Abstract
In den letzten zehn Jahren wurden Channelrhodopsine in der neurowissenschaftlichen Forschung unentbehrlich, wo sie als Werkzeuge zur nicht-invasiven Manipulation elektrischer Prozesse in Zielzellen verwendet werden. In diesem Zusammenhang ist die Ionenselektivität eines Kanalrhodopsins von besonderer Bedeutung. Dieser Artikel beschreibt die Untersuchung der Chloridselektivität für ein kürzlich identifiziertes anion-leitendes Kanalrhodopsin von Proteomonas sulcata über elektrophysiologische Patch-Clamp-Aufnahmen auf HEK293-Zellen. Das experimentelle Verfahren zur Messung von lichtgesteuerten Photoströmen erfordert eine schnell umschaltbare - idealerweise monochromatische - Lichtquelle, die in das Mikroskop eines ansonsten konventionellen Patch-Clamp-Setups eingekoppelt ist. Vorbereitende Verfahren vor dem Experiment werden unter Berücksichtigung von gepufferten Lösungen, Überlegungen über Flüssigkeitsübergangspotentiale, Seeding und Transfektion von Zellen und Ziehen von Patchpipetten skizziert. Die tatsächliche Aufzeichnung der Strom-Spannungs-BeziehungS zur Bestimmung der Umkehrpotentiale für verschiedene Chloridkonzentrationen findet nach der Transfektion 24 h bis 48 h statt. Schließlich werden elektrophysiologische Daten in Bezug auf theoretische Überlegungen zur Chloridleitung analysiert.
Introduction
Channelrhodopsine (ChR) sind lichtgesteuerte Ionenkanäle, die im Augenfleck von beweglichen Grünalgen vorkommen und als primäre Photosensoren für Phototaxis und phobische Reaktionen dienen 1 . Seit ihrer ersten Beschreibung im Jahr 2002 haben die ChRs den Weg für das entstehende Feld der Optogenetik geebnet und können in einer Vielzahl von erregbaren Zellen angewendet werden, z. B. in Skelettmuskeln, im Herzen oder im Gehirn 3 , 4 , 5 . Die Expression von ChRs in Zielzellen führt zu einer lichtsteuerbaren Ionenpermeabilität der jeweiligen Zelle. In einem neuronalen Kontext ermöglicht dies die Aktivierung 6 , 7 , 8 oder die Hemmung 9 , 10 des Aktionspotentials (AP), die - abhängig vom geführten Ion - mit dem räumlichen und zeitlichen abfeuertPräzision des Lichts, die hervorhebt, wie die Ionenselektivität einer ChR-Variante ihre optogenetische Anwendung bestimmt.
Die ersten entdeckten ChRs von Chlamydomonas reinhardtii und Volvox carteri sind für Protonen durchlässig, aber auch für monovalente Kationen wie Natrium, Kalium und in geringerem Maße zu zweiwertigen Kationen wie Calcium und Magnesium 11 , 12 , 13 . Heute sind mehr als 70 natürliche kationenleitende Kanalrhodopsine (CCRs) 14 , 15 , 16 , 17 und mehrere konstruierte Varianten 18 , 19 , 20 mit unterschiedlichen Eigenschaften wie Photostromgröße, spektrale Empfindlichkeit, Kinetik und Kationenselektivität stehen zur Verfügung. Während in der Neurowissenschaften, CCRs aRe verwendet, um Zellen zu aktivieren und APs auszulösen, waren lichtgetriebene mikrobielle Pumpen die einzigen verfügbaren Antagonisten für die Stummschaltung von Neuronen seit Jahren. Im Jahr 2014 zeigten zwei Gruppen gleichzeitig, dass CCRs durch Veränderung der Polarität entlang der putativen Ionen leitenden Pore über molekulare Technik 9 , 21 in anion-leitende Kanalrhodopsine (ACRs) umgewandelt werden können . Anschließend wurden natürliche ACRs in mehreren Kryptophytenalgen 22 , 23 , 24 identifiziert. Am wichtigsten ist, dass die Lichtaktivierung von ACRs Chloridströme in erwachsenen Neuronen vermittelt, was eine Hemmung der neuronalen Aktivität bei viel geringeren Lichtintensitäten ermöglicht als mikrobielle Pumpen, die nur einzelne Ladungen pro absorbiertem Photon transportieren.
Die ChR-Aktivität kann direkt durch elektrophysiologische Patch-Clamp-Aufnahmen von lichtinduzierten Strömen in HEK293-Zellen adressiert werden. Die Patch-ClampTechnik wurde ursprünglich in den späten 1970er Jahren entwickelt und weiter verbessert von Hamill et al. , Wodurch die Aufzeichnung der Entität von Strömen aus einer kleinen Zelle (Ganzzellenmodus) mit hoher Stromauflösung und direkter Steuerung der Membranspannung 26 ermöglicht wird. In der Zellkultur angewendet, bietet diese Technik eine genaue Kontrolle sowohl der ionischen als auch der elektrischen Aufzeichnungsbedingungen und ermöglicht die Untersuchung der Ionenselektivität zusammen mit dem relativen Beitrag der Ionen zum Gesamtstrom. Hier veranschaulichen wir die Untersuchung der Ionenselektivität für das anion-leitende Kanalrhodopsin von Proteomonas sulcata ( Ps ACR1) 22 , 23 über die Aufzeichnung von Strom-Spannungs-Beziehungen unter verschiedenen extrazellulären Chlorid-Konzentrationen, um eine hohe Chlorid-Leitfähigkeit zu beweisen.
