Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Stereological vurdering af dopaminerge Neuron antallet i mus Substantia Nigra ved hjælp af optisk fraktioneringskolonne og Standard mikroskopi udstyr

Published: September 1, 2017 doi: 10.3791/56103
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Neurology, University Hospital of Würzburg

Summary

Dette arbejde præsenterer en trinvis protokol for den uvildige stereological estimering af dopaminerge neuronal celle numre i mus substantia nigra ved hjælp af standard mikroskopi udstyr (dvs. et lysmikroskop en motoriseret objekttabellen (x, y, z fly), og public domain-software til digital billedanalyse.

Abstract

I prækliniske Parkinsons sygdom forskning er analyse af nigrostriatal tarmkanalen, herunder kvantificering af dopaminerge neuron tab inden for substantia nigra, afgørende. For at anslå det samlede dopaminerge neuron nummer, anses upartiske Stereologi ved hjælp af metoden optisk fraktioneringskolonne i øjeblikket guldstandarden. Fordi teorien bag metoden optisk fraktioneringskolonne er komplekse og Stereologi er vanskeligt at opnå uden specialudstyr, eksisterer flere kommercielt tilgængelige komplet Stereologi systemer, der indeholder den nødvendige software, rent for celle tælle grundene. Da køber en specialiseret Stereologi opsætning ikke er altid muligt, af mange grunde, denne rapport beskriver en metode for stereological vurdering af dopaminerge neuronal celle tæller ved hjælp af standard mikroskopi udstyr, herunder et lysmikroskop, en motoriseret objekttabellen (x, y, z flyet) med software til billedbehandling og en computer til analyse. En trin for trin forklaring gives på hvordan man udfører stereological kvantificering ved hjælp af metoden optisk fraktioneringskolonne, og præ-programmerede filer til beregning af forventede celletal leveres. For at vurdere rigtigheden af denne metode, blev en sammenligning med data fra et kommercielt tilgængelige Stereologi apparat udført. Sammenlignelige celle numre blev fundet ved hjælp af denne protokol og Stereologi enhed, dermed demonstrere præcisionen af denne protokol for uvildig Stereologi.

Introduction

Kvantificering af neuronal celle nummer er afgørende i prækliniske Parkinsons sygdom forskning for at fastslå omfanget af neurodegeneration substantia nigra (SN)1,2. Den uvildige stereological estimering af celle nummer i en region af interesse betragtes som guldstandarden3,4,5.

Før fremkomsten af uvildige Stereologi, blev antallet af neuroner i sektioner vurderet ved at manipulere optalte celle profiler at korrigere for de variable sandsynligheder at neuroner kommer til syne i en sektion. En af de mest almindeligt anvendte metoder var korrektion af kvantificerede celletal beskrevet af Abercrombie6. Denne metode har forsøgt at tage i betragtning at celler kan kvantificeres mere end én gang, hvis fragmenter af den samme celle findes i tilstødende tynde sektioner. Derfor, Abercrombie og andre forfattere genereres ligninger, der kræves antagelser om form, størrelse og retning af optalte celler7,8. Disse antagelser var dog normalt ikke indså og derfor førte til systematisk fejl og afvigelse fra det faktiske celle nummer (dvs. bias). Desuden kunne bias ikke reduceres ved yderligere prøveudtagning3.

Til stereological vurdering af celle numre ved hjælp af den optiske fraktioneringskolonne der matematiske principper anvendes direkte anslå celle tal direkte i en defineret, 3-dimensionelle volumen. Fordelen ved denne metode er, at det ikke indebærer antagelser om form, størrelse og retning af celler der tælles. Således, den anslåede celle numre er tættere på de sande værdier og komme tættere stikprøvestørrelsen stiger (dvs, neutral)3. Fordi mange regler skal følges, når du bruger Stereologi for at holde metoden uvildig, klar-til-brug kommercielle Stereologi systemer har udviklet (til gennemsyn, se Schmitz og Hof, 20054). Specialiserede Stereologi systemer gennemføre design-baseret stereological metoder med en på forhånd defineret sonder og prøvetagningsordninger stereological vurderinger, der fører til uafhængighed fra form, størrelse, geografiske fordeling og orientering af de celler skal være analyseret4,9. Dog er kommercielt tilgængelige Stereologi systemer dyre; Dette kan begrænse gennemførelsen i ny forskning.

Formålet med denne undersøgelse var at udvikle en brugbar teknik til design-baseret stereological vurdering af dopaminerge celletal i mus SN, beskæftiger metoden optisk fraktioneringskolonne og ved hjælp af standard mikroskopi udstyr (dvs., lys mikroskop, standard mikroskop software og en motoriseret x, y, z fase). Dette præsenteres en trinvis vejledning om hvordan man behandler mus hjernevæv og skøn SN celle numre ved hjælp af design-baseret upartiske Stereologi. Derudover leveres skabeloner for beregningen af den anslåede celle numre og koefficienter af fejl (CE).

Metoden beskrevet her, er ikke begrænset til analysen af SN, men kan tilpasses til brug i andre anatomisk definerede regioner af hjernen, mus eller rotte. Eksempelvis er upartiske Stereologi blevet brugt til at estimere neuronal celle numre i hippocampus10 og locus coeruleus11. Derudover kan celletyper end neuroner, såsom astrocytter12 og mikroglia13, vurderes som godt. Derfor, denne metode kan være nyttig til forskere, der har til hensigt at iværksætte upartiske Stereologi i deres forskning, men er ikke villig til at bruge en masse penge til at købe en Stereologi system.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

alle gældende internationale, nationale og/eller institutionelle retningslinjer for pleje og brug af dyr blev fulgt. Protokollen blev godkendt af lokale myndigheder på Regierung von Unterfranken, Wuerzburg, Tyskland.

