 1665 से पीएच) और उत्प्रेरण एकत्रीकरण अवधारणाओं का क्लस्टर, यूनिटाट, बिग-एनएसई (जेवी) और ई 4 (पीएच) के द्वारा समर्थित था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEK293 cells Sigma Aldrich 85120602 Human embryonic kidney cells
Retinal Sigma Aldrich R2500 all-trans retinal
FuGENE HD Promega E2312 Transfection reagent
DMEM Biochrome FG 0445 Dulbecco's Modified Eagle Medium
Agarose Roth 3810 Agar bridges
CaCl2 Roth 5239 CaCl2 2H2O
CsCl Biomol 2452
EGTA Roth 3054
FBS Biochrome S0615 Cell culture
Glucose Roth HN06 D(+)-Glucose
KCl Roth 6781
MgCl2 Roth 2189 MgCl2 6H2O
NaCl Roth 3957
NMG Sigma Aldrich M2004 N-Methyl-D-glucamine
Na-Aspartate Sigma Aldrich A6683 L-Aspartic acid sodium salt monohydrate
Citric acid Roth 6490
AgeI ThermoFischerScientific ER1462 Restriction enzyme
XhoI ThermoFischerScientific ER0695 Restriction enzyme
NheI ThermoFischerScientific ER0975 Restriction enzyme
XL1Blue E. coli Agilent Technologies 200249 Chemocompetent E. coli
Kanamycin Roth T832
Lysogeny broth medium Roth X964
Agar-Agar Roth 6494 Agar plates
Plasmid purification kit Marchery-Nagel 740727.25
Penicilin/Streptomycin Biochrome A 2213 Cell culture
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma Aldrich P6407-5MG Cover slip coating
Microforge Custom made Fire polishing
Serological pipettes TPP Different sizes
Clean bench Kojair Biowizard SL130
Stirrer IKA RCT classic
Silver wire Science Products AG-T25; AG-T10 Electrodes, 0.64 mm (bath); 0.25 mm (electrode)
pH-meter Knick 765 Calimetric
Osmometer Vogel OM 815
Microscope Carl Zeiss ID03 Fire polishing
CO2 incubator Binder CB150
Cell culture dishes TPP 93040 34 mm internal diameter
Cover slips Roth P232 15 mm diameter
Thermometer Rössel Messtechnik MTM12
Beamsplitter Chroma 21011 90/10 transmission
Pipette holder ALA Scientific Instruments PPH-1P-AXU-0-1.5
Headstage Molecular Devices CV203BU
Amplifier Molecular Devices AxoPatch200B
Digitizer Molecular Devices DigiData1400 Digital analog converter
Lightsource TILL Photonics Polychrome V Set to 540 nm full intensity
Microscope Carl Zeiss Axiovert 100
Shutter Vincent Associates VS25
Shutter driver Vincent Associates VCM-D1
Glass capilarries Warner Instruments G150F-3 Boresilicate capillaries with fire polished ends OD 1.5 mm ID  0.86 mm
Micropipette puller Sutter Instruments P1000
Bath handler Lorenz Messgerätebau MPCU
Tripleband filterset Chroma 69008 Fluorescence filter  ECFP/EYFP/mCherry 
CCD camera Watec Wat-221SCCD
Optometer Gigahertz Optik P9710 Measure light intensities
Objective Carl Zeiss 421462-9900-000 W Plan-Apochromat 40X/1.0 DIC
Micromanipulator Scientifica PatchStar
Recording chamber Custom made
Power supply Manson HCS-3202 Avoids electrical noise from microscope built-in power supply
Vibration isolated table Newport M-VW-3636-OPT-01
Faraday cage Custom made or any commercial matching table
Hoses Any comercial; e.g. Roth Different sizes and materials for bath handling and application of pipette pressure; agar bridges
Linear shaker Sunlab Instruments SU 1000
Liquid junction potential calculator Molecular Devices or directly from Peter H. Barry Program is included in the Clampex aquisition software or can be obtained from  p.barry@unsw.edu.au
Data acquisition software Molecular Devices Clampex 10.X
Data evaluation software Molecular Devices Clampfit 10.X
PsACR1 GenBank or Addgene KF992074.1 or Addgene plasmid #85465 Gene encoding for PsACR1
Amplifier guide Molecular Devices The Axon Guide

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 123 जीवभौतिकीय एकल इलेक्ट्रोड वोल्टेज क्लैंप पूरे सेल विन्यास HEK293 सेल ऑप्टोगनेटिक्स चैनलरहादोपसिन फोटोकॉर्ंट चयनात्मकता उत्क्रमण संबंधी संभावित जंक्शन क्षमता क्लोराइड आयन
चैनलरहादोपिस में आयन की चुनिंदा के इलेक्ट्रोफिज़ियोलोजिकल निर्धारण के लिए पूरे सेल पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग
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Grimm, C., Vierock, J., Hegemann,… More

Grimm, C., Vierock, J., Hegemann, P., Wietek, J. Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins. J. Vis. Exp. (123), e55497, doi:10.3791/55497 (2017).

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