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Protocol
Abbildung 1: Patch-Clamp-Setup. (1) Lichtquelle, (2) optische Faser, (3) programmierbarer Verschluss, (4) Digitalisierer, (5) Blendenautomat, (6) Verstärker, (7) Perfusionssystem, (8) Personal Computer, (9) Monitor (11) Perfusionseinlass, (13) Perfusionsauslass, (14) Aufzeichnungskammer, (15) Flüssigkeitsstandssensor, (16) Badelektrode mit Agarbrücke, (17) Pipettenhalter, (18) Kopfstufe, (19) Mikromanipulator, (20) invertiertes Mikroskop, (21) Mikroskop-Lampengehäuse, (22) mikroskopische Lampenstromversorgung, (23) wassergefüllte U-Rohr, (24) dreiseitig Ventil, (25) Antivibrationstisch, (26) CCD-Kamera. ( A ) Fotografien und ( B ) schematische Darstellung des Aufbaus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version von t anzuzeigenSeine Figur.
1. Vor der Aufnahme aufstellen
| Intra | Extra.1 | Extra.2 | |
| Hochchlorid | Hochchlorid | Niedriges Chlorid | |
| C [mM] | C [mM] | C [mM] | |
| Na-ASP | 0 | 0 | 140 |
| NaCl | 110 | 140 | 0 |
| KCl | 1 | 1 | 1 |
| CsCl | 1 | 1 | 1 |
| CaCl & sub2 ; | 2 | 2 | 2 |
| MgCl & sub2 ; | 2 | 2 | 2 |
| Heiligt | 10 | 10 | 10 |
| EGTA | 10 | 0 | 0 |
| PH-Wert | 7.2 | 7.2 | 7.2 |
| Osmolarität | 290 mOsm | 320 mOsm | 320 mOsm |
Tabelle 1: Ionische Zusammensetzung der gepufferten Lösungen. Zusammensetzung von intrazellulären (intra) und extrazellulären (Extra-) Puffern für Chloridselektivitätsversuche in HEK-Zellen. Verwendete Abkürzungen: Ethylenglykoltetraessigsäure (EGTA), 4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure (HEPES) und Aspartat (ASP). Alle Konzentrationen sind in mM.
- Bereiten Sie die Aufzeichnungslösungen mit Ionenkonzentrationen vor, wie in Tabelle 1 angegeben.
- Vorbereitung von 15 ml 2 M Stammlösungen in Reinstwasser für MgCl 2 , CaCl 2 , KCl und CsCl.
- Wiegen der festen Bestandteile für 100 ml des intrazellulären und500 ml der extrazellulären gepufferten Lösungen nach Tabelle 1 in getrennte Bechergläser gegeben und danach die jeweilige Menge der vorbereiteten Stammlösungen zugegeben. Zum Beispiel für den intrazellulären Puffer verwenden Sie 0,3803 g (10 mM) EGTA, 0,2383 g (10 mM) HEPES und 0,6428 g (110 mM) NaCl und geben 100 & mgr; l der 2 M MgCl 2 und CaCl 2 und 50 & mgr; l der 2 M KCl- und CsCl-Stammlösungen
- Reinigen Sie Wasser und pflegen Sie den pH-Wert sorgfältig mit Säuren und Basen, die die Messung nicht beeinträchtigen, dh nicht von der ChR durchgeführt werden, wie z. B. Zitronensäure und N-Methyl-D-glucamin (NMG + ).
- Die Osmolarität auf 290 mOsm für die intrazelluläre und auf 320 mOsm für die extrazellulären Lösungen mit Glukose anpassen.
Anmerkung: Leicht hypoosmotische intrazelluläre Lösungen erhöhen die Erfolgsquote des Patchings 26 . - Sterilfilter alle Lösungen durch 0,22 μm Filter. Lagern Sie Lösungen bei 4 ° C für zwei WochenS oder bei -20 ° C für Langzeitlagerung einfrieren.
- Berechnen Sie die Flüssigkeitsübergangspotentiale und erstellen Sie Aufzeichnungsprotokolle.
HINWEIS: Die Änderung der extrazellulären Chloridkonzentration nach der Herstellung der Ganzzellkonfiguration führt zu einem signifikanten Flüssigkeitsübergangspotential (LJP), das korrigiert werden muss 27 , 28 . LJPs können direkt gemessen oder berechnet werden, hier wird die letztere Option verwendet. In diesem Protokoll wird eine On-line-Korrektur verwendet, die ein Aufzeichnungsprotokoll für jeden externen Puffer erfordert. Für einen größeren Satz von externen Lösungen wird jedoch eine Nachkorrektur von LJP empfohlen, um eine falsche Korrektur zu vermeiden.- Öffnen Sie den Knotenpunktrechner (JPC) 27 und öffnen Sie den Dialog 'Neuer Experiment'. Wählen Sie dann "Patch-Clamp-Messungen". Wählen Sie "Ganzzellen-Messungen", "Standard Salz-Lösung Elektrode" und geben Sie eine Temperatur von25 ° C Zwischen jedem Schritt gehen Sie vorwärts, indem Sie die Auswahl durch Drücken der "nächsten" Taste annehmen.
HINWEIS: Die Versuche werden bei einer Raumtemperatur von 25 ° C in einem klimatisierten Labor durchgeführt. Stellen Sie sicher, dass Pufferlösungen vor Beginn der Experimente Raumtemperatur haben. Um die Probentemperatur zu variieren, kann eine Inkubationsstufe oder Kammer verwendet werden. Die Badtemperatur kann häufig mit einem Thermometer gemessen werden. - Fügen Sie alle individuellen Anionen- und Kationenkonzentrationen der pipettierten Lösung und des hochchloridhaltigen Puffers gemäß den in Tabelle 1 aufgeführten Konzentrationen hinzu.