1. behandling af væv og Immunhistokemi

  1. aflive mus med CO 2 eller enhver anden godkendt metode.
  2. Perfuse seks 12-uge-forhenværende C56Bl/6N mand mus transcardially med 10 mL af 0,1 M fosfatbufferet saltopløsning (PBS) ved hjælp af en 25-G kanyle og en infusion pumpe, efterfulgt af 70 mL 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i 0,1 M PBS.
    Forsigtighed: PFA er giftige, allergifremkaldende og kræftfremkaldende.
  3. Dissekere mus hjernen i den koronale fly med en hjerne matrix slicer ved region +0.74 mm fra Bregma (fig. 25, Paxinos og Franklin mus hjernen atlas 14).
  4. Sætte den dorsale del af hjernen, herunder SN, i 4% PFA i 0,1 M PBS for 1 d ved 4 ° C for fordybelse-fiksering.
  5. Udveksle PFA for 30% saccharose/0,1 mol PBS løsning til cryo-beskyttelse og inkuberes i en anden 2 d ved 4 ° C.
  6. Læg den dorsale del af hjernen i et cryomold fyldt med optimal opskæring temperatur (OCT) sammensatte og langsomt fryse vævet i flydende tøris-kølet isopentane.
    Forsigtighed: Tøris er ekstremt kold (-78 ° C); bruge personlige værnemidler (PPE), herunder handsker, mens du arbejder med tøris. Tøris fordamper i CO 2; Derfor arbejder under et stinkskab.
  7. Seriefremstillede skær 30 µm cryo-sektioner i den koronale fly og indsamle sektioner, startende fra 2,46 mm fra Bregma (figur 51, Paxinos og Franklin mus hjernen atlas 14) og slutter ved 4,04 mm fra Bregma (figur 64, Paxinos og Franklin mus hjernen atlas 14).
  8. Gemme fire serier i rør, der er fyldt med kryoprotektant (30% glycerol, 30% ethoxyethanol og 40% PBS) ved-20 ° C. Under skæring procedure, markere den højre hjernehalvdel ved punktering en lille hul i det øverste område af hjernestammen.
  9. For immunhistokemisk farvning, Vælg en række sektioner pr. mus. Preincubate frit svævende sektioner for 1 h i 10% normal ged serum (NGS)/2% BSA/0.5% vaskemiddel i 0,1 mol PBS på en shaker. Inkuber afsnittene med kanin anti-mus tyrosin hydroxylase (TH; 1:1,000 fortynding) antistof fortyndet i 2% NGS/2% BSA/0.5% vaskemiddel i 0,1 mol PBS natten over ved 4 ° C.
  10. Anvend sekundære antistoffer mod kanin Igs (1: 100 fortynding) i 2 timer ved stuetemperatur, efterfulgt af begærlighed/biotin reagens (1: 100 fortynding). Inkuber og plette med 3,3-diaminobenzidine-tetrahydrochloride (DAB) og H 2 O 2. Montere sektionerne efter farvning dem på bestrøget objekt dias.
    Bemærk: TH + dopaminerge SN neuroner er vist i figur 1a. Ved farvning én serie, et gennemsnit på 13 SN sektioner, strækker sig fra den rostralt til caudale dele af SN pars compacta (SNpc) og reticulata, farves pr. dyr ( figur 1b). Afsnittene er adskilt af 120 µm (1/4 serie) ( figur 1 c).
    Forsigtighed: DAB er mistænkt kræftfremkaldende. Det er giftigt ved kontakt og indånding. Bruge PPE, når du arbejder med DAB.

2. Erhvervelse af billeder

  1. fange TH immunohistochemically farves SN sektioner digitalt ved hjælp af billedbehandling software, der er koblet til et mikroskop. Separat analysere hver sektion af én serie.
  2. Bruger indstillingen scan dias af den billedbehandlingsprogrammer. Gemme i TIFF format til billeder i høj kvalitet (figur 2).
    Bemærk: Billedopløsning er 312 pixels pr. cm.
  3. Tryk " erhverve " at åbne vinduet erhvervelse (figur 2a).
  4. Indstillet den binning til " 2 " for gråtonebilleder.
    Bemærk: Erhvervelse af gråtonebilleder i stedet for Farvebilleder reducerer størrelsen af den endelige stak billedfil (figur 2a).
  5. Klik på " Vis Live " i vinduet erhvervelse til at åbne et nyt vindue viser live-billeder fra afsnittet (figur 2 en og b).
  6. Klik på " tidspunkt " i vinduet erhvervelse. Vælg " scanne dias " i dropdown menuen og indskrive boksen (figur 2 c).
    Bemærk: Dette giver mulighed for erhvervelse og justering af meget forstørret SN billeder (630 X forstørrelse) i x, y-fly, samt erhvervelse af stak billeder med en afstand mellem på hinanden følgende billeder af 1 µm i z-flyet, der dækker en samlet række 13 µ m.
  7. Vælg den 2,5 X målsætning at søge efter SN.
  8. Ændre mål til 63 x.
  9. Definerer de øverste venstre hjørne (TopLeft) (figur 2 c) og nederste højre hjørne (LowRight) (figur 2d) af afsnittet ved at klikke på " sæt. "
  10. Klik på " Z-serie " og tjek den " Z-plan serie " boks (figur 2e).
  11. Afgøre den faktiske monteret tykkelse af sektionerne på tre tilfældigt valgte optælling websteder pr. afsnit ved hjælp af billedbehandling software. For dette, klik på " Se toppen opveje " at definere toppen af sektion (figur 2e) og derefter klikke på " Stop Se Top " (figur 2f). Derefter, klik på " Se bunden opveje " (figur 2f) og derefter klikke på " Stop se bunden " (fig. 2 g). Nedskrive tykkelsen af afsnittet.
  12. Trækker 3 µm (guard zone) fra toppen offset og skrive resultatet i den øverste offset slot (figur 2 h). Subtrahere 13 µm (højden på den optiske disector) fra den øverste offset nummer og skrive resultatet i bunden offset slot (figur 2i). Vælg følgende parametre: skridt, 14; størrelse, 1,00 (figur 2i).
    Bemærk: Dette svarer til en tykkelse i z-plan på 13 µm med 1 µm afstand mellem på hinanden følgende billeder.
  13. Vælg mappe til at gemme filen (figur 2j).
  14. Klik på " sekvens " at starte erhvervelse (figur 2j).
  15. Klik på " behandling af " og Vælg følgende parametre: " alle fly, " fra " sekvens; " " Montage; " og " hurtigt " og " syning " kasser, med et billede overlap på 10% (figur 2 k). Begynde at sy billederne ved at klikke på " start ".
    Bemærk: Dette vil generere stak billeder til analyse (figur 2 l, fig. 3a -e).

