Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Optik Fractionator ve standart mikroskobu ekipmanlar kullanarak fare gözlemliyorum Nigra dopaminerjik nöron sayısının stereological tahmin

Published: September 1, 2017 doi: 10.3791/56103
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Neurology, University Hospital of Würzburg

Summary

Bu eser dopaminerjik nöron hücre sayıları tarafsız stereological tahmini için adım adım bir protokol fare gözlemliyorum standart mikroskobu kullanýlýyor (Yani, bir ışık mikroskobu, bir motorlu nesne tablo (x, y, z nigra içinde sunar. uçak) ve kamuya açık yazılım dijital görüntü analizi için.

Abstract

Önceden klinik Parkinson hastalığı araştırma, analiz miktar gözlemliyorum nigra içinde dopaminerjik nöron kaybı da dahil olmak üzere nigrostriatal sistemi esastır. Toplam dopaminerjik nöron sayısı tahmin etmek için tarafsız stereology optik fractionator yöntemini kullanarak şu anda altın standart olarak kabul edilir. Optik fractionator yöntemi arkasındaki teori karmaşık olduğu için ve stereology özel ekipman elde etmek zor olduğu için gerekli yazılımı dahil birkaç ticari olarak mevcut tam stereology sistemleri, tamamen var hücre için nedenleri sayma. Özel stereology Kur satın alma her zaman birçok nedenden dolayı mümkün olmadığına göre bir ışık mikroskobu, dahil olmak üzere standart mikroskobu kullanýlýyor dopaminerjik nöron hücre stereological tahmini sayar için bu raporu bir yöntem açıklanır bir nesne tablosu (x, y, z uçak) görüntüleme yazılımı ve analiz için bir bilgisayar ile motorlu. Adım adım açıklama stereological miktar optik fractionator yöntemini kullanarak gerçekleştirme konusunda verilir ve önceden programlanmış dosyaları tahmini hücre sayımları hesaplanması için sağlanır. Bu yöntem doğruluğunu değerlendirmek için piyasada bulunan stereology cihaz elde edilen verilere bir karşılaştırma gerçekleştirildi. Benzer hücre sayıları bu protokol ve stereology aygıt kullanarak böylece tarafsız stereology için bu protokolü duyarlık gösteren bulundu.

Introduction

Miktar nöronal hücre sayının gözlemliyorum nigra (SN)1,2içinde ateş düzeyini belirlemek için önceden klinik Parkinson hastalığı araştırma çok önemli. Bölge hücre sayısı faiz tarafsız stereological tahmini altın standart3,4,5olarak kabul edilir.

Tarafsız stereology gelişiyle önce nöronlar gelmek içine bir bölümü görünürde değişken olasılıklar için düzeltmek için sınırlı sayıda hücre profilleri manipüle ederek bölümleri nöronların sayısı değerlendirildi. En sık kullanılan yöntemlerden birini quantified hücre sayımları Abercrombie6tarafından açıklanan düzeltme yapıldı. Bu yöntem aynı hücreyi parçaları bitişik ince bölümlerde bulunursa, hücreler birden çok kez sayılabilir dikkate almaya çalıştı. Bu nedenle, Abercrombie ve diğer yazarlar şekli, boyutu ve yönlendirmesi sayılan hücreleri7,8hakkında varsayımlar gerekli denklemler oluşturulan. Ancak, bu varsayımlar genellikle değil fark etti ve bu nedenle gerçek hücre sayısı (Yani, önyargı) sistematik hatalar ve ıraksak evrim süreçleri sonucu yol açtı. Ayrıca, önyargı ek örnekleme3tarafından azaltılabilir değil.

Optik fractionator kullanarak hücre sayıları stereological tahmini için doğrudan doğrudan birimindeki bir tanımlanmış, 3 boyutlu hücre sayıları tahmin etmek için matematik ilkeleri uygulanır. Bu yöntemin avantajı şekli, boyutu ve yönlendirmesi sayılır varlık hücre hakkında varsayımlar anlamına gelmez mi. Böylece, tahmini hücre sayıları için gerçek değerleri daha yakın olan ve örnek boyutu (Yani, tarafsız)3arttıkça daha yakın olsun. Birçok kural stereology yöntemi tarafsız tutmak için kullanılırken izlenmesi gerekir çünkü, kullanıma hazır ticari stereology sistemleri geliştirilmiştir (gözden geçirme için bkz: Schmitz ve Hof, 20054). Özel stereology sistemlerinin uygulanması Tasarım temelli stereological yöntemleri ile tanımlanan bir priori sonda ve örnekleme düzenleri şekil, boyut, kayma dağıtım ve yönlendirmesi'dan bağımsızlığını yol stereological değerlendirmeler için hücreleri analiz4,9olmak. Ancak, piyasada bulunan stereology sistemleri pahalıdır; Bu yeni araştırma uygulamasında sınırlayabilir.

Bu çalışmada dopaminerjik hücre sayıları Mouse optik fractionator yöntemle contalı profillerde hem standart mikroskobu donanımları (Yani, ışık kullanarak SN, Tasarım temelli stereological tahmini için kullanışlı bir teknik geliştirmekti mikroskop, standart mikroskop bilgisayar yazılımı ve motorlu bir x, y, z sahne). Bunun için fare beyin dokusunu işlemek ve tarafsız stereology tasarım tabanlı kullanarak SN hücre sayıları tahmin hakkında adım adım yönergeler sunulmaktadır. Ayrıca, tahmini hücre sayıları hesaplama ve katsayıları hata (CE) için şablonlar sağlanır.

Burada açıklanan yöntemi SN analiz için sınırlı değildir, ancak fare ya da sıçan beyin anatomik olarak tanımlanmış diğer bölgelerinde kullanmak için adapte edilebilir. Örneğin, tarafsız stereology nöronal hücre sayıları Hipokampus10 ve11locus coeruleus tahmin etmek için kullanılan. Buna ek olarak, nöronlar, astrocytes1312 ve microglia gibi farklı hücre tipleri de değerlendirilebilir. Bu nedenle, bu yöntem tarafsız stereology onların araştırma uygulamayı istediğiniz ama çok stereology sistem satın almak için para harcamaya istekli olmayan bilim adamları için yararlı olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

bakım ve hayvanların kullanımı için ilgili tüm uluslararası, ulusal ve/veya kurumsal yönergeleri takip edildi. Protokol Regierung von Unterfranken Wuerzburg, Almanya itibariyle yerel yetkililer tarafından kabul edildi.