HINWEIS: Der JPC berechnet für die Startbedingungen einen LJP von -0,5 mV. - Klicken Sie auf "New Bath Solution", um die anionische und kationische Zusammensetzung des Low-Chlorid-Puffers einzugeben.
HINWEIS: Der JPC berechnet nun einen neuen LJP von +12,6 mV entsprechend der geänderten extrazellulären Aufzeichnungslösung. - Vorbereitung von zwei LJP-korrigierten Protokollen für dieZwei Messbedingungen durch Subtrahieren des berechneten LJP von dem angelegten Haltepotential; -0,5 mV für die hohen und +12,6 mV für die Lösungen mit niedrigem Chloridgehalt. So beginnen die Protokolle mit -79,5 mV (hohem Chlorid) und -92,6 mV (niedriges Chlorid), um jeweils ein LJP-korrigiertes Ausgangs-Haltepotential von -80 mV in beiden Fällen zu erhalten.
HINWEIS: Für die in der Materialliste genannte Datenerfassungssoftware gelten folgende Schritte. - Öffnen Sie den Protokoll-Editor in der Erfassungssoftware. Wechseln Sie in das Menü "Mode" und wählen Sie "Episodic Stimulation" und beinhalten 7 Sweeps.
- Wechseln Sie in das Editor "Waveform" im Editor und beinhalten eine Periode von 200 ms mit 0 mV Haltepotential, gefolgt von einer 2 s Periode mit unterschiedlichem Haltepotential ab -79,5 mV für hochchlorid. Füge eine "Delta-Ebene" von 20 mV für die zweite Periode ein, um das Haltepotential um 20 mV in jedem Sweep zu erhöhen.
- Innerhalb der Spannungsschritte der Wellenform edEs wird eine 500 ms Beleuchtungsdauer mit 540 nm Licht (3,10 mW / mm²) angewendet. Um dies zu tun, ändern Sie das "digitale Bitmuster" des angeschlossenen Verschlusses, der die Lichtquelle steuert, um aktiv zu sein, um 500 ms nach der zweiten oben beschriebenen Periode (siehe 1.2.6).
HINWEIS: Die Lichtintensität kann biophysikalische Eigenschaften von Kanalströmen wie Amplitude oder Inaktivierung beeinflussen. Daher sollten immer Lichtleistungsdichten gemeldet werden. Um die Lichtleistung nach Durchlaufen aller Optiken und des Deckglases zu messen, verwenden Sie ein kalibriertes Optometer. Um die Leistungsdichte zu berechnen, bestimmen Sie das beleuchtete Feld des Objektivs durch einen Objektmikrometer und teilen die gemessene Lichtleistung durch das ermittelte beleuchtete Feld auf. - Speichern Sie das Protokoll für die extrachloruläre Lösung mit hohem Chloridgehalt. Ändern Sie das Protokoll und ersetzen Sie das Potential der ersten Stufe durch -92,6 mV (niedriges externes Chlorid). Speichern Sie dieses zweite Protokoll, um den extrazellulären Zustand mit niedrigem Chlorid zu messen.
- Lysinbeschichtung von Glasabdeckungen nach angepasstem Protokoll 29 .
- Legen Sie mehrere 100 Deckgläser in eine Glas-Petrischale und geben Sie 250 ml HCl (1 N).
- Legen Sie die Petrischale mit dem Deckel auf einen linearen Schüttler und schütteln Sie bei 120 U / min für 72 h, um die Deckgläser zu reinigen und anschließend mit hochreinem Wasser abzuspülen, um den pH-Wert zu neutralisieren.
- Einweichen in einem kleinen Volumen von 95% Ethanol zur weiteren Reinigung.
HINWEIS: Saubere Deckgläser können in 70% Ethanol gelagert werden, bevor sie fortfahren. Arbeiten Sie unter laminarer Strömungshaube für die folgenden Schritte. - Mit einem Bunsenbrenner und Pinzette, flammt jeder Deckel und überträgt ihn in eine neue Petrischale.
- Inkubieren Sie die Glasdeckel mit einer sterilen 50 μg / ml Poly-D-Lysinlösung für mindestens 1 h (oder über Nacht) bei Raumtemperatur unter Schütteln mit einem linearen Shaker bei 150 U / min.
- Waschen Sie die Deckgläser mit Reinstwasser, um überschüssiges Poly-D-lysin zu entfernen.
- Die Deckgläser auf sterilem Papier auftragen, um 10 min zu trocknen und sie UV-Licht für die Sterilisation (mindestens 20 min) auszusetzen.
- Sammeln Sie die Deckgläser in eine sterile Petrischale, die in Aluminiumfolie bis zum Gebrauch bedeckt ist.
- Vorbereitung der DNA des Ps ACR1-Gens, das mit mCherry unter Verwendung von Standard-Molekularbiologie-Techniken fusioniert ist.
- Klonieren Sie die menschliche Codon-optimierte Gensequenz, die für Ps ACR1 kodiert, in ein peGFP-C1-Plasmid (CMV-Promotor, Kanamycinresistenz) im Rahmen mit dem mCherry-Fluorophor unter Verwendung von Restriktionsenzymen oder anderen etablierten Klonierungsverfahren.
Anmerkung: Andere Fluorophore können auch verwendet werden, aber stellen Sie sicher, dass die entsprechenden Filter-Sets zur Verfügung stehen, um ihre Fluoreszenz unter dem Mikroskop im Setup zu beobachten. - Die Plasmid-DNA in chemokompatible XL1Blue E. coli- Zellen über Hitzeschock nach Standardprotokoll umwandeln und auf Agarplatten (30 μg / ml Kanamycin) 30 plattieren
- Am nächsten Tag wird 4 ml Lysogen-Brühe-Medium mit 30 μg / ml Kanamycin mit Zellen aus einzelnen Kolonien geimpft und über Nacht bei 37 ° C und 180 U / min in einem Inkubator inkubiert.