3. Sekvensen af Stereological vurdering

  1. udføre analyse af SN stak billeder ved hjælp af NIH ImageJ softwareversion 4.7.
  2. Downloade to plugins, der er nødvendige for fra ImageJ.nih.gov hjemmeside: den " Grid Overlay " plugin 15 og den " celle Counter " plugin 16. Installere begge plugins som beskrevet.
  3. For uvildig stereological vurdering, definere parametrene tælle som følger: gitterstørrelse, 130 x 130 µm; optælling ramme, 50 x 50 µm; og optiske disector højde, 13 & #181; m.
  4. Åbne billedet ved at klikke på " fil " → " åbne " (figur 4a) angive image skala ved hjælp af de " analyser " → " sat skala " kommando (figur 4b). I dette trin, ændre den definerede størrelse fra pixels til µm (fig. 4 c).
    Bemærk: For de analyserede billeder, 425 pixels svarer til 100 µm.
  5. Vælg den " Plugins " → " gitter " → " Grid typen: linjer " kommando tilfældigt indsætte et gitter. Tjek de " tilfældige opveje " boks. Angiv størrelsen på en firkant i gitteret (gitter-pladsen) som 130 µm x 130 µm = 16,900 µm 2 ( figur 3b og figur 4 d og e).
  6. Skift billede type fra 16-bit RGB-farve (Klik på " Image " → " Type " → " RGB-farve ") (figur 4f). Find SNpc, som beskrevet af Baquet et al. 17. omringe SNpc med den " malerpenselværktøjet " (børste bredde: 11) ( figur 3 c og figur 4 g -jeg).
  7. Fortryd den " sat skala " kommando ved at klikke på " analyser " → " sat skala " → " Klik for at fjerne skala " (figur 4j -l) til at aktivere udførelsen af beregninger i pixels snarere end µm.
  8. Laver et screenshot (figur 4 m), opspare billedfil og åbne den nye fil med ImageJ (figur 4n). Vælg " punkt " (figur 4o) og en børste bredde 25 (figur 4 p). Mark hver gitter-pladsen, kontakter SN til placering af en optisk disector (figur 4q). Udføre analyse af celle nummer i alle optiske disectors, der er oversat fuldt ud eller delvist inden for de skitserede SN.
  9. Vælg en gitter-pladsen, der omfatter dele af SN. Foranstaltning i øverste venstre hjørne af dette torv med markøren i ImageJ at definere x og y koordinater til at begynde med (figur 4r).
    Bemærk: Koordinater vil blive indsat til optiske disector positionering ved hjælp af den " optisk disector holdning " (figur 4s), som beskrevet i trin 4.
  10. Beregne den optiske disector position ved hjælp af skabelonen regneark med titlen " optisk disector position, " som beskrevet i trin 4.
  11. Kalibrere den optiske disector (makro skrevet af Christopher S. Ward, Supplerende filen) ved at klikke på " Plugins " → " makroer " → " redigere " (figur 4t), åbne den " opt_dis_ Grid.txt " fil (figur 4u), og Angiv størrelsen på den " usergrid " i pixel, der svarer til x, y dimension af den optiske disector (figur 4v). Vælg en størrelse af 50 µm x 50 µm, således at størrelsen på den ene side af usergrid er defineret som 212.5 pixels (50 x 4,25 pixels).
  12. Bestemmer placeringen af den optiske disector i stakken billedet ved at indsætte ImageX og ImageY koordinater, der definerer center af den optiske disector (figur 4v). Makroen (" makroer " → " køre makroen ") (figur 4w).
    NOTE: Nettet vil forsvinde fra stakken billedet ( figur 3d og figur 4 x). Den optiske disector bevares, når du flytter i z-plan ( figur 3 og figur 4 x).
  13. Vælg " Plugins " → " celle Counter " at starte celle Counter plugin (figur 4 års). Initialiser tælleren celle og vælg en mærketype (figur 4z). Zoome ind på billedet (Klik på " + ") og udføre den stereological vurdering af celle tal på 200% forstørrelse.
  14. Identificere dopaminerge neuronal perikarya af deres rundede eller ovale form og celle størrelse ( figur 1a). Kvantificere antallet af celler ved hjælp af stereological regler.
    Bemærk: Da den optiske disector er en 3-dimensionel terning ( figur 5a), definere udstødelse sider som forreste, venstre, og øverste sider af terningen (rød). Derfor, don ' t count TH + celler, der kommer i kontakt med enten den røde linje (venstre og front) eller den øverste side. Tilføje resultaterne af celle tæller til rede regnearksfilen ret, " beregning af celletal " (trin 5).
  15. Ifølge SN billede, beregne den næste gitter-plads til at placere den optiske disector for den næste celletal, ved hjælp af x, y trin størrelsen af den overliggende gitter ( figur 5b) og den " optisk disector position " regnearksskabelon, som beskrevet i trin 4.
  16. Udføre en vurdering af celle nummer bruger den " beregning af celletal " regneark (trin 5).

