Summary
この作品には、標準的な顕微鏡装置 (すなわち、光学顕微鏡 (x、y、z のモーターを備えられたオブジェクト テーブルを使用してマウス中脳ドーパミン作動性神経細胞数の公平な薬剤推定手順プロトコル平面)、およびデジタル画像解析のためのパブリック ドメイン ソフトウェア。
Abstract
パーキンソン病臨床研究では、黒質中ドーパミン作動性ニューロンの損失の定量化を含む黒質線条体路の解析が不可欠です。合計ドーパミン作動性ニューロンの数を推定するには、公平なステレオロジー光分留メソッドを使用して現在のゴールド スタンダードと見なされます。光分留メソッドの背後にある理論は複雑、ステレオロジーが特別な装置なしに達成するために困難であるため、必要なソフトウェアを含むいくつかの市販の完全な立体システム純粋存在してセルの理由を数えます。専門ステレオロジー セットアップを購入はないので常に実行可能な多くの理由のため、このレポートは、方法を記述するドーパミン作動性神経細胞の薬剤の推定カウント標準的な顕微鏡検査機器、光学顕微鏡を使用してのイメージング ソフトウェアと解析のためのコンピューター オブジェクト テーブル (x、y、z 平面) モーターを備えられました。光分留メソッドを使用して薬剤の定量化を実行する方法のステップバイ ステップの説明は与えられたし、推定される細胞数算定のため事前にプログラムされたファイルが提供されます。このメソッドの精度を評価するために市販ステレオロジー装置から得られたデータとの比較を行った。匹敵する細胞の数は、こうして公平な立体のこのプロトコルの有効桁数を示すこのプロトコルとステレオロジー デバイスを使用して発見されました。
Introduction
神経細胞数の定量化は、前臨床パーキンソン病研究では神経変性疾患中脳 (SN)1,2内のレベルを決定する極めて重要です。関心の領域で細胞数の公平な薬剤推定は、ゴールド スタンダード3,4、5と見なされます。
公平な立体の出現の前のセクションでのニューロンの数をカウント セル ニューロンがセクションで見えて来ること変数の確率を修正するプロファイルを操作することによって評価しました。最も一般的に使用される方法の 1 つは、アバクロンビー6によって記述された定量化された細胞数の補正だった。このメソッドは、隣接する薄いセクションで同じセルのフラグメントが見つかった場合に何度も示すことができる、細胞を考慮ましょう。したがって、アバクロンビーや他の作家は、形状、サイズ、およびカウントの細胞7,8の方向を知るのために必要な方程式を生成しました。ただし、これらの仮定された通常は実現し、したがって実際のセル数 (すなわちバイアス) からの系統誤差との分岐につながった。また、バイアスを追加サンプリング3縮小できませんでした。
光の分留を使用してセル番号の薬剤の推定直接定義された、3 次元ボリュームのセル番号を直接推定する数学的原理が適用されます。このメソッドの利点は、形状、サイズ、およびカウントされて細胞の向きについての仮定を必要としないことです。したがって、推定の細胞数は真の値に近い、サンプル サイズが増加3(すなわち、公平な) 近づきます。すぐに使える商用ステレオロジー システムが開発されているステレオロジーを使用して公平な方法を維持するとき多くの規則が続かれなければならないので (レビュー、シュミッツとホフ, 2005年4を参照してください)。特殊な立体システム実装図形、サイズ、分布、およびの向きから自立につながる薬剤の評価のために事前定義されているプローブとサンプリング方式のデザイン ベースの薬剤方法、分析4,9セル。ただし、市販の立体システムは高価です;これは新しい研究での実装に制限があります。
本研究の目的は SN、光分留方式を採用した、標準的な顕微鏡装置 (すなわち、光を用いたマウスにおけるドーパミン細胞数のデザイン ベースの薬剤評価のため使用可能な手法の開発、顕微鏡、顕微鏡の標準ソフトウェア、および電動 x、y、z ステージ)。このため、マウス脳組織を処理する方法、および公平な立体のデザイン ベースを用いた SN 細胞数を推定する方法についてステップバイ ステップ ガイドが表示されます。さらに、エラー (CE) の係数と推定される細胞数の計算のテンプレートが提供されます。
ここで説明したメソッドは、SN の分析に限定されていないが、マウスまたはラットの脳の他の解剖学的に定義された地域での使用に適応することができます。例えば、海馬10や11の軌跡青斑核神経細胞の数を推定する公平なステレオロジーを使用されています。さらに、アストロ サイト12とミクログリア13など、神経細胞以外の細胞型も同様に評価することができます。したがって、このメソッドは、科学者の研究で公平なステレオロジーを実装するつもりが、ステレオロジー システムを購入するお金の多くを費やすことをいとわないされてすることができます。
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Protocol
ケアとの動物の使用のためのすべての該当する国際、国家、および/または制度ガイドラインが続いていた。Regierung ・ フォン ・ Unterfranken、ヴュルツブルク、ドイツの地方自治体によって承認されたプロトコル
。1 です組織処理および免疫組織化学
- CO 2 等で安楽死マウス承認メソッド。 。
- 10 ml の 0.1 M リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 25 G 針と輸液ポンプを用いての Perfuse 6 12 週齢 C56Bl/6 n の雄マウス transcardially は 0.1 M PBS で 4% パラホルムアルデヒド (PFA) の 70 mL に続いて