- Nach der Inkubation über Nacht die Plasmid-DNA aus den Kulturen unter Verwendung eines handelsüblichen Kits (siehe Werkstofftabelle ) gemäß den Anweisungen des Herstellers reinigen.
- Klonieren Sie die menschliche Codon-optimierte Gensequenz, die für Ps ACR1 kodiert, in ein peGFP-C1-Plasmid (CMV-Promotor, Kanamycinresistenz) im Rahmen mit dem mCherry-Fluorophor unter Verwendung von Restriktionsenzymen oder anderen etablierten Klonierungsverfahren.
- Samen die Zellen
HINWEIS: Führen Sie Schritte unter einer laminaren Strömungshaube durch.- Platzieren Sie bis zu drei lysinbeschichtete Glasabdeckungen nebeneinander in einer 35-mm-Petrischale.
HINWEIS: Drücken Sie sie vorsichtig gegen den Boden der Schale, um ein Verrutschen zu vermeiden. - Samen 1,5 x 10 5 HEK-Zellen in 2 mL Standard Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) in jeder Schale.
- Ergänzung all- trans retinal beiEine Endkonzentration von 1 μM Wachsen Sie die Zellen für mindestens einen Tag, bevor Sie mit Schritt 1.6 fortfahren.
- Platzieren Sie bis zu drei lysinbeschichtete Glasabdeckungen nebeneinander in einer 35-mm-Petrischale.
- Die Zellen vorübergehend durch Lipofektion 31 transfizieren.
- Für jede Schale von Zellen wird eine Lösung von 2 & mgr; g Plasmid-DNA (wie in Schritt 1.4 hergestellt) in 250 & mgr; l DMEM ohne FBS und 6 & mgr; l Transfektionsreagenz hergestellt (siehe Materialtabelle ).
- Nach 15 min Inkubation, sanft (tropfenweise) die Lösung zu den Zellen hinzufügen.
- Agarbrücken vorbereiten
- Füge 0,75 g Agarose zu 50 ml steriler Kochsalzlösung (140 mM) hinzu und löst sie durch Erhitzen in einer Mikrowelle auf.
HINWEIS: 2 - 3 M KCl für die Agarbrückenpräparation reduziert LJP aufgrund höherer Konzentration ( z. B. konstante Diffusion von der Brücke) und gleicher Mobilität von K + - und Cl - Ionen, wurde aber vermieden, um Ionen - (insbesondere Cl - ) - Leckagen zu minimieren In t Er Badlösung 32 . - Füllen Sie 10 μl Pipettenspitzen (oder einen kleinen Durchmesser Schlauch) mit der flüssigen Agarose-Lösung mit einer Spritze.
HINWEIS: Vermeiden Sie Luftblasen in der Brücke. - Nachdem die Agarbrücken abgekühlt und verfestigt sind, lagern sie in steriler 140 mM Natriumchloridlösung.
- Füge 0,75 g Agarose zu 50 ml steriler Kochsalzlösung (140 mM) hinzu und löst sie durch Erhitzen in einer Mikrowelle auf.
- Bereiten Sie Aufzeichnungs- und Badelektroden vor.
- Entfernen Sie die Silberdrähte des Bades und der Aufzeichnungselektrode des Patch-Clamp-Setups.
- Polieren Sie die Drähte mit Sandpapier, um Silberchlorid aus früheren Experimenten zu entfernen. Tauchen Sie den sauberen Silberdraht in 3 M KCl ein und verbinden Sie ihn mit dem Pluspol einer 1,5 V Batterie für die elektrolytische Beschichtung mit Silberchlorid.
HINWEIS: Eine Laborstromversorgung kann anstelle einer Batterie verwendet werden.
- Ziehen Sie niedrigfeste Patchpipetten (1,5-3,0 MΩ) aus Glaskapillaren mit einem Mikropipettenabzieher und feuern Sie sie wie von Brown et alLass = "xref"> 33. Pipetten für den Tag der Messung staubfrei aufbewahren.
- Schalten Sie alle Setup-Komponenten auf, um die Arbeitstemperatur 30 min vorherige Aufnahmen aufzuheizen. Stellen Sie sicher, dass die Puffer bei Raumtemperatur sind.
2. Selektivitätsmessungen
- Starten Sie die Aufnahmen 24 bis 48 h nach der transienten Transfektion der in 1.6 beschriebenen Zellen.
- Legen Sie einen Deckel in die Messkammer und verschließen Sie ihn mit Silikon, um ein Austreten des externen Puffers zu vermeiden. Lagern Sie die Petrischale mit den anderen Deckgläschen in einem Inkubator für den nächsten Satz von Experimenten.
- Füllen Sie die Kammer vorsichtig mit extrazellulärem Puffer (hoch [Cl - ]), um das Ablösen von Zellen zu verhindern, legen Sie sie dann unter das Mikroskop und verwenden Sie das 40X-Ziel für die Zellvisualisierung.
- Setzen Sie eine Agarbrücke über die Badelektrode und legen Sie sie zusammen mit dem Flüssigkeitsstandssensor und dem Perfusionsauslass des Badbehandlers in die Kammer.
- Tauschen Sie die exTrazelluläre Lösung zweimal mit 1 ml frischer externer Lösung (hoher [Cl - ]), um restliches Kulturmedium und abgetrennte Zellen zu entfernen.