4. Beregning af optisk Disector Position ved hjælp af " optisk Disector holdning " regnearksskabelon

  1. beregne størrelsen og placeringen af hvert optisk disector skal placeres i den overliggende gitter inden for omridset af SN ( figur 5b) ved hjælp af den " optisk disector position.xlsx " regnearksfil (Supplerende fil).
  2. Indsætte omdannelse af pixel pr. µm, som defineret af den " sat skala " kommando, i de gule markerede positioner af den " optisk disector position.xlsx " fil ( figur 6a og supplerende fil ).
  3. Indsætte den planlagte størrelse af den optiske disector og størrelsen af grid-pladsen i den overliggende gitter, defineret af længden af en side (i µm), i de orange markante holdninger.
    Bemærk: Resultaterne er afbildet i de røde bokse ud for boksene orange.
  4. Starter med grid-pladsen inden for SN dispositionen, der blev fastsat som udgangspunkt (en grid-pladsen blev valgt til at begynde med som i trin 3.9, ovenfor).
  5. Indsæt x og y koordinater, målt i trin 3.9, i de grønne felter i filen (ved hjælp af disse værdier, x, y koordinater for centrum af den optiske disector i denne første kvadrat beregnes, og resultaterne er afbildet i de blå kasserne). Køre makroen opt_dis_grid.txt (Supplerende fil).
  6. Beregne x, y koordinater af de på hinanden følgende optiske disectors ved indsættelse af grid-pladsen afstanden (målt i antal pladser) i forhold til den første gitter-pladsen (brune kasser).
    Bemærk: + x: gitter-pladsen ligger til højre; -x: gitter-pladsen ligger til venstre; + y: gitter-pladsen ligger til bunden. -y: gitter-pladsen er placeret til toppen. Resultaterne er vist i de grå bokse.

5. Estimering af celle nummer ved hjælp af den " beregning af celletal " regneark

  1. Beregn det anslåede antal af TH + SN celler pr. dyr (N) ved hjælp af formlen offentliggjort af West mfl., 1991 3, hvor ∑ Q - er defineret som det samlede antal TH + neuroner tælles i alle optiske disectors af en hjerne afdeling.
    Bemærk: Højden af den optiske disector (h) i forhold til den målte tykkelsen af afsnittet (t) er inkluderet i ligningen. Området prøveudtagning brøkdel (asf) er defineret som andelen af området (A) i den optiske disector (en optiske disector) rammestørrelse inden for firkantet størrelsen af gitteret (en x, y trin) (en optisk disector/A x, y trin) ( figur 3b), og den afsnit prøveudtagning brøkdel (ssf) er defineret som andelen af dele af hjernen, hele seriefremstillede cut:
    Equation 1
    til at sikre høj kvalitet kvantitative estimater, koefficienten for fejl (CE) bør være lavere end 0,10. Bestemme CE ved hjælp af formlen af Keuker mfl., 2001 10:
    Equation 2
  2. til stereological vurdering af celle nummer inden for SN af hver mus, indsætter de angivne oplysninger om det samlede antal oprettede serie pr. mus, højden af den optiske disector, x, y område af den optiske disector (en optisk disector, i µm 2), x, y område af grid-pladsen (en x, y trin i µm 2), og gennemsnitlige målte tykkelsen af afsnittet (i µm) i de gule bokse ved hjælp af den " beregning af celle count.xlsx " regnearksfil ( fig. 6b og supplerende fil ).
  3. Analyserer hvert SN afsnit fra det samme dyr, som beskrevet i trin 5.
  4. Indsæt celle tæller for hver optisk disector i de grå bokse, hver linje henviser til en SN afsnit, ved hjælp af den " beregning af celle count.xlsx " regnearksfil (Supplerende fil).
    Bemærk: Anslået celle nummer og den beregnede CE er afbildet i blå kasser ( fig. 6b).