。 注意:PFA は、アレルギー性、有毒で発がん性 。
- 前 (図 25、Paxinos、フランクリン マウス脳アトラス 14) から +0.74 mm の領域で脳マトリックス スライサーとコロナの平面でマウスの脳を解剖します 。
- 4% で、SN を含む脳の背の部分を入れて浸漬固定のための 4 ° C で 1 d の 0.1 M PBS で PFA 。
- 低温保護のため 30% ショ糖/0.1 mol PBS 溶液の PFA を交換し、インキュベートする別の 2 d で 4 ° C
- 、Cryomold に脳の背の部分は、最適な切削温度 (OCT) でいっぱい入れて化合物し、液体ドライアイス冷却イソペンタンで組織をゆっくりと凍結します
。 注意:ドライアイスは、非常に寒いです (-78 ° C);ドライアイスでの作業中、手袋を含む個人保護具 (PPE) を使用します。CO 2 でドライアイスが蒸発します。したがって、ヒューム フードの下で動作します 。
- 直列コロナの平面カット 30 μ m の低温電子顕微鏡セクションとセクション、開始前 (図 51、Paxinos とフランクリン マウス脳アトラス 14) から 2.46 mm で、前から 4.04 mm で終了を収集 (図 64、Paxinos、フランクリン マウス脳アトラス 14).
- は、保護剤の検討 (30% のグリセロール、30 %ethoxyethanol と 40 %pbs)-20 ° C で満ちている管に 4 つのシリーズを格納します。断面中に、脳幹の上部領域に小さな穴を貫通して右半球をマークします 。
- 免疫染色、セクションごとにマウスの 1 つの系列を選択します。1 h で 10% ヤギ血清 (NGS)/2% BSA/0.5% 洗剤 0.1 mol シェーカーで PBS の preincubate の浮遊セクション4 で一晩 2% NGS/2% BSA/0.5% 洗剤 0.1 mol PBS で希釈したウサギ抗マウス チロシン水酸化酵素 (TH; 縮尺希釈) 抗体とセクションを孵化 ° C
- 適用二次抗体ウサギ、室温で 2 時間 (1: 100 希釈) Igs は続いてアビジン ・ ビオチン試薬 (1: 100 希釈)。孵化し、3, 3-ジアミノベンジジン-tetrahydrochloride (軽打) と H 2 O 2 ステインします。被塗り物のスライドで、それらを染色後のセクションにマウントします
。 注: TH + ドーパミンニューロン SN は、 図 1 a に表示されます。1 つの系列を染色によって平均 13 SN セクション、SN pars 緻密 (SNpc) とカン、尾側の部分に、吻側から伸びるの動物 ( 図 1 b) あたりステンド グラスします。セクションは 120 μ m (1/4 シリーズ) で区切られます ( 図 1 c).
注意:軽打は発がん性が疑われるです。接触、吸入によって有毒であります。軽打で PPE を使用します 。
2。画像の取得
- キャプチャ TH 免疫染色 SN セクション デジタル顕微鏡に結合イメージング ソフトウェアを使用しています。1 つの系列の各セクションを別々 に分析します 。
- は、イメージング ソフトウェアのスキャン スライド オプションを使用します。高品質の画像 (図 2) の TIFF 形式で保存します
。 注: 画像の解像度は 1 cm あたり 312 ピクセルです 。
- プレス " 取得 " 取得] ウィンドウ (図 2 a) を開きます 。
- 設定、ビニング " 2 " グレースケール画像
。 注: カラー画像ではなくグレースケール画像の取得最終的なスタック画像ファイル (図 2 a) のサイズが小さくなります 。
- をクリックして " ショーの生きている " セクションのライブ画像を表示新しいウィンドウを開くにアクイジション ・ ウィンドウで (図 2 と b). クリックして
- " ステージ " アクイジション ・ ウィンドウで。選択 " スライド スキャン " ドロップ ダウン メニューとチェック ボックス (図 2 c).
注: これにより、集録と 13 μ の全範囲をカバー z 平面で 1 μ m の連続する画像間距離で画像をスタックの取得と同様、x、y 平面の非常に拡大、SN イメージ (630 X 倍率) の配置m. - 2.5 X 目的 SN を検索するを選択します 。
- X. 63 に目標を変更
- をクリックして左上隅 (左上) (図 2 c) および右下隅 (LowRight) (図 2 d) 部を定義 " セット " 。
- をクリックして " Z シリーズ " して、" Z 平面シリーズ " ボックス (図 2 e). イメージング ソフトウェアを使用してセクションごとの
- を決定する 3 つのランダムに選択されたカウントでセクションの実際のマウントされた厚みのサイト。これをクリックして " ビュー上部のオフセット " (図 2 e) セクションの上部を定義し、をクリックする " ビュー上部の停止 " (図 2 f)。その後、つけ " ビュー下部のオフセット " (図 2 f)、[クリックして " ビュー下部の停止 " (図 2 g)。断面の厚みを書き留めます 。
- を引く 3 μ m (ガード ゾーン) 上からオフセットし、上のオフセット スロット (図 2 h) に結果を入力します。上オフセットの数字から 13 μ m (光 disector の高さ) を減算し、下部オフセット スロット (図 2 i) に結果を入力します。次のパラメーターを選択: 手順、14;サイズ、1.00 (図 2i).