1. doku işleme ve immünhistokimya

  1. Euthanize fareler CO 2 veya başka herhangi bir onaylanmış yöntemi.
    2. 70 mL 0.1 M PBS %4 paraformaldehyde (PFA) tarafından takip
  2. Perfuse altı 12 haftalık C56Bl/6N erkek fare transcardially ile 25-G iğne ve bir infüzyon pompa kullanarak 0.1 M fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) 10 mL.
    Uyarı: İngiltere'de yılın, alerjik, zehirli ve kanserojen.
  3. Bir beyin matris dilimleyici bölgesinin +0.74 mm Bregma (şekil 25, Paxinos ve Franklin fare beyin atlas 14) üzerinden, koronal düzlemde fare beynini incelememize.
  4. SN, %4 oranında dahil beyin, dorsal parçası koymak daldırma-fiksasyon için 4 ° C'de 1 d 0.1 M PBS PFA.
  5. PFA cryo-koruma için % 30 Sükroz/0,1 mol PBS çözüm için döviz ve için başka bir 2 d 4'te kuluçkaya ° C.
  6. Bir cryomold beynine dorsal parçası dolu en uygun kesme sıcaklık (OCT) ile yerine bileşik ve yavaş yavaş sıvı kuru buz-serin isopentane doku dondurmak.
    Uyarı: Kuru buz son derece soğuk (-78 ° C); Kuru buz ile çalışırken eldiven, dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipman (PPE), kullanın. Kuru buz CO 2 ' buharlaşır; Bu nedenle, bir duman başlık altında çalışmak.
  7. Seri olarak 30 µm cryo-bölümler koronal düzlemde kesmek ve 2,46 mm Bregma (şekil 51, Paxinos ve Franklin fare beyin atlas 14) arasında başlayan ve Bregma 4,04 mm'den at bitiş bölümleri toplamak (şekil 64, Paxinos ve Franklin fare beyin atlas 14).
  8. Dört serisi cryoprotectant (% 30 gliserol, %30 ethoxyethanol ve % 40 PBS)-20 ° C'de dolu tüpler saklayın Beyin sapı üst bölgeye küçük bir delik delme tarafından sağ hemisfer parça işlem sırasında işaretlemek.
  9. İmmunohistokimyasal boyama için fare başına bölümleri bir dizi seçin. Preincubate serbest yüzer bölümleri için 1 h % 10 normal keçi Serumda (0,1 mol bir shaker PBS NGS)/2% BSA/0.5% deterjan. Gece 4'te % 2 NGS/2% BSA/0.5% deterjan 0,1 mol PBS içinde seyreltilmiş tavşan Anti-fare tirozin hidroksilaz (TH; 1:1,000 seyreltme) antikor ile bölümleri kuluçkaya ° C.
    10. Tavşan karşı
  10. Uygula ikincil antikor IGS (1: 100 seyreltme) oda sıcaklığında 2 h için avidin/biotin reaktif (1: 100 seyreltme) tarafından takip ettim. Kuluçkaya ve 3,3-diaminobenzidine-tetrahydrochloride (DAB) ve H 2 O 2 ile leke. Bölümleri kaplamalı nesne slaytlarda boyama sonra mount.
    Not: TH + dopaminerjik SN nöronlar Şekil 1a ile gösterilir. Bir seri boyama tarafından ortalama 13 SN kesitler rostral SN pars compacta (SNpc) ve reticulata, Kaudal kısımları uzanan, lekeli hayvan ( Şekil 1b). Bölümleri 120 µm (1/4 serisi) tarafından ayrılır ( şekil 1 c).
    Uyarı: DAB şüpheli bir kanserojen olduğu. İletişim ve inhalasyon tarafından zehirlidir. DAB ile çalışırken KKE kullanın.

2. Görüntüleri edinimi

  1. TH yakalamak immunohistochemically lekeli dijital mikroskop için birleştiğinde düşsel bilgisayar yazılımı kullanma SN bölümlerine. Bir dizi her bölümü ayrı ayrı analiz.
  2. Düşsel bilgisayar yazılımı inceden inceye gözden geçirmek Slayt seçeneğini kullanın. Yüksek-nitelik imge (Şekil 2) için TIFF biçiminde kaydetme.
    Not: Görüntü çözümlemesidir 312 piksel / cm.
  3. Basın " al " (şekil 2a) edinme penceresini açmak için.
  4. Ayarla binning " 2 " gri tonlamalı görüntüler için.
    Not: Renkli resimlerin yerine gri tonlamalı görüntüleri edinimi son yığın görüntü dosyası (şekil 2a) küçültür.
  5. Tıklayın " göstermek yaşamak " bölümünün canlı görüntü gösteren yeni bir pencere açmak için edinme pencerede (Şekil 2 bir ve b).
  6. Tıklayın " sahne " edinme penceresinde. Seçin " tarama slayt " açılır menü ve onay kutusu (Şekil 2 c).
    Not: Bu satın alma ve son derece büyütülmüş SN görüntüleri (630 X büyütme) x, y-uçak gibi üst üste görüntüleri düzlemde z-13 µ toplam aralığını kapsayan, 1 µm arasındaki mesafe ile yığın görüntüleri edinimi hizalamasını sağlar m.
  7. SN için aramak için 2.5 X hedefi seçin.
  8. 63 amacı değiştirmek
  9. Yanında tıkırtı üstünde sol üst köşesinde (TopLeft) (Şekil 2 c) ve sağ alt köşesinde (LowRight) (şekil 2B) bölümü tanımlar " kümesi. "
  10. Tıklayın " Z-serisi " ve kontrol " Z-uçak serisi " kutusu (şekil 2e).
  11. Belirleme gerçek takılı kalınlığı üç rasgele seçilen sayma, bölümlerin siteleri görüntüleme yazılımı kullanarak bölüm başına. Bunun için tıklayın " görünümü üst kayan " (şekil 2e) bölümünün üst tanımlamak ve o zaman tıkırtı üstünde " durdurmak görünümü üst " (şekil 2f). Bundan sonra tıklayın " görünümü alt ofset " (şekil 2f) ve o zaman tıkırtı üstünde " durdurmak görünümü alt " (Resim 2 g). Bölüm kalınlığı yazmak.
  12. Baştan çıkarma 3 µm (guard zone) ofset ve sonuç en iyi mahsup yuvaya (Şekil 2 h) yazın. 13 µm (optik disector yüksekliği) üst mahsup numaradan çıkarma ve sonucu alt mahsup yuvasına (şekil 2i) yazın. Aşağıdaki parametreleri seçin: adımlar, 14; Boyut, 1.00 (şekil 2i).
    Not: Bu ardışık görüntüler arasında 1 µm mesafe ile 13 µm, z-bir düzlemde bir kalınlığı karşılık gelir.
  13. (Şekil 2j) dosyayı kaydetmek istediğiniz dizini seçin.
  14. Tıklayın " sıra " edinme (şekil 2j) başlatmak için.
  15. Tıklayın " işleme " ve aşağıdaki parametreleri seçin: " tüm uçaklar, " üzerinden " sıra; " " montaj; " ve " hızlı " ve " dikiş " kutuları, resim örtüşen % 10 (Şekil 2 k). Yanında tıkırtı üstünde belgili tanımlık imge dikiş başlamak " başlatmak ".
    Not: Bu analiz için yığın görüntü oluşturur (Şekil 2 l, şekil 3a -e).