6. Estimering af celle nummer ved hjælp af en kommercielt tilgængelig Stereologi System

  1. Start estimering af dopaminerge SNpc celle nummer ved at klikke på " sonder " → " optisk fraktioneringskolonne arbejdsprocessen " hen til lukke op den optisk fraktioneringskolonne Arbejdsprocessen vindue.
    Bemærk: Et nyt vindue vil pop-up at afgøre, om en ny serie af SN vil blive talt.
  2. Begynder en ny serie af TH + SN sektioner ved at klikke på " Start et nyt emne " i pop-up vinduet.
  3. Gå gennem de forskellige trin i arbejdsprocessen optisk fraktioneringskolonne. Opsætning af emnet i den første skridt. For dette, indsætte investigator ' s navn, emnet ' s navn (SN gruppe) og andre nyttige oplysninger. Indsæt antallet sektioner til at tælle for denne SN. Indsæt tykkelsen af afsnittene cut væv. Indsæt afsnit interval, som i dette tilfælde er fire. Indsæt tilfældigt bestemt sektionsnummeret til at starte med.
  4. i det andet trin, sæt mikroskop til lav forstørrelse (2 X mål) og vælg " 2 X Mag linse " menuen.
  5. i trin 3, spore det pågældende område med venstre museknap, som er SNpc, som beskrevet af Baquet al.., 2009 17.
  6. Sæt mikroskop til høj forstørrelse i trin 4. For dette, ændre målet til 100 X og vælg " 100 X Mag linse " fra dropdown menuen.
  7. Måler monteret tykkelsen i trin 5 ved at fokusere på toppen og bunden af sektionen.
  8. i trin 6, definere optælling rammestørrelsen som 50 x 50 µm; dette er størrelsen af den optiske disector (x, y).
  9. i trin 7, indstille størrelsen af gitteret systematisk stikprøvekontrol (SRS) som 130 x 130 µm.
  10. Angiv en 3 µm guard zone i trin 8.
  11. Gemme indstillingerne i trin 9.
  12. Endelig tælle TH + dopaminerge celler i hver af de optiske disectors inden for SRS gitteret i trin 10 i optisk fraktioneringskolonne arbejdsprocessen. For dette, start ved at klikke på den " tælle " knappen.
  13. Efter endt én sektion, skal du klikke på den " begynde næste afsnit " knappen for at starte den optiske fraktioneringskolonne Workflow af den næste SN afsnit af samme SN serien.
  14. Når den sidste SN sektion af en SN-serien er blevet kvantificeret, klik på " jeg ' ve færdig tælle. "
  15. Klik på den " Se resultater " knap til at få vist resultaterne af prøveudtagning som Stereologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved hjælp af metoden præsenteres, det anslåede antal af TH + dopaminerge neuroner SN varierede mellem 7,363 og 7,987 celler til højre og venstre SN, mellem 7,446 og 7,904 celler. Det gennemsnitlige antal dopaminerge neuroner (± SEM) var således 7,647 ± 83 celler til højre SN og 7,675 ± 66 til venstre SN. Den beregnede CE for hvert dyr var lavere end 0,08 (range: 0.073-0.079) (figur 7). For at sikre sammenligneligheden af denne metode med kommercielt tilgængelige og specialiserede Stereologi systemer, var SN celle numre også kvantificeres ved hjælp af Stereologi setup (figur 8). Parametrene tælle var: gitterstørrelse, 130 x 130 µm; Counting ramme, 50 x 50 µm; Guard zone, 3 µm. sektioner blev analyseret med en 100 x / 1,25 numerisk blænde mål på en BX53 mikroskop. Den anslået befolkning på TH + SN neuroner ved hjælp af den gennemsnitlige snittykkelse varierede fra 7,067 til 8,105 celler/SN og 7,164 til at 8,015 celler/SN på højre og venstre side, henholdsvis. Den gennemsnitlige neuronal antallet blev beregnet som 7,535 ± 155 celler til højre SN og 7,699 ± 128 celler til venstre SN. Gundersen CE (m = 1) var ≤0.08 i hver SN kvantificeret (figur 7). Statistiske analyser ved hjælp af parrede Student's t-test afslørede ikke nogen væsentlige forskelle mellem TH + celle tæller af de to metoder i højre eller den venstre SN (betyde ± SEM; højre: t (5) = 0.9524, P > 0,05; venstre: t (5) = 0.2928, P > 0,05) (figur 7 ).

Figure 1
Figur 1. Repræsentative billeder af musen SN farvet for dopaminerge neuroner.
(a) en oversigt over en repræsentant mus SN er vist i det øverste panel. Bemærk det lille hul i den øverste del af højre hjernestammen, der markerer højre side. Højere forstørrelse af indsatser (sort boks) skildrer TH + dopaminerge neuroner. (b) en række TH-farvede SN sektioner er vist, der dækker hele musen SN fra rostralt til caudale. (c) hver sektion er adskilt fra afsnittet træk af 120 µm. skala barer: en, øverste panel, 500 µm; nederste panel, stort billede, 100 µm; nederste panel, indsatser, 50 µm; b, 500 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2. Erhvervelse af billeder for stereological analyse ved hjælp af billedbehandling software.
(a) rød pil: Åbn vinduet erhvervelse; grøn pil: indstille binning til "2" blå pil: vise live-aftrykket. (b) åbnes et nyt vindue viser live-billeder (rød pil). (c) rød pil: Vælg menuen "Scenen"; grøn pil: Vælg indstillingen "Skan Slide"; blå pil: Afmærk i indstillingen "Skan Slide"; sort pil: definere øverste venstre hjørne. (d) sort pil: definere nederste højre hjørne. (e) rød pil: Vælg menuen "Z-serien"; grøn pil: check "Z-plan serie;" blå pil: starter den "Se Top Offset" til at søge efter toppen af afsnittet. (f) rød pil: Klik på "Stop Se toppen" til at definere toppen af sektionen. grøn pil: begynde at "Se bunden Offset" til at søge efter i bunden af sektionen. (g) rød pil: Klik på "Stop se bunden" til at definere i bunden af sektionen. (h) rød pil: trække 3 µm guard zone fra "Top Offset" og indsætte resultatet i slidsen "Top Offset". (i) rød pil: fratræk 13 µm fra nummeret "Top Offset" og indsætte resultatet i slidsen "Bunden Offset"; grøn pil: definere 14 trin, der svarer til en z-plan tykkelse af 13 µm; blå pil: definere en størrelse på 1,00 µm, der svarer til en 1 µm afstand mellem på hinanden følgende billeder. (j) rød pil: Vælg mappe til at gemme filen til; blå pil: Klik på "Sekvens" til at starte erhvervelse af billeder. (k) rød pil: Klik på "Forarbejdning" tjekke følgende parametre: grøn pil: "Alle fly;" blå pil: "Sekvens;" sort pil: "Montage;" grå pil: "Syning;" lilla pil: hurtig. (l) Klik på den gule pil til at starte syning billederne. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Figure 3
Figur 3. Behandling af billeder for stereological analyse.
(a) et eksempel stak billede taget fra en mus SN. (b og c) Efter den randomiserede indsættelse af et gitter overliggende SN (turkis linjer, b), er SN skitseret i et andet trin (blå linje, c). (d) en optisk disector er placeret i SN stak billede. (e) seks på hinanden følgende fokale fly inden for SN stak billede dækker 13 µm samlede i z-plan. Skalere barer: a-d, 100 µm; e, 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4. Sekvensen af stereological vurdering ved hjælp af ImageJ.
(a) rød pil: Klik på "File" → "Åbn" for at åbne en stak billede. (b) rød pil: Klik på "Analysere" → "Sat skala". (c) røde pile: definere parametrene for "Afstand i pixel," "Kendt afstand" og "Enhed af længde." (d) rød pil: Vælg "Plugins" → "Grid." (e) rød pil: Vælg "Linier;" grønne pil: check "Tilfældig forskydning;" blå pil: Indsæt gitterets størrelse i µm2. (f) rød pil: Klik på "Billede" → "Type" → "RGB farve." (g) rød pil: Vælg "Malerpenselværktøjet;" grønne pil: definere "børste bredde" som 11. (h) rød pil: begynde at omringe den SNpc. (i) røde pile skildrer den omringede SNpc (j) rød pil: Klik på "Analysere" → "Sat skala" og fjerne skala (k) ved at klikke på "Klik på at fjerne skala," skildret af røde pil. Bemærk ændringen fra µm (k, grøn pil) til pixels (l, rød pil). (m) Tag et screenshot (rød pil peger mod screenshot) og (n) åbne billedfilen screenshot med ImageJ. (o) rød pil: Klik på "Point." (p) rød pil: Indsæt en børste bredde af 25. (q) den røde pil skildrer de markerede gitter-firkanter, der kontakter SNpc. (r) den røde pil peger på den øverste venstre hjørne af en gitter-pladsen, der omfatter en del af SN. Ved at placere markøren på dette punkt, x, y koordinater for den "optiske disector holdning" (trin 4) er målt og indsættes i skabelonen "optisk disector position.xlsx" (s, rød pil). (t) rød pil: Vælg "Plugins" →"Makroer" → "Rediger." (u) rød pil: Vælg filen "opt_dis_grid.txt". Der åbnes et nyt vindue (v). Indsætte størrelsen på "usergrid," i pixel (v, rød pil), og x, y koordinater (v, grøn pil). (w) køre makroen "opt_dis_grid.txt" (rød pil). (x) en optisk disector vises i midten af det tidligere definerede gitter-square (rød pil). (y) rød pil: Klik på "Plugins" → "Celle tæller." (z) initialisere celle Counter (rød pil) og vælg en mærketype (grøn pil). Venligst klik her for at downloade denne fil.