注: これは 13 μ m、連続する画像間の 1 μ m の距離の z 平面の厚みに対応しています 。
- (図 2 j) ファイルを保存するディレクトリを選択します 。
- をクリックして " シーケンス " 集録 (図 2 j) を開始する 。 [
- ] をクリックして " 処理 " し、次のパラメーターを選択: " すべての平面、" から " シーケンス; " " モンタージュ; " と " 高速 " と " ステッチ " 10% (図 2 k) の画像の重なりで囲まれたボックス。クリックして画像をステッチを開始 " を開始 ".
注: これは解析のための画像をスタックが生成されます (図 2 l 図 3 a -e).
3。薬剤評価のシーケンス
- ソフトウェア バージョン 4.7 NIH ImageJ を用いた SN スタック画像の分析を実行します 。
- ImageJ.nih.gov のウェブサイトからの必要な 2 つのプラグインのダウンロード: " グリッド オーバーレイ " プラグイン 15 と " 細胞カウンター " プラグイン 16。前述の両方のプラグインをインストールします 。
- 公平な薬剤の評価のためには、次のようにカウント パラメーターを定義: グリッドのサイズ、130 × 130 μ m; カウント フレーム、50 × 50 μ m と光 disector 高さ 13 ・ #181; m.
- をクリックして画像を開いて " ファイル " → " オープン " (図 4 a) を使用してイメージの尺度を設定します " 分析 " → " 縮尺の設定 " コマンド (図 4 b)。この手順では、定義されたサイズをピクセルから μ m (図 4 c) に変更します
。 注: 分析画像 425 ピクセル対応 100 μ m にします 。
- 選択、" プラグイン " → " グリッド " → " グリッドの種類: 行 " グリッドをランダムに挿入するコマンド。チェック、" ランダム オフセット " ボックス。グリッド (グリッド) 内の 1 つの正方形のサイズ 130 μ x 130 μ m として指定 16,900 μ m 2 ( 図 3 b と 図 4 d と e) を = します 。
- 変更のイメージの種類から 16 ビット RGB カラー (をクリックして " 画像 " → " 型 " → " RGB カラー ") (図 4 階)。バケー募集しています ら で説明されているように、SNpc を検索します。 17、SNpc を取り囲んで、" ペイント ブラシ ツール " (ブラシの幅: 11) ( 図 3 c と 図 4 g -私)。 。
- 元に戻す、" スケールを設定 " をクリックしてコマンド " 分析 " → " 縮尺の設定 " → " スケールを削除するをクリックして " (図 4 j -l) ではなくピクセル単位で計算のパフォーマンスを有効にするにはμ m よりです 。
- は、スクリーン ショット (図 4 m)、イメージ ファイルを保存し、ImageJ (図 4 n) で新しいファイルを開きます。選択 " ポイント " (図 4 o) と 25 (図 4 p) のブラシの幅。すべてのグリッド正方形光 disector (図第 4 四半期) の配置をその連絡先 SN をマークします。完全にローカライズされているすべての光学 disectors またはアウトラインの SN の内で部分的に細胞数の分析を実行します 。
- は、SN の部分を含む 1 つのグリッドを選択します。(図 4 r) で開始する x と y を定義する ImageJ にカーソルがこの正方形の左上隅の座標測定
。 メモ: 座標は、光 disector を用いた位置決め用挿入されます、" 光 disector 位置 " (図 4)、手順 4 で説明した 。
- と題してスプレッドシート テンプレートを使用して光の disector 位置を計算 " 光 disector 位置、" 手順 4 で説明した 。
- をクリックして光 disector (マクロ クリストファー s. 病棟、補足のファイル に記入) を調整する " プラグイン " → " マクロ " → " 編集 " (図 4 t) を開き、" opt_dis_grid.txt " (図 4 u) ファイルを開き、定義のサイズ、" usergrid " 光 disector (図 4 v) の y 次元 x に対応するピクセル単位。50 μ x 50 μ m のサイズを選択すると、212.5 ピクセル (50 x 4.25 ピクセル) として、usergrid の 1 つの側面のサイズを定義します 。
- は、光 disector (図 4 v) の中心を定義する ImageX および ImageY の座標を挿入することによってスタックのイメージで光の disector の位置を決定します。マクロを実行 (" マクロ " → " マクロの実行 ") (図 4 w).
