Abstract
I løbet af det sidste årti blev kanalrhodopsiner blevet uundværlige i neurovidenskabelig forskning, hvor de bruges som redskaber til ikke-invasiv manipulation af elektriske processer i målceller. I denne sammenhæng er ion selektivitet af en kanalrhodopsin af særlig betydning. Denne artikel beskriver undersøgelsen af klorid-selektivitet for et nyligt identificeret anionledende channelrhodopsin af Proteomonas sulcata via elektrofysiologiske patch-clamp-optagelser på HEK293-celler. Den eksperimentelle procedure til måling af lysgitterede fotokræfter kræver en hurtig omskiftelig - ideelt monokromatisk - lyskilde koblet i mikroskopet af en ellers konventionel patch-clamp opsætning. Præparative procedurer forud for eksperimentet er skitseret med fremstilling af pufrede opløsninger, overvejelser om væskeforbindelsespotentialer, podning og transfektion af celler og udtrækning af patchpipetter. Den aktuelle optagelse af strømspændingsforholdS for at bestemme reverseringspotentialerne for forskellige kloridkoncentrationer finder sted 24 timer til 48 timer efter transfektion. Endelig analyseres elektrofysiologiske data med hensyn til teoretiske overvejelser af chloridledning.
Introduction
Channelrhodopsiner (ChR) er lysdæmpede ionkanaler, der forekommer i øjnene på motile grønne alger, og tjener som primære fotosensorer til fototakse og fobiske reaktioner 1 . Siden deres første beskrivelse i 2002 2 har ChR'er banet vejen for det fremvoksende område af optogenetik og kan anvendes i en række forskellige excitente celler, f.eks. Inden for skelets muskler, hjertet eller hjernen 3 , 4 , 5 . Ekspression af ChR'er i målceller resulterer i lysstyrbar ionpermeabilitet af den respektive celle. I en neuronal sammenhæng tillader dette aktivering 6 , 7 , 8 eller inhibering 9 , 10 af actionpotentiale (AP) -affyring - afhængigt af den udførte ion - med det rumlige og tidsmæssigeLysets præcision understreger, hvordan ion-selektiviteten af en ChR-variant bestemmer dens optogenetiske anvendelse.
De første opdagede ChRs fra Chlamydomonas reinhardtii og Volvox carteri er permeable til protoner, men også til monovalente kationer som natrium, kalium og i mindre grad til divalente kationer, såsom calcium og magnesium 11 , 12 , 13 . I dag har mere end 70 naturlige kation-ledende channelrhodopsiner (CCR'er) 14 , 15 , 16 , 17 og flere konstruerede varianter 18 , 19 , 20 med forskellige egenskaber som f.eks. Fotokurrensstørrelse, spektralfølsomhed, kinetik og kation selektivitet er tilgængelige. I neurovidenskab er CCR aRe bruges til at aktivere celler og udløse AP'er, var lysdrevne mikrobielle pumper de eneste tilgængelige antagonister til at silere neuroner i årevis. I 2014 viste to grupper samtidigt, at CCR'er kan omdannes til anionledende channelrhodopsiner (ACR'er) ved ændring af polariteten langs den formodede ionledende pore via molekylærteknik 9 , 21 . Derefter blev naturlige ACR'er identificeret i flere kryptofytealger 22 , 23 , 24 . Vigtigst er det, at lysaktivering af ACR'er medierer kloridstrømme i voksne neuroner, der tillader hæmning af neuronaktivitet ved meget lavere lysintensiteter end mikrobielle pumper, der kun transporterer enkeltladninger pr. Absorberet foton.
ChR-aktivitet kan adresseres direkte ved elektrofysiologiske patch-clamp-optagelser af lysinducerede strømme i HEK293-celler. KlipklemmenTeknik blev oprindeligt udviklet i slutningen af 1970'erne 25 og yderligere forbedret af Hamill et al. , Hvilket tillader registrering af enheden af strømme fra en lille celle (helcelle-mode) med høj strømopløsning og direkte styring af membranspændingen 26 . Anvendt i cellekultur giver denne teknik nøjagtig kontrol af de ioniske såvel som elektriske registreringsbetingelser og muliggør undersøgelse af ionselektivitet sammen med det relative bidrag fra ionerne til den samlede strøm. Her eksemplificerer vi undersøgelsen af ionelektivitet for den anionledende channelrhodopsin af Proteomonas sulcata ( Ps ACR1) 22 , 23 via optagelse af strømspændingsrelationer under forskellige ekstracellulære chloridkoncentrationer for at bevise højchloridkonduktans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Figur 1: Opsætning af patch-clamp. (1) lyskilde, (2) optisk fiber, (3) programmerbar lukker, (4) digitizer, (5) lukkerdriver, (6) forstærker, (7) perfusionssystem, (8) personlig computer, (10) faraday bur, (11) mikroskop stadium, (12) perfusion indløb, (13) perfusion udløb, (14) optagekammer, (15) væskeniveau sensor, (16) badelektrode med agar bro, Pipetteholder, (18) headstage, (19) micromanipulator, (20) inverteret mikroskop, (21) mikroskoplampehus, (22) mikroskoplampe strømforsyning, (23) vandfyldt U-rør, (24) trevej Ventil, (25) anti-vibrationsbord, (26) CCD kamera. ( A ) Fotografier og ( B ) skematisk repræsentation af opsætningen. Klik her for at se en større version af tHans figur.