Figure 5
Figur 5. Placeringen af den optiske disector.
a en Illustration af den optiske disector anvendes til upartiske Stereologi. Den optiske disector er en 3-dimensionel terning. Tre skematisk celler er synlige inden for den optiske disector. Stereological reglerne for kvantificering af celler viser, at cellerne at røre de røde mærket sider af den optiske disector er udelukket (røde blodlegemer), mens celler, kontakte den grønne mærket sider er inkluderet i celle tælle (grønne celler). (b) en optisk disector er placeret i hver gitter-pladsen, der kommer i kontakt med SN. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6. Beregning af optisk disector position og estimering af celle nummer.
a en eksempel beregning udført for positionering af den optiske disector. (b) et eksempel på at anslå den samlede celle nummer. Antallet af kvantificerede celler er indsat i de grå bokse, mens parametrene for stereological kvantificering er indsat i de gule bokse. Den anslåede celle nummer og CE-vises i boksene blå. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7. Sammenligning af celle tælle parameter.
(a) sammenligne anslåede TH + celle antallet af venstre og højre museknap SN fremstillet af metoden beskrevne stereological med de data, der er erhvervet fra analyse ved hjælp af kommercielt tilgængelige Stereologi system viste ikke nogen væsentlige forskelle. En detaljeret liste over fremkomne data fra højre (b) og venstre (c) SN er givet med den forventede celle nummer pr. dyr, antallet af celler faktisk tælles, antallet af sektioner tælles, og antallet af stikprøver websteder (dvs. antallet af grid-firkanter tælles) for begge metoder. Værdierne i søjlediagrammer er den gennemsnit ± SEM af data fra 6 mus. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8. Kvantificering af celler med kommercielt tilgængelige Stereologi system.
(a-b) Omridset af SN tegnes og (c) positioner i den optiske disectors er automatisk bestemmes. (d-e) Hver optisk disector er analyseret for celle nummer ved at fokusere langs z-fly. Seks på hinanden følgende fokale planer inden for SN er vist. De røde og grønne linjer svarer til den optiske disector. Skalere barer: a-d, 100 µm; e, 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende fil 1. opt_dis_grid.txt Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 2. Optisk disector position.xlsx venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 3. Beregning af celle count.xlsx venligst klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Stereologi starter med væv behandling. Den serielle skæring af SN væv skal udføres omhyggeligt for at forhindre tab af dele under stereological analyse. Derudover er et afgørende skridt til at markere en halvkugle for at skelne højre fra venstre SN, når du udfører Stereologi. Placere et lille hul på den øverste del af hjernestammen genereret de bedste resultater i de præsenterede undersøgelse. Desuden siden arbejdet med de optiske fraktioneringskolonne metode kræver, at væv er skåret i tykke sektioner af ca 30-40 µm i stedet for de 5-10 µm mere almindeligt anvendt immunhistokemi, antistof og andre inkubation væske væv penetration under immunhistokemisk farvning skal sikres, sådan som ved hjælp af et rengøringsmiddel.

Immunhistokemisk farvning for dopaminerge neuroner ved hjælp af TH antistof etiketter SN neuroner, samt neuroner i det ventrale tegmentale område (VTA), som er placeret medialt fra SN, og neuroner i feltet retrorubral. Et andet kritisk punkt når du udfører Stereologi af SN er således viden om musen SN anatomi, da SN neuroner kan visualiseres udelukkende af standard immunhistokemiske eller histologiske farvning. I stedet, anerkendelse af anatomiske landemærker, subthalamicus, feltet retrorubral og VTA, er vigtig for at bestemme det hele omfang af SN17,18,19.