3. Stereological değerlendirme sırasını

  1. SN yığını görüntüleri NIH ImageJ yazılım sürümü 4.7 kullanarak Çözümlemeyi gerçekleştirmek.
  2. ImageJ.nih.gov web sitesinden gerekli olan iki eklentileri download: " kılavuz yerleşimi " eklenti 15 ve " hücre Counter " eklenti 16. Her iki eklentileri bölümünde açıklandığı gibi yükleyin.
  3. Tarafsız stereological değerlendirmesi için sayım parametreleri aşağıdaki gibi tanımlayın: ızgara boyutunu, 130 x 130 µm; sayım çerçeve, 50 x 50 µm; ve optik disector yükseklik, 13 ve #181; m.
  4. Açık görüntü yanında tıkırtı üstünde " dosya " → " açık " (şekil 4a) kullanarak görüntü ölçeği ayarlayın " analiz " → " ölçeği ayarla " komut (şekil 4b). Bu adımda, tanımlı boyutunu piksel uzakta µm (şekil 4 c) değiştirmek.
    Not: analiz görüntülerde 425 piksel karşılık gelen için 100 µm.
  5. Select " eklentileri " → " kılavuz " → " ızgara türü: satır " rasgele bir kılavuz eklemek için komut. Kontrol " rasgele ofset " kutusu. 130 µm x 130 µm kılavuz (kılavuz-kare) içinde bir kare boyutunu define = 16.900 µm 2 (şekil 3b ve şekil 4 d ve e).
  6. Değiştir resim türü üzerinden 16-bit RGB renk için (tıklayın " resim " → " türü " → " RGB renk ") (şekil 4f). Baquet vd tarafından açıklandığı gibi SNpc bulun 17. SNpc ile çembere " Boya Fırçası aracını " (fırça genişliği: 11) ( şekil 3 c ve şekil 4 g -ı).
  7. Geri alma " ölçeği ayarla " komutunu tıklatarak " analiz " → " ölçeği ayarla " → "'ı tıklatın Kaldır Ölçekle " (şekil 4j -l) piksel hesaplamalarda performansını oldukça etkinleştirmek için µm daha.
  8. Bir ekran görüntüsü (şekil 4 m) yapmak, kurtarmak imge eğe ve ImageJ (şekil 4n) ile yeni bir dosya açın. Seçin " noktası " (şekil 4o) ve fırça genişliği 25 (şekil 4 p). Her kılavuz-kare için bir optik disector (şekil 4q) yerleşimini SN o kartvizitleri iþaretleyin. Tam yerelleştirilmiş tüm optik disectors veya kısmen Seviyelendirilmiş SN içinde cep numarasını analizini gerçekleştirmek.
  9. SN bölümlerini içeren bir kılavuz-kare seçin. Bu kare x ve y tanımlamak için ImageJ içindeki imleç ile sol üst köşesinde koordinatları (4r rakam ile) başlatmak için ölçü.
    Not: Koordinatları kullanarak konumlandırma optik disector için eklenir " optik disector konumu " (Adım 4'te açıklandığı gibi şekil 4'ler),.
  10. Optik disector pozisyon başlıklı elektronik tablo şablonu kullanarak hesaplama " optik disector pozisyon, " adım 4'te açıklandığı gibi.
  11. Kalibre optik disector (Christopher S. Ward, Ek dosya tarafından yazıldı makro) yanında tıkırtı üstünde " eklentileri " → " makroları " → " düzenleme " (şekil 4t), açık " opt_dis_ Grid.txt " dosya (4u rakam) ve boyutunu define " usergrid " x ile y boyut-in görme duyusuyla ilgili disector (şekil 4v) karşılık gelen piksel cinsinden. Usergrid bir tarafı boyutunu 212.5 piksel (50 x 4.25 piksel) tanımlanan 50 µm x 50 µm, boyutunu seçin.
  12. Optik disector (şekil 4v) ortasına tanımlayan ImageX ve ImageY koordinat ekleyerek yığın görüntü optik disector konumunu belirleyin. Makroyu çalıştırmak (" makroları " → " Makro Çalıştır ") (şekil 4w).
    Not: Kılavuz ( 3d şekil ve 4 x rakam) yığın görüntüden kaybolur olacaktır. Optik disector z-düzlemde ( 3e anlamaya ve 4 x rakam) taşırken devam edecek.
  13. Select " eklentileri " → " hücre Counter " hücre sayaç eklentisi (şekil 4y) başlatmak için. Hücre Sayacı başlatmak ve bir işaret türü (şekil 4z) seçin. Resmi yakınlaştırmak (tıklayın " + ") ve % 200 bir büyütmede hücre sayıları stereological değerlendirmesi gerçekleştir.
  14. Tespit dopaminerjik nöron perikarya onların yuvarlak veya oval şekil ve hücre boyutuna göre ( Şekil 1a). Stereological kuralları kullanarak hücre sayısını ölçmek.
    Not: optik disector 3 boyutlu küp ( şekil 5a) olduğundan, dışlama taraf olarak ön, sol ve küp (kırmızı) üst kenarlarında tanımlayın. Bu nedenle, don ' t sayısı TH + hücreleri (sağ ve sol açık) kırmızı çizgi ya da üst yan temas geliyor. Hücre sayımları sonuçlarını başlıklı hazırlanmış elektronik tablo dosyasına ekleyin " hücre sayısı hesaplanması " (5. adım).
  15. Göre SN resmi, sonraki kılavuz-kare sonraki hücre sayısı için optik disector yerleştirileceği hesaplamak kullanarak x, y adımlar örten kılavuz ( şekil 5b) boyutunu ve " optik disector pozisyon " elektronik tablo şablonu, adım 4'te açıklandığı gibi.
  16. Kullanarak hücre bir tahmini gerçekleştirmek " hücre sayısı hesaplanması " elektronik tablo (5. adım).

