Estereológicos estimación de número de la neurona dopaminérgica en el Nigra del Substantia de ratón usando el fraccionador óptico y equipo de microscopía estándar

Summary

Este trabajo presenta un protocolo paso a paso para la estimación imparcial estereológicos del número de células neuronales dopaminérgicas en la sustancia negra de ratón utilizando equipo de microscopía estándar (es decir, un microscopio de luz, una tabla de objeto motorizado (x, y, z plano) y software de dominio público para el análisis de imagen digital.

Abstract

En la investigación de la enfermedad de Parkinson preclínica, el análisis del tracto nigroestriatal, incluyendo la cuantificación de la pérdida de neuronas dopaminérgicas en el nigra del substantia, es esencial. Para estimar el número de neuronas dopaminérgicas total, estereología imparcial usando el método de fraccionamiento óptico es considerado el estándar de oro. Porque la teoría detrás del método óptico fraccionador es complejo y porque estereología es difícil de lograr sin equipos especializados, existen varios sistemas de estereología completa disponible en el mercado que incluyen el software necesario, puramente para celular con razones. Desde adquirir una configuración de estereología especializados no siempre es factible, por muchas razones, este informe describe un método para la estimación Estereológicas de células neuronales dopaminérgicas cuenta con equipo de microscopia estándar, incluyendo un microscopio de luz, un motorizado de tabla de objeto (x, y, z plano) con software tratamiento de imágenes y una computadora para el análisis. Se da una explicación paso a paso sobre cómo realizar Estereológicas cuantificación mediante el método de fraccionamiento óptico, y se proporcionan archivos preprogramados para el cálculo del estimado del recuento. Para evaluar la exactitud de este método, se realizó una comparación con datos obtenidos de un aparato de estereología comercialmente disponibles. Un número similar de células fueron encontrado usando este protocolo y el dispositivo de la estereología, demostrando así la precisión de este protocolo de estereología imparcial.

Introduction

La cuantificación del número de célula neuronal es fundamental en la investigación de la enfermedad de Parkinson preclínica para determinar el nivel de la neurodegeneración en la substantia nigra (SN)^1,2. La estimación imparcial Estereológicas del número de células en una región de interés se considera el estándar de oro^3,4,5.

Antes del advenimiento de estereología imparcial, se evaluó el número de neuronas en secciones mediante la manipulación de células contadas perfiles para corregir para las probabilidades variables que las neuronas entran en vista en una sección. Uno de los métodos más utilizados fue la corrección de un recuento cuantificados descritos por Abercrombie⁶. Este método tratado de tomar en cuenta que las células se pueden cuantificar más de una vez si fragmentos de la misma célula se encuentran en las secciones delgadas adyacentes. Por lo tanto, Abercrombie y otros autores generaron ecuaciones que requieren supuestos sobre la forma, tamaño y orientación de las células contadas^7,8. Sin embargo, estos supuestos fueron generalmente no se dio cuenta y por lo tanto condujo a errores sistemáticos y divergencia del número real de la célula (es decir, sesgo). Por otra parte, no podría reducirse el sesgo de muestreo adicional³.

Para la estimación Estereológicas de números de celular mediante el fraccionador óptico, se aplican principios matemáticos para estimar directamente el número de células en un volumen definido, 3 dimensiones. La ventaja de este método es que no involucra supuestos sobre la forma, tamaño y orientación de las células se contaron. Así, el número estimado de la célula está más cercano de los verdaderos valores y acercarse a medida que el tamaño de muestra aumenta (es decir, imparciales)³. Porque muchas reglas deben seguirse cuando se usa la estereología para mantener el método imparcial, se han desarrollado sistemas de estereología comercial lista para usar (para revisión, ver Schmitz y Hof, 2005,⁴). Sistemas especializados de estereología implementan métodos estereológicos basados en diseño con sondas de priori definidos y planes de muestreo para evaluaciones estereológicos que conducen a la independencia de la forma, tamaño, distribución espacial y orientación de la células para ser analizado^4,9. Sin embargo, los sistemas de estereología comercialmente disponibles son caros; Esto puede limitar la aplicación en una nueva investigación.

El objetivo de este estudio fue desarrollar una técnica útil para la estimación Estereológicas basado en el diseño de recuentos de células dopaminérgicas en el ratón SN, empleando el método de fraccionamiento óptica y uso de equipo de microscopia estándar (es decir, luz microscopio, microscopio estándar de software y un motor x, y, z etapa). Para ello, se presenta una guía paso a paso sobre cómo procesar el tejido de cerebro de ratón y cómo estimar el número de células del SN mediante estereología imparcial basada en diseño. Además, se proporcionan plantillas para el cálculo de los números de celular Estimado y los coeficientes de error (CE).

El método descrito aquí no se limita al análisis del SN, pero puede ser adaptado para su uso en otras regiones anatómicamente definidas del cerebro de ratón o rata. Por ejemplo, estereología imparcial se ha utilizado para estimar el número de células neuronales en el hipocampo¹⁰ y el locus coeruleus¹¹. Además, tipos de células distintos de neuronas, como¹² y microglia astrocitos¹³, pueden ser evaluados también. Por lo tanto, este método puede ser útil para los científicos que pretenden implementar estereología imparcial en sus investigaciones, pero no están dispuestos a gastar mucho dinero para comprar un sistema de estereología.