1. Opsætning forud for optagelser
| intra. | extra.1 | extra.2 | |
| Højt chlorid | Højt chlorid | Lavt chlorid | |
| C [mM] | C [mM] | C [mM] | |
| Na-ASP | 0 | 0 | 140 |
| NaCl | 110 | 140 | 0 |
| KCI | 1 | 1 | 1 |
| CsCI | 1 | 1 | 1 |
| CaCl2 | 2 | 2 | 2 |
| MgCl2 | 2 | 2 | 2 |
| HEPES | 10 | 10 | 10 |
| EGTA | 10 | 0 | 0 |
| pH | 7.2 | 7.2 | 7.2 |
| osmolaritet | 290 mOsm | 320 mOsm | 320 mOsm |
Tabel 1: Den ioniske sammensætning af de bufferede opløsninger. Sammensætning af intracellulære (intra.) Og ekstracellulære (ekstra.) Buffere til chloridselektivitetsforsøg i HEK-celler. Anvendte forkortelser: ethylenglycoltetraeddikesyre (EGTA), 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsyre (HEPES) og aspartat (ASP). Alle koncentrationer er i mM.
- Klargør optageløsningerne med ionkoncentrationer som angivet i tabel 1.
- Tilbered 15 ml 2 M stamopløsninger i ultralugt vand til MgCl2, CaCl2, KCl og CsCl.
- Væg de faste komponenter til 100 ml intracellulær og500 ml af de ekstracellulære pufrede opløsninger ifølge tabel 1 i separate bægerglas og tilsæt den respektive mængde af de fremstillede stamopløsninger bagefter. For eksempel anvendes 0,3803 g (10 mM) EGTA, 0,2383 g (10 mM) HEPES og 0,6428 g (110 mM) NaCl og tilsæt 100 μL af 2 M MgCl2 og CaCl2 og 50 μl af den 2 M KCl og CsCl stamopløsninger.
- Tilsæt ultralugt vand og omhyggeligt justere pH ved hjælp af syrer og baser, som ikke forstyrrer målingen, dvs. udføres ikke af ChR, såsom citronsyre og N-methyl-D-glucamin (NMG + ).
- Juster osmolariteten til 290 mOsm for intracellulær og til 320 mOsm for de ekstracellulære opløsninger med glucose.
Bemærk: Litt hypoosmotiske intracellulære opløsninger øger succesfrekvensen af patching 26 . - Sterilfiltrer alle opløsninger gennem 0,22 μm filtre. Opbevares opløsninger ved 4 ° C i to ugerS eller frys ved -20 ° C til langtidsopbevaring.
- Beregn væskeforbindelsespotentialer og forberede optagelsesprotokoller.
BEMÆRK: Ændring af ekstracellulær chloridkoncentration efter etablering af helcellekonfiguration forårsager et signifikant flydende koblingspotentiale (LJP), der skal korrigeres 27 , 28 . LJP'er kan måles eller beregnes direkte, her bruges sidstnævnte mulighed. I denne protokol anvendes onlinekorrektion, der kræver en registreringsprotokol for hver ekstern buffer. Men for et større sæt eksterne løsninger anbefales en postkorrektion af LJP for at undgå falsk korrektion.- Åbn junction potential calculator (JPC) 27 og åbn dialogboksen 'Ny eksperiment'. Vælg derefter "Patch-clamp measurements". Vælg "helcellemålinger", "Standard saltopløsningselektrode" og indtast en temperatur på25 ° C. Mellem hvert trin går du frem ved at acceptere valget ved at trykke på knappen "Næste".
BEMÆRK: Eksperimenter udføres ved stuetemperatur på 25 ° C i et luftkonditioneret laboratorium. Sørg for, at bufferopløsninger har stuetemperatur, før eksperimenter påbegyndes. For at variere prøvetemperaturen kan et inkubationstrin eller kammer anvendes. Badtemperaturen måles ofte med et termometer. - Tilsæt alle individuelle anion- og kationkoncentrationer af den pipetterede opløsning og højchloridbufferen i overensstemmelse med koncentrationerne anført i tabel 1 .
BEMÆRK: JPC'en beregner et LJP på -0,5 mV for startbetingelserne. - Klik på "New Bath Solution" for at komme ind i den anioniske og kationiske sammensætning af low chloride buffer.
BEMÆRK: JPC'en beregner nu et nyt LJP på +12,6 mV ifølge den ændrede ekstracellulære optagelsesløsning. - Forbered to LJP-korrigerede protokoller tilTo målebetingelser ved at trække det beregnede LJP fra det anvendte holdepotentiale -0,5 mV for den høje og +12,6 mV for de lave chlorid-ydre opløsninger. Protokollerne starter således med henholdsvis -79,5 mV (højchlorid) og -92,6 mV (lav chlorid) for at opnå et LJP-korrigeret startholdingspotentiale på -80 mV i begge tilfælde.
BEMÆRK: Følgende trin gælder for dataindsamlingssoftwaren, der er nævnt i materialelisten. - Åbn protokolleditoren i overtagelsessoftwaren. Skift til menuen "Mode" vælg "Episodic stimulation" og inkludere 7 fejninger.
- Skift til menuen "Waveform" i redaktøren og inkludere en 200 ms periode med 0 mV holdpotentiale efterfulgt af en 2 s periode med varierende holdbarhed startende ved -79,5 mV for højt chlorid. Inkluder et "Delta niveau" på 20 mV for den anden periode for at øge holdpotentialet med 20 mV i hvert feje.
- Inden for spændingstrinene af bølgeformen edItor anvende en 500 ms belysningsperiode med 540 nm lys (3.10 mW / mm²). For at gøre det skal du ændre det "digitale bitmønster" på den tilsluttede lukkertid, der styrer lyskilden for at være aktiv 500 ms efter den anden periode beskrevet ovenfor (se 1.2.6).
BEMÆRK: Lysintensiteten kan påvirke biofysiske egenskaber ved kanalstrømme som amplitude eller inaktivering. Derfor bør lysdensiteter altid rapporteres. For at måle lyskraften efter at have passeret gennem al optik og dækslip, skal du bruge et kalibreret optometer. For at beregne strømtætheden skal du bestemme det belysede felt for objektivet ved hjælp af et objektmikrometer og opdele det målte lysstyrke med det bestemte belysningsfelt. - Gem protokollen for den ekstraherede opløsning med høj chlorid. Modificer protokollen og udskift det første niveau holdpotentiale med -92,6 mV (lavt ekstern klorid). Gem denne anden protokol for at måle ekstracellulær tilstanden med lav chlorid.
- Lysin-belægning af glasdækslister som pr. Tilpasset protokol 29 .
- Placer flere 100 dæklag i en glas petriskål og tilsæt 250 ml HCI (1 N).
- Placer petriskålen med dækslisterne på en lineær ryster og ryst ved 120 omdrejninger pr. Minut i 72 timer for at rengøre dækslisterne og skyll derefter med ultralugt vand for at neutralisere pH.
- Sug disse i et lille volumen på 95% ethanol til yderligere rengøring.
BEMÆRK: Rene dæksler kan opbevares i 70% ethanol, inden de fortsættes. Arbejd under laminær flowhætte til følgende trin. - Brug en Bunsen-brænder og pincet, og flamme hvert låg, og overfør det til en ny petriskål.
- Inkuber glasdækslisterne med en steril 50 μg / ml poly-D-lysinopløsning i mindst 1 time (eller natten over) ved stuetemperatur under omrystning med en lineær ryster ved 150 omdr./min.
- Vask dækslisterne med ultralugt vand for at fjerne overskydende poly-D-lysin.
- Spred dækslisterne på sterilt papir for at tørre i 10 minutter, og udsæt dem for UV-lys til sterilisering (mindst 20 minutter).
- Saml dækslerne i en steril petriskål, der er dækket af aluminiumsfolie, indtil brug.
- Forbered DNA fra Ps ACR1 genet fusioneret til mCherry ved anvendelse af standard molekylærbiologi teknikker.
- Klon den humane kodonoptimerede gensekvens, der koder for Ps ACR1, i et peGFP-C1-plasmid (CMV-promotor, kanamycinresistens) i ramme med mCherry-fluoroforet under anvendelse af restriktionsenzymer eller andre etablerede kloningsmetoder.
Bemærk: Andre fluoroforer kan også bruges, men sørg for at de tilhørende filtersæt er tilgængelige for at observere deres fluorescens under mikroskopet i opsætningen. - Transform plasmid-DNA'et i kemokompetente XL1Blue E. coli- celler via varmeskok som pr. Standardprotokol og plad dem på agarplader (30 μg / ml kanamycin) 30
- Den næste dag inokuleres 4 ml lysogeny bouillonmedium suppleret med 30 μg / ml kanamycin med celler fra enkeltkolonier og inkuberer dem natten over ved 37 ° C og 180 omdr./min. I en inkubator.
- Efter inkubation natten over renses plasmid-DNA'et fra kulturerne under anvendelse af et kommercielt tilgængeligt kit (se materialetabellen ) ifølge producentens anvisninger.
- Klon den humane kodonoptimerede gensekvens, der koder for Ps ACR1, i et peGFP-C1-plasmid (CMV-promotor, kanamycinresistens) i ramme med mCherry-fluoroforet under anvendelse af restriktionsenzymer eller andre etablerede kloningsmetoder.
- Sæd cellerne
BEMÆRK: Udfør trin under en laminær flowhætte.- Placer op til tre lysin-coatede glasdækslister ved siden af hinanden i en 35 mm petriskål.
BEMÆRK: Tryk forsigtigt dem mod bunden af fadet for at undgå at glide ind på hinanden. - Sæd 1,5 x 10 5 HEK celler i 2 ml standard Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) i hver skål.
- Supplement all- trans retinal hosEn slutkoncentration på 1 μM. Væk cellerne i mindst en dag, før du fortsætter med trin 1.6.
- Placer op til tre lysin-coatede glasdækslister ved siden af hinanden i en 35 mm petriskål.
- Transient transfektion af cellerne via lipofektion 31 .
- For hver opvaskemaskine fremstilles en opløsning af 2 μg plasmid-DNA (som fremstillet i trin 1.4) i 250 μl DMEM uden FBS og 6 μl transfektionsreagens (se Materialetabel ).
- Efter 15 min inkubation tilsættes forsigtigt (dråbevis) opløsningen til cellerne.
- Forbered agarbroer
- Tilsæt 0,75 g agarose til 50 ml steril natriumchloridopløsning (140 mM) og opløs det ved opvarmning i en mikrobølgeovn.
BEMÆRK: 2 - 3 M KCl til agarbro forberedelse reducerer yderligere LJP på grund af højere koncentration ( fx konstant diffusion fra broen) og lige bevægelighed for K + og Cl - ioner, men blev undgået for at minimere ion - (især Cl - ) lækage Ind i t Han badopløsning 32 . - Fyld 10 μL pipettespidser (eller en slange med lille diameter) med væskeagarosevæsken ved hjælp af en sprøjte.
BEMÆRK: Undgå luftbobler i broen. - Efter at agarbroerne er blevet afkølet og størknet, opbevar dem i steril 140 mM natriumchloridopløsning.
- Tilsæt 0,75 g agarose til 50 ml steril natriumchloridopløsning (140 mM) og opløs det ved opvarmning i en mikrobølgeovn.
- Forbered optagelse og badelektroder.
- Fjern sølvkablerne i badet og optageelektroden i patch-clamp setup.