注: グリッド ( 3 d 図 し、図 4 x) スタックのイメージから消滅するでしょう。光の disector も保持されます ( 図 3e と 図 4 x) z 面で下に移動します 。
- 選択 " プラグイン " → " セル カウンター " カウンター プラグイン (図 4 y) を開始します。細胞カウンターを初期化し、(図 4z) のマーカーの種類を選択します。画像をズームイン (をクリックして " + ") 及び 200% の拡大率で細胞数の薬剤の評価を行う 。
- 識別ドーパミン作動性神経細胞の円形または卵形形状とセルのサイズによって ( 図 1 a)。薬剤の規則を使用してセルの数を定量化します
。 注: 光学 disector は 3 次元キューブ ( 図 5 a) なので除外として、左前側面とキューブ (赤) のトップの側面を定義します。したがって、ドン ' t カウント TH + 細胞その赤い線 (左、フロント) またはトップ側と接触。細胞数の結果を権利、準備されたスプレッドシート ファイルに追加 " 細胞数の計算 " (ステップ 5). - SN 画像によると次の細胞数の光 disector を配置する次のグリッドを計算する場合、y の手順を覆うグリッド ( 図 5 b) のサイズと " 光 disector 位置 "スプレッドシートのテンプレート、手順 4 で説明した 。
- 用いた細胞数の推定を実行、" 細胞数の計算 " スプレッドシート (手順 5).
4。Disector 位置を用いた光の計算、" 光 Disector 位置 " スプレッドシート テンプレート
- サイズと上を覆うグリッド SN (アウトライン内に配置するそれぞれの光 disector の位置を計算 図 5 b)使用して、" 光 disector position.xlsx " スプレッドシート ファイル (補足のファイル).
- Μ m あたりのピクセルの変換を挿入で定義されている、" スケールを設定 " の黄色マークの位置に、コマンド、" 光 disector position.xlsx " ファイル ( 図 6a と 補足ファイル).
- オレンジのマークの位置に光 disector の計画されたサイズと (μ m) で 1 つの側面の長さによって定義された、上を覆うグリッドのグリッドのサイズを挿入します
。 注: 結果のオレンジ色のボックスの横にある赤い箱に描かれている 。
- の出発点として決定された SN アウトライン内で四角形のグリッドでスタート (1 グリッドの正方形で始まるにように選択ステップ 3.9、上).
- 挿入の x と y 座標を (この最初の四角形内で光の disector の中心が計算され、結果が青のボックスで描かれているために、これらの値は、x、y 座標を使用して) によってファイルの緑色のボックスに 3.9 のステップで測定されます。Opt_dis_grid.txt マクロ (補足のファイル) を実行します 。
- 最初のグリッド広場 (茶色のボックス) を基準にしてグリッド正方形距離 (単位正方形の数) を挿入することによって x, 連続光 disectors の y 座標を計算します
。 注: + x: グリッドの右側にあります。-x: グリッドの左にあります。y: グリッド正方形; 下に位置しています +-y: グリッドの上にあります。灰色のボックスに結果が表示されます 。
5。使用セル数の推定、" セル数の計算 " スプレッドシート
- 出版した動物 (N) 数式を使用して 1 回 + SN セルの数が推定計算西 ら によって.、1991 年 3、どこ ∑ Q - は TH + ニューロン 1 つの脳のセクションのすべての光 disectors でカウント数の合計として定義されている
。 注: セクション (t) の厚みの測定に関連して光 disector (h) の高さは、方程式に含まれます。エリア サンプリング分数 (asf) は光学 disector (光 disector) フレーム サイズ (x、y のステップ) のグリッドの正方形のサイズ内の領域 (A) の割合として定義されている (光の disector/A x, y ステップ) ( 図 3 b) とセクション サンプリング分数 (ssf) は、連続全体カットの脳の部分の割合として定義:
高品質の定量的見積もりの係数エラー (CE) は、0.10 よりも低くする必要があります。CE Keuker ら によって、数式を使用してを決定します, 2001 10:
- それぞれの SN 内細胞数の薬剤の評価のため。マウス、マウスあたり生成される系列の合計数、光 disector、x、光 disector (、光 disector、μ m 2 で)、x、y グリッド正方形 (x、y のステップ部 y 地区の高さについて示されている情報を挿入、μ m 2 で)、平均 (μ m) で黄色のボックスを使用してセクションの厚さを測定し、" 細胞 count.xlsx の計算 " スプレッドシート ファイル ( 図 6 b と補足ファイル).
- 手順 5 で説明したように同じ動物から各 SN セクションを分析します 。
- 挿入細胞数各光 disector 灰色のボックス内の各行は 1 つの SN」を参照し、使用して、" 細胞 count.xlsx の計算 " スプレッドシート ファイル (補足のファイル).