4. Optik Disector konumunu kullanarak hesaplama " optik Disector konumu " elektronik tablo şablonu

  1. hesaplamak, boyutunu ve konumunu SN (anahat içinde örten kılavuz içine yerleştirilmesini optik her disector şekil 5b) kullanarak " optik disector position.xlsx " elektronik tablo dosyası (Ek dosya).
  2. Ekle µm, her piksel için dönüşüm tarafından tanımlanan " ölçeği ayarla " komutu, sarı işaretli konumlarını içine " optik disector position.xlsx " dosya ( şekil 6a ve ek dosya ).
  3. INSERT optik disector planlanan boyutunu ve kılavuz-kare (µm), bir tarafta uzunluğu tarafından tanımlanan üstteki kılavuzunun boyutunu portakal işaretli pozisyonlar.
    Not: Sonuçları turuncu kutu yanındaki kırmızı kutuları içinde tasvir edilmektedir.
  4. Başlangıç noktası olarak belirlendi SN anahat içinde kılavuz Meydanı ile başlar (bir kılavuz-kare seçildi, adım 3.9, olduğu gibi yukarıda).
  5. x ve y koordinatları, adım 3.9, dosyanın yeşil kutularına (bu değerleri, x, y koordinatları için bu ilk kare içinde optik disector ortasına hesaplanır ve sonuçları mavi kutu içinde tasvir edilmektedir kullanarak) ölçülen ekle. Opt_dis_grid.txt (Ek dosya) makroyu.
  6. Hesaplamak x, y koordinatları ardışık optik disectors (kareler cinsinden ölçülür) kılavuz-kare mesafe ilk kılavuz-kare (kahverengi kutular) göre ekleyerek.
    Not: + x: Kılavuz-kare sağda yer alır; -x: Kılavuz-kare sola; bulunur + y: Kılavuz-kare için alt yer alır; -y: Kılavuz-kare başına bulunur. Sonuçlar gri kutularında gösterilir.

5. Cep numarasını kullanarak tahmini " hücre sayısı hesaplama " elektronik tablo

  1. hesapla TH + SN hücre formülü kullanarak hayvan (N) başına tahmini sayısı Yayınlandı tarafından Batı ve ark., 1991 3, nerede ∑ Q - bir beyin bölümü tüm optik disectors içinde sayılan TH + nöronlar toplam sayısı olarak tanımlanır.
    Not: Optik disector (h) ile ilgili olarak ölçülen kalınlığı (t) bölümünün yüksekliğini denklemde dahildir. Alan örnekleme kesir (asf) optik disector (optik disector) çerçeve boyutu kılavuz (x, y adım) kare boyutunu içinde alan (A) oranı olarak tanımlanır (optik disector/A x, y adım) ( şekil 3b) ve Bölüm örnekleme kesir (ssf) bütün seri olarak kesilmiş beyin bölümlerini oranı tanımlanır:
    Equation 1
    yüksek kaliteli nicel sağlamak, tahminleri katsayısı hata (CE) 0,10 düşük olmalıdır. Keuker ve ark tarafından formülü kullanarak CE belirlemek., 2001 10:
    Equation 2
  2. her hücre sayısı içinde belgili tanımlık SN stereological tahmini için fare, fare başına oluşturulan serisi toplam sayısı, optik disector, x, y alan optik disector (optik bir disector, µm 2), x, y alan kılavuz kare (x, y adım yüksekliği ile ilgili olarak belirtilen bilgileri ekle µm 2), ve ortalama ölçülen kalınlığı bölümünde (µm) kullanarak sarı kutulara " hücre count.xlsx hesaplanması " elektronik tablo dosyası ( şekil 6b ve ek dosya ).
  3. Analiz her SN bölümüne aynı hayvan, adım 5'te açıklandığı gibi.
  4. Insert Hücre sayar optik her disector gri kutularındaki için her satır bir SN bölümüne atıfta, kullanarak " hücre count.xlsx hesaplanması " elektronik tablo dosyası (Ek dosya).
    Not: Tahmini cep telefonu numarasını ve hesaplanan CE mavi kutu ( şekil 6b) tasvir edilmektedir.

6. Bir ticari olarak kullanılabilir Stereology sistem kullanarak hücre sayının tahmin

  1. Başlangıç dopaminerjik SNpc tahmini cep numarasını tıklayarak " sondalar " → " optik Fractionator iş akışı " optik Fractionator açmak için İş akışı pencere.
    Not: Yeni bir pencere olacaktır SN yeni bir dizi sayılması olup olmayacağını belirlemek için açılır pencere.
  2. Tıklatarak TH + SN bölümleri yeni bir seri başlatmak " yeni bir konu başlatmak " açılan pencerede.
  3. Optik Fractionator iş akışı farklı adım adım gitmek. İlk adım konu ayarlayın. Bunun için araştırmacı Ekle ' s adı, konu ' s adı (SN grubu) ve diğer yararlı bilgiler. Bu SN için saymak için bölümlerin numaralarını ekleyin. Kesme doku bölümleri kalınlığı yerleştirin. Bu durumda dörttür bölüm aralığı ekleyin. Rastgele belirlenen bölüm numarası ile başlamak ekle.
  4. İkinci adımda, mikroskop büyütme (2 X amaç) düşük ve seçmek için ayarla " 2 X Mag mercek " menüsünden.
  5. Adım 3'te, faiz Baquet ve ark tarafından açıklandığı gibi SNpc olan sol fare tuşu ile bölgenin izini., 2009 17.
    6. 4. adımda yüksek büyütme için mikroskop
  6. ayarlayın. Bunun için hedefi 100 X değiştirmek ve seçin " 100 X Mag objektif " açılır menüden.
  7. Odaklanarak adım 5'te üst ve alt kısmındaki kısmına monte kalınlığı ölçmek.
  8. Adım 6, 50 x 50 µm sayım çerçeve boyutu tanımla; bu optik disector (x, y) boyutudur.
  9. 7. adımda sistematik rastgele örnekleme (SRS) kılavuz boyutu 130 x 130 µm ayarlayın.
  10. 3-µm koruma bölgesi 8. adımda girin.
  11. Adım 9 ayarları kaydetmek.
  12. Son olarak, her optik disectors içinde adım 10 optik Fractionator iş akışı SRS kılavuzunda TH + dopaminerjik hücreleri saymak. Bunun için yanında tıkırtı üstünde başlamak " Counting " düğmesini.
  13. Bir bölümü bitirdikten sonra tıklayın " sonraki bölüme başlar " aynı SN serisi sonraki SN bölümünün optik Fractionator iş akışını başlatmak için düğmeyi.
  14. Sayısal bir SN serisi son SN bölümünü ne zaman tıkırtı üstünde " ben ' ve tamamlandı sayım. "
  15. Tıklayın " sonuçları göster " stereology örnekleme sonuçlarını görüntülemek için düğmeyi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Sunulan yöntemi, TH + dopaminerjik nöron 7,363 ve 7,987 hücreler arasında değişmekteydi SN sağ ve sol SN, tahmini sayısı 7,446 ve 7,904 hücreler arasında kullanarak. Böylece, dopaminerjik nöron (± SEM) ortalama sayısı SN sağ ve sol SN için 66 7,675 ± 7,647 ± 83 hücreleri idi. Her hayvan için hesaplanan CE 0,08 düşüktü (aralığı: 0,073 0.079) (Şekil 7). Bu yöntem ticari olarak kullanılabilir ve özel stereology sistemleri ile karşılaştırılabilir tespit etmek için SN hücre sayıları da stereology kurulumu (şekil 8) kullanarak sayısal. Sayım Parametreler: ızgara boyutunu, 130 x 130 µm; sayım çerçeve, 50 x 50 µm; güvenlik bölgesi, 3 µm. bölümden bir 100 x ile analiz / 1,25 sayısal diyafram amaçta BX53 mikroskop. 7,067 8,105 hücreler/SN ve 7,164-8,015 hücreleri/SN sağ ve sol tarafta sırasıyla değişmekteydi ortalama bölüm kalınlığı kullanarak TH + SN nöronlar tahmini nüfusu. Ortalama nöronal numarası 7,535 ± 155 hücreler için sağdaki SN ve 7,699 ± 128 hücreler için soldaki SN olarak hesaplanır. Gundersen CE (m = 1) sayısal her SN (Şekil 7) içinde ≤0.08 oldu. İstatistiksel analiz eşleştirilmiş Öğrenci t-testi kullanarak TH + hücre sayıları iki yöntemden sağ veya sol SN arasında herhangi bir önemli farklılıklar ortaya (± SEM; yani mi: t (5) 0.9524, P = > 0,05; sol: t (5) 0.2928, P = > 0,05) (Şekil 7 ).

Figure 1
Şekil 1. Fare SN temsilcisi görüntülerini dopaminerjik nöron için lekeli.
(a) bir temsilcisi fare SN genel bir bakış üst panelinde gösterilir. Sağ tarafta işaretler doğru beyin sapı üst kısmında küçük delik unutmayın. İç metin (kara kutu) daha yüksek büyütme TH + dopaminerjik nöron gösteriyor. (b) TH lekeli SN bölümleri bir dizi, tüm fare SN rostral Kaudal için kapsayan gösterilir. (c) her bölüm 120 µm. ölçek çubuklarla ardışık bölümünden ayrılır: bir, üst panel, 500 µm; Alt paneli, büyük görüntü, 100 µm; alt panel, iç metin, 50 µm; b, 500 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2. Görüntüleme yazılımı kullanarak stereological analiz için görüntü edinimi.
(a) kırmızı ok: edinme penceresini; Yeşil ok: "2;" binning ayarla mavi ok: canlı görüntüyü göster. (b) canlı görüntü (kırmızı ok) gösteren yeni bir pencere açılacaktır. (c) kırmızı ok: "Sahne" menü; Yeşil ok: "Slayt Scan" seçeneği; seçin mavi ok: kontrol "slayt Scan" seçeneği; siyah oku: sol üst köşesinde tanımlayın. (d) siyah oku: sağ alt köşede tanımlayın. (e) kırmızı ok: "Z-serisi" menü; Yeşil ok: "Z-uçak serisi;" kontrol mavi ok: "görünümü üst kısmındaki üst için arama yapmak için kayan" başlatın. (f) kırmızı ok: "Dur görünümü üst kısım; tanımlamak için" tıklayın üst Yeşil ok: "Görünümü alt kısmındaki alt için aramak için ofset" başlatın. (g) kırmızı ok: "Dur görüntüle bölümünün en altına tanımlamak için alt" tıklayın. (h) kırmızı ok: 3 µm guard zone "üst kayan" ve sonuç "Üst kayan" yuvaya takın çıkarın. (i) kırmızı ok: "Üst kayan" sayı arasında bir sayı 13 µm çıkarma ve sonuç "Alt ofset" yuvaya; takın Yeşil ok: 13 µm; z-uçak kalınlık için karşılık gelen 14 adımları tanımlamak mavi ok: ardışık görüntüler arasında 1 µm uzaklığa karşılık gelen 1.00 µm boyutunu tanımlamak. (j) kırmızı ok:; dosyayı kaydetmek istediğiniz dizini seçin mavi ok: görüntüleri edinimi başlatmak için "Sequence"'ı tıklatın. (k) kırmızı ok: "İşleme;" tıklatın aşağıdaki parametreleri denetleyin: Yeşil ok: "Tüm uçaklar;" mavi ok: "Sıra;" siyah oku: "Montaj;" gri ok: "Dikiş;" mor ok: hızlı. (l) görüntüleri dikiş başlatmak için sarı oku tıklatın. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3. Stereological analiz için görüntü işleme.
(a) bir fare SN alınan bir örnek yığını görüntü. (b ve c) SN (Turkuaz hattı, b) örten bir kılavuz randomize eklemeden sonra SN ikinci bir adım (mavi çizgi, c) gösterilmiştir. (d) bir optik disector SN yığını görüntü yerleştirilir. (e) 13 µm z düzlemde toplam altı ardışık odak uçaklar SN yığını görüntü içinde kapak. Ölçek çubukları: a-d, 100 µm; e, 50 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4. ImageJ kullanarak stereological değerlendirme sırası.
(a) kırmızı ok: "Dosya" → "açık" bir yığın görüntüyü açmak için tıklatın. (b) kırmızı ok: "Analiz" → "Ölçeği ayarla" tıklayın. (c) Kırmızı oklar: "Mesafe" piksel cinsinden için parametreleri tanımlamak "Bilinen mesafe" ve "Uzunluk birimi." (d) kırmızı ok: seçin "Eklentiler" → "Izgara." (e) kırmızı ok: "Satırları;" seçin Yeşil ok: "Random ofset;" kontrol mavi ok: ızgara boyutunu µm2' de ekle. (f) kırmızı ok: tıklayın "Resim" → "Türü" → "RGB renk." (g) kırmızı ok: "Boya Fırçası aracını;" seçin Yeşil ok: "fırça genişliği" 11 tanımlayın. (h) kırmızı ok: SNpc. (ı) kırmızı çembere başlar okları tasvir deklanşörü SNpc. (j) kırmızı ok: tıklayın "→"Ölçeği ayarla"analiz" ve ölçek (k) yanında tıkırtı üstünde "'ı tıklatın Kaldır kırmızı ile tasvir ölçekli," kaldırma ok. Piksel (l, kırmızı ok) µm (k, Yeşil ok) gelen değişim unutmayın. (m) almak a screenshot (ekran doğru kırmızı ok puan) ve (n) ImageJ ile ekran görüntüsü görüntü dosyasını açın. (o) kırmızı ok: tıklayın "Nokta." (p) kırmızı ok: bir fırça genişliği 25 yerleştirin. (q) kırmızı ok işaretli kırmızı ok belgili tanımlık SN bir bölümü içeren bir kılavuz-kare sol üst köşesinde gösterir SNpc. (r) temas plankarede görülmektedir. İmleç şu anda koyarak, x, y "optik disector pozisyon" için koordinatları (Adım 4) ölçülen ve "optik disector position.xlsx" şablonu (s, kırmızı ok) içine eklenmiş. (t) kırmızı ok: "Eklentiler" seçin →"Makrolar" → "Düzenle." (u) kırmızı ok: "opt_dis_grid.txt" dosyasını seçin. (V)yeni bir pencere açılacaktır. "Usergrid," boyutunu piksel (v, kırmızı ok) ve x, y koordinatları (v, Yeşil ok) koyun. (w) "opt_dis_grid.txt" (kırmızı ok) çalıştırın. (x) bir optik disector önceden tanımlanmış kılavuz-meydanın ortasında (kırmızı ok) gösterilir. (y) kırmızı ok: "Eklentiler" tıklayın → "Hücre Counter." (z) hücre Counter (kırmızı ok) başlatmak ve bir işaret türü (Yeşil ok) seçin. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5. Optik disector yerleşimi.
(a) için tarafsız stereology kullanılan optik disector gösterimi. Optik disector 3 boyutlu bir küp var. Üç şematik hücre içinde optik disector görülebilir. Hücre miktar için stereological kurallar optik disector kırmızı etiketli kenarlarında dokunmadan hücre dışlanan (kırmızı hücre), etiketli taraf (yeşil hücreleri) sayma hücrede bulunan yeşil başvurun hücreleri ise olduğunu gösteriyor. (b) bir optik disector SN ile temas halinde gelir her Izgara Meydanı'nda yer alıyor. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6. Optik disector pozisyon ve tahmini hücre sayısının hesaplanması.
(a) bir örnek hesaplama gerçekleştirilen optik disector konumlandırma için. (b) tahmini toplam hücre sayısının bir örnek. Stereological miktar parametrelerinin sarı kutulara yerleştirilir iken quantified hücreleri sayıda gri kutularına eklenir. Tahmini cep telefonu numarasını ve CE mavi kutularında görüntülenir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 7
Şekil 7. Parametre sayma hücre karşılaştırılması.
(a) TH + hücre sayısı tahmini sağ ve sol fare piyasada bulunan stereology sistemini kullanarak analizinden alınan verilerle açıklanan stereological yönteminden elde SN karşılaştırarak herhangi bir önemli farklılıklar görünmüyor. Hayvan, aslında sayılır, sayılan bölüm sayısı ve (Yani, örnekleme sitelerin sayısı hücre sayısı başına tahmini cep numarası ile elde edilen verileri doğru (b) ve sol (c) SN ait ayrıntılı bir liste verilir sayılan plankarelerinde sayısı) her iki yöntem için. Çubuk grafikler değerleri 6 fareler verilerden ortalama ± SEM vardır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 8
Şekil 8. Miktar piyasada bulunan stereology sistemi ile hücre.
(a-b) SN taslağı çizilmiş ve (c) optik disectors konumlarını otomatik olarak belirlenir. (d-e) Her görme duyusuyla ilgili disector hücre sayısı için z düzlemde odaklanarak analiz edilir. Altı ardışık odak uçaklar SN içinde gösterilir. Kırmızı ve yeşil çizgiler için optik disector karşılık gelir. Ölçek çubukları: a-d, 100 µm; e, 50 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Ek dosya 1. opt_dis_grid.txt Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek dosyası 2. Optik disector position.xlsx Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek dosya 3. Hücre count.xlsx hesaplama Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Stereology doku işleme ile başlar. Seri kesim SN doku stereological Çözümleme sırasında bölümler kaybını önlemek için dikkatli bir şekilde gerçekleştirilmesi gerekir. Ayrıca, sağ sol SN stereology gerçekleştirirken ayırmak için bir Yarımküre işaretlemek için bir temel adım olduğunu. Beyin sapı üst kısmında küçük bir delik yerleştirerek en iyi sonuçları sunulan çalışmada oluşturulan. Ayrıca, immünhistokimya, antikor ve diğer kuluçka sıvı doku penetrasyon sırasında daha yaygın olarak kullanılan 5-10 µm yerine yaklaşık 30-40 µm kalınlığında bölümlerini doku optik fractionator yöntemi talepleri ile çalışma beri kesmek immunohistokimyasal boyama gerekir sağlanmış, böyle bir deterjan kullanarak gibi.

TH antikor kullanarak dopaminerjik nöron için boyama immunohistokimyasal SN nöronlar, hem de hemen--dan belgili tanımlık SN yer alan ventral tegmental alan (VTA), içinde sinir hücreleri ve retrorubral alandaki nöronların Etiketler. SN nöronlar yalnızca standart immunohistokimyasal veya histolojik boyama tarafından görüntülenmeyecektir olamaz beri böylece, başka bir kritik nokta belgili tanımlık SN stereology işlemi sırasında fare SN anatomi, bilgidir. Bunun yerine, subthalamic çekirdeği, retrorubral alan ve VTA gibi anatomik simge tanınması SN17,18,19bütün kapsamını belirlemek önemli.