Vurdering af neuronal antallet skal være pålidelig og reproducerbar. Selvom forskellige grupper bruge kommercielt tilgængelige Stereologi opsætninger, varierer antal TH + dopaminerge SN neuroner i wt mus, taget fra forskellige publikationer, i antal17,20. I Baquet mfl., design-baseret stereological analyse i 3 til 4 måneder gammel mandlige og kvindelige C57BL/6J wt mus ved hjælp af en kommercielt tilgængelig Stereologi afslørede en anslået 8,716 ± 338 TH + dopaminerge SN neuroner (range: 7,546-9,869)17 . Derimod Smeyne mfl. fundet færre TH + SN celler i 9 til 16 uger gamle mandlige C57BL/6J mus, der modtog 0,9% saltvand i.p., lige fra 6,302 ± 262 celler til 6,861 ± 338 celler, bruger en nyere version af den samme Stereologi system20. Den første forfatter var imidlertid også den sidste forfatter i Baquet mfl. papir, derfor udelukke varierende grader af erfaring som årsag til de forskellige resultater. Disse modstridende data afspejler behovet for en stereological kvantificering metode, der viser mindre variabilitet. Kontroller teknik af kvantificering og den formel, der anvendes ved blev en sammenligning af resultaterne af SN nummer celletal ved hjælp af metoden beskrevet med en kvantificering ved hjælp af kommercielt tilgængelige Stereologi setup udført. Statistisk analyse viste ikke nogen væsentlige forskelle, når man sammenligner antallet af TH + dopaminerge neuroner i højre og venstre SN af wt mus bestemmes ved hjælp af begge teknikker celle bestemmelsesgrænsen, således viser, at denne metode er muligt for den stereological vurdering af SN neuroner i mus.

Den største fordel ved den beskrevne metode er, at det reducerer de omkostninger, der normalt forbundet med gennemførelsen af Stereologi teknikker til celle optælling. En anden fordel er, at den beskrevne metode, stak billeder af SN gemmes og kan analyseres helst (endda på samme tid) af en anden investigator. Desuden er erhvervelse og analyser af fluorescens billeder muligt med denne metode, fordi gråtonebilleder kan være farvet med "Opslagstabeller" i ImageJ. Der er dog begrænsninger til denne undersøgelse. Først, kvantificering af celle nummer er mere tidskrævende (omkring 50%) end kvantificering med kommercielt tilgængelige Stereologi system. Dette skyldes primært to grunde: 1. stak billeder af SN skal tages og 2. beregning af optisk disector placering inden for hver SN og beregningen af den anslåede celle nummer og CE skal foretages manuelt ved hjælp af beregningsskabeloner i. For det andet, i det mindste med det system, der er til rådighed i vores laboratorium, analysen kan kun udføres på gråtonebilleder på grund af den store filstørrelse af Farvebilleder, som ikke kunne behandles af ImageJ. Dette kan udgøre et problem, hvis der er behov for at kvantificere to forskellige cellepopulationer samtidig i en dobbelt pletten. Det kunne være mere vanskeligt at skelne to forskelligt farvede cellepopulationer i gråtonebilleder. Derfor, selv om en motoriserede Stadium (x, y, z flyet) og den tilsvarende software er tilgængelig i mange laboratorier, der arbejder med histologiske prøver, forvaltning og kvaliteten af stak billeder vil afhænge af mikroskop software og ydeevne den tilsluttede computer.

Der er mulige måder at overvinde begrænsningerne. Ved hjælp af beregningsskabeloner vi udviklet, kunne programmering af makroer til at automatisere nogle af de processer, der i øjeblikket manuelt udførte reducere fejl eller unøjagtigheder under stereological vurdering og accelerere hastigheden af arbejde. Derudover bør med den igangværende udvikling af ImageJ og andre billedbehandlingsprogrammer, samt med stigende computer processorkraft, større billede filstørrelser ikke udgør et problem i den nærmeste fremtid. Analyser af lysfelt Farvebilleder bliver derfor overskueligt med den beskrevne teknik.

Den teknik beskrevet er ikke begrænset til analyser af TH + SN celler, men kan udvides til at analysere andre celletyper og hjerneregioner af gnavere. For dette, for det pågældende område, anatomiske grænser skal bestemmes og de respektive farvning skal udføres. Denne teknik kan desuden tilpasses til tykkere sektioner. For dette, skal erhvervelse af stak billeder tilpasses giver mere stak billeder. For eksempel, hvis 40 µm tykt afsnit er påkrævet, monteret den faktiske tykkelse af afsnittet efter væv farvning skal vurderes for at bestemme den nødvendige højde på den optiske disector. Subtrahere 6 µm (3 µm guard zone på toppen og bunden) fra den gennemsnitlige væv tykkelse og tage resultatet som højden af den optiske disector.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

C. W. I. har tjent på videnskabelige bestyrelser i Merz Pharmaceuticals, LLC og TEVA; har modtaget støtte for rejse fra Ipsen, Merz Pharmaceuticals, LLC og Allergan, Inc.; og har modtaget højttaler honorarer fra Merz, TEVA og Allergan, Inc. udenfor det indsendte arbejde. J. V. har fungeret som konsulent for Boston Scientific, Medtronic, og AbbVie og har modtaget honorarer fra Medtronic, Boston Scientific, AbbVie, Bial, Allergan, og GlobalKinetics uden for det indsendte arbejde.