- Bringen Sie die Zellen in den Fokus und suchen Sie nach einer transfizierten (fluoreszierenden) Zelle, die von anderen Zellen isoliert werden muss. Verwenden Sie ein Triple-Band-Filter-Set und orangefarbenes Licht (590 nm, Bandbreite 15 nm, 100% Intensität), um mCherry anzuregen und zu visualisieren.
ANMERKUNG: HEK-Zellen können mit ihren Nachbarn durch Spaltübergänge 34 elektrisch gekoppelt werden, was zu einem geringen Membranwiderstand in der Ganzzellkonfiguration führt. - Füllen Sie eine der gezogenen Pipetten mit intrazellulärer Lösung und entfernen Sie Luftblasen, indem Sie die Pipette mehrmals umklappen.
- Montieren Sie die Pipette auf den Pipettenhalter und wenden Sie einen positiven Druck an, um ein Verstopfen der Spitze zu verhindern.
- Finden Sie die Spitze der Patchpipette unter dem Mikroskop und navigieren Sie es in der Nähe der Zelle mit dem Mikromanipulator.
HINWEIS: Die folgenden Schritte gelten für die aMplifier, Datenerfassungs- und Auswertesoftware, die in der Materialliste erwähnt wird. - Starten Sie den "Membrantest" in der Datenerfassungssoftware und setzen Sie einen Spannungsschritt (Testimpuls, zB 5 mV für 10 ms, Grundlinie bei 0 mV), manuell oder automatisch über spezifizierte Software mit "Badbetrieb" bei laufendem "Membrantest" In der Datenerfassungssoftware.
- Prüfen Sie, ob der Pipettenwiderstand im gewünschten Bereich liegt (1,5-3,0 MΩ).
- Zero Offset-Ströme durch Einstellen des Pipettenpotentials durch Drehen des Pipetten-Offset-Reglers am Verstärker während der Arbeit im "Bad-Modus" des "Membran-Tests".
- Festlegen eines Patches in der Ganzzellenkonfiguration 26 .
HINWEIS: Die folgenden Schritte erfordern die Anwendung von positivem und negativem Druck, der an den Seitenanschluss des verwendeten Pipettenhalters geliefert wird. Dies geschieht durch die Verwendung einer Spritze, über ein Mundstück oder eine elektronisch kon-Trolled Druckregler. In diesem Protokoll werden positiver und negativer Druck über ein Mundstück angelegt.- Langsam nähern sich die Zelle mit der Patchpipette von oben und entlasten den positiven Druck direkt vor dem Berühren.
HINWEIS: Wenn die Spitze in der Nähe der Zelle liegt, wird der Widerstand leicht ansteigen; Dies wird durch eine reduzierte Größe des Testimpulses angezeigt. - Ändern Sie den "Membrantest" vom "Bad-Modus" in den "Patch-Modus" und damit das Haltepotential auf das erwartete Ruhepotential der Zellen (-30 bis -40 mV).
- In einigen Fällen bildet sich die zellengebundene Konfiguration nach Freigabe des positiven Drucks (2.13.1), wenn nicht, sanft einen Unterdruck anwenden, um die Gigasealbildung zu unterstützen.
HINWEIS: Die mit der Zelle verbundene Konfiguration wird hergestellt, wenn der Testimpuls zu zwei kleinen kapazitiven Peaks am Anfang und am Ende des Pulses reduziert wird und der Membranwiderstand im GΩ-Bereich liegt; Negative Spannungen bis zu -60 mV mDie gigaseale Bildung erleichtern - Kompensieren Sie die Pipettenkapazität, indem Sie die "Pipettenkapazitätskompensations" -Regler drehen, um eine flache Antwort des Testimpulses zu erhalten.
- Bringen Sie den Patch ohne Zerstörung der Dichtung, indem Sie kurze Impulse von Unterdruck oder Unterdruck mit zunehmender Festigkeit anwenden, um eine Ganzzellkonformation zu erhalten.
HINWEIS: Der erfolgreiche Übergang von der Zelle-zu-Ganz-Zelle-Konfiguration wird durch eine Erhöhung der kapazitiven Peaks angezeigt. - Die Widerstandskompensation durch die Einstellung von Ganzzellenparametern und Kompensationsanpassungen des verwendeten Verstärkers zur genauen Klemmung des Membranpotentials auf die gewünschte Haltespannung anwenden.
- Schalten Sie den "Membrantest" in den "Ganzzellen" -Modus, in der "Serie Widerstandskompensation" -Panel schalten Sie "Vorhersage" und "Korrektur" bis zu 90% Vermeidung von Überschreitungen und Oszillation der kapazitiven Antwort, drehen Sie die ganze ZelleKompensation einschalten und ganze Zellenparameter mit den entsprechenden Fronttastenknöpfen ("Ganzzellenkapazität" und "Serienwiderstand") des Verstärkers auf iterative Weise einstellen, um eine ideal flache Testversiegelungsreaktion zu erhalten.
HINWEIS: Für detaillierte Beschreibung der Serienwiderstandskompensation und -korrektur wird auf das Handbuch des Verstärkers oder der Richtlinie verwiesen, da dieses Verfahren bei verschiedenen Herstellern variiert.
- Schalten Sie den "Membrantest" in den "Ganzzellen" -Modus, in der "Serie Widerstandskompensation" -Panel schalten Sie "Vorhersage" und "Korrektur" bis zu 90% Vermeidung von Überschreitungen und Oszillation der kapazitiven Antwort, drehen Sie die ganze ZelleKompensation einschalten und ganze Zellenparameter mit den entsprechenden Fronttastenknöpfen ("Ganzzellenkapazität" und "Serienwiderstand") des Verstärkers auf iterative Weise einstellen, um eine ideal flache Testversiegelungsreaktion zu erhalten.