Güvenilir ve tekrarlanabilir nöronal numarası değerlendirilmesi gerekmektedir. Çeşitli gruplar piyasada bulunan stereology kurulumları kullansa da, TH + SN dopaminerjik nöron farklı yayınlardan alınan wt farelerde numaraları numarası17,20dakika içinde değişir. Baquet ve ark., Tasarım temelli stereological çözümleme farelerde piyasada bulunan stereology sistemini kullanarak 3 - için 4-ay-yaşlı erkek ve dişi C57BL/6J wt ortaya bir tahmini 8,716 ± 338 TH + dopaminerjik SN nöronlar (aralığı: 7,546-9,869)17 . Buna ek olarak, Smeyne ve ark. daha az sayıda TH + SN hücrelerin farelerde 6,302 ± 262 hücrelerden aynı stereology sistem20daha yeni bir sürümü kullanarak 6,861 ± 338 hücrelere, değişen % 0,9 serum fizyolojik ı.p. alınan 9 - için 16-hafta-yaşlı erkek C57BL/6J buldum. Ancak, ilk yazar da Baquet ve arkiçin son yazarı. Kağıt, bu nedenle farklı sonuçlar için gerekçe olarak deneyim değişen derecelerde hariç. Bu çakışan veri daha az değişkenlik gösterir bir stereological miktar yöntemi ihtiyacını yansıtır. Miktar ve kullanılan formül tekniği doğrulamak için SN hücre sayı sayısı piyasada bulunan stereology Kurulumu kullanarak bir miktar ile açıklanan yöntemi kullanarak sonuçlarını karşılaştırma gerçekleştirildi. İstatistiksel analiz herhangi bir önemli farklılıklar TH + dopaminerjik nöronlarda sağ sayıda karşılaştırırken belli etmedi ve bu nedenle bu yöntem için uygun olduğunu gösteren SN wt farelerin hücre miktar, her iki teknikleri kullanarak kararlı yaptı SN nöronların farelerde stereological tahmin.

Açıklanan yöntemi büyük avantajı stereology teknikleri Hücre sayımı için uygulanması ile genellikle ilişkili olan maliyeti azaltır olduğunu. Açıklanan yöntemi için belgili tanımlık SN yığını görüntüleri kaydedilir ve her zaman (hatta aynı anda) başka bir araştırmacı tarafından çözümlenebilir, ikinci bir avantaj sağlıyor. Gri tonlamalı görüntüler ImageJ içinde "arama tabloları" renkli çünkü Ayrıca, satın alma ve floresan görüntü analizleri bu yöntemle mümkündür. Ancak, bu çalışma için sınırlamalar vardır. İlk olarak, cep numarası miktar (yaklaşık % 50) miktar piyasada bulunan stereology sistemi ile daha fazla zaman alıcıdır. Esas olarak iki nedenlerden dolayı bu: 1. yığın belgili tanımlık SN görüntülerini götürülmeli ve 2. Hesaplama her SN içinde optik disector bulma ve tahmini cep telefonu numarasını ve CE hesaplama hesaplama şablonları kullanarak el ile yapılması gerekir. İkinci olarak, en az sistem kullanılabilir bizim laboratuvar, analiz yalnızca gri tonlamalı görüntülerde ImageJ tarafından işlenemedi renk görüntülerin büyük dosya boyutu nedeniyle gerçekleştirilebilir. Çift Kişilik bir leke aynı anda iki farklı hücre popülasyonlarının ölçmek için bir ihtiyaç varsa bu bir sorun teşkil. Daha iki farklı lekeli hücre popülasyonlarının gri tonlamalı görüntülerde ayırt etmek zor olabilir. Motorlu bir sahne (x, y, z uçak) ve ilgili yazılım ile histolojik numuneler çalışma birçok laboratuarlarında mevcut olmasına rağmen bu nedenle, yönetim ve yığın görüntülerin kalitesi belgili tanımlık mikroskop bilgisayar yazılımı ve performansını bağlıdır ekli bilgisayar.

Sınırlamaları aşmak için olası yolları vardır. Geliştirdiğimiz hesaplama şablonlarını kullanarak, bazı şu anda el ile gerçekleştirilen işlemlerle otomatikleştirmek için makro programlama hataları veya yanlışlıklar stereological değerlendirme sırasında azaltmak olabilir ve çalışma hızını hızlandırmak. Ayrıca, sürekli bir gelişim ImageJ ve diğer görüntüleme yazılımı ile yanı sıra artan bilgisayar işlem gücüne sahip, daha büyük görüntü dosya boyutları bir sorun yakın bir gelecekte teşkil olmamalıdır. Bu nedenle, alan parlak renkli görüntüler analizleri-ecek var olmak açıklanan tekniği ile yönetilebilir.

Açıklanan teknik TH + SN hücre analizleri için sınırlı değildir, ama diğer hücre tipleri ve beyin bölgeler kemirgenler çözümlemek için genişletilebilir. Bunun için bölgenin ilgi anatomik sınırları belirledi ve ilgili boyama yapılması gerekiyor. Ayrıca, bu teknik daha kalın bölümlerine adapte edilebilir. Bunun için edinme yığını görüntülerin daha fazla yığın görüntüleri sağlamak için adapte olması gerekir. 40 µm kalınlığında bölümünde gerekliyse, doku boyama optik disector gerekli yüksekliğini belirlemek için tabi gerekir sonra örneğin, fiili bölümünün kalınlığı monte. 6 µm (3 µm koruma bölge üst ve alt) ortalama doku kalınlığı çıkarma ve optik disector yükseklik sonuç almak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

C. W. ı. Merz eczacılık, LLC ve TEVA için bilimsel kurullarında hizmet vermiştir; Ipsen, Celal eczacılık, LLC ve Allergan, Inc.'a seyahat için fon aldı; ve hoparlör honoraria dışında gönderilen iş Merz, TEVA ve Allergan, Inc aldı. J. V. Boston bilimsel, Medtronic ve AbbVie için bir danışman olarak hizmet vermiştir ve honoraria Medtronic, Boston bilimsel, AbbVie, Bial, Allergan ve GlobalKinetics dışında gönderilen iş aldı.