Protocol

se siguieron todas las guías internacionales, nacionales o institucionales aplicables para el cuidado y uso de animales. El protocolo fue aprobado por las autoridades locales en el Regierung von Unterfranken, Würzburg, Alemania.

1. procesamiento de tejido e inmunohistoquímica

1. Euthanize ratones con CO ₂ o cualquier otro método aprobaron.
2. Transcardially de ratones machos de C56Bl/6N de 12 semanas de edad Perfuse seis con 10 mL de 0.1 M tampón fosfato salino (PBS) con una aguja de 25 G y una bomba de infusión, seguido de 70 mL de paraformaldehído al 4% (PFA) en PBS de 0,1 M.
   PRECAUCIÓN: PFA es tóxico, alergénico y carcinogénico.
3. Diseccionar el cerebro de ratón en el plano coronal con una máquina de cortar de matriz de cerebro en la región de +0,74 mm de Bregma (Paxinos, figura 25 y Franklin ratón cerebro atlas ¹⁴).
4. Poner la parte dorsal del cerebro, incluyendo el SN, en el 4% PFA en PBS de 0,1 M para d 1 a 4 ° C para la fijación de la inmersión.
5. Intercambiar la PFA para solución al 30% sacarosa/0.1 mol de PBS para cryo-protección e incubar para otro d 2 a 4 ° C.
6. Ponga la parte dorsal del cerebro en un cryomold lleno de temperatura corte óptimo (OCT) compuesto y congelar lentamente el tejido en líquido refrigerado por hielo seco isopentano.
   PRECAUCIÓN: Hielo seco es extremadamente frío (-78 ° C); Utilice equipo de protección personal (EPP), incluyendo guantes, mientras trabajaba con hielo seco. Hielo seco se evapora en el CO ₂. por lo tanto, trabajar bajo una campana de humos.
7. En serie corte cryo-secciones de 30 μm en el plano coronal y recoger las secciones, a partir de 2,46 mm de Bregma (Paxinos, figura 51 y Franklin ratón cerebro atlas ¹⁴) y terminando en 4,04 mm del vértice (Figura 64, Paxinos y Franklin ratón cerebro atlas ¹⁴).
8. Almacenar cuatro series de tubos que se llenan con crioprotector (glicerol al 30%, Etoxietanol 30% y 40% PBS) a-20 ° C. Durante el procedimiento de seccionamiento, marque el hemisferio derecho perforando un pequeño orificio en la región superior del tronco encefálico.
9. Para la coloración de immunohistochemical, seleccionar una serie de secciones por ratón. Preincubate flotante secciones para 1 h en 10% de suero normal de cabra (NGS)/2% BSA/0.5% detergente en 0,1 mol de PBS en una coctelera Boston. Incubar las secciones con anti-ratón tirosina hidroxilasa (TH; 1:1,000 dilución) anticuerpos diluida en detergente 2% NGS/2% BSA/0.5% 0,1 mol de PBS durante la noche a 4 ° C.
10. Secundaria de aplicar anticuerpos contra conejo Igs (dilución 1: 100) por 2 h a temperatura ambiente, seguido por reactivo de avidina/biotina (dilución 1: 100). Incubar y mancha con 3,3-diaminobenzidina-tetrahydrochloride (DAB) y H ₂ O ₂. Monte las secciones después de la tinción en diapositivas objeto revestido.
    Nota: TH + SN las neuronas dopaminérgicas se muestran en la Figura 1a. Manchando de una serie, un promedio de 13 secciones de SN, que se extiende desde la rostral a caudales porciones de la SN pars compacta (SNpc) y reticulata, se tiñen por animal ( Figura 1b). Las secciones están separadas por 120 μm (serie de la 1/4) ( figura 1C).
    PRECAUCIÓN: DAB es un carcinógeno. Es tóxico por contacto e inhalación. Utilizar EPI cuando se trabaja con DAB.

2. Adquisición de imágenes

1. TH capturar immunohistochemically manchadas las secciones SN digital utilizando el software de imagen que se acopla a un microscopio. Analizar por separado cada sección de una serie.
2. Utilice la opción de diapositiva de exploración de la proyección de imagen de software. Guardar en formato TIFF para imágenes de alta calidad (figura 2).
   Nota: Resolución de la imagen es de 312 píxeles por cm.
3. Prensa " adquirir " para abrir la ventana de adquisición (Figura 2a).
4. Establece el binning en " 2 " para imágenes en escala de grises.
   Nota: La adquisición de imágenes en escala de grises en lugar de cuadros de color reduce el tamaño del archivo de imagen final de la pila (Figura 2a).
5. Haga clic en " Show en vivo " en la ventana de adquisición para abrir una nueva ventana que muestra la imagen en directo de la sección (figura 2 a y b).
6. Clic en " etapa " en la ventana de adquisición. Elegir " Deslice la exploración " en el menú desplegable y marque la casilla (figura 2C).
   Nota: Esto permite la adquisición y la alineación de imágenes altamente magnificadas en SN (630 aumentos) en el x, y el plano, así como la adquisición de imágenes de la pila con una distancia entre imágenes consecutivas de 1 μm en el plano z, que abarcan un total de 13 μ m.
7. Seleccione el objetivo X 2,5 para el SN.
8. Cambiar el objetivo a 63 x.
9. Definir la esquina superior izquierda (TopLeft) (figura 2C) y la esquina inferior derecha (LowRight) (Figura 2d) de la sección haciendo clic en " Set. "
10. Clic en " serie Z " y el " serie Z-Plane " caja (figura 2e).
11. Determinar el espesor real montado de las secciones en cuenta seleccionados al azar tres sitios por sección utilizando el software de imágenes. Para ello, haga clic en " vista superior Offset " para definir la parte superior de la sección (figura 2e) y luego haga clic en " parada superiores " (figura 2f). Después de eso, haga clic en " vista inferior Offset " (figura 2f) y haga clic en " parada vista inferior " (figura 2 g). Escriba el grosor de la sección de.
12. Restar 3 μm (zona de guarda) de la parte superior offset y escriba el resultado en la ranura superior del offset (figura 2 h). Resta 13 μm (altura del disector óptico) del superior número y escriba el resultado en la ranura de compensación inferior (figura 2i). Seleccione los parámetros siguientes: pasos, 14; tamaño, 1.00 (figura 2i).
    Nota: Este corresponde a un grosor en el plano z de 13 μm, con una distancia de 1-μm entre imágenes consecutivas.
13. Seleccione el directorio para guardar el archivo (figura 2j).
14. Clic en " secuencia " para iniciar la adquisición (figura 2j).
15. Haga clic en " procesamiento " y seleccione los parámetros siguientes: " todos los planos, " de " de la secuencia; " " montaje; " y el " rápido " y " costura " cajas, con una superposición de imagen de 10% (figura 2 k). Comenzar a coser las imágenes haciendo clic en " empezar ".
    Nota: Esto va a generar imágenes de pila para su análisis (figura 2 l, figura 3a -e).

3. Secuencia de evaluación estereológicos

1. realizar el análisis de imágenes de pila de SN con el ImageJ NIH versión 4.7.
2. Descargar los dos plugins que se necesitan desde la Web de ImageJ.nih.gov: la " superposición de cuadrícula de " plugin ¹⁵ y la " contador celular " plugin ¹⁶. Instalar dos plugins según.
3. Para evaluación imparcial Estereológicas, definir los parámetros de recuentos como sigue: tamaño de la cuadrícula, 130 x 130 μm, cuenta marco, 50 x 50 μm; y disector óptico de altura, 13 & #181; m.
4. Abre la imagen haciendo clic en " archivo " → " Open " (figura 4a) establecer la escala de la imagen mediante el " analizar " → " Set escala " comando (Figura 4b). Para este paso, cambiar el tamaño definido de píxeles a μm (figura 4C).
   Nota: Para las imágenes analizadas, 425 pixeles corresponde a 100 μm.
5. Seleccione el " Plugins " → " red " → " rejilla tipo: líneas " comando al azar insertar una cuadrícula. Compruebe la " Offset aleatorio " caja. Definir el tamaño de un cuadrado dentro de la cuadrícula (cuadrícula) como 130 μm μm x 130 = 16.900 μm ² ( figura 3b y 4 de la figura d y e).
6. Cambio de tipo de la imagen a Color RGB de 16 bits (haga clic en " imagen " → " tipo " → " de Color RGB ") (figura 4f). Localizar el SNpc, descrito por Baquet et al. ¹⁷. cercar el SNpc con la " herramienta pincel " (cepillo ancho: 11) ( figura 3 c y g de la figura 4 -me).
7. Deshacer la " escala Set " comando haciendo clic en " analizar " → " escala Set " → " haga clic para quitar la escala " (figura 4j -l) para permitir la realización de los cálculos de píxeles más bien a μm.
8. Hacer una captura de pantalla (figura 4 m), guarde el archivo de imagen y abrir el nuevo archivo con ImageJ (figura 4n). Seleccione " punto de " (figura 4o) y una anchura de cepillo de 25 (p de la figura 4). Marque cada cuadrícula contactos del SN para la colocación de un disector óptico (figura 4q). Realizar análisis del número de células en todos disectors ópticos que se localizan completamente o parcialmente dentro del SN se.
9. Seleccione una cuadrícula que incluye partes de la SN. Medida de la esquina superior izquierda de esta plaza con el cursor en ImageJ para definir x e y coordenadas para empezar (figura 4r).
   Nota: Coordenadas insertará para disector óptico de posicionamiento usando el " posición del disector óptico " (figura 4s), como se describe en el paso 4.
10. Calcular la posición del disector óptico utilizando la plantilla de hoja de cálculo titulada, " posición de disector óptico, " como se describe en el paso 4.
11. Calibrar el disector óptico (macro escrito por Christopher S. Ward, Archivo suplementario) haciendo clic en " Plugins " → " Macros " → " editar " (figura 4t), abrir el " opt_dis_ Grid.txt " de archivo (figura 4u) y define el tamaño de la " usergrid " en píxeles que se corresponde con la x, dimensión y el disector óptico (figura 4v). Seleccione un tamaño de 50 μm x 50 μm, por lo que el tamaño de un lado de la usergrid se define como 212,5 píxeles (4.25 x 50 píxeles).
12. Determinar la posición del disector óptico de la imagen de la pila insertando el ImageX y ImageY coordenadas que definen el centro del disector óptico (figura 4v). Ejecute la macro (" Macros " → " ejecutar Macro ") (figura 4w).
    Nota: La rejilla se desvanecerá de la imagen de la pila ( Figura 3d y figura x 4). El disector óptico persistirá cuando se mueve hacia abajo en el plano z ( figura 3e y figura 4 x).
13. Select " Plugins " → " contador celular " para iniciar el plugin contador de células (figura 4y). Inicializar el contador de célula y seleccione un tipo de marcador (figura 4z). Ampliar la imagen (haga clic en " + ") y realizar la evaluación Estereológicas de los números de celular en un aumento de 200%.
14. Identificar dopaminérgicas perikarya neuronal por su redondeada u ovoide forma y celdas tamaño ( Figura 1a). Cuantificar el número de células mediante reglas Estereológicas.
    Nota: Puesto que el disector óptico es un cubo de 3 dimensiones ( figura 5a), definir los lados de exclusión como el frente, izquierda y los lados superiores del cubo (rojo). Por lo tanto, don ' Conde t TH + células que vienen en contacto con la línea roja (izquierda y delantera) o el lado superior. Añadir los resultados de los recuentos de células en el archivo de hoja de cálculo preparado titulado, " cálculo del recuento de células " (paso 5).
15. Según la imagen de la SN, calcular la siguiente cuadrícula para colocar el disector óptico para la siguiente cuenta de la célula, con x, y los pasos del tamaño de la cuadrícula que lo recubre ( figura 5b) y la " posición de disector óptico " plantilla de hoja de cálculo, como se describe en el paso 4.
16. Realizar una valoración de la utilización del número de celular del " cálculo del recuento de células " hoja de cálculo (paso 5).

4. Cálculo de la posición de Disector óptico utilizando la " posición de Disector óptico " plantilla de hoja de cálculo

1. calcular el tamaño y la posición de cada disector óptico colocado en la red sobrepuesta dentro del contorno de la SN ( figura 5b) con el " óptico disector position.xlsx " archivo de hoja de cálculo (Archivo suplementario).
2. Insertar la conversión de pixel por μm, según lo definido por la " escala Set " comando, en las posiciones marcadas de amarillo de la " position.xlsx de disector óptico " archivo ( Figura 6a y archivo suplementario ).
3. Inserte el tamaño previsto del disector óptico y el tamaño de la cuadrícula de la rejilla sobrepuesta, definida por la longitud de un lado (en μm), en las posiciones marcadas naranja.
   Nota: Resultados son representados en las casillas rojas junto a las cajas naranja.
4. Empezar con la cuadrícula en el contorno del SN que se determinó como punto de partida (una cuadrícula fue seleccionado, como en el paso 3.9, arriba).
5. Introduzca las coordenadas x e y, según lo medido en el paso 3.9, en los cuadros verdes del archivo (mediante el uso de estos valores x, y coordenadas se calcula el centro del disector óptico dentro de esta primera plaza, y los resultados están representados en las casillas azules). Ejecute la macro opt_dis_grid.txt (Archivo suplementario).
6. Calcular la x, y coordenadas de la disectors óptica consecutiva introduciendo la distancia de cuadrícula (medida en número de plazas) en relación con la primera plaza de parrilla (caja marrón).
   Nota: + x: cuadrícula está situado a la derecha; -x: cuadrícula está situado a la izquierda; + y: cuadrícula está situado en la parte inferior; -y: cuadrícula está situado en la parte superior. Resultados se muestran en los cuadros grises.

5. Estimación de número de celular utilizando la " cálculo de conteo de " hoja de cálculo

1. calcular el número estimado de las células TH + SN por animal (N) utilizando la fórmula publicado por West et al., 1991 ³, donde ∑ Q ^– se define como el número total de TH + neuronas en todos disectors ópticos de la sección de un cerebro.
   Nota: La altura del disector óptico (h) en relación con el espesor medido de la sección (t) está incluida en la ecuación. La fracción de muestreo de área (asf) se define como la proporción del área (A) el disector óptico (un disector óptico) del tamaño de marco dentro del tamaño del cuadrado de la cuadrícula (una x, y de paso) (una óptica disector/A x, y de paso) ( figura 3b) y la fracción de muestreo de sección (ssf) se define como la proporción de las secciones del cerebro entero en serie corte:
   
   para asegurar alta calidad cuantitativa las estimaciones, el coeficiente de error (CE) debe ser inferior a 0,10. Determinar la CE mediante la fórmula de Keuker et al., 2001 ¹⁰:
   
2. para la estimación Estereológicas del número de células dentro del SN de cada uno ratón, insertar la información indicada en el número de serie generado por el ratón, la altura del disector óptico, x, y el área del disector óptico (un disector óptico, en μm ²), x, y área de la cuadrícula (una x, y de paso en el μm ²), y la media mide el espesor de la sección (en μm) en las cajas amarillas con el " cálculo de count.xlsx celular " archivo de hoja de cálculo ( figura 6b y archivo suplementario ).
3. Analizar cada sección SN del mismo animal, como se describe en el paso 5.
4. Inserto recuento para cada disector óptico en las cajas grises, cada línea refiere a una sección de SN, usando el " cálculo de count.xlsx celular " archivo de hoja de cálculo (Archivo suplementario).
   Nota: El número estimado de la célula y la CE calculada están representados en los cuadros azules ( figura 6b).

6. Estimación del número de celular utilizando un sistema de estereología disponibles comercialmente

numero de celular

1. Inicio la estimación de dopaminérgicas SNpc haciendo clic en " sondas " → " flujo fraccionador óptico " para abrir el fraccionador óptico Ventana de flujo de trabajo.
   Nota: Aparecerá una nueva ventana para determinar si una nueva serie de SN va a ser contado.
2. Iniciar una nueva serie de TH + SN secciones haciendo clic en " iniciar un nuevo tema de " en la ventana emergente.
3. Ir a través de los diferentes pasos del flujo de trabajo óptico de fraccionamiento. Establecer el tema en el primer paso. Para ello, inserte el investigador ' nombre, el tema ' nombre (grupo SN) y otra información útil. Introduzca el número de secciones para contar para este SN. Inserte el espesor de las secciones de tejido cortado. Introduzca el intervalo de la sección, que es cuatro en este caso. Inserte la sección al azar determinado número para comenzar con.
4. En el segundo paso, establecer el microscopio a bajo aumento (objetivo de 2 X) y seleccione " Mag lente 2 X " en el menú de.
5. En el paso 3, se traza la región de interés con el botón izquierdo del ratón, que es el SNpc, descrito por Baquet et al., 2009 ¹⁷.
6. Establezca el microscopio de alta magnificación en el paso 4. Para ello, cambie el objetivo 100 X y seleccione " lente Mag X 100 " en el menú desplegable.
7. Medir el espesor montado en el paso 5, centrándose en la parte superior y en la parte inferior de la sección de.
8. En el paso 6, definir el tamaño de fotograma cuenta como 50 x 50 μm; esto es el tamaño del disector óptico (x, y).
9. En el paso 7, establecer el tamaño de la cuadrícula de muestreo al azar sistemático (SRS) como 130 x 130 μm.
10. Entrar en una zona de protección de 3 μm en el paso 8.
11. Guardar la configuración en el paso 9.
12. Finalmente, contar las células TH + dopaminérgica en cada una de la disectors óptica dentro de la cuadrícula SRS en el paso 10 del flujo de trabajo óptico de fraccionamiento. Para esto, comience haciendo clic en el " cuenta " botón.
13. Después de terminar una sección, haga clic en la " sección siguiente comenzar " el botón para iniciar el flujo de trabajo de fraccionador óptico de la próxima sección de SN de la misma serie de SN.
14. Cuando se ha cuantificado la última sección de SN de una serie de SN, haga clic en " ' ve acabado cuenta. "
15. Haga clic en el " ver resultados " para mostrar los resultados de los muestreos de la estereología.

Representative Results

El método presentado, el número estimado de TH + las neuronas dopaminérgicas en la derecha SN oscilado entre células 7.363 y 7.987 y en la izquierda SN, entre las células 7.446 y 7.904. Así, la media de las neuronas dopaminérgicas (± SEM) fue 7.647 ± 83 células para la derecha SN y 7.675 ± 66 para la izquierda SN. La CE calculado para cada animal fue inferior a 0.08 (gama: 0.079 0.073) (figura 7). Para determinar la comparabilidad de este método con sistemas comercialmente disponibles y especializados de la estereología, SN un número de células también se cuantificaron utilizando la configuración de estereología (figura 8). Los parámetros de recuentos fueron: tamaño de la cuadrícula, 130 x 130 μm; marco de la cuenta, 50 x 50 μm; protector de la zona, 3 μm. secciones fueron analizados con un 100 x / 1.25 objetivo de apertura numérica en un microscopio BX53. La población estimada de neuronas TH + SN con el espesor de la sección media variaron de 7.067 a 8.105 células/SN y células de 7.164 a 8.015/SN en los lados derecho e izquierdos, respectivamente. Se calculó el número neuronal como 7.535 ± 155 las células para la derecha SN y 7.699 ± 128 células para la izquierda SN. La CE Gundersen (m = 1) fue ≤0.08 en cada SN cuantificado (figura 7). Análisis estadístico mediante la prueba t de Student apareado no reveló diferencias significativas entre el TH + un recuento de los dos métodos en el derecho o el izquierdo SN (media ± SEM; derecha: t (5) = 0.9524, P > 0.05; izquierda: t (5) = 0.2928, P > 0.05) (figura 7 ).

Figura 1. Imágenes representativas del ratón SN teñido para las neuronas dopaminérgicas.
(a) un resumen de una SN de ratón representante se muestra en el panel superior. Cuenta del diminuto agujero en la parte superior del tronco encefálico derecho que marca la derecha. Aumento mayor de la inserción (caja negra) representa TH + las neuronas dopaminérgicas. se muestra (b) una serie de secciones manchadas de TH SN, cubriendo el ratón todo SN de rostral a caudal. (c) cada sección está separada de la sección consecutiva por 120 μm. barras de escala: a, parte superior del panel, 500 μm; panel inferior, imagen grande, 100 μm; panel inferior, empotrado, 50 μm; b, 500 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Adquisición de imágenes para análisis estereológicos utilizando el software de imágenes.
(a) flecha roja: abrir la ventana de adquisición; flecha verde: establecer el binning "2"; flecha azul: Mostrar la imagen en directo. (b) se abrirá una nueva ventana que muestra la imagen en directo (flecha roja). flecha roja (c) : selecciona el menú "Stage"; flecha verde: seleccione la opción "Scan Slide"; flecha azul: Marque la opción "Scan Slide"; flecha negra: definen la esquina superior izquierda. flecha negra (d) : definen la esquina inferior derecha. flecha roja (e) : seleccione el menú de "Serie Z"; flecha verde: ver la "serie Z-Plane"; flecha azul: iniciar "Vista superior Offset" a buscar la parte superior de la sección. flecha roja (f) : haga clic en "Detener superiores" para definir la parte superior de la sección; flecha verde: "Vista inferior Offset" a buscar la parte inferior de la sección de inicio. flecha roja (g) : Haz clic en "Dejar de ver abajo" para definir la parte inferior de la sección. flecha roja (h) : restar la Guardia 3 μm de la zona de "Top Offset" e inserta el resultado en la ranura "Top Offset". flecha roja (i) : restar 13 μm desde el número "Superior Offset" y coloque el resultado en la ranura "Fondo Offset"; flecha verde: definir 14 pasos que corresponde a un grosor de z-avión de 13 μm; flecha azul: definir un tamaño de 1.00 μm que corresponde a una distancia de 1-μm entre imágenes consecutivas. flecha roja (j) : seleccione el directorio para guardar el archivo; flecha azul: haga clic en "Secuencia" para iniciar la adquisición de imágenes. flecha roja (k) : haga clic en "Procesar"; Compruebe los siguientes parámetros: flecha verde: "Todos los planos;" flecha azul: "Secuencia"; flecha negra: "Montaje"; flecha gris: "Costura"; púrpura flecha: rápido. (l) haga clic en la flecha amarilla para comenzar a coser las imágenes. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura 3. Procesamiento de imágenes para análisis estereológicos.
(a) una imagen de la pila de ejemplo tomada de un ratón SN. (b y c) Después de la inserción al azar de una cuadrícula que cubre el SN (líneas de color turquesa, b), la SN se contornea en un segundo paso (línea azul, c). (d) un disector óptico se coloca en la imagen de la pila de SN. (e) seis planos focales consecutivos dentro de la imagen de la pila de SN cubren total en el plano z 13 μm. Barras de escala: a-d, 100 μm; e, 50 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. Secuencia de evaluación estereológicos con ImageJ.
(a) flecha roja: haga clic en "Archivo" → "Open" para abrir una imagen de la pila. (b) flecha roja: haga clic en "Analizar" → "Configurar escala". flechas rojas (c) : definir los parámetros de la "distancia en pixeles," "distancia conocido" y "Unidad de longitud." flecha roja (d) : seleccione "Plugins" → "Red." flecha roja (e) : seleccione "Líneas;" flecha verde: Compruebe "Random Offset;" flecha azul: Introduzca el tamaño de la cuadrícula en el μm². flecha roja (f) : haga clic en "Imagen" → "Tipo" → "RGB Color." flecha roja (g) : selecciona la "herramienta pincel"; flecha verde: definir el "ancho de cepillo" como 11. flecha roja (h) : comienzan a rodear el SNpc. (i) rojo las flechas representan la cercada SNpc. (j) flecha roja: haga clic en "Analizar" → "Configurar escala" y quitar la escala (k) haciendo clic en "Haga clic en para quitar escala," representado por el rojo con la flecha. Tenga en cuenta el cambio del μm (k, verde flecha) píxeles (flechal, rojo). (m) tomar una captura de pantalla (puntos de la flecha roja hacia la captura de pantalla) y (n) abrir el archivo de imagen captura de pantalla con ImageJ. flecha roja (o) : haga clic en "Punto". flecha roja (p) : Introduzca una anchura de cepillo de 25. (q) la flecha roja muestra los marcada cuadrados de rejilla que Contacta con el SNpc. (r) señala la flecha roja en la esquina superior izquierda de una cuadrícula que incluye parte del SN. Al poner el cursor en este punto, el x, y coordenadas para la "posición de disector óptico" (paso 4) se miden y se inserta en la plantilla "position.xlsx disector óptico" (flechas, rojo). flecha roja (t) : seleccione "Plugins" →"Macros" → "editar." flecha roja (u) : seleccione el archivo "opt_dis_grid.txt". Abrirá una nueva ventana (v). Introduzca el tamaño de la "usergrid", en píxeles (v, flecha roja) y el x, y coordenadas (v, flecha verde). (w) ejecute la macro "opt_dis_grid.txt" (flecha roja). (x) un disector óptico aparecerá en medio de la cuadrícula previamente definida (flecha roja). flecha roja (y) : haga clic en "Plugins" → "Contador de célula." (z) inicializar el contador de células (flecha roja) y seleccione un tipo de marcador (flecha verde). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura 5. Colocación del disector óptico.
(a) ilustración del disector óptico utilizado para estereología imparcial. El disector óptico es un cubo de 3 dimensiones. Tres células esquemáticas son visibles en el disector óptico. Las reglas Estereológicas para la cuantificación de células indican que células tocando los lados marcados rojo del disector óptico son excluidos (glóbulos rojos), mientras que las células en contacto con el verde lados marcados están incluidos en el conteo (células verdes) de la célula. (b) un disector óptico se coloca en cada cuadrado de rejilla que entra en contacto con el SN. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6. Cálculo de la posición de disector óptico y estimación del número de células.
(a) un ejemplo de cálculo realizado para la colocación del disector óptico. (b) un ejemplo de la estimación del número total de la célula. El número de células cuantificadas se inserta en las cajas grises, mientras que los parámetros de cuantificación estereológicos se insertan en las cajas amarillas. El número estimado de la célula y la CE se muestran en los cuadros azules. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7. Comparación de recuento de parámetro de la célula.
(a) comparando el número estimado TH + de la célula del ratón derecho e izquierdo SN obtenido desde el método estereológicos descrito con los datos obtenidos del análisis utilizando el sistema de estereología comercialmente disponibles no mostraron diferencias significativas. Una lista detallada de los datos obtenidos de la derecha (b) y a la izquierda (c) SN se da con el numero de celular estimado por animal, el número de células que realmente cuentan, el número de secciones de contado y el número de sitios de muestreo (es decir, cuenta el número de cuadrados de rejilla) para ambos métodos. Los valores de los gráficos de barras son la media ± SEM de los datos de 6 ratones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8. Cuantificación de células con el sistema de estereología comercialmente disponibles.
(a-b) Se dibuja el contorno del SN y (c) las posiciones de la disectors óptica son automáticamente determinada. (d-e) Cada disector óptico se analiza por número de células, centrándose en el plano z. Se muestran seis planos focales consecutivos dentro del SN. Las líneas rojas y verdes se corresponden con el disector óptico. Barras de escala: a-d, 100 μm; e, 50 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Archivo suplementario de 1. opt_dis_grid.txt Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo adicional 2. Position.xlsx disector óptico haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario de 3. Cálculo de count.xlsx celular haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

Estereología se inicia con el proceso de tejido. La serie corte de tejido SN debe realizarse cuidadosamente para evitar la pérdida de las secciones durante el análisis estereológicos. Además, un paso esencial es marcar un hemisferio para distinguir la derecha de la izquierda SN realización de estereología. Colocar un pequeño agujero en la parte superior del tronco encefálico genera los mejores resultados en el estudio presentado. Por otra parte, desde el trabajo con las exigencias de método fraccionador óptico que el tejido es cortado en secciones gruesas de unos 30-40 μm, en lugar de los 5-10 μm más comúnmente utilizados en inmunohistoquímica, anticuerpos y otros penetración de tejido fluido de incubación durante la coloración de Immunohistochemical debe garantizarse, tales como mediante el uso de un detergente.

Immunohistochemical que manchaba para las neuronas dopaminérgicas utilizando el anticuerpo TH etiquetas las neuronas de la SN, así como las neuronas en el área tegmental ventral (VTA), que se ubica medialmente del SN y las neuronas en el campo retrorubral. Así, otro punto crítico al realizar la estereología del SN es conocimiento del ratón anatomía SN, puesto que las neuronas de la SN no se pueden visualizar exclusivamente por inmunohistoquímica estándar o tinción histológica. En cambio, el reconocimiento de puntos anatómicos, como el núcleo subtalámico, el campo retrorubral y VTA, son importantes para determinar el grado entero de la SN^17,18,19.

Evaluación del número neuronal debe ser confiable y reproducible. Aunque varios grupos utilizan configuraciones disponibles en el mercado de la estereología, números de TH + neuronas dopaminérgicas SN en ratones wt, tomadas de diversas publicaciones, varían en el número^17,20. En Baquet et al., diseño basado en el análisis estereológicos en ratones de peso de 3 a 4 meses machos y hembras C57BL/6J utilizando un sistema de estereología comercialmente disponible reveló un estimado 8.716 ± 338 TH + SN neuronas dopaminérgicas (gama: 7.546 9.869)¹⁷ . Por el contrario, Smeyne et al. encuentra menos las células TH + SN en ratones machos C57BL/6J 9 a 16 semanas de edad que recibieron 0.9% salina i.p., que van desde 262 células de 6.302 ± a 6.861 ± 338 las células, usando una versión más reciente del mismo sistema de la estereología²⁰. Sin embargo, el primer autor fue también el último autor en Baquet et al. papel, excluyendo, por tanto, diferentes grados de experiencia como la razón de los diferentes resultados. Estos datos contradictorios reflejan la necesidad de un método de cuantificación estereológicos que demuestra menor variabilidad. Para comprobar la técnica de cuantificación y la fórmula utilizada, se realizó una comparación de los resultados de SN número conteo utilizando el método descrito con una cuantificación usando la configuración disponible en el mercado de la estereología. Análisis estadístico no mostró diferencias significativas al comparar el número de TH + neuronas dopaminérgicas en la derecha e izquierda SN de los ratones wt determinado usando ambas técnicas de cuantificación celular, demostrando así que este método es viable para la estimación estereológicos de neuronas de la SN en ratones.

La principal ventaja del método descrito es que reduce los costos que se asocian generalmente a la aplicación de técnicas de la estereología para el recuento celular. Una segunda ventaja es que el método descrito, imágenes de pila del SN se guardan y pueden ser analizadas en cualquier momento (incluso al mismo tiempo) por otro investigador. Por otra parte, la adquisición y análisis de imágenes de fluorescencia son posibles con este método, debido a imágenes en escala de grises pueden ser coloreados con las "tablas de Lookup" en ImageJ. Sin embargo, existen limitaciones a este estudio. En primer lugar, la cuantificación del número de células es más lento (alrededor del 50%) de cuantificación con el sistema de estereología comercialmente disponibles. Esto es principalmente debido a dos razones: 1. pila se tomarán imágenes del SN y 2. cálculo de la posición de disector óptico en cada SN y cálculo del número estimado de la célula y CE deben realizarse manualmente utilizando las plantillas de cálculo. En segundo lugar, por lo menos con el sistema disponible en nuestro laboratorio, el análisis puede realizarse solamente en imágenes en escala de grises debido al tamaño de grandes archivos de imágenes a color, que no podría ser procesado por el ImageJ. Esto podría plantear un problema si hay que cuantificar dos diferentes poblaciones celulares al mismo tiempo en una doble tinción. Podría ser más difícil de distinguir dos poblaciones de células diferentemente manchadas en imágenes en escala de grises. Por lo tanto, aunque una etapa motorizada (x, y, z plano) y el software correspondiente están disponibles en muchos laboratorios trabajando con muestras histológicas, la gestión y la calidad de las imágenes de la pila dependerá del software del microscopio y el desempeño de el equipo conectado.

Hay posibles formas de superar las limitaciones. Mediante el uso de las plantillas de cálculo que hemos desarrollado, la programación de macros para automatizar algunos de los procesos actualmente manualmente realizados podría reducir errores o inexactitudes durante evaluación estereológicos y acelerar la velocidad de trabajo. Además, con el desarrollo continuo de ImageJ y otro software de imagen, así como con cada vez mayor potencia de procesamiento del ordenador, mayor tamaño de archivo de imagen no debería plantear un problema en un futuro cercano. Por lo tanto, el análisis de imágenes de campo claro color será manejables con la técnica descrita.

La técnica descrita no se limita al análisis de las células TH + SN, pero se puede ampliar para analizar otros tipos de células y las regiones del cerebro de los roedores. Para esto, deben determinarse los límites anatómicos de la región de interés y debe realizarse la tinción respectivas. Además, esta técnica puede ser adaptada a las secciones más gruesas. Para ello, la adquisición de imágenes de pila debe ser adaptada para proporcionar más imágenes de pila. Por ejemplo, si 40 μm de espesor sección se requiere, el real montado grueso de la sección después de tinción de tejidos debe ser evaluado para determinar la altura necesaria del disector óptico. Restar el espesor de tejido malo a 6 μm (μm 3 protector de la zona en la parte superior e inferior) y tomar el resultado como la altura del disector óptico.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paxinos mouse atlas			The Mouse Brain George Paxinos Keith B.J.FranklinCopyright @2001 by Academic Press CD Rom designet & created by Paul Halasz
brain matrix slicer mouse	Zivic Instruments	BSMAS 001-1
paraformaldehyde	Merck	1040051000
sucrose /D(+) Saccharose	Roth	4621.1
isopentane	Roth	3927.1
glycerol	Merck	1040931000
Ethanol	Sigma Aldrich	32205-1L
Name	Company	Catalog Number	Comments
phosphate buffered saline ingredients:
sodium chloride	Sigma Aldrich	31434-1KG-R
potassium dihydrogen phosphate	Merck	1048731000
di-sodium hydrogen phosphate dihydrate	Merck	1065801000
potassium chloride	Merck	1049360500
normal goat serum	Dako	X0907
bovine serum albumin	Sigma	A4503-100G
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100-100ml	detergent
3,3-Diaminobenzidine-tetrahydrochlorid/DAB tablets 10mg pH 7.0	Kem En Tec	4170
H2O2/ Hydrogen peroxide 30%	Merck	1072090250
avidin/biotin reagent	Thermo Scientific	32050	Standard Ultra Sensitive ABC Staining Kit, 1:100
rabbit anti mouse tyrosine hydroxylase antibody	abcam	Ab112	1:1000
biotinylated goat-anti-rabbit IgG H+L	vector laboratories	BA-1000	1:100
StereoInvestigator version 11.07	MBF
BX53 microscope	Olympus
Visiview	Visitron Systems GmbH	3.3.0.2
Axiophot2	Zeiss
ImageJ software	NIH	Version 4.7
Tissue-TEK OCT	Sakura	4583
dry ice
grid overlay plugin	Wayne Rasband		https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html
cell counter plugin	Kurt de Vos		https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html).
optical disector macro	Christopher Ward
C57Bl/6N male mice	Charles River, Germany
SuperFrost Plus coated object slides	Langenbrinck, Germany
25G needle Microlance 3	BD	300400
REGLO Analog Infusion pump	Ismatec	ISM 829
StereoInvestigator system			StereoInvestigator version 11.07
BX53 microscope			BX53 microscope
self-assorted stereology			Visiview
Axiophot2			Axiophot2