- Nach der Festlegung der Ganzzellkonfiguration mindestens 2 Minuten vor der Aufnahme warten, um einen ausreichenden Austausch der intrazellulären Lösung durch die Patchpipette 35 zu gewährleisten.
- Langsam nähern sich die Zelle mit der Patchpipette von oben und entlasten den positiven Druck direkt vor dem Berühren.
- Notieren Sie lichtinduzierte Ströme bei unterschiedlichen Haltepotentialen, indem Sie die zuvor eingestellten Protokolle (in 1.2) verwenden.
- Tauschen Sie den extrazellulären Puffer in der Kammer mindestens fünfmal aus, um den Patch zu zerstören und eine neue Stromspannungsbeziehung ( vgl. Schritt 1.2) bei t aufzuzeichnenEr neue Chloridkonzentration.
HINWEIS: Ein Perfusionssystem für automatisierten Pufferaustausch erleichtert diesen Prozess, ist aber nicht notwendig. - Wiederholung 2.15. Für jeden zu testenden Ionenzustand, aber wiederholt die Qualität des Pflasters zwischen den Messungen durch einen oben beschriebenen "Membrantest" zu überprüfen.
HINWEIS: Um eine genaue Membranspannung und eine stabile intrazelluläre Ionenzusammensetzung zu gewährleisten, sollte der Membranwiderstand über 500 MΩ liegen, während der Zugriffswiderstand 10 MΩ nicht übersteigen sollte . 2.12.6). Vergessen Sie nicht, die Ganzzellenparameterkompensation für den Membrantest auszuschalten. - Wiederholung 2.2. Auf 2,15. Für mehrere Zellen, aber nehmen Sie einen neuen Deckzettel für jede Testreihe, um die Gesundheit der Zellen zu gewährleisten.
3. Datenauswertung
- Passen Sie die Grundlinie jeder aktuellen Spur an, indem Sie den mittleren Strom vor der Beleuchtung subtrahieren.
- Berechnen Sie den mittleren stationären Photostrom I s (
- Wiederholen Sie die Schritte 3.1) und 3.2) für alle getesteten Bedingungen und verschiedene Zellen.
- Zeichnen Sie die ermittelten Photoströme gegenüber dem jeweiligen Haltepotential ab.
HINWEIS: Wenn mehrere Messungen gemittelt werden, können einzelne Aufnahmen auf eine bestimmte Bedingung oder die Kapazität der Zelle normiert werden. - Der Schnittpunkt der Strom-Spannungs-Relation mit der Spannungsachse stellt das Umkehrpotential dar (Nettostrom ist Null). Bestimmen Sie es durch lineare Interpolation zwischen den beiden benachbarten Datenpunkten.
HINWEIS: Wenn es keine Polaritätsinversion von Photoströmen gibt, extrapolieren Sie linear von den letzten zwei Punkten nahe Null, um eine Annäherung des Schnittpunktes zu erhalten. - Durchschnittlich die ermittelten rEverspotentiale für die gleichen Bedingungen und zeichnen sie gegen die Chloridkonzentration der externen Pufferlösungen ( siehe Abbildung 2B ).
- Öffnen Sie den Knotenpunktrechner (JPC) 27 und öffnen Sie den Dialog 'Neuer Experiment'. Wählen Sie dann "Patch-Clamp-Messungen". Wählen Sie "Ganzzellen-Messungen", "Standard Salz-Lösung Elektrode" und geben Sie eine Temperatur von25 ° C Zwischen jedem Schritt gehen Sie vorwärts, indem Sie die Auswahl durch Drücken der "nächsten" Taste annehmen.
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Representative Results
Fig. 2 zeigt repräsentative Ergebnisse, die aus Messungen nach dem beschriebenen Protokoll erhalten wurden. Bei der Beleuchtung mit grünem Licht weist der Ps ACR1 einen schnellen Übergangsstrom auf, der schnell auf einen stationären Strompegel abfällt. Nach dem Ausschalten des Lichtes zerfallen die Photoströme innerhalb von Millisekunden auf Null (Abbildung 2A ). Der Austausch der extrazellulären Chloridkonzentration bewirkt eine Verschiebung des Umkehrpotentials, das direkt in den erworbenen Photostromspuren beobachtet werden kann. Die Auswertung von Umkehrpotentialen aus mehreren Messungen quantifiziert die dramatische Umkehrpotentialverschiebung, die durch die Variation der äußeren Chloridkonzentration verursacht wird (Abbildung 2B ). Auffallend entsprechen die gemessenen Umkehrpotentiale direkt den berechneten Nernstpotentialen für Chlorid (Abbildung 2C ), die die hohe Chloridselektivität von Ps ACR1 bestätigen.