注: 推定の細胞数と計算される CE 青のボックス ( 図 6 b) で描かれている 。
6。商業利用可能な立体システムを使用して細胞数の推定
- ドーパミン SNpc の推定開始セル数をクリックして " プローブ " → " 光分留ワークフロー " 光分留を開くにはワークフロー ウィンドウ
。 注: 新しいウィンドウがポップアップのかどうか SN の新シリーズはカウントするつもりを決定します 。
- をクリックして回 + SN セクションの新シリーズを開始 " 新しい件名を開始 " ポップアップ ウィンドウで 。
- 光の分留ワークフローの別のステップを通過します。最初のステップで件名を設定します。このため、捜査官を挿入 ' の名前、件名 ' s 名 (SN グループ)、および他の有用な情報。この SN をカウントするセクションの番号を挿入します。カット組織切片の厚さを挿入します。この場合は 4 セクションの間隔を挿入します。手始めにランダムに決められたセクション番号を挿入します 。
- 2 番目の手順では、低倍率 (2 × 対物) と選択に顕微鏡をセット " マグ レンズ X 2 " メニューから 。
- ステップ 3 で、バケー募集しています ら による記述で、SNpc は、マウスの左ボタンで関心領域をトレースします, 2009 17。 。
- は、顕微鏡を手順 4 で高倍率に設定します。このため、100 X に目的を変更し、選択 " 100 倍マグ レンズ " ドロップ ダウン メニューからです 。
- 手順 5 で焦点を当ててセクションの下部と上部にマウントされた厚さを測定します 。
- ステップ 6、50 × 50 μ m としてカウント フレーム サイズを定義; 光学 disector (x, y) のサイズです 。
- ステップ 7 で 130 x 130 μ m として体系的なランダム サンプリング (SRS) グリッドのサイズを設定します 。
- 手順 8 で 3 μ m ガード ゾーンを入力します 。
- 9 の手順で設定を保存します 。
- は、最後に、光 disectors 光の分留ワークフローの手順 10 で SRS グリッド内のそれぞれの TH + ドーパミン作動性セルをカウントします。このため、開始をクリックして、" カウント " ボタン 。
- をクリックして 1 つのセクションを終えた後、" 次のセクションを開始 " 同じ SN シリーズの次の SN のセクションの光の分留ワークフローを開始する] ボタンをクリックします 。
- 1 つの SN シリーズの最後の SN セクションが定量化されてときに、クリックして " 私 ' ve 完了カウントします " 。
- をクリックして、" ビュー結果 " ステレオロジー サンプリングの結果を表示するボタンです 。
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Representative Results
提案手法は, TH + 右 SN 7,363 と 7,987 セル間であったのと、SN、左のドーパミン作動性ニューロンの推定数を使用して、7,446 7,904 細胞間。したがって、ドーパミン作動性ニューロン (± SEM) の平均数は、SN 右と左の SN 7,675 ± 66 7,647 ± 83 細胞だった。各動物のため計算される CE は 0.08 より低かった (範囲: 0.073 0.079) (図 7)。商業的に特殊な立体を用いたこの方式の比較可能性を確認するためには、ステレオロジー セットアップ (図 8) を使用して SN セル番号も定量化しました。カウント パラメーター: グリッドのサイズ、130 × 130 μ m;カウント フレーム、50 × 50 μ m;ガード ゾーン、3 μ m の範囲のセクションを行った 100 x 1.25/開口 BX53 顕微鏡の目的。TH + SN ニューロン 〜 7,067 8,105 セル/SN と 7,164 に 8,015 セル/SN、右と左の両側にそれぞれ平均厚の推定人口。7,535 ± 155 セル右 SN と左側の SN 7,699 ± 128 セル平均ニューロン数を求めた。ガンダーセン CE (m = 1) 各 SN の定量化 (図 7) で ≤0.08 をだった。TH + 細胞数、右または左の SN の 2 つの方法の間で大きな違いを明らかにしなかった一スチューデントの t 検定を使用して統計分析 (± sem; 右: t (5) = 0.9524, P > 0.05; 左: t (5) = 0.2928, P > 0.05) (図 7).