- Poler trådene med sandpapir for at fjerne sølvchlorid fra tidligere eksperimenter. Sænk den rene sølvtråd i 3 M KCl og tilslut den til den positive pol på et 1,5 V batteri til elektrolytisk belægning med sølvchlorid.
BEMÆRK: En lab-strømforsyning kan bruges i stedet for et batteri.
- Træk pipetter med lav modstandsdygtighed (1,5-3,0 MΩ) ud fra glaskapillærer med en mikropipettudtræk og brandpudse dem som beskrevet af Brown et al.Lass = "xref"> 33. Opbevar pipetter støvfri til måleværdien.
- Tænd alle opsætningskomponenter for at varme op til arbejdstemperatur 30 min. Forudgående optagelser. Sørg for, at buffere er ved stuetemperatur.
2. Selektivitetsmålinger
- Start optagelserne 24 til 48 timer efter transient transfektion af cellerne beskrevet i 1.6.
- Anbring et dækslip i målekammeret og forseg det med silicium for at forhindre lækage af den eksterne buffer. Opbevar petriskålen med de øvrige dækslister i en inkubator til næste sæt eksperimenter.
- Fyld kammeret forsigtigt med ekstracellulær buffer (høj [Cl - ]) for at forhindre frigørelse af celler, læg det derefter under mikroskopet og brug 40X-målet for cellevisualisering.
- Sæt en agarbro over badelektroden og læg den ind i kammeret sammen med væskeniveau sensoren og badestyrelsens perfusion udløb.
- Udveksle exTracellulær opløsning to gange med 1 ml frisk ekstern opløsning (høj [Cl - ]) for at fjerne resterende dyrkningsmedium og løsne celler.
- Bring cellerne i fokus og søg efter en transficeret (fluorescerende) celle, som skal isoleres fra andre celler. Brug et triple-band filter-sæt og orange lys (590 nm, båndbredde 15 nm, 100% intensitet) for at excitere og visualisere mCherry.
BEMÆRK: HEK-celler kan kobles elektrisk til deres naboer ved mellemrumskrydsninger 34, hvilket resulterer i lav membranmodstand i helcellekonfigurationen. - Fyld en af de trukket pipetter med intracellulær opløsning og fjern luftbobler ved at flippe pipetten flere gange.
- Monter pipetten på pipetteholderen og anbring noget positivt tryk for at forhindre tilstopning af spidsen.
- Find spidsen af patchpipetten under mikroskopet og naviger det tæt ved cellen ved hjælp af micromanipulatoren.
BEMÆRK: Følgende trin gælder for aMplifier, dataindsamling og evalueringssoftware nævnt i materialelisten. - Start "membrantesten" i dataindsamlingssoftwaren og anvend et spændingstrin (testpuls, f.eks. 5 mV i 10 ms, basislinje ved 0 mV) manuelt eller automatisk via specificeret software ved brug af "badmodus", mens du kører "membrantest" I dataopsamlingssoftwaren.
- Kontroller, at pipettemodstanden er i det ønskede område (1,5-3,0 MΩ).
- Nul offsetstrømme ved at justere pipettepotentialet ved at dreje pipetteforskydningsknappen på forstærkeren, mens du arbejder i "bademodus" af "membranstesten".
- Opret en patch i hele celle konfigurationen 26 .
BEMÆRK: Følgende trin kræver anvendelse af positivt og negativt tryk, der leveres til sideporten på den anvendte pipetteholder. Dette kan gøres ved at bruge enten en sprøjte, via et mundstykke eller en elektronisk konTrolled trykregulator. I denne protokol anvendes positivt og negativt tryk via et mundstykke.- Langsomt tilgang cellen med patchpipetten fra toppen og lind det positive tryk lige før det berøres.
BEMÆRK: Når spidsen er tæt på cellen, stiger modstanden lidt; Dette er angivet med en reduceret størrelse af testpulsen. - Skift "membrantest" fra "badtilstand" til "patch mode" og dermed holdpotentialet til cellernes forventede hvilepotentiale (-30 til -40 mV).
- I nogle tilfælde dannes den cellebundne konfiguration efter frigivelse af det positive tryk (2.13.1), hvis det ikke er tilfældet, påfør forsigtigt negativt tryk for at hjælpe gigaseformation.
BEMÆRK: Cellebundet konfiguration er etableret, når testpulsen reduceres til to små kapacitive toppe ved begyndelsen og slutningen af pulsen, og membranmodstanden er i GΩ-området; Negative spændinger op til -60 mV mIght letter gigase dannelse. - Kompensere pipettens kapacitans ved at dreje "pipette capacitance compensation" -knapperne for at få et fladt svar fra testpulsen.
- Bryd plasteren uden at ødelægge forseglingen ved at anvende korte impulser af negativt tryk eller negativt tryk med stigende styrke for at opnå helcellekonformation.
BEMÆRK: Succesfuld overgang fra cellebundet til helcellekonfiguration er indikeret ved en stigning i de kapacitive toppe. - Anvend seriemodstandsudligning ved at indstille helcelleparametre og kompensationsjusteringer af den anvendte forstærker for nøjagtig fastspænding af membranpotentialet til den ønskede holdspænding.
- Skift "membrantest" til "helcelle" -modus. I panelet "Seriemodstands kompensation" aktiveres "forudsigelse" og "korrektion" op til 90% for at undgå oversvømmelser og svingning af det kapacitive svar, drej hele cellenKompensation tænder og justerer hele celleparametre med passende frontpanelknapper ("helcellekapacitet" og "serieresistens") på forstærkeren på en iterativ måde for at opnå et ideelt flad testforseglingsrespons.
BEMÆRK: For detaljeret beskrivelse af serie modstand kompensation og korrektion henvises til forstærker manual eller retningslinje, da denne procedure varierer mellem forskellige producenter.
- Skift "membrantest" til "helcelle" -modus. I panelet "Seriemodstands kompensation" aktiveres "forudsigelse" og "korrektion" op til 90% for at undgå oversvømmelser og svingning af det kapacitive svar, drej hele cellenKompensation tænder og justerer hele celleparametre med passende frontpanelknapper ("helcellekapacitet" og "serieresistens") på forstærkeren på en iterativ måde for at opnå et ideelt flad testforseglingsrespons.
- Efter etablering af helcellekonfiguration, vent mindst 2 minutter før optagelse for at sikre tilstrækkelig udskiftning af intracellulær opløsning via patchpipetten 35 .
- Langsomt tilgang cellen med patchpipetten fra toppen og lind det positive tryk lige før det berøres.
- Optag lysinduserede strømme ved forskellige holdpotentialer ved at bruge de protokoller, der blev installeret tidligere (i 1.2).
- Udveksl den ekstracellulære buffer til lav [Cl - ] i kammeret mindst fem gange uden at ødelægge lappen og optage en anden strømspændingsrelation ( jf. Trin 1.2) ved tHan ny kloridkoncentration.
BEMÆRK: Et perfusionssystem til automatiseret bufferudveksling letter denne proces, men er ikke nødvendig. - Gentag 2.15. For hver jonisk tilstand, der skal testes, men gentag kontrollen af plasterens kvalitet mellem målingerne ved hjælp af en "membrantest" beskrevet ovenfor.
BEMÆRK: For at garantere nøjagtig membranspænding og stabil intracellulær ionsammensætning skal membranmodstanden være over 500 MΩ, mens adgangsbestandigheden ikke må overstige 10 MΩ, se . 2.12.6). Glem ikke at skifte helcelleparametreudligningen til membrantesten. - Gentag 2.2. Til 2,15. Til flere celler, men tag et nyt dækslip for hver testserie for at sikre sundhed af celler.
3. Dataevaluering
- Juster basislinjen for hvert nuværende spor ved at trække den gennemsnitlige strøm fra før belysning.
- Beregn den gennemsnitlige stationære fotokurrent I s (
- Gentag trin 3.1) og 3.2) for alle testede betingelser og forskellige celler.
- Plot de bestemte fotokrøb versus det respektive holdpotentiale.
BEMÆRK: Hvis flere målinger er gennemsnitlige, kan individuelle optagelser normaliseres til en bestemt tilstand eller cellens kapacitans. - Krydsningen af strømspændingsforholdet med spændingsaksen repræsenterer reverseringspotentialet (netstrøm er nul). Bestem det ved lineær interpolation mellem de to nabostatpunkter.
BEMÆRK: Hvis der ikke er nogen polaritet inversion af fotokobler, ekstrapolere lineært fra de sidste to punkter tæt på nul for at opnå en tilnærmelse af skæringspunktet. - Gennemsnitlig den bestemte rEversale potentialer til de samme betingelser og plotte dem mod chloridkoncentrationen af de eksterne bufferopløsninger ( jf. Figur 2B ).
- Åbn junction potential calculator (JPC) 27 og åbn dialogboksen 'Ny eksperiment'. Vælg derefter "Patch-clamp measurements". Vælg "helcellemålinger", "Standard saltopløsningselektrode" og indtast en temperatur på25 ° C. Mellem hvert trin går du frem ved at acceptere valget ved at trykke på knappen "Næste".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 viser repræsentative resultater opnået ved målinger efter den beskrevne protokol. Under lyset med grønt lys har Ps ACR1 en hurtig forbigående strøm, der hurtigt falder til et stationært strømniveau. Når lyset er slukket, falder fotokoblerne til nul inden for millisekunder ( figur 2A ). Udveksling af den ekstracellulære chloridkoncentration forårsager et skift af reverseringspotentialet, der kan ses direkte i de overførte fotokurrentspor. Evaluering af reverseringspotentialer fra flere målinger kvantificerer det dramatiske reverseringspotentialeskift forårsaget af variationen af den eksterne chloridkoncentration ( figur 2B ). Påfaldende svarer de målte reverseringspotentialer direkte til beregnede Nernst-potentialer for chlorid ( figur 2C ), der bekræfter høj-klorid-selektiviteten af Ps ACR1.
T "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figur 2: Chlorid selektivitet af Ps ACR1 . ( A ) Repræsentative nuværende spor af Ps ACR1 i HEK293-celler. Intracellulær chloridkoncentration blev holdt ved 120 mM, mens ekstracellulær koncentration varierede fra 150 mM (grøn) til 10 mM (lilla) chlorid ved delvis udskiftning af NaCl med Na-aspartat. Holdpotentialet blev forøget i 20 mV trin fra -80 mV til +40 mV (LJP korrigeret). ( B ) Gennemsnitlig strømspændingsrelationer (n = 6 svarende til betingelserne i A). ( C ) Tilbagevendelsespotentiale (midterlinier indikerer medianer, boksgrænser angiver 25 og 75 percentiler, whiskers forlænger 2 gange standardafvigelsen og cirkler angiver enkelte datapunkter) udtaget fra strømspændingsrelationerne. For højchloridkoncentrationenDition (grøn) var værdien lineært interpoleret mellem -20 mV og 0 mV holdpotentiale, mens værdien blev lineært ekstrapoleret over +40 mV (lilla, punkteret linje, panel B). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bestemmelse af reverseringspotentialer ved definerede ioniske og elektriske betingelser tilvejebringer information om ionarten transporteret efter lysaktivering af ChRs. Hvis udelukkende en ionart varieres i et komplekst fysiologisk medium, og de opnåede reverseringspotentialeskift i henhold til det teoretiske Nernst-potentiale, er denne ionart den eneste transporterede.
For ChRs er reverseringspotentialeforskydninger sædvanligvis mindre udtalte end forventet fra Nernst-ligningen på grund af permeabilitet for forskellige ionarter samt konkurrence blandt ledede ioner. I dette tilfælde bliver situationen mere kompleks, og alle potentielt udførte ioner skal udskiftes særskilt og kræve en række måleløsninger. Desuden er de fleste CCR'er og de første kunstige ACR'er 9 , 10 , 21 ledende for protoner, men varierende protonkoncentraKræver en særlig grundig analyse, da protonkoncentration ikke kun kan skifte reverseringspotentialer, men kan også påvirke ionkonduktans 9 , fotokurrentkinetik 21 , 36 og spektral lysfølsomhed 11 , 37 som følge af ændring af hydrogenbindingsnetværkerne, protoneringstilstanden af Individuelle rester og sekundære strukturændringer. Protonkonduktans kan adresseres ved at reducere koncentrationer af alle andre potentielt udførte ioner, såsom Na + , Ca 2+ eller Cl - samtidig med at pH-værdien holdes konstant for at undgå proteinændringer nævnt ovenfor. Ikke-udførte substitutter er sædvanligvis store, ladede molekyler som NMG + for kationer 12 og gluconat, 2- ( N- morpholino) ethansulfonat (MES-) eller aspartat til anioner. Sammenligning af reverseringspotentialer i forskellige iOniske opløsninger tillader derefter beregningen af de relative ionpermeabiliteter ved ligevægtsbetingelser ved Goldman-Hodgkin-Katz spændingsligningen. Kvantificering af de forskellige ioners nøjagtige bidrag til netfotocurrenter, der overvejer ionkonkurrence ud over ligevægtsbetingelser kræver imidlertid komplekse matematiske modeller 12 , 38 .
At kende sammensætningen af ioner transporteret af ChRs hjælper med at belyse mulige bivirkninger som følge af ChR-applikation, især i en neurofysiologisk sammenhæng. For eksempel kan langvarig ChR-aktivering forårsage intracellulær forsuring 39 eller udført-Ca2 + kan udløse synaptisk frigivelse og anden messenger-veje 40 . Da celler sædvanligvis er tæt pakket i væv, kan aktivering af mikrobielle rhodopsiner ikke kun påvirke den intracellulære ionsammensætning, men også det ekstracellulære lumen og påvirker således nNabo celler 41 .
På trods af ionselektivitet er andre biofysiske træk ved ChRs som fotokurrente amplituder, inaktivering, spektral eller lysfølsomhed og kinetiske egenskaber ofte af interesse for at udføre, designe og fortolke forsøg med optogenetiske teknikker. Nogle af disse egenskaber kan også bestemmes ud fra protokollen ovenfor som beskrevet andetsteds 18 , 37 , 42 . For at undersøge lysfølsomheden af den ChR-udtrykkende celle kan lysintensiteten varieres ved at justere lyskildens effekt eller ved at dæmpe aktiveringslyset med neutrale densitetsfiltre. For at opnå spektralfølsomheden er der brug for en polychromatisk lyskilde, og intensiteterne skal indstilles til ens fotonflux og båndbredde for alle bølgelængder. Højintensitetsspektre ligner kun absorptionsspektrene for fotoreceptoren, hvis kort lysimpulser ellerDer anvendes laserflasker, ellers kan der forekomme tilpasningsfænomener og fotokemiske reaktioner. Gendannelsen fra delvist inaktiveret til fuldt aktiv ChR (samlet fotocyklisk omsætningstid) kan probes ved at anvende en dobbeltpulsprotokol med stigende mørke intervaller mellem de to lysimpulser. De biofysiske egenskaber ved ChRs, der er diskuteret ovenfor, er vigtige for at vælge en passende ChR, der matcher de eksperimentelle behov 40 .
Afledning af disse biofysiske egenskaber ved elektrofysiologiske teknikker ligner direkte proteinfunktion, som næsten ikke er dækket af spektroskopiske metoder. Efter en vellykket etablering af spændingsklemmemålinger kan teknikken kombineres med proteintekniske fremgangsmåder som steddirigeret mutagenese 9 , 11 , 43 , 44 , helix-shuffling 37 ,
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi takker Maila Reh, Tharsana Tharmalingam og især Altina Klein for fremragende teknisk assistance. Dette arbejde blev støttet af det tyske forskningsstiftelse (DFG) (SFB1078 B2, FOR1279 SPP1665 til PH) og Cluster of Excellence Unifying Concepts i Catalysis, UniCat, BIG-NSE (JV) og E4 (PH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK293 cells | Sigma Aldrich | 85120602 | Human embryonic kidney cells |
| Retinal | Sigma Aldrich | R2500 | all-trans retinal |
| FuGENE HD | Promega | E2312 | Transfection reagent |
| DMEM | Biochrome | FG 0445 | Dulbecco's Modified Eagle Medium |
| Agarose | Roth | 3810 | Agar bridges |
| CaCl2 | Roth | 5239 | CaCl2 2H2O |
| CsCl | Biomol | 2452 | |
| EGTA | Roth | 3054 | |
| FBS | Biochrome | S0615 | Cell culture |
| Glucose | Roth | HN06 | D(+)-Glucose |
| KCl | Roth | 6781 | |
| MgCl2 | Roth | 2189 | MgCl2 6H2O |
| NaCl | Roth | 3957 | |
| NMG | Sigma Aldrich | M2004 | N-Methyl-D-glucamine |
| Na-Aspartate | Sigma Aldrich | A6683 | L-Aspartic acid sodium salt monohydrate |
| Citric acid | Roth | 6490 | |
| AgeI | ThermoFischerScientific | ER1462 | Restriction enzyme |
| XhoI | ThermoFischerScientific | ER0695 | Restriction enzyme |
| NheI | ThermoFischerScientific | ER0975 | Restriction enzyme |
| XL1Blue E. coli | Agilent Technologies | 200249 | Chemocompetent E. coli |
| Kanamycin | Roth | T832 | |
| Lysogeny broth medium | Roth | X964 | |
| Agar-Agar | Roth | 6494 | Agar plates |
| Plasmid purification kit | Marchery-Nagel | 740727.25 | |
| Penicilin/Streptomycin | Biochrome | A 2213 | Cell culture |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma Aldrich | P6407-5MG | Cover slip coating |
| Microforge | Custom made | Fire polishing | |
| Serological pipettes | TPP | Different sizes | |
| Clean bench | Kojair | Biowizard SL130 | |
| Stirrer | IKA | RCT classic | |
| Silver wire | Science Products | AG-T25; AG-T10 | Electrodes, 0.64 mm (bath); 0.25 mm (electrode) |
| pH-meter | Knick | 765 Calimetric | |
| Osmometer | Vogel | OM 815 | |
| Microscope | Carl Zeiss | ID03 | Fire polishing |
| CO2 incubator | Binder | CB150 | |
| Cell culture dishes | TPP | 93040 | 34 mm internal diameter |
| Cover slips | Roth | P232 | 15 mm diameter |
| Thermometer | Rössel Messtechnik | MTM12 | |
| Beamsplitter | Chroma | 21011 | 90/10 transmission |
| Pipette holder | ALA Scientific Instruments | PPH-1P-AXU-0-1.5 | |
| Headstage | Molecular Devices | CV203BU | |
| Amplifier | Molecular Devices | AxoPatch200B | |
| Digitizer | Molecular Devices | DigiData1400 | Digital analog converter |
| Lightsource | TILL Photonics | Polychrome V | Set to 540 nm full intensity |
| Microscope | Carl Zeiss | Axiovert 100 | |
| Shutter | Vincent Associates | VS25 | |
| Shutter driver | Vincent Associates | VCM-D1 | |
| Glass capilarries | Warner Instruments | G150F-3 | Boresilicate capillaries with fire polished ends OD 1.5 mm ID 0.86 mm |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P1000 | |
| Bath handler | Lorenz Messgerätebau | MPCU | |
| Tripleband filterset | Chroma | 69008 | Fluorescence filter ECFP/EYFP/mCherry |
| CCD camera | Watec | Wat-221SCCD | |
| Optometer | Gigahertz Optik | P9710 | Measure light intensities |
| Objective | Carl Zeiss | 421462-9900-000 | W Plan-Apochromat 40X/1.0 DIC |
| Micromanipulator | Scientifica | PatchStar | |
| Recording chamber | Custom made | ||
| Power supply | Manson | HCS-3202 | Avoids electrical noise from microscope built-in power supply |
| Vibration isolated table | Newport | M-VW-3636-OPT-01 | |
| Faraday cage | Custom made or any commercial matching table | ||
| Hoses | Any comercial; e.g. Roth | Different sizes and materials for bath handling and application of pipette pressure; agar bridges | |
| Linear shaker | Sunlab Instruments | SU 1000 | |
| Liquid junction potential calculator | Molecular Devices or directly from Peter H. Barry | Program is included in the Clampex aquisition software or can be obtained from p.barry@unsw.edu.au | |
| Data acquisition software | Molecular Devices | Clampex 10.X | |
| Data evaluation software | Molecular Devices | Clampfit 10.X | |
| PsACR1 | GenBank or Addgene | KF992074.1 or Addgene plasmid #85465 | Gene encoding for PsACR1 |
| Amplifier guide | Molecular Devices | The Axon Guide |
References
- Hegemann, P. Algal sensory photoreceptors. Annu. Rev. Plant Biol. 59, 167-189 (2008).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae. Science. 296 (5577), 2395-2398 (2002).
- Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of contractile function in skeletal muscle. Nat. Commun. 6 (7153), 1-8 (2015).
- Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo. Nat. Methods. 7 (11), 897-900 (2010).
- Zhang, F., et al. The microbial opsin family of optogenetic tools. Cell. 147 (7), 1446-1457 (2011).
- Nagel, G., et al. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr. Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
- Li, X., et al. Fast noninvasive activation and inhibition of neural and network activity by vertebrate rhodopsin and green algae channelrhodopsin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (49), 17816-17821 (2005).
- Ishizuka, T., Kakuda, M., Araki, R., Yawo, H. Kinetic evaluation of photosensitivity in genetically engineered neurons expressing green algae light-gated channels. Neurosci. Res. 54 (2), 85-94 (2006).
- Wietek, J., et al. Conversion of channelrhodopsin into a light-gated chloride channel. Science. 344 (6182), 409-412 (2014).
- Berndt, A., et al. Structural foundations of optogenetics: Determinants of channelrhodopsin ion selectivity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 113 (4), 822-829 (2016).
- Tsunoda, S. P., Hegemann, P. Glu 87 of Channelrhodopsin-1 Causes pH-dependent Color Tuning and Fast Photocurrent Inactivation. Photochem. Photobiol. 85 (2), 564-569 (2009).
- Schneider, F., Gradmann, D., Hegemann, P. Ion selectivity and competition in channelrhodopsins. Biophys. J. 105 (1), 91-100 (2013).
- Prigge, M. Über die elektrophysiologische Untersuchung und Entwicklung von farbverschobenen Kanalrhodopsinchimären aus der Grünalge Volvox carteri. , Diss. Humboldt-Universität zu Berlin. Available from: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:11-100203476 (2012).
- Govorunova, E. G., Spudich, E. N., Lane, C. E., Sineshchekov, O. A., Spudich, J. L. New Channelrhodopsin with a Red-Shifted Spectrum and Rapid Kinetics from Mesostigma viride. MBio. 2 (3), 1-9 (2011).
- Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Li, H., Janz, R., Spudich, J. L. Characterization of a highly efficient blue-shifted channelrhodopsin from the marine alga Platymonas subcordiformis. J. Biol. Chem. 288 (41), 29911-29922 (2013).
- Hou, S. -Y., et al. Diversity of Chlamydomonas Channelrhodopsins. Photochem. Photobiol. 88 (1), 119-128 (2012).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat. Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophys. J. 96 (5), 1803-1814 (2009).
- Yizhar, O., et al. Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction. Nature. 477 (7363), 171-178 (2011).
- Berndt, A., Yizhar, O., Gunaydin, L. a, Hegemann, P., Deisseroth, K. Bi-stable neural state switches. Nat. Neurosci. 12 (2), 229-234 (2009).
- Berndt, A., Lee, S. Y., Ramakrishnan, C., Deisseroth, K. Structure-Guided Transformation of Channelrhodopsin into a Light-Activated Chloride Channel. Science. 344 (6182), 420-424 (2014).
- Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Spudich, J. L. Proteomonas sulcata ACR1: A Fast Anion Channelrhodopsin. Photochem. Photobiol. 92 (2), 257-263 (2016).
- Wietek, J., Broser, M., Krause, B. S., Hegemann, P. Identification of a Natural Green Light Absorbing Chloride Conducting Channelrhodopsin from Proteomonas sulcata. J. Biol. Chem. 291 (8), 4121-4127 (2016).
- Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Janz, R., Liu, X., Spudich, J. L. Natural light-gated anion channels: A family of microbial rhodopsins for advanced optogenetics. Science. 349 (6248), 647-650 (2015).
- Neher, E., Sakmann, B., Steinbach, J. H. The extracellular patch clamp: A method for resolving currents through individual open channels in biological membranes. Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. 375 (2), 219-228 (1978).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. Arch. Eur. J. Physiol. 391 (2), 85-100 (1981).
- Barry, P. H. JPCalc, a software package for calculating liquid junction potential corrections in patch-clamp, intracellular, epithelial and bilayer measurements and for correcting junction potential measurements. J. Neurosci. Methods. 51 (1), 107-116 (1994).
- Amtmann, A., Sanders, D. A unified procedure for the correction of liquid junction potentials in patch clamp experiments on endo- and plasma membranes. J. Exp. Bot. 48, (Special) 361-364 (1997).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).
- Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. J. Vis. Exp. (63), e1-e18 (2012).
- Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 84 (21), 7413-7417 (1987).
- Halliwell, J., Whitaker, M., Ogden, D. Using microelectrodes. Microelectrode Tech. Plymouth Work. Handb. 3, 1-15 (1949).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J. Vis. Exp. (20), e1-e2 (2008).
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
- Pusch, M., Neher, E. Rates of diffusional exchange between small cells and a measuring patch pipette. Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. 411 (2), 204-211 (1988).
- Berndt, A. Mechanismus und anwendungsbezogene Optimierung von Channelrhodopsin-2. , Diss Humboldt-Universität zu Berlin. Available from: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:11-100191266 (2011).
- Prigge, M., et al. Color-tuned channelrhodopsins for multiwavelength optogenetics. J. Biol. Chem. 287 (38), 31804-31812 (2012).
- Gradmann, D., Berndt, A., Schneider, F., Hegemann, P. Rectification of the channelrhodopsin early conductance. Biophys. J. 101 (5), 1057-1068 (2011).
- Beppu, K., et al. Optogenetic countering of glial acidosis suppresses glial glutamate release and ischemic brain damage. Neuron. 81 (2), 314-320 (2014).
- Wietek, J., Prigge, M. Enhancing Channelrhodopsins: An Overview. Methods Mol. Biol. 1408, 141-165 (2016).
- Ferenczi, E. A., et al. Optogenetic approaches addressing extracellular modulation of neural excitability. Sci. Rep. 6, 1-20 (2016).
- Zhang, F., et al. Red-shifted optogenetic excitation: a tool for fast neural control derived from Volvox carteri. Nat. Neurosci. 11 (6), 631-633 (2008).
- Sugiyama, Y., et al. Photocurrent attenuation by a single polar-to-nonpolar point mutation of channelrhodopsin-2. Photochem. Photobiol. Sci. 8 (3), 328-336 (2009).
- Kleinlogel, S., et al. Ultra light-sensitive and fast neuronal activation with the Ca2+-permeable channelrhodopsin CatCh. Nat. Neurosci. 14 (4), 513-518 (2011).
- Wang, H., et al. Molecular determinants differentiating photocurrent properties of two channelrhodopsins from chlamydomonas. J. Biol. Chem. 284 (9), 5685-5696 (2009).
- Gradinaru, V., Thompson, K. R., Deisseroth, K. eNpHR: a Natronomonas halorhodopsin enhanced for optogenetic applications. Brain Cell Biol. 36 (1-4), 129-139 (2008).
- Berglund, K., et al. Luminopsins integrate opto- and chemogenetics by using physical and biological light sources for opsin activation. Proc. Natl. Acad. Sci. 113 (3), 358-367 (2016).