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Abbildung 2: Chloridselektivität von Ps ACR1 . ( A ) Repräsentative Stromspuren von Ps ACR1 in HEK293-Zellen. Die intrazelluläre Chloridkonzentration wurde bei 120 mM gehalten, während die extrazelluläre Konzentration von 150 mM (grün) bis 10 mM (lila) Chlorid durch teilweises Ersetzen von NaCl mit Na-Aspartat variierte. Das Haltungspotential wurde in 20 mV Schritten von -80 mV auf +40 mV (LJP korrigiert) erhöht. ( B ) Durchschnittliche Strom-Spannungs-Relationen (n = 6 entsprechend den Bedingungen in A). ( C ) Umkehrpotentiale (Mittellinien zeigen Medianen, Feldgrenzen zeigen die 25. und 75. Perzentile an, wobei die Whisker das 2-fache der Standardabweichung und die Kreise auf einzelne Datenpunkte hindeuten, die aus den Strom-Spannungs-Relationen extrahiert werden. Für die hohe Chlorid-Kon-(Grün) wurde der Wert zwischen -20 mV und 0 mV Haltepotential linear interpoliert, während der Wert linear über +40 mV (lila, gestrichelte Linie, Tafel B) extrapoliert wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Die Bestimmung von Umkehrpotentialen bei definierten ionischen und elektrischen Bedingungen liefert Informationen über die nach der Lichtaktivierung von ChRs transportierten Ionenspezies. Wenn nur eine Ionenspezies in einem komplexen physiologischen Medium variiert wird und die erhaltenen Umkehrpotentialverschiebungen nach dem theoretischen Nernstpotential sind, ist diese Ionensorte die einzige transportierte.
Für ChRs sind jedoch Umkehrpotentialverschiebungen in der Regel weniger ausgeprägt als erwartet aus der Nernst-Gleichung aufgrund der Permeabilität gegenüber verschiedenen ionischen Spezies sowie der Konkurrenz unter den geführten Ionen. In diesem Fall wird die Situation komplexer und alle potentiell geführten Ionen müssen separat ausgetauscht werden, um eine Vielzahl von Messlösungen anzufordern. Darüber hinaus sind die meisten CCRs und die ersten künstlichen ACRs 9 , 10 , 21 für Protonen leitend, aber variierende ProtonenkonzentrationErfordert eine besonders gründliche Analyse, da die Protonenkonzentration nicht nur Umkehrpotentiale verschieben kann, sondern auch die Ionenleitfähigkeit 9 , die Photoströme Kinetik 21 , 36 und die spektrale Lichtempfindlichkeit 11 , 37 aufgrund einer Veränderung der Wasserstoffbindungsnetzwerke, des Protonierungszustandes von Individuelle Rückstände und sekundäre Strukturänderungen. Die Protonenleitfähigkeit kann durch Verringerung der Konzentrationen aller anderen potentiell durchgeführten Ionen wie Na & spplus ; , Ca & sub2; & spplus ; oder Cl & rgr; adressiert werden, während der pH-Wert konstant gehalten wird, um die oben erwähnten Proteinveränderungen zu vermeiden. Nicht durchgeführte Substitute sind meist sperrige, geladene Moleküle wie NMG + für Kationen 12 und Gluconat, 2- ( N- Morpholino) ethansulfonat (MES-) oder Aspartat für Anionen. Vergleich von Umkehrpotentialen in verschiedenen iOnic-Lösungen erlaubt dann die Berechnung der relativen Ionenpermeabilitäten bei Gleichgewichtsbedingungen durch die Goldman-Hodgkin-Katz-Spannungsgleichung. Die Quantifizierung des exakten Beitrags verschiedener Ionen zu den Netto-Photostraten unter Berücksichtigung des Ionenkonzers über Gleichgewichtsbedingungen erfordert jedoch komplexe mathematische Modelle 12 , 38 .
Die Kenntnis der Zusammensetzung von Ionen, die von ChRs transportiert werden, hilft, mögliche Nebenwirkungen, die sich aus der ChR-Anwendung ergeben, besonders in einem neurophysiologischen Kontext zu erhellen. Zum Beispiel kann eine verlängerte ChR-Aktivierung eine intrazelluläre Säuerung verursachen 39 oder durchgeführt-Ca 2+ kann die synaptische Freisetzung und die zweiten Messengerwege auslösen 40 . Da die Zellen in der Regel fest in Gewebe gepackt sind, kann die Aktivierung von mikrobiellen Rhodopsinen nicht nur die intrazelluläre Ionenzusammensetzung beeinflussen, sondern auch das extrazelluläre Lumen, wodurch nBenachbarten Zellen 41 .
Trotz Ionenselektivität sind andere biophysikalische Merkmale von ChRs wie Photostromamplituden, Inaktivierung, Spektral- oder Lichtempfindlichkeit und kinetische Eigenschaften oft von Interesse, um Experimente mit optogenetischen Techniken durchzuführen, zu entwerfen und zu interpretieren. Einige dieser Eigenschaften können auch aus dem oben beschriebenen Protokoll , wie an anderer Stelle 18 , 37 , 42 beschrieben , bestimmt werden . Um die Lichtempfindlichkeit der ChR-exprimierenden Zelle zu untersuchen, kann die Lichtintensität durch Einstellen der Leistung der Lichtquelle oder durch Dämpfen des Aktivierungslichts mit Neutral-Dichte-Filtern variiert werden. Um die spektrale Empfindlichkeit zu erhalten, wird eine polychromatische Lichtquelle benötigt und die Intensitäten müssen auf den gleichen Photonenfluss und die Bandbreite für alle Wellenlängen eingestellt werden. Hochintensitätsspektren ähneln nur Absorptionsspektren des Photorezeptors, wenn kurze Lichtimpulse oderLaser-Blitze werden verwendet, ansonsten können Anpassungsphänomene und photochemische Rückreaktionen auftreten. Die Erholung von teilweise inaktiviertem bis voll aktivem ChR (Gesamt-Photocycle-Umschlagszeit) kann durch Anlegen eines Doppelpuls-Protokolls mit zunehmenden Dunkelintervallen zwischen den beiden Lichtpulsen untersucht werden. Die oben diskutierten biophysikalischen Eigenschaften von ChRs sind wichtig für die Auswahl eines geeigneten ChR, der den experimentellen Bedürfnissen entspricht 40 .