Acknowledgments

Forfatterne er Keali Röhm, Louisa Frieß og Heike Menzel taknemmelig for deres ekspert teknisk bistand; til Helga Brünner dyrs pleje; og at Chistopher S. Ward til produktion og distribution af optisk disector gitter plugin for ImageJ software.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Paxinos mouse atlas The Mouse Brain George Paxinos Keith B.J.FranklinCopyright @2001 by Academic Press CD Rom designet & created by Paul Halasz
brain matrix slicer mouse Zivic Instruments BSMAS 001-1
paraformaldehyde Merck 1040051000
sucrose /D(+) Saccharose Roth 4621.1
isopentane Roth 3927.1
glycerol Merck 1040931000
Ethanol Sigma Aldrich 32205-1L
Name Company Catalog Number Comments
phosphate buffered saline ingredients:
sodium chloride Sigma Aldrich 31434-1KG-R
potassium dihydrogen phosphate Merck 1048731000
di-sodium hydrogen phosphate dihydrate Merck 1065801000
potassium chloride Merck 1049360500
normal goat serum Dako X0907
bovine serum albumin Sigma A4503-100G
Triton X-100 Sigma Aldrich X100-100ml detergent
3,3-Diaminobenzidine-tetrahydrochlorid/DAB tablets 10mg pH 7.0 Kem En Tec 4170
H2O2/ Hydrogen peroxide 30% Merck 1072090250
avidin/biotin reagent Thermo Scientific 32050 Standard Ultra Sensitive ABC Staining Kit, 1:100
rabbit anti mouse tyrosine hydroxylase antibody abcam Ab112 1:1000
biotinylated goat-anti-rabbit IgG H+L vector laboratories BA-1000 1:100
StereoInvestigator version 11.07 MBF
BX53 microscope Olympus
Visiview Visitron Systems GmbH 3.3.0.2
Axiophot2 Zeiss
ImageJ software NIH Version 4.7
Tissue-TEK OCT Sakura 4583
dry ice
grid overlay plugin Wayne Rasband https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html
cell counter plugin Kurt de Vos https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html). 
optical disector macro Christopher Ward
C57Bl/6N male mice Charles River, Germany
SuperFrost Plus coated object slides Langenbrinck, Germany
25G needle Microlance 3 BD 300400
REGLO Analog Infusion pump Ismatec ISM 829
StereoInvestigator system StereoInvestigator version 11.07
BX53 microscope BX53 microscope
self-assorted stereology Visiview
Axiophot2 Axiophot2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ip, C. W., et al. AAV1/2-induced overexpression of A53T-alpha-synuclein in the substantia nigra results in degeneration of the nigrostriatal system with Lewy-like pathology and motor impairment: a new mouse model for Parkinson's disease. Acta Neuropathol Commun. 5 (1), 11 (2017).
  2. Ip, C. W., Beck, S. K., Volkmann, J. Lymphocytes reduce nigrostriatal deficits in the 6-hydroxydopamine mouse model of Parkinson's disease. J Neural Transm (Vienna). 122 (12), 1633-1643 (2015).
  3. West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Anat Rec. 231 (4), 482-497 (1991).
  4. Schmitz, C., Hof, P. R. Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience. 130 (4), 813-831 (2005).
  5. Tieu, K. A guide to neurotoxic animal models of Parkinson's disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 1 (1), e009316 (2011).
  6. Abercrombie, M. Estimation of nuclear population from microtome sections. Anat Rec. 94, 239-247 (1946).
  7. Rose, R. D., Rohrlich, D. Counting sectioned cells via mathematical reconstruction. J Comp Neurol. 263 (3), 365-386 (1987).
  8. Weibel, E. R., Gomez, D. M. A principle for counting tissue structures on random sections. J Appl Physiol. 17, 343-348 (1962).
  9. West, M. J. Design-based stereological methods for counting neurons. Prog Brain Res. 135, 43-51 (2002).
  10. Keuker, J. I., Vollmann-Honsdorf, G. K., Fuchs, E. How to use the optical fractionator: an example based on the estimation of neurons in the hippocampal CA1 and CA3 regions of tree shrews. Brain Res Brain Res Protoc. 7 (3), 211-221 (2001).
  11. Mouton, P. R., et al. The effects of age and lipopolysaccharide (LPS)-mediated peripheral inflammation on numbers of central catecholaminergic neurons. Neurobiol Aging. 33 (2), e427-e436 (2012).
  12. Barreto, G. E., Sun, X., Xu, L., Giffard, R. G. Astrocyte proliferation following stroke in the mouse depends on distance from the infarct. PLoS One. 6 (11), e27881 (2011).
  13. Robinson, S., et al. Microstructural and microglial changes after repetitive mild traumatic brain injury in mice. J Neurosci Res. 95 (4), 1025-1035 (2017).
  14. Paxinos, G., Franklin, K. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (2001).
  15. Rasband, W. Grid_Overlay.java. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html (2010).
  16. De Vos, K. cell_counter.jar. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html (2010).
  17. Baquet, Z. C., Williams, D., Brody, J., Smeyne, R. J. A comparison of model-based (2D) and design-based (3D) stereological methods for estimating cell number in the substantia nigra pars compacta (SNpc) of the C57BL/6J mouse. Neuroscience. 161 (4), 1082-1090 (2009).
  18. Fu, Y., et al. A cytoarchitectonic and chemoarchitectonic analysis of the dopamine cell groups in the substantia nigra, ventral tegmental area, and retrorubral field in the mouse. Brain Struct Funct. 217 (2), 591-612 (2012).
  19. German, D. C., Manaye, K. F. Midbrain dopaminergic neurons (nuclei A8, A9, and A10): three-dimensional reconstruction in the rat. J Comp Neurol. 331 (3), 297-309 (1993).
  20. Smeyne, R. J., et al. Assessment of the Effects of MPTP and Paraquat on Dopaminergic Neurons and Microglia in the Substantia Nigra Pars Compacta of C57BL/6 Mice. PLoS One. 11 (10), e0164094 (2016).

Tags

Neurobiologi sag 127 Stereologi optisk fraktioneringskolonne Parkinsons sygdom celletal dopaminerge neuroner substantia nigra
Stereological vurdering af dopaminerge Neuron antallet i mus Substantia Nigra ved hjælp af optisk fraktioneringskolonne og Standard mikroskopi udstyr
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ip, C. W., Cheong, D., Volkmann, J.… More

Ip, C. W., Cheong, D., Volkmann, J. Stereological Estimation of Dopaminergic Neuron Number in the Mouse Substantia Nigra Using the Optical Fractionator and Standard Microscopy Equipment. J. Vis. Exp. (127), e56103, doi:10.3791/56103 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter