Summary
يعرض هذا العمل بروتوكول خطوة بخطوة لتقدير إعداد الخلايا العصبية تتميز ستيريولوجيكال غير متحيزة في أسود الدماغ الماوس باستخدام معدات الفحص المجهري القياسي (أي، مجهر ضوء، يجهز كائن جدول (x, y, z الطائرة)، وبرمجيات المجال العام لتحليل الصور الرقمية.
Abstract
في بحوث مرض باركنسون قبل الإكلينيكية، تحليل المسالك نيجروسترياتال، بما في ذلك تحديد مقدار الخسارة العصبية تتميز داخل أسود الدماغ، أمرا أساسيا. لتقدير عدد الخلايا العصبية تتميز الإجمالي، يعتبر غير متحيز ستيريولوجي باستخدام الأسلوب فراكتيوناتور الضوئية حاليا معيار الذهب. لأن النظرية وراء الأسلوب فراكتيوناتور الضوئية المعقدة ونظرا لأن ستيريولوجي أمر يصعب تحقيقه دون المعدات المتخصصة، عدة نظم ستيريولوجي كاملة المتاحة تجارياً التي تشمل البرمجيات اللازمة موجودة، محض لعد أسباب الخلية. منذ شراء إعداد ستيريولوجي متخصصة ليست دائماً ممكنة، لأسباب كثيرة، يصف هذا التقرير وسيلة لتقدير ستيريولوجيكال من الخلايا العصبية تتميز بحساب استخدام معدات الفحص المجهري القياسية، بما في ذلك مجهر خفيفة، يجهز كائن الجدول (x، y، z الطائرة) مع برامج التصوير، وجهاز كمبيوتر للتحليل. ويرد شرح خطوة بخطوة حول كيفية إجراء التقدير الكمي ستيريولوجيكال باستخدام الأسلوب فراكتيوناتور الضوئية، ويتم توفير ملفات مبرمجة مسبقاً لحساب عدد خلايا المقدرة. وأجرى لتقييم مدى دقة هذا الأسلوب، مقارنة بالبيانات التي تم الحصول عليها من جهاز ستيريولوجي متاحة تجارياً. أرقام الخلية القابلة للمقارنة تم العثور على استخدام هذا البروتوكول والجهاز ستيريولوجي، مما يدل على دقة هذا البروتوكول بالنسبة ستيريولوجي غير متحيزة.
Introduction
التحديد الكمي لعدد الخلايا العصبية يعتبر عنصرا محوريا في أبحاث مرض باركنسون قبل الإكلينيكية لتحديد مستوى نيوروديجينيريشن داخل المادة الرمادية (SN)1،2. ويعتبر تقدير عدد الخلايا في منطقة لمصلحة ستيريولوجيكال غير متحيزة معيار الذهب3،،من45.
قبل مجيء ستيريولوجي غير منحازة، تم تقييم عدد الخلايا العصبية في الأقسام عن طريق التلاعب في التشكيلات الجانبية للخلية التي تم جردها لتصحيح للاحتمالات متغير أن الخلايا العصبية حيز البصر في مقطع. إحدى الطرق الأكثر استخداماً هو تصحيح عدد خلايا كمياً تصفها ابركرومبي6. هذا الأسلوب وحاول أن تأخذ في الاعتبار أن الخلايا يمكن قياسها كمياً أكثر من مرة إذا تم العثور على أجزاء من نفس الخلية في أقسام رقيقة المتاخمة. وبالتالي، ابركرومبي ومؤلفين آخرين إنشاء المعادلات التي تتطلب افتراضات بشأن شكل وحجم، والتوجه ل الخلايا التي تم جردها7،8. بيد هذه الافتراضات عادة لم تتحقق وذلك أدى إلى أخطاء منهجية، والاختلاف من عدد الخلايا الفعلية (أي تحيز). وعلاوة على ذلك، يمكن تخفيض التحيز ليس بأخذ العينات الإضافية3.
لتقدير أرقام الخلية باستخدام فراكتيوناتور الضوئية ستيريولوجيكال، يتم تطبيق المبادئ الرياضية مباشرة تقدير أرقام الخلية مباشرة في مجلد محدد، ثلاثي الأبعاد. وميزة هذا الأسلوب أنها لا تنطوي على افتراضات بشأن شكل وحجم، والتوجه للخلايا يتم حسابها. وهكذا، أرقام الخلية المقدرة هي أقرب إلى القيم الحقيقية والاقتراب كما يزيد حجم العينة (أي، غير متحيز)3. نظراً لأن العديد من القواعد يجب أن يتبع عند استخدام ستيريولوجي للاحتفاظ الطريقة غير متحيزة، وضعت نظم جاهزة للاستخدام التجاري ستيريولوجي (للاستعراض، انظر شميتز وهوف، 20054). نظم ستيريولوجي المتخصصة تنفيذ أساليب ستيريولوجيكال التصميم القائم مع خطط أخذ العينات والمسابير مسبقاً تعريف لتقييمات ستيريولوجيكال التي تؤدي إلى الاستقلال عن الشكل والحجم، والتوزيع المكاني، وتوجه الخلايا يتم تحليلها4،9. ومع ذلك، نظم ستيريولوجي المتاحة تجارياً غالية الثمن؛ وهذا قد يحد من تنفيذ في بحث جديد.
كان الهدف من هذه الدراسة لتطوير تقنية يمكن استخدامها لتقدير ستيريولوجيكال المستندة إلى تصميم عدد خلايا تتميز في الماوس SN، استخدام الأسلوب فراكتيوناتور الضوئية واستخدام معدات الفحص المجهري القياسي (أي، خفيفة المجهر مجهر القياسية والبرامج ويجهز x، y، z المرحلة). لهذا، يرد دليل خطوة بخطوة حول كيفية معالجة أنسجة المخ الماوس وكيفية تقدير أرقام الخلية التعطيل باستخدام ستيريولوجي غير منحازة على أساس التصميم. وعلاوة على ذلك، يتم توفير قوالب لحساب أرقام الخلية المقدرة ومعاملات للخطأ (CE).
الأسلوب الموصوفة هنا لا يقتصر على تحليل التعطيل، ولكن يمكن تكييفها للاستخدام في المناطق الأخرى المحددة تشريحيا الدماغ الماوس أو الفئران. على سبيل المثال، استخدمت ستيريولوجي غير منحازة لتقدير أرقام الخلايا العصبية في قرن آمون10 و كوروليس موضع11. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تقييم أنواع الخلايا عدا الخلايا العصبية، مثل أستروسيتيس12 و microglia13، كذلك. ولذلك، هذا الأسلوب يمكن أن تكون مفيدة للعلماء الذين تعتزم تنفيذ ستيريولوجي غير متحيزة في أبحاثهم ولكنهم ليسوا على استعداد لإنفاق الكثير من المال لشراء نظام ستيريولوجي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
اتبعت جميع التوجيهية الدولية والوطنية، و/أو المؤسسية المطبق لرعاية واستخدام الحيوانات. واعتمد البروتوكول السلطات المحلية في اونترفرانكين فون ريجيرونج، ويرزبيرج، ألمانيا-
1-تجهيز الأنسجة وإيمونوهيستوتشيميستري
- الفئران يوثانيزي CO 2 أو أي دولة أخرى وافقت الأسلوب.
- عمره 12 أسبوع ستة بيرفوسي C56Bl/6N الفئران الذكور ترانسكارديالي مع 10 مل من مخزنة الفوسفات 0.1 M المالحة (PBS) باستخدام إبرة 25-ز، ومضخة لضخ، تليها 70 مل بارافورمالدهيد 4% (PFA) في برنامج تلفزيوني 0.1 م.
تنبيه: منهاج عمل بيجين السامة والمسببة للحساسية، ومسببة للسرطان. - تشريح الدماغ الماوس في الطائرة الاكليلية مع مقسم طريقة عرض مصفوفة الدماغ في منطقة مم +0.74 من بريجما (الرقم 25 وأوضح فرانكلين الماوس الدماغ أطلس 14)-
- وضع الجزء الظهرية من الدماغ، بما في ذلك التعطيل، 4% في منهاج العمل في برنامج تلفزيوني 0.1 م عن د 1 في 4 درجات مئوية للغمر-التثبيت-
- تبادل منهاج العمل لحل مول برنامج تلفزيوني السكروز/0.1 30% للحماية من البرد واحتضانها لآخر 2 د 4 ° C.
- وضع الجزء الظهرية من الدماغ في كريومولد مليئة بالقطع الأمثل درجة الحرارة (OCT) مركب وتجميد الأنسجة ببطء في سائل تبريد الثلج الجاف إيسوبينتاني.
تنبيه: الثلج الجاف باردة للغاية (-78 درجة مئوية)؛ استخدام معدات الوقاية الشخصية (معدات الوقاية الشخصية)، بما في ذلك القفازات، بينما كان يعمل مع الثلج الجاف. الثلج الجاف يتبخر في CO 2؛ ولذلك، تعمل تحت غطاء دخان. - متسلسل قص 30-ميكرومتر cryo-المقاطع في الطائرة الاكليلية وجمع الفروع، بدءاً من 2.46 مم من بريجما (الرقم 51 وأوضح فرانكلين الماوس الدماغ أطلس 14) وتنتهي عند 4.04 مم من بريجما (الرقم 64، أوضح و فرانكلين الماوس الدماغ أطلس 14)-
- تخزين سلسلة أربعة في الأنابيب التي تمتلئ كريوبروتيكتانت (والغليسيرول 30%، اثوكسييثانول 30%، وبرنامج تلفزيوني 40 ٪) في-20 درجة مئوية. أثناء إجراء تقطيع، وضع علامة في نصف الكرة الأيمن بثقب حفرة صغيرة في المنطقة العليا من الدماغ.
- للتلوين المناعي، حدد سلسلة واحدة من الأقسام في الماوس. بريينكوباتي أبواب التعويم الحر ح 1 في مصل الماعز العادي 10% (NGS)/2% BSA/0.5% المنظفات في 0.1 مول برنامج تلفزيوني حول شاكر. احتضان الفروع مع أرنب تيروزين الماوس المضادة hydroxylase (TH؛ وإضعاف 1:1,000) جسم المخفف بنسبة 2% NGS/2% BSA/0.5% المنظفات في 0.1 مول برنامج تلفزيوني بين عشية وضحاها في 4 ° C.
- تطبيق الثانوية أضداد الأرنب Igs (تخفيف 1: 100) ح 2 في درجة حرارة الغرفة، تليها عبدين/البيوتين كاشف (تخفيف 1: 100). احتضان ووصمة عار مع 3,3-ديامينوبينزيديني-تيتراهيدروتشلوريدي (DAB) وح 2 س 2. جبل المقاطع بعد تلطيخ لهم على الشرائح كائن المغلفة.
ملاحظة: ال + تتميز SN الخلايا العصبية مبينة في الشكل 1a. تلطيخ سلسلة واحدة، ملطخة في متوسط 13 SN المقاطع، تمتد من روسترال إلى أجزاء والذيلية SN بارس المكتنزة (سنبك) والشبكي، كل الحيوانات ( الشكل 1b). يتم فصل المقاطع بواسطة 120 ميكرومتر (سلسلة 1/4) ( الشكل 1 ج)-
تنبيه: الدأب مادة مسرطنة مشتبه فيها. أنها سامة بالاتصال واستنشاق. استخدام معدات الوقاية الشخصية عند العمل مع الدأب.
2. الحصول على الصور
- إيمونوهيستوتشيميكالي "ال التقاط" الملون SN المقاطع رقمياً باستخدام برامج التصوير التي تقترن مجهر. تحليل كل على حدة في كل قسم من سلسلة واحدة-
- استخدام الخيار مسح الشرائح من برامج التصوير. حفظ في تنسيق TIFF لصور عالية الجودة (الشكل 2).
ملاحظة: دقة وضوح الصورة 312 بكسل لكل سم. - الصحافة " الحصول على " لفتح نافذة اقتناء (الشكل 2a). تعيين
- binning إلى " 2 " للصور الرمادية.
ملاحظة: الحصول على الصور الرمادية بدلاً من صور ملونة يقلل من حجم ملف الصورة النهائية المكدس (الشكل 2a). - انقر فوق " "عرض حية" " في إطار اقتناء لفتح نافذة جديدة تظهر الصورة الحية للقسم (الشكل 2 وب). انقر فوق
- في " مرحلة " في إطار اقتناء. اختر " "مسح الشرائح" " في القائمة المنسدلة والاختيار المربع (الشكل 2 (ج)).
ملاحظة: هذا يمكن اقتناء والمحاذاة للصور SN تكبيرا عاليا (630 X التكبير) في x, y-الطائرة، فضلا عن الحصول على صور مكدس مع مسافة بين صور متتالية من 1 ميكرومتر في الطائرة-z، تغطي مجموعة إجمالي من 13 μ م. - حدد الهدف X 2.5 للبحث للتعطيل.
- تغيير هدف 63 العاشر-
- تحديد الزاوية اليسرى العليا (توبليفت) (الشكل 2 (ج)) والزاوية اليمنى السفلي (لوريت) (الشكل 2d) القسم بالنقر على " مجموعة-"
- انقر فوق " ض سلسلة " وتحقق من " سلسلة Z-طائرة " مربع (الشكل 2e).
- تحديد سمك المحملة الفعلية من المقاطع في عد تم اختيارها عشوائياً ثلاثة مواقع كل مقطع باستخدام برامج التصوير. لهذا، انقر فوق " "عرض أعلى الإزاحة" " لتحديد الجزء العلوي من هذا الباب (الشكل 2e) ثم انقر على " "إيقاف عرض أعلى" " (الشكل 2 واو). وبعد ذلك، انقر فوق " "إزاحة أسفل طريقة العرض" " (الشكل 2 واو) ثم انقر فوق " "وقف أسفل طريقة العرض" " (الشكل 2 ز). قم بتدوين سمك المقطع.
- طرح 3 ميكرومتر (منطقة الحرس) من الأعلى الإزاحة واكتب النتيجة في الفتحة المقابلة أعلى (ح الشكل 2). طرح 13 ميكرومتر (ارتفاع ديسيكتور البصرية) من أعلى رقم الإزاحة واكتب النتيجة في الفتحة أسفل الإزاحة (الشكل 2 طاء). تحديد المعلمات التالية: الخطوات، 14؛ الحجم، 1.00 (الشكل 2 طاء).
ملاحظة: وهذا يتوافق مع سمك في z-الطائرة من 13 ميكرومتر، مع مسافة 1 ميكرومتر بين صور متتالية. - حدد الدليل لحفظ الملف (2j الشكل)-
- انقر فوق " تسلسل " لبدء الحصول على (الرقم 2j).
- انقر فوق " تجهيز " وتحديد المعلمات التالية: " "جميع الطائرات"، " من " التسلسل؛ " " المونتاج؛ " " سريع " و " ستيتشينج " مربعات، مع وجود تداخل صورة بنسبة 10% (الشكل 2 ك). ابدأ بغرزة الصور عن طريق النقر على " بدء ".
ملاحظة: سيؤدي هذا إلى إنشاء الصور المكدس للتحليل (الشكل 2 لتر، الشكل 3 ألف -ه)-
3. تسلسل من "تقييم ستيريولوجيكال"
- إجراء تحليل SN رص الصور باستخدام إيماجيج المعاهد الوطنية للصحة البرمجيات الإصدار 4.7.
- تحميل اثنين الإضافات اللازمة من موقع ImageJ.nih.gov: " "تراكب الشبكة" " المساعد 15 " "العداد خلية" " المساعد 16. تركيب كل الإضافات كما هو موضح.
- لتقييم ستيريولوجيكال غير منحازة، تعريف المعلمات فرز الأصوات كما يلي: حجم الشبكة، 130 × 130 ميكرومتر؛ عد الإطار, 50 x 50 ميكرومتر؛ والارتفاع ديسيكتور الضوئية، 13 & #181؛ م.
- فتح الصورة عن طريق النقر على " ملف " → " فتح " (الشكل 4 أ) تعيين حجم الصورة باستخدام " تحليل " → " "ضبط مقياس" " الأمر (الشكل 4 باء). لهذه الخطوة، تغيير حجم محدد من بكسل ميكرومتر (الشكل 4 ج)-
ملاحظة: للصور تم تحليلها، 425 بكسل يناظر 100 ميكرومتر. - حدد " الإضافات " → " شبكة " → " "نوع الشبكة": خطوط " الأمر إدراج عشوائياً شبكة. تحقق من " "إزاحة عشوائية" " مربع. تحديد حجم مربع واحد داخل الشبكة (الشبكة--مربع) ك 130 ميكرون x 130 مكم = 16,900 مكم 2 ( الشكل 3b و الشكل 4 د و ه)-
- تغير نوع من الصورة 16-بت للألوان RGB (انقر فوق " صورة " → " نوع " → " لون RGB ") (الشكل 4f). قم بتحديد موقع سنبك، كما وصفها باقويت et al. 17. تطويق سنبك مع " "أداة فرشاة الطلاء" " (فرشاة العرض: 11) ( الشكل 3 جيم و زاي 4 الرقم -أنا).
- تراجع " "ضبط مقياس" " الأوامر بواسطة النقر فوق " تحليل " → " "ضبط مقياس" " → " انقر "إزالة مقياس" " (4j الشكل -l) لتمكين أداء العمليات الحسابية في بكسل بدلاً من ذلك من ميكرومتر.
- جعل لقطة (الشكل 4 م) وحفظ ملف الصورة، وفتح الملف الجديد مع إيماجيج (4n الشكل). حدد " نقطة " (4o الشكل) وعرض فرشاة من 25 (الشكل 4 ف). مارك كل مربع الشبكة أن إجراء اتصالات التعطيل للموضع من ديسيكتور الضوئية (4q الشكل). إجراء تحليل لعدد الخلايا في جميع ديسيكتورس الضوئية التي تكون مترجمة كاملا أو جزئيا داخل التعطيل المبينة.
- حدد مربع شبكة واحد يحتوي على أجزاء من التعطيل. قياس الزاوية اليسرى العليا من هذه الساحة مع المؤشر في إيماجيج لتعريف x و y تنسق لتبدأ مع (الرقم 4r).
ملاحظة: سيتم إدراج إحداثيات لبصرى ديسيكتور تحديد المواقع باستخدام " موقف ديسيكتور الضوئية " (4s الشكل)، كما هو موضح في الخطوة 4. - حساب موقف ديسيكتور الضوئية باستخدام قالب جدول عنوان، " موقف ديسيكتور الضوئية، " كما هو موضح في الخطوة 4.
- معايرة ديسيكتور الضوئية (ماكرو كتبه كريستوفر وارد س.، الملف تكميلية) بالنقر فوق " الإضافات " → " وحدات الماكرو " → " تحرير " (الرقم 4t)، فتح " opt_dis_ grid.txt " ملف (الرقم 4u)، وتحديد الحجم " أوسيرجريد " في بكسل الذي يتوافق مع x، y البعد ديسيكتور الضوئية (4v الشكل). حدد حجم 50 ميكرومتر µm x 50، بحيث يعرف الحجم جانب واحد من أوسيرجريد كسل 212.5 (4.25 × 50 بكسل)-
- تحديد موقف ديسيكتور الضوئية في الصورة المكدس عن طريق إدراج إحداثيات ImageX وإيماجيي التي تقوم بتعريف مركز ديسيكتور الضوئية (4v الشكل). تشغيل الماكرو (" وحدات الماكرو " → " "تشغيل الماكرو" ") (رقم 4w)-
ملاحظة: سوف تختفي الشبكة من الصورة المكدس ( الشكل 3d و الشكل 4 x). سوف تستمر ديسيكتور الضوئية عند تحريك لأسفل في z-الطائرة ( الرقم 3e و الشكل 4 x)- - تحديد " الإضافات " → " "العداد الخلية" " لبدء تشغيل البرنامج المساعد "العداد الخلية" (الشكل 4y). تهيئة "العداد الخلية" وتحديد نوع علامة (4z الشكل). قم بتكبير الصورة (اضغط على " + ") والقيام بتقييم أرقام الخلية في تكبير من 200% ستيريولوجيكال.
- تحديد بيريكاريا تتميز الخلايا العصبية بتقريب أو مغزليا الشكل وخلية حجمها ( الشكل 1a). تحديد عدد الخلايا باستخدام قواعد ستيريولوجيكال.
ملاحظة: منذ ديسيكتور الضوئية مكعب ثلاثي الأبعاد ( الشكل 5a)، تعريف الجانبين الاستبعاد كالجبهة، اليسار، والجانبين العلوي للمكعب (أحمر). ولذلك، دون ' عد تي ال + الخلايا التي تأتي مع الخط الأحمر (اليسار والجبهة) أو أعلى الجانب. إضافة نتائج عدد خلايا إلى ملف جدول البيانات المعدة بعنوان، " حساب عدد الخلايا " (الخطوة 5)- - وفقا للصورة SN، حساب المربع الشبكة التالي الذي وضع ديسيكتور الضوئية للعد الخلية التالية، استخدام x، y الخطوات حجم الشبكة السطحية ( الشكل 5b) " موقف ديسيكتور الضوئية " قالب جدول البيانات، كما هو موضح في الخطوة 4.
- إجراء تقدير لاستخدام الخلية رقم " حساب عدد الخلايا " جدول البيانات (الخطوة 5)-
4. حساب "موقف ديسيكتور الضوئية باستخدام" " "الضوئية ديسيكتور موقف" " "قالب جدول"
- حساب حجم وموضع لكل ديسيكتور الضوئية وضعها في الشبكة السطحية داخل المخطط التفصيلي (SN الشكل 5 (ب)) استخدام " position.xlsx ديسيكتور الضوئية " ملف جدول بيانات (ملف تكميلي).
- إدراج عملية التحويل من بكسل لكل ميكرومتر، حسب تعريف " "ضبط مقياس" " الأمر، إلى مواقف ملحوظة صفراء " الضوئية ديسيكتور position.xlsx " ملف ( الشكل 6a و "ملف إضافي" ).
- إدراج حجم المخطط ديسيكتور الضوئية وحجم الشبكة-ساحة الشبكة السطحية، يعرف بطول جانب واحد (في ميكرومتر)، في مواقف ملحوظ البرتقال.
ملاحظة: النتائج هي صورت في مربعات حمراء بجوار المربعات البرتقالية. - ابدأ مع الشبكة المربع ضمن مخطط التعطيل التي تم تحديدها كنقطة انطلاق (شبكة واحدة-ساحة اختير بادئ ذي بدء، كما هو الحال في الخطوة 3، 9، أعلاه)-
- إدراج x و y تنسق، مقيسا بخطوة 3.9، إلى مربعات خضراء للملف (باستخدام هذه القيم, x, y إحداثيات ليتم حساب مركز ديسيكتور الضوئية داخل هذا المربع الأول، ويصور النتائج في مربعات زرقاء). تشغيل الماكرو opt_dis_grid.txt (ملف تكميلي).
- حساب x, y إحداثيات ديسيكتورس الضوئية على التوالي عن طريق إدراج مسافة الشبكة-ساحة (مقيسة بعدد من المربعات) بالنسبة إلى ساحة الشبكة الأولى (مربعات براون)-
ملاحظة: + x: الشبكة-ساحة يقع إلى اليمين؛ -x: الشبكة-ساحة يقع إلى اليسار؛ + y: شبكة مربعة تقع إلى الأسفل؛ -ص: شبكة مربعة تقع إلى الأعلى. وترد النتائج في مربعات رمادية.
5. تقدير "عدد الخلايا باستخدام" " حساب عدد الخلايا " جدول
- حساب العدد المقدر للخلايا TH + SN كل الحيوانات (N) باستخدام الصيغة المنشورة بالغرب et al.، 1991 3، حيث ∑ س – يعرف العدد الكلي للخلايا العصبية ال + عد في جميع ديسيكتورس الضوئية قسم الدماغ واحد.
ملاحظة: يتم تضمين ارتفاع ديسيكتور الضوئية (ح) فيما يتعلق بقياس سمك المقطع (t) في المعادلة. يعرف الكسر مجال أخذ العينات (asf) كنسبة المنطقة (أ) حجم الإطار ديسيكتور الضوئية (ديسيكتور ضوئية) داخل مربع حجم الشبكة (x, y خطوة) (بصري ديسيكتور/A x، y خطوة) ( الشكل 3)، يتم تعريف قسم أخذ العينات كسر (صندوق الضمان الاجتماعي) كنسبة أقسام الدماغ قطع كامل متسلسل:
لضمان الجودة الكمية المقدرة، المعامل وينبغي أن يكون الخطأ (CE) أقل من 0.10. تحديد CE استخدام الصيغة التي كوكر et al., 2001 10:
- لتقدير عدد الخلايا داخل التعطيل كل ستيريولوجيكال الماوس، قم بإدراج المعلومات المشار إليها فيما يتعلق بالعدد الإجمالي للسلسلة التي تم إنشاؤها في الماوس، وارتفاع ديسيكتور الضوئية، x، y منطقة ديسيكتور الضوئية (بصري ديسيكتور، في ميكرومتر 2)، x، y مجال الشبكة مربعة (x، y خطوة ، ميكرومتر 2)، ويعني قياس سماكة المقطع (في ميكرومتر) في المربعات الصفراء باستخدام " حساب count.xlsx خلية " ملف جدول بيانات ( الشكل 6b و "ملف إضافي" ).
- تحليل كل قسم التعطيل من الحيوان نفسه، كما هو موضح في الخطوة 5. خلية
- إدراج حساب لكل ديسيكتور الضوئية في مربعات رمادية، كل سطر الإشارة إلى مقطع واحد من التعطيل، واستخدام " حساب count.xlsx خلية " ملف جدول بيانات (ملف تكميلي).
ملاحظة: عدد الخلايا المقدرة و CE المحسوبة هي صورت في مربعات زرقاء ( الشكل 6b).
6. تقدير عدد الخلايا باستخدام "نظام ستيريولوجي المتاحة تجارياً"
- ابدأ تقدير تتميز سنبك عدد الخلايا بالنقر فوق " يسبر " → " "الضوئية فراكتيوناتور سير" " لفتح "فراكتيوناتور الضوئية" إطار سير العمل.
ملاحظة: نافذة جديدة سوف المنبثقة لتحديد إذا سلسلة جديدة من التعطيل لن تحسب. - بدء سلسلة جديدة من ال + SN المقاطع بواسطة النقر فوق " بدء موضوع جديد " في نافذة منبثقة.
- تذهب من خلال الخطوات المختلفة "سير العمل فراكتيوناتور الضوئية". قم بإعداد هذا الموضوع في الخطوة الأولى. لهذا، إدراج المحقق ' اسم s، الموضوع ' دا اسم (SN المجموعة)، ومعلومات أخرى مفيدة. إدراج أرقام المقاطع لعد لهذا التعطيل. إدراج سمك الفروع قطع الأنسجة. إدراج المقطع الفاصل الزمني، وأربعة في هذه الحالة. إدراج رقم المقطع تصميماً عشوائياً لتبدأ.
- وفي الخطوة الثانية، تعيين المجهر انخفاض التكبير (2 X الهدف)، وحدد " 2 X عدسة ماج " من القائمة.
- في الخطوة 3، تتبع منطقة الاهتمام باستخدام زر الماوس الأيسر، وهو سنبك، كما وصفها باقويت et al., 2009 17- تعيين
- المجهر إلى تضخم عالية في الخطوة 4. لهذا، قم بتغيير الهدف إلى 100 X وحدد " 100 "ماج س" عدسة " من القائمة المنسدلة.
- قياس سماكة المحملة في الخطوة 5 بالتركيز إلى الأعلى وإلى أسفل المقطع.
- في الخطوة 6، تحديد حجم الإطار عد ك 50 x 50 ميكرون؛ وهذا هو حجم ديسيكتور الضوئية (x, y).
- في الخطوة 7، تعيين حجم عينة عشوائية منتظمة (SRS) الشبكة ك 130 x 130 ميكرومتر.
- إدخال منطقة حرس 3 ميكرومتر في الخطوة 8.
- حفظ الإعدادات في الخطوة 9- وأخيراً، عد
- ال + تتميز الخلايا الموجودة في كل من ديسيكتورس البصرية داخل الشبكة SRS في الخطوة 10 من "سير فراكتيوناتور البصري". لذلك، ابدأ بالنقر فوق " عد " زر.
- بعد الانتهاء من مقطع واحد، انقر على " "يبدأ المقطع التالي" " زر لبدء تشغيل "سير العمل فراكتيوناتور الضوئية" للمقطع التالي من التعطيل لنفس سلسلة SN.
- عند قد تم تحديده كمياً SN القسم الأخير من سلسلة SN واحدة، انقر على " وأنا ' ve انتهى العد. "
- انقر فوق " "عرض نتائج" " الزر لعرض نتائج العينات ستيريولوجي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
استخدام أسلوب عرضها، العدد المقدر لل + تتميز الخلايا العصبية في حق التعطيل وتراوحت بين الخلايا 7,363 و 7,987، وفي اليسار التعطيل، بين الخلايا 7,446 و 7,904. وبالتالي، كان متوسط عدد الخلايا العصبية تتميز (± SEM) 7,647 الخلايا 83 ± ± 7,675 66 لليسار التعطيل وحق التعطيل. CE المحسوبة لكل الحيوانات كانت أقل من 0.08 (النطاق: 0.073 0.079) (الشكل 7). للتأكد من إمكانية المقارنة بين هذا الأسلوب مع نظم ستيريولوجي المتخصصة والمتاحة تجارياً، كانت أرقام الخلية SN أيضا كمياً باستخدام الإعداد ستيريولوجي (الشكل 8). كانت المعلمات العد: حجم الشبكة، 130 × 130 ميكرومتر؛ عد الإطار, 50 x 50 ميكرومتر؛ منطقة الحرس، 3 ميكرومتر. أقسام حللت مع 100 x/1.25 الهدف الفتحة العددية في مجهر BX53. يقدر عدد سكان ال + SN الخلايا العصبية باستخدام سمك الباب يعني تتراوح من 7,067 إلى 8,105 الخلايا/التعطيل و 7,164 إلى 8,015 الخلايا/التعطيل على الجانبين الأيمن والأيسر، على التوالي. تم حساب متوسط عدد الخلايا العصبية 7,535 ± 155 خلايا حق التعطيل و 7,699 ± الخلايا 128 لليسار SN. م جوندرسن (m = 1) وكان ≤0.08 في كل SN كمياً (الشكل 7). التحليل الإحصائي باستخدام اختبار t المزدوجة الطالب لم تكشف عن أي اختلافات كبيرة بين عدد خلايا TH + طريقتين في الحق أو التعطيل الأيسر (يعني ± ووزارة شؤون المرأة؛ الحق: t (5) = 0.9524، ف > 0.05; اليسار: t (5) = 0.2928، ف > 0.05) (الرقم 7 ).
الشكل 1. صور الممثل للتعطيل الماوس الملون تتميز الخلايا العصبية.
(أ) لمحة عامة عن SN الماوس ممثل يظهر في اللوحة العلوية. ملاحظة ثقب صغير في الجزء العلوي من جذع الدماغ الحق الذي يمثل الجانب الأيمن. أعلى التكبير من اقحم (الصندوق الأسود) يصور ال + تتميز الخلايا العصبية. (ب) سلسلة واحدة من الأقسام الملطخة بال SN يرد، تغطي الماوس SN كامل من روسترال إلى والذيلية. (ج) كل قسم هو القسم على التوالي 120 ميكرومتر. مقياس أشرطة عن: أ من لوحة علوية، 500 ميكرومتر؛ لوحة أقل، صورة كبيرة، 100 ميكرومتر؛ لوحة أقل، واقحم، 50 ميكرومتر؛ ب، 500 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 2. اقتناء الصور لتحليل ستيريولوجيكال باستخدام برامج التصوير.
(أ) سهم أحمر: فتح نافذة اقتناء؛ السهم الأخضر: تعيين binning إلى "2؛" السهم الأزرق: إظهار الصورة الحية. (ب) سيتم فتح نافذة جديدة تظهر الصورة الحية (السهم الأحمر). (ج) السهم الأحمر: حدد من القائمة "المرحلة"؛ السهم الأخضر: حدد الخيار "مسح الشرائح"؛ السهم الأزرق: التحقق من الخيار "مسح الشرائح"؛ السهم الأسود: تعريف الركن الأيسر العلوي. السهم الأسود (د) : تحديد الزاوية اليمنى السفلي. (ﻫ) سهم أحمر: حدد من القائمة "Z-سلسلة"؛ السهم الأخضر: التحقق من سلسلة "Z-الطائرة؛" السهم الأزرق: البدء في "عرض أعلى إزاحة" للبحث عن الجزء العلوي من هذا الباب. (و) السهم الأحمر: انقر فوق "إيقاف أعلى طريقة العرض" لتحديد الجزء العلوي من القسم؛ السهم الأخضر: بدء تشغيل "العرض أسفل إزاحة" للبحث عن الجزء السفلي من المقطع. (ز) السهم الأحمر: انقر فوق "إيقاف أسفل طريقة العرض" لتحديد الجزء السفلي من المقطع. (ح) السهم الأحمر: طرح الحرس 3 ميكرومتر المنطقة من "إزاحة أعلى" وإدراج النتيجة في الفتحة "إزاحة أعلى". (ط) السهم الأحمر: طرح 13 ميكرون من عدد "أعلى إزاحة" وإدراج النتيجة في الفتحة "إزاحة السفلي"؛ السهم الأخضر: تعريف الخطوات 14 المتوافق لسمك z-طائرة من 13 ميكرومتر؛ السهم الأزرق: تعريف حجم ميكرون 1.00 يتوافق إلى مسافة 1 ميكرومتر بين الصور على التوالي. (ي) السهم الأحمر: حدد الدليل لحفظ الملف إلى؛ السهم الأزرق: انقر فوق "التسلسل" لبدء الحصول على الصور. سهم أحمر (k) : انقر فوق "معالجة"؛ تحقق من المعلمات التالية: السهم الأخضر: "جميع الطائرات؛" السهم الأزرق: "التسلسل"؛ السهم الأسود: "المونتاج"؛ السهم الرمادي: "خياطة"؛ الأرجواني السهم: سريعة. (ل) اضغط على السهم الأصفر لبدء خياطة الصور. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
الشكل 3. تجهيز الصور لتحليل ستيريولوجيكال.
(أ) صورة مكدس مثال مأخوذة من ماوس SN. (ب وج) بعد الإدراج العشوائية لشبكة تغمر SN (خطوط الفيروز، ب)، يرد التعطيل في خطوة ثانية (الخط الأزرق، ج). (د) يوضع ديسيكتور بصرية في الصورة المكدس SN. (ه) تغطية ست طائرات التنسيق على التوالي داخل الصورة المكدس SN المجموع في z-الطائرة 13 ميكرومتر. تغيير حجم أشرطة: أ-د، 100 ميكرومتر؛ ﻫ، 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4. تسلسل تقييم ستيريولوجيكال باستخدام إيماجيج.
(أ) سهم أحمر: انقر فوق "ملف" ← "فتح" لفتح صورة مكدس. (ب) السهم الأحمر: انقر فوق "تحليل" ← "ضبط مقياس". (ج) الأسهم الحمراء: تعريف المعلمات "المسافة بالبكسل،" "المسافة المعروفة باسم"، و "وحدة للطول." (د) السهم الأحمر: حدد "الإضافات" ← "الشبكة". سهم أحمر (ه) : حدد "خطوط؛" السهم الأخضر: التحقق من "إزاحة عشوائية؛" السهم الأزرق: إدراج حجم الشبكة في ميكرومتر2. (و) السهم الأحمر: انقر فوق "صورة" ← "نوع" ← "RGB اللون." (ز) السهم الأحمر: حدد أداة "الرسام"؛ السهم الأخضر: تعريف "عرض الفرشاة" 11. السهم الأحمر (ح) : ابدأ لتطويق سنبك. (ط) الأحمر تصور الأسهم محاصرة سنبك. (ي) السهم الأحمر: انقر فوق "تحليل" ← "ضبط مقياس" وإزالة المقياس (ك) بواسطة النقر فوق "انقر لإزالة النطاق،" يصور بالأحمر السهم. ملاحظة التغيير من ميكرومتر (سهمك، الأخضر) إلى بكسل (سهملام، أحمر). (م) أخذ لقطة لشاشة (يشير السهم الأحمر نحو الصورة) و (ن) فتح ملف صورة قطة مع إيماجيج. (س) السهم الأحمر: انقر فوق "نقطة". (ف) السهم الأحمر: إدراج عرض فرشاة من 25. () السهم الأحمر يصور الشبكة ملحوظ-الساحات التي اتصل سنبك. (r) يشير السهم الأحمر في الزاوية اليسرى العليا من ساحة الشبكة الذي يحتوي على جزء من التعطيل. عن طريق وضع المؤشر عند هذه النقطة، x, y إحداثيات لموضع "ديسيكتور الضوئية" (الخطوة 4) يتم قياس وإدراجها في القالب "ديسيكتور الضوئية position.xlsx" (السهمs، أحمر). سهم أحمر (t) : حدد "الإضافات" ←"وحدات الماكرو" ← "تحرير." سهم أحمر (u) : حدد الملف "opt_dis_grid.txt". سيتم فتح نافذة جديدة (v). أدخل حجم "أوسيرجريد"، في بكسل (الخامس، السهم الأحمر)، والعاشر، الإحداثيات y (الخامس، السهم الأخضر). (ث) تشغيل الماكرو "opt_dis_grid.txt" (السهم الأحمر). (س) سوف تظهر ديسيكتور ضوئية في وسط ساحة الشبكة المعرفة مسبقاً (السهم الأحمر). سهم أحمر (y) : انقر فوق "الوظائف الإضافية" ← "عداد الخلية." (ض) تهيئة "العداد الخلية" (السهم الأحمر)، وحدد نوع علامة (السهم الأخضر). اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
الشكل 5. وضع ديسيكتور الضوئية.
(أ) توضيح ديسيكتور الضوئية المستخدمة ستيريولوجي غير متحيزة. ديسيكتور الضوئية مكعب ثلاثي الأبعاد. ثلاث خلايا تخطيطية مرئية داخل ديسيكتور الضوئية. قواعد التحديد الكمي للخلايا ستيريولوجيكال تشير إلى أن الخلايا لمس جانبي المسمى الأحمر ديسيكتور الضوئية المستبعدة (الخلية الحمراء)، بينما الخلايا التي اتصل الأخضر الجانبين المسمى مدرجة في خلية العد (الخلايا الخضراء). (ب) يوضع ديسيكتور بصرية في كل ساحة الشبكة التي تأتي على اتصال التعطيل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 6. حساب موقف ديسيكتور الضوئية وتقدير عدد الخلايا.
(أ) حساب مثال إجراء لتحديد المواقع من ديسيكتور الضوئية. (ب) مثال عن تقدير عدد الخلايا الإجمالي. يتم إدراج عدد الخلايا المحددة كمياً في مربعات رمادية، بينما يتم إدراج معايير القياس الكمي ستيريولوجيكال في المربعات الصفراء. يتم عرض عدد الخلايا المقدرة ومجلس أوربا في مربعات زرقاء. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 7. مقارنة بين الخلية عد المعلمة.
(أ) مقارنة الخلية عدد ال + المقدرة للماوس الأيمن والأيسر SN الحصول عليها من الأسلوب ستيريولوجيكال هو موضح بالبيانات التي تم الحصول عليها من التحليل باستخدام نظام ستيريولوجي المتاحة تجارياً ولم تظهر أي اختلافات كبيرة. وترد قائمة مفصلة من البيانات التي تم الحصول عليها من الحق (ب) واليسار (ج) SN مع عدد الخلايا المقدر للحيوان، وعدد الخلايا التي تم عدها فعلا، عدد المقاطع التي تم عدها، والعدد من مواقع أخذ العينات (أي، حساب عدد المربعات الشبكة) لكلتا الطريقتين. القيم الموجودة في شريط الرسوم البيانية هي ± يعني SEM من البيانات من الفئران 6. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 8. التقدير الكمي للخلايا باستخدام نظام ستيريولوجي المتاحة تجارياً.
(أ-ب) يتم رسم الخطوط العريضة للتعطيل ومواقف ديسيكتورس الضوئية (ج) يتم تلقائياً تحديد. (د-ه) ويتم تحليل كل ديسيكتور الضوئية لعدد الخلايا من خلال التركيز على طول z-الطائرة. يتم عرض ست طائرات التنسيق على التوالي داخل التعطيل. وتناظر الخطوط الحمراء والخضراء ديسيكتور الضوئية. تغيير حجم أشرطة: أ-د، 100 ميكرومتر؛ ﻫ، 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
تكميلية الملف 1. opt_dis_grid.txt اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
تكميلية الملف 2. ديسيكتور الضوئية position.xlsx اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
تكميلية ملف 3. حساب الخلايا count.xlsx اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويبدأ ستيريولوجي مع معالجة الأنسجة. يجب أن يتم قطع الأنسجة SN المسلسل بعناية لمنع الخسائر في الأقسام أثناء تحليل ستيريولوجيكال. بالإضافة إلى ذلك، خطوة أساسية للاحتفال واحد نصف الكرة الأرضية بغية تمييز الحق من اليسار SN عند تنفيذ ستيريولوجي. وضع ثقب صغير في الجزء العلوي من جذع الدماغ تولد نتائج أفضل في الدراسة المقدمة. وعلاوة على ذلك، منذ العمل مع متطلبات الأسلوب فراكتيوناتور الضوئية أن الأنسجة قطع في فروع سميكة من حوالي 30-40 ميكرومتر، بدلاً من ميكرومتر 5-10 أكثر شيوعاً في إيمونوهيستوتشيميستري وجسم واختراق السوائل الأنسجة حضانة أخرى خلال المناعي تلطيخ يجب ضمان، مثل ما باستخدام مطهر.
المناعي تلطيخ الخلايا العصبية تتميز باستخدام تسميات جسم ال SN الخلايا العصبية، فضلا عن الخلايا العصبية داخل منطقة تيجمينتال البطني (صادر)، الذي يقع من ميديالى التعطيل، والخلايا العصبية في الحقل ريتروروبرال. وهكذا، هو آخر نقطة حرجة عند إجراء ستيريولوجي للتعطيل المعرفة بالماوس SN التشريح، إذ لا يمكن تصور الخلايا العصبية SN حصرا بالمناعي المعيارية أو تلطيخ نسيجية. بدلاً من ذلك، يتم الاعتراف بالمعالم التشريحية، مثل نواة سوبثالاميك، وميدان ريتروروبرال، وصادر، هامة لتحديد مدى كامل من ال SN17،،من1819.
ويتعين تقييم عدد الخلايا العصبية موثوقة واستنساخه. على الرغم من أن استخدام مختلف مجموعات الأجهزة المتاحة تجارياً ستيريولوجي، تختلف الأرقام من ال + تتميز SN الخلايا العصبية في الفئران wt، مأخوذة من منشورات مختلفة، في رقم17،20. في باقة et al.، كشف تحليل ستيريولوجيكال على أساس التصميم في 3-4 شهرا ذكوراً وإناثاً C57BL/6J وزن الفئران باستخدام نظام ستيريولوجي متاحة تجارياً ما يقدر 8,716 ± 338 ال + تتميز SN الخلايا العصبية (النطاق: 7,546-9,869)17 . وفي المقابل، سمين وآخرون. العثور على خلايا TH + SN أقل في ذكور الفئران C57BL/6J 9-16 أسبوع أن تلقي القائمة المالحة 0.9 في المائة، تتراوح بين 6,302 الخلايا 262 ± 6,861 ± الخلايا 338، باستخدام إصدار أحدث من نفس نظام ستيريولوجي20. غير أن صاحب البلاغ الأول كان أيضا صاحب البلاغ الأخير في باقويت وآخرون. الورق، وذلك باستثناء درجات متفاوتة من الخبرة كسبب لنتائج مختلفة. وتعكس هذه البيانات المتناقضة الحاجة إلى أسلوب التقدير الكمي ستيريولوجيكال الذي يظهر تباين أقل. للتحقق من الأسلوب الكمي والصيغة المستخدمة، أجريت مقارنة بين نتائج التعطيل الخلية رقم العد باستخدام الأسلوب الموصوفة مع إجراء تقييم كمي باستخدام الإعداد ستيريولوجي المتاحة تجارياً. التحليل الإحصائي ولم تظهر أي اختلافات كبيرة عند مقارنة أرقام ال + تتميز الخلايا العصبية في الحق وترك SN wt الفئران تحدد باستخدام كل تقنيات لتقدير حجم الخلية، مما يدل على أن هذا الأسلوب عمليا ستيريولوجيكال تقدير SN الخلايا العصبية في الفئران.
والميزة الرئيسية للأسلوب المبين هو أنه يقلل من التكاليف التي ترتبط عادة بتنفيذ تقنيات ستيريولوجي لخلية العد. وميزة ثانية هي أنه رص الصور للتعطيل للطريقة الموصوفة، ويتم حفظها ويمكن تحليل أي وقت (حتى في نفس الوقت) بمحقق آخر. وعلاوة على ذلك، اقتناء وتحليلات للصور الفلورية ممكن بهذه الطريقة، لأنه يمكن تلوين الصور الرمادية مع "جداول البحث" في إيماجيج. ومع ذلك، هناك قيود على هذه الدراسة. أولاً، التحديد الكمي لعدد الخلايا أكثر مضيعة للوقت (حوالي 50 في المائة) من القياس الكمي باستخدام نظام ستيريولوجي المتاحة تجارياً. هذا أساسا بسبب سببين: 1. المكدس يجب أن تؤخذ صور التعطيل و 2. يجب أن يتم حساب إيداع ديسيكتور الضوئية داخل كل التعطيل وحساب عدد الخلايا المقدرة و CE يدوياً باستخدام قوالب حساب. ثانيا، على الأقل مع نظام متاح في المختبر، التحليل يمكن فقط إجراء على الصور الرمادية بسبب حجم ملف كبير من الصور الملونة، التي لا يمكن معالجتها بواسطة إيماجيج. وهذا قد يطرح مشكلة إذا كان هناك حاجة إلى قياس اثنين من السكان خلية مختلفة في نفس الوقت في وصمة عار مزدوجة. أنه يمكن أن يكون أكثر صعوبة التمييز بين اثنين من السكان خلية ملطخة بشكل مختلف في الصور الرمادية. ولذلك، على الرغم من أن مرحلة إليه (x، y، z الطائرة) وبرنامج المقابلة متوفرة في العديد من المختبرات التي تعمل مع عينات نسيجية، إدارة ونوعية الصور المكدس سيتوقف على البرنامج مجهر وأداء الكمبيوتر المرفقة.
وهناك طرق ممكنة للتغلب على القيود. باستخدام قوالب حساب وضعنا، يمكن تقليل الأخطاء أو عدم الدقة أثناء تقييم ستيريولوجيكال برمجة وحدات الماكرو لأتمتة بعض العمليات المنجزة حاليا يدوياً والتعجيل بسرعة العمل. بالإضافة إلى ذلك، مع التطوير المستمر إيماجيج وبرامج التصوير الأخرى، وكذلك مع تزايد قوة معالجة الكمبيوتر، أحجام ملف الصورة الأكبر ينبغي أن لا تشكل مشكلة في المستقبل القريب. ولذلك، سوف تكون تحليلات للصور الملونة مشرق الميدان يمكن التحكم فيها مع تقنية وصف.
الأسلوب الموصوفة لا يقتصر على تحليلات للخلايا TH + "التعطيل"، ولكن يمكن توسيعها لتحليل مناطق الدماغ للقوارض وأنواع الخلايا الأخرى. لهذا، يجب أن تحدد الحدود التشريحية لمنطقة اهتمام، وتلطيخ كل منها يجب أن يتم. بالإضافة إلى ذلك، هذا الأسلوب يمكن تكييفها لأقسام أكثر سمكا. لهذا، يجب أن يكون الحصول على صور المكدس تكييفها لتوفير مزيد من الصور المكدس. على سبيل المثال، إذا كانت 40 ميكرومتر سميكة القسم المطلوب، الفعلية شنت سمك المقطع بعد تلطيخ الأنسجة يجب تقييم لتحديد ارتفاع ديسيكتور البصرية اللازمة. طرح 6 ميكرومتر (3-ميكرومتر حراسة المنطقة في الأعلى والأسفل) من سمك الأنسجة يعني وتأخذ النتيجة ارتفاع ديسيكتور الضوئية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
أولاً الأميركي جيم خدمت في المجالس العلمية للمستحضرات الصيدلانية ميرز وشركة تيفا؛ وقد تلقت تمويلاً للسفر من إبسن والمستحضرات الصيدلانية ميرز، ذ م م وشركة Allergan؛ وقد تلقي أتعاب المتكلم من ميرز، تيفا, وشركة Allergan خارج العمل المقدم. . ج. ف عملت كمستشار لبوسطن العلمية ومدترونيك، وأبفيي، وتلقت الأتعاب من مدترونيك والعلمية بوسطن، أبفيي، بيل، Allergan، وجلوبالكينيتيكس خارج العمل المقدم.
Acknowledgments
الكتاب ممتنون لروم كيلي ولويزا Frieß، ومنزل هايك لخبراء المساعدة التقنية؛ إلى هيلغا برنر لرعاية الحيوان؛ وإلى جناح س. تشيستوفير لتوليد وتوزيع ديسيكتور البصرية شبكة البرنامج المساعد للبرنامج إيماجيج.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paxinos mouse atlas | The Mouse Brain George Paxinos Keith B.J.FranklinCopyright @2001 by Academic Press CD Rom designet & created by Paul Halasz | ||
| brain matrix slicer mouse | Zivic Instruments | BSMAS 001-1 | |
| paraformaldehyde | Merck | 1040051000 | |
| sucrose /D(+) Saccharose | Roth | 4621.1 | |
| isopentane | Roth | 3927.1 | |
| glycerol | Merck | 1040931000 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 32205-1L | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| phosphate buffered saline ingredients: | |||
| sodium chloride | Sigma Aldrich | 31434-1KG-R | |
| potassium dihydrogen phosphate | Merck | 1048731000 | |
| di-sodium hydrogen phosphate dihydrate | Merck | 1065801000 | |
| potassium chloride | Merck | 1049360500 | |
| normal goat serum | Dako | X0907 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A4503-100G | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ml | detergent |
| 3,3-Diaminobenzidine-tetrahydrochlorid/DAB tablets 10mg pH 7.0 | Kem En Tec | 4170 | |
| H2O2/ Hydrogen peroxide 30% | Merck | 1072090250 | |
| avidin/biotin reagent | Thermo Scientific | 32050 | Standard Ultra Sensitive ABC Staining Kit, 1:100 |
| rabbit anti mouse tyrosine hydroxylase antibody | abcam | Ab112 | 1:1000 |
| biotinylated goat-anti-rabbit IgG H+L | vector laboratories | BA-1000 | 1:100 |
| StereoInvestigator version 11.07 | MBF | ||
| BX53 microscope | Olympus | ||
| Visiview | Visitron Systems GmbH | 3.3.0.2 | |
| Axiophot2 | Zeiss | ||
| ImageJ software | NIH | Version 4.7 | |
| Tissue-TEK OCT | Sakura | 4583 | |
| dry ice | |||
| grid overlay plugin | Wayne Rasband | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html | |
| cell counter plugin | Kurt de Vos | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html). | |
| optical disector macro | Christopher Ward | ||
| C57Bl/6N male mice | Charles River, Germany | ||
| SuperFrost Plus coated object slides | Langenbrinck, Germany | ||
| 25G needle Microlance 3 | BD | 300400 | |
| REGLO Analog Infusion pump | Ismatec | ISM 829 | |
| StereoInvestigator system | StereoInvestigator version 11.07 | ||
| BX53 microscope | BX53 microscope | ||
| self-assorted stereology | Visiview | ||
| Axiophot2 | Axiophot2 |
References
- Ip, C. W., et al. AAV1/2-induced overexpression of A53T-alpha-synuclein in the substantia nigra results in degeneration of the nigrostriatal system with Lewy-like pathology and motor impairment: a new mouse model for Parkinson's disease. Acta Neuropathol Commun. 5 (1), 11 (2017).
- Ip, C. W., Beck, S. K., Volkmann, J. Lymphocytes reduce nigrostriatal deficits in the 6-hydroxydopamine mouse model of Parkinson's disease. J Neural Transm (Vienna). 122 (12), 1633-1643 (2015).
- West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Anat Rec. 231 (4), 482-497 (1991).
- Schmitz, C., Hof, P. R. Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience. 130 (4), 813-831 (2005).
- Tieu, K. A guide to neurotoxic animal models of Parkinson's disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 1 (1), e009316 (2011).
- Abercrombie, M. Estimation of nuclear population from microtome sections. Anat Rec. 94, 239-247 (1946).
- Rose, R. D., Rohrlich, D. Counting sectioned cells via mathematical reconstruction. J Comp Neurol. 263 (3), 365-386 (1987).
- Weibel, E. R., Gomez, D. M. A principle for counting tissue structures on random sections. J Appl Physiol. 17, 343-348 (1962).
- West, M. J. Design-based stereological methods for counting neurons. Prog Brain Res. 135, 43-51 (2002).
- Keuker, J. I., Vollmann-Honsdorf, G. K., Fuchs, E. How to use the optical fractionator: an example based on the estimation of neurons in the hippocampal CA1 and CA3 regions of tree shrews. Brain Res Brain Res Protoc. 7 (3), 211-221 (2001).
- Mouton, P. R., et al. The effects of age and lipopolysaccharide (LPS)-mediated peripheral inflammation on numbers of central catecholaminergic neurons. Neurobiol Aging. 33 (2), e427-e436 (2012).
- Barreto, G. E., Sun, X., Xu, L., Giffard, R. G. Astrocyte proliferation following stroke in the mouse depends on distance from the infarct. PLoS One. 6 (11), e27881 (2011).
- Robinson, S., et al. Microstructural and microglial changes after repetitive mild traumatic brain injury in mice. J Neurosci Res. 95 (4), 1025-1035 (2017).
- Paxinos, G., Franklin, K. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (2001).
- Rasband, W. Grid_Overlay.java. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html (2010).
- De Vos, K. cell_counter.jar. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html (2010).
- Baquet, Z. C., Williams, D., Brody, J., Smeyne, R. J. A comparison of model-based (2D) and design-based (3D) stereological methods for estimating cell number in the substantia nigra pars compacta (SNpc) of the C57BL/6J mouse. Neuroscience. 161 (4), 1082-1090 (2009).
- Fu, Y., et al. A cytoarchitectonic and chemoarchitectonic analysis of the dopamine cell groups in the substantia nigra, ventral tegmental area, and retrorubral field in the mouse. Brain Struct Funct. 217 (2), 591-612 (2012).
- German, D. C., Manaye, K. F. Midbrain dopaminergic neurons (nuclei A8, A9, and A10): three-dimensional reconstruction in the rat. J Comp Neurol. 331 (3), 297-309 (1993).
- Smeyne, R. J., et al. Assessment of the Effects of MPTP and Paraquat on Dopaminergic Neurons and Microglia in the Substantia Nigra Pars Compacta of C57BL/6 Mice. PLoS One. 11 (10), e0164094 (2016).