Die Ableitung dieser biophysikalischen Eigenschaften durch elektrophysiologische Techniken ähnelt direkt der Proteinfunktion, die kaum durch spektroskopische Methoden abgedeckt ist. Nach erfolgreicher Etablierung von Spannungsklemmmessungen kann die Technik mit Protein-Engineering-Ansätzen wie ortsgerichtete Mutagenese 9 , 11 , 43 , 44 , Helix-Shuffling 37 ,
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Acknowledgments
Wir danken Maila Reh, Tharsana Tharmalingam und vor allem Altina Klein für hervorragende technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) (SFB1078 B2, FOR1279 SPP1665 bis PH) und dem Exzellenzcluster Vereinigungskonzepte in der Katalyse, UniCat, BIG-NSE (JV) und E4 (PH) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK293 cells | Sigma Aldrich | 85120602 | Human embryonic kidney cells |
| Retinal | Sigma Aldrich | R2500 | all-trans retinal |
| FuGENE HD | Promega | E2312 | Transfection reagent |
| DMEM | Biochrome | FG 0445 | Dulbecco's Modified Eagle Medium |
| Agarose | Roth | 3810 | Agar bridges |
| CaCl2 | Roth | 5239 | CaCl2 2H2O |
| CsCl | Biomol | 2452 | |
| EGTA | Roth | 3054 | |
| FBS | Biochrome | S0615 | Cell culture |
| Glucose | Roth | HN06 | D(+)-Glucose |
| KCl | Roth | 6781 | |
| MgCl2 | Roth | 2189 | MgCl2 6H2O |
| NaCl | Roth | 3957 | |
| NMG | Sigma Aldrich | M2004 | N-Methyl-D-glucamine |
| Na-Aspartate | Sigma Aldrich | A6683 | L-Aspartic acid sodium salt monohydrate |
| Citric acid | Roth | 6490 | |
| AgeI | ThermoFischerScientific | ER1462 | Restriction enzyme |
| XhoI | ThermoFischerScientific | ER0695 | Restriction enzyme |
| NheI | ThermoFischerScientific | ER0975 | Restriction enzyme |
| XL1Blue E. coli | Agilent Technologies | 200249 | Chemocompetent E. coli |
| Kanamycin | Roth | T832 | |
| Lysogeny broth medium | Roth | X964 | |
| Agar-Agar | Roth | 6494 | Agar plates |
| Plasmid purification kit | Marchery-Nagel | 740727.25 | |
| Penicilin/Streptomycin | Biochrome | A 2213 | Cell culture |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma Aldrich | P6407-5MG | Cover slip coating |
| Microforge | Custom made | Fire polishing | |
| Serological pipettes | TPP | Different sizes | |
| Clean bench | Kojair | Biowizard SL130 | |
| Stirrer | IKA | RCT classic | |
| Silver wire | Science Products | AG-T25; AG-T10 | Electrodes, 0.64 mm (bath); 0.25 mm (electrode) |
| pH-meter | Knick | 765 Calimetric | |
| Osmometer | Vogel | OM 815 | |
| Microscope | Carl Zeiss | ID03 | Fire polishing |
| CO2 incubator | Binder | CB150 | |
| Cell culture dishes | TPP | 93040 | 34 mm internal diameter |
| Cover slips | Roth | P232 | 15 mm diameter |
| Thermometer | Rössel Messtechnik | MTM12 | |
| Beamsplitter | Chroma | 21011 | 90/10 transmission |
| Pipette holder | ALA Scientific Instruments | PPH-1P-AXU-0-1.5 | |
| Headstage | Molecular Devices | CV203BU | |
| Amplifier | Molecular Devices | AxoPatch200B | |
| Digitizer | Molecular Devices | DigiData1400 | Digital analog converter |
| Lightsource | TILL Photonics | Polychrome V | Set to 540 nm full intensity |
| Microscope | Carl Zeiss | Axiovert 100 | |
| Shutter | Vincent Associates | VS25 | |
| Shutter driver | Vincent Associates | VCM-D1 | |
| Glass capilarries | Warner Instruments | G150F-3 | Boresilicate capillaries with fire polished ends OD 1.5 mm ID 0.86 mm |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P1000 | |
| Bath handler | Lorenz Messgerätebau | MPCU | |
| Tripleband filterset | Chroma | 69008 | Fluorescence filter ECFP/EYFP/mCherry |
| CCD camera | Watec | Wat-221SCCD | |
| Optometer | Gigahertz Optik | P9710 | Measure light intensities |
| Objective | Carl Zeiss | 421462-9900-000 | W Plan-Apochromat 40X/1.0 DIC |
| Micromanipulator | Scientifica | PatchStar | |
| Recording chamber | Custom made | ||
| Power supply | Manson | HCS-3202 | Avoids electrical noise from microscope built-in power supply |
| Vibration isolated table | Newport | M-VW-3636-OPT-01 | |
| Faraday cage | Custom made or any commercial matching table | ||
| Hoses | Any comercial; e.g. Roth | Different sizes and materials for bath handling and application of pipette pressure; agar bridges | |
| Linear shaker | Sunlab Instruments | SU 1000 | |
| Liquid junction potential calculator | Molecular Devices or directly from Peter H. Barry | Program is included in the Clampex aquisition software or can be obtained from p.barry@unsw.edu.au | |
| Data acquisition software | Molecular Devices | Clampex 10.X | |
| Data evaluation software | Molecular Devices | Clampfit 10.X | |
| PsACR1 | GenBank or Addgene | KF992074.1 or Addgene plasmid #85465 | Gene encoding for PsACR1 |
| Amplifier guide | Molecular Devices | The Axon Guide |
References
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