図 1。マウス SN の代表的なイメージは、ドーパミン作動性ニューロンのステンド グラス。
(a)代表マウス SN の概要が表示されます上のパネルに。マークの右側にある右脳幹の上部の小さな穴に注意してください。インセット (ブラック ボックス) の高倍率は、TH + ドーパミン作動性ニューロンを示しています。全体のマウス SN 吻側から尾側をカバー (b) TH ステンド SN のセクションの 1 つの系列が表示されます。各セクションは、120 μ m スケール バーで連続したセクションから区切られます(c) : 上部のパネルは、500 μ m;下のパネル、大きな画像、100 μ m;下のパネル、はめ込み式、50 μ mb、500 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2。イメージング ソフトウェアを使用して解析のための画像の取得。
(a)赤い矢印: 取得ウィンドウを開きます。緑の矢印:「2;」にビニング設定青い矢印: ライブ画像を表示します。(b)ライブ画像 (赤矢印) を示す新しいウィンドウが開きます。(c)赤矢印:「ステージ」メニューを選択緑の矢印:「スライドをスキャン」オプションを選択青い矢印:「スライドをスキャン」オプションをチェック黒い矢印: 左上隅を定義します。(d)黒い矢印: 右下隅を定義します。(e)赤い矢印:「Z シリーズ」メニューを選択緑の矢印:「Z 飛行機シリーズ;」をチェック青い矢印:「ビュー上部のオフセット」セクションの上部の検索を開始します。(f)赤い矢印:; セクションの上部を定義する「ビュー上部の停止」をクリックして緑の矢印: セクションの下部を検索する「ビュー下部オフセット」を開始。(g)赤い矢印: セクションの下部を定義する「ビュー下部の停止」をクリックしますします。(h)赤い矢印: 引き算 3 μ m ガード」上部のオフセット"からゾーンし、結果を「上部のオフセット」スロットに挿入します。(i)赤い矢印: 13 μ m「上部のオフセット」番号からを減算し、結果を「下部オフセット」スロットに挿入緑の矢印: 13 μ m の z 平面の厚さに対応する 14 の手順を定義青い矢印: 連続する画像間の 1 μ m の距離に対応する 1.00 μ m のサイズを定義します。(j)赤い矢印: にファイルを保存するディレクトリを選択青い矢印: 画像の集録を開始する「シーケンス」をクリックします。(k)赤矢印:「処理」をクリックして次パラメーターをチェック: 緑の矢印:"すべて飛行機;"青い矢印:「シーケンス」; 黒い矢印:"モンタージュ"; 灰色の矢印: 紫色の矢印の"ステッチ";: 高速。(l)は、イメージのステッチを開始する黄色の矢印をクリックします。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
図 3。解析のための画像を処理しています。
(a)マウス SN からスタックの例です。(b と c)SN (青緑色のライン、 b) を覆うグリッドのランダム挿入後 SN の (青い線、 c) の 2 番目の手順の通りです。(d)光 disector は、SN のスタック画像に配置されます。(e) SN スタック イメージ内で六つの連続した焦点面は、13 μ m z 平面全体をカバーします。スケール バー: a ~ d、100 μ m;e、50 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4。ImageJ を用いた薬剤評価のシーケンス。
(a)赤い矢印:「ファイル」→ スタック画像を開くには「開く」をクリックします。(b)赤矢印:「分析」→「スケールを設定」をクリックします。(c)赤い矢印: ピクセル単位での「距離」パラメーターを定義「知られている距離」と「長さの単位」(d)赤矢印:「プラグイン」を選択 →「グリッド」(e)赤い矢印:「行」を選択して緑の矢印:「ランダム オフセット」をチェック青い矢印: μ m2のグリッドのサイズを挿入します。(f)赤い矢印: をクリックして、「画像」→「型」→「RGB 色」。(g)赤い矢印:「絵筆ツール」を選択して緑の矢印: 11 として"ブラシの幅"を定義します。(h)赤い矢印: 開始、SNpc (i)赤を取り囲むように矢印を描く丸 SNpc。 (j)赤い矢印: をクリックして"分析"→"設定スケール"と"をクリック削除スケール、"に赤で描かれているをクリックしてスケール(k)を削除します。矢印。Μ m (k、緑色矢印) からピクセル (l、赤い矢印) への変更に注意してください。(m)スクリーン ショット (スクリーン ショットに向かって赤い矢印) と(n)は、ImageJ でスクリーン ショット イメージ ファイルを開きます。(o)赤い矢印:「ポイント」をクリックして(p)赤い矢印: 25 のブラシの幅を挿入します。(q)赤い矢印マーク - 正方形のグリッド、SNpc (r) SN の部分を含む、正方形のグリッドの左上隅に赤い矢印が連絡を示しています。この時点でカーソルを置く、x, y 座標「光 disector 位置」(ステップ 4) の測定および「光 disector position.xlsx」テンプレート (s赤矢印) に挿入されます。(t)赤い矢印:「プラグイン」を選択 →「マクロ」→「編集します。」(u)赤い矢印:"opt_dis_grid.txt"ファイルを選択します。新しいウィンドウには、 (v)が開きます。ピクセル (v, 赤い矢印) と x、y 座標 (v, 緑の矢印) の"usergrid、"のサイズを挿入します。(w)では、"opt_dis_grid.txt"マクロ (赤矢印) を実行します。(x)光 disector は、以前に定義したグリッド広場 (赤矢印) の真ん中に表示されます。(y)赤い矢印:「プラグイン」をクリック →「細胞カウンター」(z)は細胞カウンター (赤矢印) を初期化し、マーカーの種類 (緑の矢印) を選択します。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
図 5。光 disector の配置。
(a)公平なステレオロジー用光 disector の図。光 disector は、3 次元のキューブです。3 つのスケマティック セルが光の disector 内で表示されます。細胞の定量の薬剤の規則は、光 disector の赤ラベル側面に触れる細胞が除外 (赤血球)、渡りて緑のラベルの付いた側面 (緑の細胞) を数えるセルに含まれている細胞中であることを示します。(b)光 disector は、SN と接触するすべてのグリッドに配置されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6。光 disector の位置と細胞数の推定計算。
(a)例計算光学 disector の位置に対して実行されます。(b)細胞数の推定の例。定量化された細胞の数は、薬剤の数量化パラメーターを黄色のボックスに入れたまま、灰色のボックスに挿入されます。推定される細胞の数と CE は、青色のボックスに表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7。細胞カウント パラメーターの比較。
(a) TH + 細胞数の推定値右と左マウス市販ステレオロジー システムを用いた分析から得られたデータを説明クラックテンソルから得られる SN を比較する任意の有意差を示さなかった。右(b)および(c)左 SN の得られたデータの詳細なリスト、動物、実際にカウント、カウント、セクションの数とサンプリング サイト (すなわち、数セル数推定の細胞数で与えられるグリッドの四角形の数を数える) どちらの方法。バー グラフの値は、6 匹のマウスからデータの平均 ± SEM です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 8。市販ステレオロジー システムによる細胞の定量化。
(b)SN のアウトラインが描画され、 (c)光 disectors の位置が自動的に決定されます。(d ・ e)各光 disector、z 平面に沿って中心細胞数を分析します。SN 内六つの連続した焦点平面が表示されます。赤と緑の線は、光 disector に対応します。スケール バー: a ~ d、100 μ m;e、50 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
ステレオロジーは、ティッシュの処理から始まります。SN 組織のシリアルの切削は、解析中にセクションの損失を防ぐために慎重に行う必要があります。さらに、1 つの重要なステップは、ステレオロジーを実行するとき、SN の左から右を区別するために 1 つの半球をマークします。脳幹の上の部分に小さな穴を配置すると、提示された研究で最良の結果が生成されます。また、組織が光分留メソッド要求の使用以来、免疫、抗体、中に他のインキュベーション流体組織の浸透でより一般的に使用される 5-10 μ m ではなく、約 30-40 μ m の厚さのセクションでカットします。免疫組織化学染色保障されなければならない、このような洗剤を使用しています。
免疫は、SN から内側のある腹側被蓋野 (VTA) 内回抗体ラベル SN ニューロンとニューロンを用いたドーパミン作動性ニューロンのドパミン神経細胞染色します。したがって、別の臨界点 sn ステレオロジーを実行するときは、標準的な免疫組織化学的または組織学的染色によって専ら SN ニューロンを視覚化することはできませんのでマウス SN 解剖学の知識です。代わりに、視床下核、ドパミン、VTA などの解剖学的ランドマークの認識、SN17,18,19の全範囲を決定するため重要です。
神経細胞の数の評価は信頼性が高く、再現性のある必要があります。様々 なグループは、市販の立体設定を使用して、番号17,20TH + SN ドーパミンニューロンの wt マウス、別の出版物から取られる数が異なります。バケー募集していますet al.、3-4 ヶ月古い男性と女性 c57bl/6 j wt マウス市販ステレオロジー システムを使用しての設計に基づく解析は、推定 8,716 ± 338 TH + SN ドパミンニューロンを明らかに (範囲: 7,546 9,869)17.対照的に、Smeyneら。0.9% 生理食塩水 i. p.、6,302 ± 262 セルから同じステレオロジー システム20の新しいバージョンを使用して、6,861 の ± 338 セルに至るまでを受信した 9-16 週齢雄の c57bl/6 j マウスの少ない SN TH + 細胞が認められました。しかし、最初の著者はまたバケー募集していますら最後の著者だった。紙、したがって異なる結果の理由としての経験の度合いを除きます。これらの否定のデータより少ない可変性を示す薬剤の数量化の必要性を反映します。数量と使用される数式のテクニックを確認するには、SN セル数の市販ステレオロジー セットアップを使用する定量化と記述されているメソッドを使用して結果の比較を行った。統計解析におけるドーパミンニューロン TH + 右側の数字を比較する場合任意の有意差を示さなかったし、デモはこの方法が適さない wt マウス細胞数量の両方の方法を使用して決定の SN を左、マウスにおける SN ニューロンの薬剤分布の推定。
この方法の主な利点は、通常セルカウント ステレオロジー技術の実装に関連付けられているコストを減少させることです。第二の利点は、記載されているメソッドの SN の画像をスタックが保存されます (でも同時に) いつでも別の研究者によって分析できます。また、買収と蛍光画像の解析は、グレースケール画像 ImageJ で「参照テーブル」と色を指定できるのでこの方法で可能に。しかし、この研究に制限があります。まず、セル数の定量化はより時間がかかる (約 50%) 市販ステレオロジーを用いた定量化より。これは主に 2 つの理由: 1。 スタック SN の画像を撮影する必要があります、2。各 SN 内光 disector 配置の計算と推定される細胞数と CE の計算は、計算テンプレートを使用して手動で実行する必要があります。第二に、少なくとも私たちの研究室で使用可能なシステムと解析のみ実行できますグレースケール画像に ImageJ で処理できなかったカラー画像のファイルサイズが大きいため。二重染色で同時に 2 つの異なる細胞集団を定量化する必要がある場合この問題が発生可能性があります。グレースケール画像で 2 つの異なる染色細胞集団を区別するより難しいかもしれません。したがって、組織標本所見での作業の研究所では、モーターを備えられた段階 (x、y、z 平面) および対応するソフトウェアを利用できるが、管理と品質のスタック画像顕微鏡ソフトウェアと異なりますのパフォーマンス接続されているコンピューター。
限界を克服するために可能な方法があります。我々 が開発した計算テンプレートを使用して、現在手動で行っていたプロセスの一部を自動化するマクロのプログラミングが薬剤アセスメント中にエラーまたは不正確な情報を削減でき作業の速度を加速します。また、ImageJ やその他のイメージング ソフトウェアの継続的な開発とコンピューター処理能力の向上、大きい画像ファイルのサイズが問題を提起しない、近い将来に。したがって、明るいフィールド カラー画像の解析に記載した技術と管理しやすくなります。
説明する手法は、SN TH + 細胞の解析に限定されませんが、他のセルタイプおよび齧歯動物の脳を分析する拡張することができます。このため、関心領域の解剖学的境界を決定する必要がありますとそれぞれの染色を行う必要があります。さらに、この手法はより厚いセクションに適応することができます。このため、スタック画像の取得はより多くのスタック画像が提供される必要があります。たとえば、40 μ m 厚のセクションが必要な場合、実際後にマウント断面の厚みの組織染色は、光 disector の必要な高さを決定する評価されなければなりません。平均組織厚から 6 μ m (上部と下部の 3 μ m ガード ゾーン) を引くし、光の disector の高さと結果を取る。
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Disclosures
C. w. i.、メルツ医薬品、LLC、テバ; の科学的なボードを務めていますイプセン、メルツ医薬品、LLC は、アラガン株式会社からの旅行のための資金を受けた応募作品外メルツ、テバと、アラガン社からスピーカーの謝礼を受けた。J. V. ボストンサイエンティフィック、メドトロニック、および AbbVie のコンサルタントを務めて、提出した応募作品外メドトロニック、ボストンサイエンティフィック、AbbVie、ビアル、アラガン社、および GlobalKinetics から謝礼を受けた。
Acknowledgments
著者は、専門家の技術援助; Keali Röhm、ルイザ Frieß、平家メンツェルに感謝してヘルガ Brünner 動物のケアのためにクリストファー s. 病棟の生成と ImageJ ソフトウェアの光 disector グリッドのプラグインの配布します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paxinos mouse atlas | The Mouse Brain George Paxinos Keith B.J.FranklinCopyright @2001 by Academic Press CD Rom designet & created by Paul Halasz | ||
| brain matrix slicer mouse | Zivic Instruments | BSMAS 001-1 | |
| paraformaldehyde | Merck | 1040051000 | |
| sucrose /D(+) Saccharose | Roth | 4621.1 | |
| isopentane | Roth | 3927.1 | |
| glycerol | Merck | 1040931000 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 32205-1L | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| phosphate buffered saline ingredients: | |||
| sodium chloride | Sigma Aldrich | 31434-1KG-R | |
| potassium dihydrogen phosphate | Merck | 1048731000 | |
| di-sodium hydrogen phosphate dihydrate | Merck | 1065801000 | |
| potassium chloride | Merck | 1049360500 | |
| normal goat serum | Dako | X0907 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A4503-100G | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ml | detergent |
| 3,3-Diaminobenzidine-tetrahydrochlorid/DAB tablets 10mg pH 7.0 | Kem En Tec | 4170 | |
| H2O2/ Hydrogen peroxide 30% | Merck | 1072090250 | |
| avidin/biotin reagent | Thermo Scientific | 32050 | Standard Ultra Sensitive ABC Staining Kit, 1:100 |
| rabbit anti mouse tyrosine hydroxylase antibody | abcam | Ab112 | 1:1000 |
| biotinylated goat-anti-rabbit IgG H+L | vector laboratories | BA-1000 | 1:100 |
| StereoInvestigator version 11.07 | MBF | ||
| BX53 microscope | Olympus | ||
| Visiview | Visitron Systems GmbH | 3.3.0.2 | |
| Axiophot2 | Zeiss | ||
| ImageJ software | NIH | Version 4.7 | |
| Tissue-TEK OCT | Sakura | 4583 | |
| dry ice | |||
| grid overlay plugin | Wayne Rasband | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html | |
| cell counter plugin | Kurt de Vos | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html). | |
| optical disector macro | Christopher Ward | ||
| C57Bl/6N male mice | Charles River, Germany | ||
| SuperFrost Plus coated object slides | Langenbrinck, Germany | ||
| 25G needle Microlance 3 | BD | 300400 | |
| REGLO Analog Infusion pump | Ismatec | ISM 829 | |
| StereoInvestigator system | StereoInvestigator version 11.07 | ||
| BX53 microscope | BX53 microscope | ||
| self-assorted stereology | Visiview | ||
| Axiophot2 | Axiophot2 |
References
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