Acknowledgments

Yazarlar, uzman teknik yardım Keali Röhm, Louisa Frieß ve Heike Menzel için minnettarız; Helga Brünner hayvan bakımı için için; ve Chistopher S. Ward için üretim ve dağıtım ImageJ yazılım için optik disector kılavuz eklentisi için.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Paxinos mouse atlas The Mouse Brain George Paxinos Keith B.J.FranklinCopyright @2001 by Academic Press CD Rom designet & created by Paul Halasz
brain matrix slicer mouse Zivic Instruments BSMAS 001-1
paraformaldehyde Merck 1040051000
sucrose /D(+) Saccharose Roth 4621.1
isopentane Roth 3927.1
glycerol Merck 1040931000
Ethanol Sigma Aldrich 32205-1L
Name Company Catalog Number Comments
phosphate buffered saline ingredients:
sodium chloride Sigma Aldrich 31434-1KG-R
potassium dihydrogen phosphate Merck 1048731000
di-sodium hydrogen phosphate dihydrate Merck 1065801000
potassium chloride Merck 1049360500
normal goat serum Dako X0907
bovine serum albumin Sigma A4503-100G
Triton X-100 Sigma Aldrich X100-100ml detergent
3,3-Diaminobenzidine-tetrahydrochlorid/DAB tablets 10mg pH 7.0 Kem En Tec 4170
H2O2/ Hydrogen peroxide 30% Merck 1072090250
avidin/biotin reagent Thermo Scientific 32050 Standard Ultra Sensitive ABC Staining Kit, 1:100
rabbit anti mouse tyrosine hydroxylase antibody abcam Ab112 1:1000
biotinylated goat-anti-rabbit IgG H+L vector laboratories BA-1000 1:100
StereoInvestigator version 11.07 MBF
BX53 microscope Olympus
Visiview Visitron Systems GmbH 3.3.0.2
Axiophot2 Zeiss
ImageJ software NIH Version 4.7
Tissue-TEK OCT Sakura 4583
dry ice
grid overlay plugin Wayne Rasband https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html
cell counter plugin Kurt de Vos https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html). 
optical disector macro Christopher Ward
C57Bl/6N male mice Charles River, Germany
SuperFrost Plus coated object slides Langenbrinck, Germany
25G needle Microlance 3 BD 300400
REGLO Analog Infusion pump Ismatec ISM 829
StereoInvestigator system StereoInvestigator version 11.07
BX53 microscope BX53 microscope
self-assorted stereology Visiview
Axiophot2 Axiophot2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ip, C. W., et al. AAV1/2-induced overexpression of A53T-alpha-synuclein in the substantia nigra results in degeneration of the nigrostriatal system with Lewy-like pathology and motor impairment: a new mouse model for Parkinson's disease. Acta Neuropathol Commun. 5 (1), 11 (2017).
  2. Ip, C. W., Beck, S. K., Volkmann, J. Lymphocytes reduce nigrostriatal deficits in the 6-hydroxydopamine mouse model of Parkinson's disease. J Neural Transm (Vienna). 122 (12), 1633-1643 (2015).
  3. West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Anat Rec. 231 (4), 482-497 (1991).
  4. Schmitz, C., Hof, P. R. Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience. 130 (4), 813-831 (2005).
  5. Tieu, K. A guide to neurotoxic animal models of Parkinson's disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 1 (1), e009316 (2011).
  6. Abercrombie, M. Estimation of nuclear population from microtome sections. Anat Rec. 94, 239-247 (1946).
  7. Rose, R. D., Rohrlich, D. Counting sectioned cells via mathematical reconstruction. J Comp Neurol. 263 (3), 365-386 (1987).
  8. Weibel, E. R., Gomez, D. M. A principle for counting tissue structures on random sections. J Appl Physiol. 17, 343-348 (1962).
  9. West, M. J. Design-based stereological methods for counting neurons. Prog Brain Res. 135, 43-51 (2002).
  10. Keuker, J. I., Vollmann-Honsdorf, G. K., Fuchs, E. How to use the optical fractionator: an example based on the estimation of neurons in the hippocampal CA1 and CA3 regions of tree shrews. Brain Res Brain Res Protoc. 7 (3), 211-221 (2001).
  11. Mouton, P. R., et al. The effects of age and lipopolysaccharide (LPS)-mediated peripheral inflammation on numbers of central catecholaminergic neurons. Neurobiol Aging. 33 (2), e427-e436 (2012).
  12. Barreto, G. E., Sun, X., Xu, L., Giffard, R. G. Astrocyte proliferation following stroke in the mouse depends on distance from the infarct. PLoS One. 6 (11), e27881 (2011).
  13. Robinson, S., et al. Microstructural and microglial changes after repetitive mild traumatic brain injury in mice. J Neurosci Res. 95 (4), 1025-1035 (2017).
  14. Paxinos, G., Franklin, K. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (2001).
  15. Rasband, W. Grid_Overlay.java. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html (2010).
  16. De Vos, K. cell_counter.jar. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html (2010).
  17. Baquet, Z. C., Williams, D., Brody, J., Smeyne, R. J. A comparison of model-based (2D) and design-based (3D) stereological methods for estimating cell number in the substantia nigra pars compacta (SNpc) of the C57BL/6J mouse. Neuroscience. 161 (4), 1082-1090 (2009).
  18. Fu, Y., et al. A cytoarchitectonic and chemoarchitectonic analysis of the dopamine cell groups in the substantia nigra, ventral tegmental area, and retrorubral field in the mouse. Brain Struct Funct. 217 (2), 591-612 (2012).
  19. German, D. C., Manaye, K. F. Midbrain dopaminergic neurons (nuclei A8, A9, and A10): three-dimensional reconstruction in the rat. J Comp Neurol. 331 (3), 297-309 (1993).
  20. Smeyne, R. J., et al. Assessment of the Effects of MPTP and Paraquat on Dopaminergic Neurons and Microglia in the Substantia Nigra Pars Compacta of C57BL/6 Mice. PLoS One. 11 (10), e0164094 (2016).

Tags

Nörobiyoloji sayı: 127 stereology optik fractionator Parkinson hastalığı hücre sayımları dopaminerjik nöron gözlemliyorum nigra
Optik Fractionator ve standart mikroskobu ekipmanlar kullanarak fare gözlemliyorum Nigra dopaminerjik nöron sayısının stereological tahmin
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ip, C. W., Cheong, D., Volkmann, J.… More

Ip, C. W., Cheong, D., Volkmann, J. Stereological Estimation of Dopaminergic Neuron Number in the Mouse Substantia Nigra Using the Optical Fractionator and Standard Microscopy Equipment. J. Vis. Exp. (127), e56103, doi:10.3791/56103 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter