Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Стереологических Оценка числа дофаминергических нейронов в Substantia мыши, с помощью оптических фракционатор и стандартных микроскопии оборудование

Published: September 1, 2017 doi: 10.3791/56103
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Neurology, University Hospital of Würzburg

Summary

Эта работа представляет пошаговые протокол для объективной стереологических оценки числа дофаминергических нейронов клеток в Substantia мыши, с помощью микроскопии стандартного оборудования (т.е., световой микроскоп, моторизованные объекта таблицы (x, y, z плоскость) и общественное достояние программного обеспечения для анализа цифровых изображений.

Abstract

В болезнь Паркинсона доклинические исследования анализ Нигростриарный тракта, включая количественную оценку дофаминергической нейрон потери в пределах substantia nigra, имеет важное значение. Для оценки числа общей дофаминергической нейрон, объективной stereology с помощью метода оптического фракционатор в настоящее время считается золотым стандартом. Поскольку теория оптических фракционатор метод является сложным и stereology трудно добиться без специализированного оборудования, несколько коммерчески доступных полный stereology систем, которые включают необходимое программное обеспечение существует, чисто для подсчета причин ячейки. Поскольку приобретение специализированного stereology установки не всегда возможно, по многим причинам, этот доклад описывает метод для стереологических оценки дофаминергической нейрональные клетки подсчитывает с использованием стандартных микроскопии оборудования, в том числе световой микроскоп, моторизованные таблицы объектов (x, y, z плоскости) с изображений программное обеспечение и компьютер для анализа. Дается подробное объяснение на как выполнить стереологических количественной оценки, с помощью метода оптического фракционатор, и предоставляются запрограммированные файлы для расчета сметных клеток. Чтобы оценить точность этого метода, было выполнено сравнение данных, полученных из коммерчески доступных stereology аппарат. Числа сопоставимых клеток были найдены с помощью этого протокола и stereology устройство, продемонстрировав тем самым точность этого протокола для объективной stereology.

Introduction

Количественная оценка количества нейрональных клеток играет важнейшую роль в доклинических болезнь Паркинсона исследования для определения уровня нейродегенеративные в1,nigra substantia (SN)2. Объективной оценки стереологических клеток количество интерес в регионе считается золотым стандартом3,4,5.

До появления объективной stereology количество нейронов в разделах оценивалась путем манипулирования профили подсчет клеток исправить для переменной вероятностей, что нейроны вступают в прицел в секции. Одним из наиболее часто используемых методов была коррекция количественных клеток характеризуется Аберкромби6. Этот метод попытался принять во внимание, что клетки могут быть количественно более одного раза, если фрагменты же клетки находятся в прилегающих шлифов. Поэтому Аберкромби и другие авторы генерируется уравнений, которые требуют предположений о форме, размер и ориентацию в подсчет клеток7,8. Однако эти предположения были обычно не понял и поэтому привело к систематической ошибки и расхождения из числа фактических ячейки (то есть, смещения). Кроме того смещение не может сводиться на дополнительные выборки3.

Для стереологических оценки числа клеток с помощью оптических фракционатор математические принципы применяются непосредственно оценить число клеток непосредственно в определенных, 3-мерного объема. Преимуществом этого метода является, что она не предполагает предположения о форму, размер и ориентацию подсчитываемое клеток. Таким образом число оценкам клеток ближе к подлинным ценностям и ближе, как размер выборки увеличивается (т.е. объективное)3. Потому что многие правила должны соблюдаться при использовании stereology держать метод объективной, готовые к использованию коммерческих stereology системы были разработаны (для обзора, см Schmitz и Hof, 20054). Специализированных stereology систем реализации дизайн-методы на основе стереологических с априори определены зондов и схем отбора проб для стереологических оценок, которые приводят к независимости от формы, размера, пространственное распределение и ориентации клетки, чтобы быть проанализированы4,9. Однако коммерчески доступных stereology системы являются дорогостоящими; Это может ограничить осуществление в новых исследований.

Целью данного исследования было разработать полезная методика на основе дизайна стереологических оценки дофаминергической клеток мыши SN, используя стандартные микроскопии оборудования (то есть, свет и метод оптического фракционатор Микроскоп, стандартные Микроскоп программного обеспечения и моторизованных x, y, z этап). Для этого представлено пошаговое руководство по как обрабатывать ткани мозга мыши и как оценить SN числа клеток с помощью дизайн на основе объективной stereology. Кроме того предоставляются шаблоны для расчета числа оценкам клеток и коэффициентов ошибки (CE).

Метод, описанный здесь не ограничивается анализ SN, но могут быть адаптированы для использования в других анатомически определенных регионах мозга мыши или крысы. К примеру объективной stereology был использован для оценки числа нейрональных клеток в гиппокампе10 и Локус пятно11. Кроме того типы клеток помимо нейронов, например астроциты12 и микроглии13, можно оценить как хорошо. Таким образом этот метод может быть полезным для ученых, которые намерены реализовать объективной stereology в их исследований, но не готовы тратить много денег на покупку stereology системы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

были соблюдены все применимые международные, национальные и/или институциональных руководящих принципов для ухода и использования животных. Протокол был одобрен местными властями на Regierung фон Унтерфранкен, Вюрцбург, Германия.

1. обработка ткани и иммуногистохимии

  1. Euthanize мышей с CO 2, или любой другой утвердил метод.
  2. Perfuse шесть 12-недельных C56Bl/6Н мышей-самцов transcardially с 10 мл 0,1 М фосфат амортизированное saline (PBS) с помощью иглы 25-G и инфузионный насос, после чего 70 мл 4% параформальдегида (PFA) в PBS 0,1 М.
    ОСТОРОЖНОСТЬЮ: PFA аллергенные, токсичными и канцерогенными.
  3. Вскрыть мозга мыши в корональных плоскости с матрицей срез мозга в регионе +0.74 мм от Bregma (рис. 25, Paxinos и Франклин мыши мозга Атлас 14).
  4. Поместить в спинной части мозга, SN, в том числе в 4% ПФА в 0,1 М PBS для 1 d на 4 ° C для погружения фиксации.
  5. Обмен PFA для 30% сахарозы/0,1 моль PBS решения для крио защиты и инкубировать еще 2 d на 4 ° C.
  6. Поставить спинной частью мозга в cryomold заполнены с температурой оптимального раскроя (OCT) соединения и медленно замораживания тканей в жидкий охлажденный сухим льдом изопентана.
    ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Сухой лед очень холодно (-78 ° C); использование средств индивидуальной защиты (СИЗ), включая перчатки, работая с сухим льдом. Сухой лед испаряется в CO 2; Таким образом, работа под зонт.
  7. Серийно сократить 30 мкм крио секции в корональных плоскости и собирать разделы, начиная 2.46 мм от Bregma (рис. 51, Paxinos и Франклин мыши мозга Атлас 14) и заканчивая 4.04 мм от Bregma (рис. 64, Paxinos и Франклин мыши мозга Атлас 14).
  8. Хранить четыре серии в трубах, которые заполнены с криопротектора (30% глицерина, этоксиэтанол 30% и 40% PBS) при-20 ° C. В процессе резания, Марк правого полушария, проколов небольшое отверстие в верхней области мозга.
  9. Для иммуногистохимическое окрашивание, выберите один из ряда секций на мышь. Preincubate свободно плавающего разделы за 1 час в 10% нормальной козьего сыворотки (NGS)/2% BSA/0.5% моющее средство в 0,1 моль PBS на шейкер. Проинкубируйте разделы с кролик борьбе мыши тирозин гидроксилазы (TH; 1:1,000 разрежения) антитела разводят в 2% NGS/2% BSA/0.5% моющее средство в 0,1 моль PBS на ночь на 4 ° C.
  10. Применить средней антител против кролик Igs (разбавления 1: 100) за 2 ч при комнатной температуре, затем авидин/биотина реагента (разбавления 1: 100). Инкубировать и пятна с 3,3-Диаминобензидин tetrahydrochloride (DAB) и H 2 O 2. Смонтировать разделы после окрашивания их на слайдах с покрытием объект.
    Примечание: TH + дофаминергические нейроны SN показаны на рисунке 1a. Путем пятнать одной серии в среднем 13 разделов SN, простирающейся от ростральной к хвостовой части SN pars compacta (SNpc) и сетчатая, запятнаны на животное ( рис. 1b). Разделов, разделенных 120 мкм (1/4 серии) ( рис. 1 c).
    ОСТОРОЖНОСТЬЮ: DAB является подозреваемых канцерогенов. Он является токсичным и ингаляции. Использование средств индивидуальной защиты при работе с DAB.

2. Получение изображений

  1. immunohistochemically й захватить окрашенных SN секции цифровой подписью с использованием изображений программное обеспечение, которое сочетается с микроскопом. Отдельно анализировать каждый раздел одной серии.
  2. Параметр сканирования слайдов изображений программного обеспечения. Сохранить в формате TIFF для высокого качества изображения (Рисунок 2).
    Примечание: Разрешение изображения – 312 пикселей на см.
  3. Пресс " приобрести " для открытия окна приобретение (рис. 2a).
  4. Присвоено биннинга " 2 " для изображений в градациях серого.
    Примечание: Приобретение изображений в градациях серого вместо цветные картинки уменьшает размер файла изображения окончательного стека (Рисунок 2a).
  5. Нажмите на " шоу Live " в окне приобретения, чтобы открыть новое окно, показывающее live-образ секции (рис. 2 и b).
  6. Нажмите на " стадии " в окне приобретения. Выбрать " сканирования слайдов " в выпадающем меню и установите флажок (рис. 2 c).
    Примечание: Это позволяет приобретение и выравнивание сильно увеличенное SN изображений (630 X увеличение) в x, y самолет, а также приобретение стека изображений с расстоянием между последовательных изображений 1 мкм в плоскости z, охватывающих ряд всего 13 µ м.
  7. выберите 2,5 X цель для поиска SN.
  8. Изменить цель 63 х.
  9. Определяют верхний левый угол (TopLeft) (рис. 2 c) и правом нижнем углу (LowRight) (Рисунок 2d) раздел, нажав на " компл. "
  10. Нажмите на " Z-серии " и проверить " плоскости Z серии " поле (рис. 2е).
  11. Определение фактической навесные толщина секций на три произвольно выбранных подсчета сайтов каждой секции с помощью визуализации программного обеспечения. Для этого, нажмите на " вид сверху смещение " для определения верхней секции (рис. 2е) и затем нажмите на " остановить просмотр Top " (Рисунок 2f). После этого, нажмите на " вид снизу смещение " (Рисунок 2f) и затем нажмите на " остановить просмотр нижней " (рис. 2г). Запишите толщина секции.
  12. Вычесть 3 мкм (охранник зоны) от верхней смещение и введите результат в верхний слот смещения (рис. 2 h). Вычесть 13 мкм (высота оптической disector) из верхнего смещения числа и введите результат в нижний слот смещения (рис. 2i). Выберите следующие параметры: шаги, 14; размер, 1.00 (Рисунок 2i).
    Примечание: Это соответствует толщине в плоскости z 13 мкм, с расстоянием между последовательных изображений 1-мкм.
  13. Выберите папку для сохранения файла (Рисунок 2j).
  14. Нажмите на " последовательность " чтобы начать приобретение (Рисунок 2j).
  15. Нажмите на " обработки " и выберите следующие параметры: " все самолеты, " от " последовательностей; " " монтаж; " и " быстро " и " колющие " коробки, с напуском изображения на 10% (рис. 2 k). Начинают стежка изображения, нажав на " начать ".
    Примечание: Это будет генерировать стека изображений для анализа (рис. 2 l, Рисунок 3a -e).

3. Последовательность стереологических оценки

  1. выполнять анализ SN стека изображений с помощью NIH ImageJ программного обеспечения версии 4.7.
  2. Скачать два плагинов, которые необходимы на веб-сайте ImageJ.nih.gov: " наложение сетки " плагин 15 и " счетчик соматических клеток " плагин 16. Установите оба плагины, как описано.
  3. Для объективной оценки стереологических, определяют подсчета параметры следующим образом: размер сетки, 130 x 130 мкм; учет кадров, 50 x 50 мкм; и оптических disector высота, 13 & #181; м.
  4. Открыть изображение, нажав на " файл " → " открытые " (рис. 4a) Задать масштаб изображения с помощью " анализ " → " задайте шкала " команды (рис. 4В). Для этого шага, изменить определенный размер пикселей до мкм (рис. 4 c).
    Примечание: Для анализируемого изображений, 425 пикселей соответствует 100 µm.
  5. Выберите " плагины " → " сетка " → " тип сетки: линии " команды случайно включить сетку. Проверить " случайное смещение " поле. Определить размер одного квадрата в сетке (сетка квадрат) как 130 мкм x 130 мкм = 16,900 мкм 2 ( Рисунок 3b и Рисунок 4 d и e).
  6. Изменить тип от изображения 16-бит RGB цвет (нажмите на " изображение " → " типа " → " цвет RGB ") (Рисунок 4f). Найдите SNpc, как описано в Baquet и др. 17. окружить SNpc с " инструмент кисть " (кисть ширина: 11) ( рис. 3 c и Рисунок 4 g -я).
  7. Отменить " задайте шкала " команды, нажав " анализ " → " задайте шкала " → " нажмите, чтобы удалить масштабах " (Рисунок 4j -l) для обеспечения производительности вычислений в пикселях скорее чем мкм.
  8. Сделать скриншот (рис. 4 m), сохраните файл изображения и откройте новый файл с ImageJ (Рисунок 4n). Выберите " точки " (Рисунок 4o) и кисти шириной 25 (Рисунок 4 p). Марк каждого квадрата сетки, что контакты SN для размещения оптического disector (Рисунок 4q). Выполнить анализ количества клеток всех оптических disectors, которые локализуются полностью или частично в рамках намеченных SN.
  9. Выбрать одного квадрата сетки, которая включает в себя части SN. Мера в левом верхнем углу этой площади с курсором в ImageJ определить x и y координаты, чтобы начать с (Рисунок 4r).
    Примечание: Координаты будут вставлены для позиционирования с помощью оптических disector " оптических disector позиции " (Рисунок 4s), как описано в шаге 4.
  10. Расчета оптических disector позицию, используя шаблон электронной таблицы под названием, " оптических disector позиция, " как описано в шаге 4.
  11. Калибровки оптических disector (автор Кристофер Уорд S., Дополнительный файл макроса), нажав на " плагины " → " макросы " → " редактировать " (Рисунок 4Т), откройте " opt_dis_ Grid.txt " файл (Рисунок 4u) и определить размер " usergrid " в точках, которые соответствует x, y измерение оптической disector (рис. 4В). Выберите размер 50 мкм, мкм x 50, так что размер одной стороны usergrid определяется как 212,5 пикселей (50 x 4,25 пикселей).
  12. Определить положение оптического disector в изображении стека, вставив ImageX и ImageY координаты, определяющие центр оптической disector (рис. 4В). Запуск макроса (" макросы " → " выполнить макрос ") (Рисунок 4w).
    Примечание: Сетки исчезнет из стека изображений ( 3d рисунок и Рисунок 4 x). Оптические disector будут сохраняться при переходе в плоскости z ( Рисунок 3e и Рисунок 4 x).
  13. Выберите " плагины " → " счетчик соматических клеток " чтобы начать плагин счетчик соматических клеток (Рисунок 4y). Инициализировать счетчик клеток и выберите тип маркера (Рисунок 4z). Увеличить изображение (нажмите на " + ") и выполнять стереологических оценки числа клеток при увеличении в 200%.
  14. Идентификация дофаминергических нейронов perikarya их округлые или овальные формы и ячейки размером ( рис. 1a). Подсчитать количество клеток, используя правила стереологических.
    Примечание: Поскольку оптический disector является 3-мерный куб ( Рисунок 5a), определите исключения сторонами как спереди, слева и верхней стороны куб (красный). Таким образом, Дон ' t фото й + клеток которые приходят в контакт с красной линии (левый и фронт) или верхней стороны. Добавьте результаты клеток в подготовленные таблицы файл под названием " расчет клеток " (шаг 5).
  15. Согласно СН изображения, вычисления следующего квадрата сетки для размещения оптического disector для следующего количества клеток, используя x, y шаги размер покрывающей сетки ( Рисунок 5b) и " оптический disector позиция " шаблон электронной таблицы, как описано в шаге 4.
  16. Выполнить оценку ячейки номер с помощью " расчет клеток " таблицы (шаг 5).

4. Расчет оптических Disector позицию с помощью " оптических Disector позиция " шаблон электронной таблицы

  1. вычислить размер и положение каждого оптических disector должен быть помещен в сетке вышележащих внутри контура SN ( Рисунок 5b) с помощью " оптических disector position.xlsx " файл электронной таблицы (Дополнительный файл).
  2. Вставить конверсия пикселей на мкм, как определено " задайте шкала " команды, в желтых отмеченные позиции " оптических disector position.xlsx " файл ( Рисунок 6a и дополнительных файлов ).
  3. Вставки в оранжевый отмеченные позиции запланированный размер оптических disector и размер квадрата сетки вышележащих сетки, определяется длина одной стороны (в мкм),.
    Примечание: Результаты изображены в Красные флажки Оранжевые прямоугольники.
  4. Начало с площади сетки в набросках SN, который был определен в качестве отправной точки (одного квадрата сетки был выбран с самого начала, как шаг 3.9, выше).
  5. Вставки, координаты x и y, измеряемый в шаге 3.9, в зеленые поля файла (используя эти значения, x, y координаты вычисляются центр оптической disector в течение этого первого квадрата, и результаты изображены в синие). Макрос opt_dis_grid.txt (Дополнительный файл).
  6. Вычисления x, y координаты подряд оптические disectors, вставив квадрата сетки расстояние (измеряется в количество квадратов) относительно первого квадрата сетки (коричневый коробки).
    Примечание: + x: ГРИД Сквер расположен справа; -x: ГРИД Сквер расположен слева; + y: ГРИД Сквер расположен на дно; -y: ГРИД Сквер расположен в верхней. Результаты отображаются в полях серый.

5. Оценки с использованием номер ячейки " расчет число ячеек " таблицы

  1. Calculate, предполагаемое количество ячеек й + SN на животных (N) с помощью формулы опубликованных на западе и др., 1991 3, где ∑ Q – определяется как общее количество й + нейронов, учитываются в всех оптических disectors секции одного мозга.
    Примечание: Высота оптической disector (h) по отношению к измеренной толщины секции (t) входит в уравнение. Площадь выборочная доля (asf) определяется как доля области (A) размер кадра оптических disector (оптический disector) в пределах площади размер сетки (x, y шаг) (оптический disector/A x, y шаг) ( рис. 3b) и разделе выборочная доля (ФСО) определяется как доля участков всей серийно отрезока мозга:
    Equation 1
    для обеспечения высокого качества количественных оценок, коэффициент Ошибка (CE) должны быть ниже 0,10. Определить CE, с помощью формулы, Keuker и др., 2001 10:
    Equation 2
  2. для стереологических оценки количества клеток в пределах SN каждого мышь, вставить указанной информации относительно общее количество созданных серии на мышь, высота оптической disector, x, y области оптической disector (оптические disector, в 2 мкм), x, y площадь квадрата сетки (x, y шаг в мкм 2), и среднее значение измеряется толщина раздела (в мкм) в полях желтого с использованием " расчет count.xlsx клеток " файл электронной таблицы ( Рисунок 6b и дополнительный файл ).
  3. Анализа каждого раздела SN от же животное, как описано в шаге 5.
  4. Вставки ячейки подсчитывает для каждого оптических disector в серые коробки, каждая строка, ссылаясь на одной секции СН, используя " расчет count.xlsx клеток " файл электронной таблицы (Дополнительный файл).
    Примечание: Номер оценкам ячейки и рассчитанные CE изображены в синие ( Рисунок 6b).

6. Оценка количества клеток с помощью коммерчески доступные системы Stereology

  1. начала оценки дофаминергической SNpc мобильный номер, нажав на " зонды " → " оптических фракционатор рабочий процесс " чтобы открыть оптический фракционатор Окно процесса.
    Примечание: Новое окно будет всплывающее окно, чтобы определить, если новая серия СН будет быть подсчитанным.
  2. Начать новую серию й + SN разделов, нажав " начать новую тему " во всплывающем окне.
  3. Пройти через различные этапы процесса оптического фракционатор. Настройте тему на первом шаге. Для этого вставьте следователь ' s имя, тема ' s имя (SN группы) и другую полезную информацию. Вставка числа секций для подсчета для этого SN. Вставьте толщина среза ткани секций. Вставка раздела интервал, который в данном случае это четыре. Вставить номер случайным образом определяется в разделе начать с.
  4. На втором шаге, задайте микроскоп с низким увеличение (2 X цель) и выберите " 2 X Mag объектива " в меню.
  5. На шаге 3, след региона интерес с левой кнопкой мыши, которая является SNpc, как описано в Baquet и др., 2009 17.
  6. Набор микроскоп высокого увеличения в шаге 4. Для этого измените цель до 100 X и выберите " 100 X Mag объектив " из ниспадающего меню.
  7. Измерить толщину монтируется на шаге 5, сосредоточив внимание на верхней и нижней части секции.
  8. На шаге 6, определить размер кадра подсчет как 50 x 50 мкм; это размер оптических disector (x, y).
  9. На шаге 7, установите размер сетки систематического случайной выборки (SRS) как 130 x 130 мкм.
  10. Войти в зону гвардии 3 мкм в шаге 8.
  11. Сохранить параметры на шаге 9.
  12. Наконец, граф й + дофаминергических клетках в каждом из оптических disectors в сетке SRS в шаге 10 оптических фракционатор рабочего процесса. Для этого, начать, нажав на " подсчет " кнопку.
  13. После окончания одной секции, щелкните на " начать следующий раздел " кнопку, чтобы начать процесс оптического фракционатор в следующем разделе SN этой же серии СН.
  14. Когда последний раздел SN одной серии СН были количественно, нажмите на " я ' ve закончено подсчета. "
  15. Нажмите на " посмотреть результаты " кнопку, чтобы отобразить результаты выборки stereology.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

С помощью метода представленных, предполагаемое количество й + дофаминергических нейронов в правом SN варьировались между 7,363 и 7987 клетки и в левый SN, между 7,446 и 7,904 клетки. Таким образом среднее количество дофаминергических нейронов (± SEM) был 7,647 ± 83 клетки для право SN и 7675 ± 66 левый SN. Вычисляемые CE для каждого животного был ниже, чем 0.08 (диапазон: 0,073-0,079) (Рисунок 7). Для выяснения сопоставимости этого метода с коммерчески доступных и специализированными stereology систем, SN числа клеток были также количественно с использованием stereology установки (рис. 8). Подсчитывая параметры были: размер сетки, 130 x 130 мкм; Подсчет кадр, 50 x 50 мкм; зоны охраны, 3 µm. разделы были проанализированы с 100 x / 1,25 числовая апертура цель на микроскопе BX53. Численность населения й + SN нейронов, с использованием средней секции толщина колеблется от 7,067 до 8105 клеток/SN и 7,164 для 8,015 клеток/SN на правой и левой сторон, соответственно. Среднее число нейронов была рассчитана как 7,535 ± 155 ячейки для право SN и 7699 ± 128 левый SN. CE Гундерсен (m = 1) был ≤0.08 в каждом SN количественно (рис. 7). Статистический анализ с использованием парных студент t теста не выявили каких-либо существенные различия между й + клеток двух методов в правом или левом SN (означает ± SEM; право: t (5) = 0.9524, P > 0,05; слева: t (5) = 0.2928, P > 0,05) (рис. 7 ).

Figure 1
Рисунок 1. Представитель изображения мыши SN витражи для дофаминергических нейронов.
(a) обзор SN мыши представитель показан в верхней панели. Обратите внимание на небольшое отверстие в верхней части правой мозга, отмечающий с правой стороны. Увеличение врезные (черный ящик) изображает й + дофаминергических нейронов. (b) одна серия TH-окрашенных SN разделов показано, охватывающих весь мыши SN с ростральной каудально. (c) каждая секция отделена от секции подряд 120 мкм. Шкала бары:, верхняя панель, 500 мкм; нижней панели, большое изображение, 100 мкм; Нижняя панель, врезные, 50 мкм; b, 500 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2. Приобретение изображений для стереологических анализа с использованием изображений программного обеспечения.
(a) красная стрелка: открыть окно приобретения; Зеленая стрелка: установить биннинга «2;» синяя стрелка: Показать «живой» образ. (b) откроет новое окно, показывающее live-образ (красная стрелка). Красная стрелка (c) : выберите в меню «Этап»; Зеленая стрелка: выберите параметр «Сканировать слайд»; Синяя стрелка: флажок «Сканировать слайд»; черная стрелка: определить верхний левый угол. (d) черная стрелка: определить правом нижнем углу. Красная стрелка (e) : выберите в меню «Z-серии»; Зеленая стрелка: проверить серии «Z-плоскости;» синяя стрелка: запустить «просмотр Top смещение» для поиска в верхней части раздела. Красная стрелка (f) : нажмите на «Остановить просмотр Top» для определения верхней секции; Зеленая стрелка: старт «Вид снизу смещение» для поиска в нижней части раздела. Красная стрелка (g) : нажмите на «Stop вид снизу» для определения нижней секции. Красная стрелка (h) : вычитать гвардии 3-мкм зоны от «Смещение сверху» и вставить результат в слот «Смещение сверху». (i) красная стрелка: вычесть 13 мкм из числа «Смещение сверху» и вставить результат в слот «Смещение снизу»; Зеленая стрелка: определить 14 шагов, которые соответствует толщине плоскости z 13 мкм; Синяя стрелка: определить размер 1,00 мкм, что соответствует 1-мкм расстояние между последовательных изображений. Красная стрелка (j) : выберите папку для сохранения файла; Синяя стрелка: нажмите на «Последовательности», чтобы начать приобретение изображений. Красная стрелка (k) : нажмите на «Обработки»; проверить следующие параметры: зеленая стрелка: «Все самолеты;» синяя стрелка: «Последовательность»; черная стрелка: «Монтаж»; серая стрелка: «Шить»; фиолетовые стрелки: быстро. (l) нажмите на желтую стрелку, чтобы начать шить изображения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Figure 3
На рисунке 3. Обработка изображений для стереологических анализа.
(a) пример стека изображения взяты из мыши SN. (b и c) После вставки рандомизированных сетки вышележащих SN (бирюзовый линий, b) SN изложена на втором этапе (синяя линия, c). (d) оптический disector помещается в стек изображений SN. (e) шесть подряд фокуса плоскостей в изображении стека SN покрывают 13 мкм всего в плоскости z. Масштаб бары: a-d, 100 мкм; e, 50 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4. Последовательность стереологических оценки с использованием ImageJ.
(a) красная стрелка: нажмите на «Файл» → «Открыть», чтобы открыть образ стека. (b) красная стрелка: нажмите на «Анализировать» → «Задать шкалу». (c) красные стрелки: определить параметры для «Расстояние в пикселях,» «Известный расстояние» и «Единица длины.» (d) красная стрелка: выберите «Плагины» → «Сетка». (e) красная стрелка: выберите «Линий;» зеленая стрелка: проверить «Случайные смещение;» синяя стрелка: вставьте размер сетки в мкм2. Красная стрелка (f) : нажмите на «Образ» → «Тип» → «RGB цвета.» Красная стрелка (g) : выберите «Инструмент «кисть»;» зеленая стрелка: определить ширину «кисть» 11. Красная стрелка (h) : начало окружить SNpc. (i) красные стрелки изображают обведенные SNpc. (j) красная стрелка: нажмите на «Анализировать» → «Задайте шкала» и удалите масштаб (k) , нажав на «Щелкните для удаления масштаба, «изображен красный стрелка. Обратите внимание на изменения от мкм (k, зеленая стрелка) пикселей (l, красная стрелка). (m) скриншот (красная стрелка указывает на скриншоте) и (n) открыть файл изображения скриншот с ImageJ. Красная стрелка (o) : нажмите на «Точку». Красная стрелка (p) : вставить кисти шириной 25. (q) красная стрелка изображает заметное квадратов сетки, контактирующих с SNpc. (r) красная стрелка указывает на левом верхнем углу квадрата сетки, которая включает в себя часть SN. Поставив курсор на данный момент, x, y координаты для «оптических disector позиция» (шаг 4) измеряются и вставлены в шаблон «оптических disector position.xlsx» (s, красная стрелка). Красная стрелка (t) : выберите «Плагины» →«Макросы» → «Edit». Красная стрелка (u) : выберите файл «opt_dis_grid.txt». (V)будет открыто новое окно. Размер «usergrid», вставьте в пикселах (v, красная стрелка) и x, y координаты (v, зеленая стрелка). (w) макрос «opt_dis_grid.txt» (красная стрелка). (x) оптический disector появится в середине ранее определенных квадрата сетки (красная стрелка). Красная стрелка (y) : нажмите на «Плагины» → «Счетчик соматических клеток.» (z) инициализировать счетчик соматических клеток (красная стрелка) и выберите тип маркера (зеленая стрелка). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Figure 5
Рисунок 5. Размещение оптических disector.
(a) Иллюстрация оптические disector, используемых для объективной stereology. Оптические disector является 3-мерный куб. Три схемы клетки являются видимыми в оптических disector. Стереологических правила для количественной оценки клетки показывают, что клетки, касаясь красной меткой стороны оптических disector исключены (эритроцитов), при этом клетки, которые связаться с зеленой меткой Сторон включены в ячейке подсчета (зеленые клетки). (b) оптический disector помещается в каждого квадрата сетки, которая соприкасается с SN. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6. Расчет оптических disector позиции и оценки количества клеток.
(a) пример расчета выполняется для позиционирования оптических disector. (b) пример оценки числа общей ячейки. Число количественных ячейки вставляются в серые коробки, в то время как параметры стереологических квантификации вставляются в полях желтого. В синие отображаются номер оценкам ячейки и CE. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 7
Рисунок 7. Сравнение клеток подсчета параметр.
(a) сравнения предполагаемое й + клеток количество правой и левой мыши SN, полученные из описанных стереологических метода с данные, полученные от анализа с использованием коммерчески доступных stereology системы не показывают каких-либо существенных различий. Подробный перечень полученных данных справа (b) и левой (c) SN дается с оценкам мобильный номер на животное, количество клеток, фактически подсчитано, количество секций рассчитывал и число участков отбора проб (т.е. подсчитать количество квадратов сетки) для обоих методов. Значения в бар графики являются среднее ± SEM данных из 6 мышей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 8
Рисунок 8. Количественная оценка клеток с системой коммерчески доступных stereology.
(a-b) Рисуется контур SN и (c) позиции оптические disectors, автоматически определяется. (d-e) Каждый оптических disector анализируется для количества клеток, сосредоточив внимание в плоскости z. Показаны шесть последовательных фокуса самолетов в пределах СН. Красные и зеленые линии соответствуют оптических disector. Масштаб бары: a-d, 100 мкм; e, 50 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Дополнительный файл 1. opt_dis_grid.txt Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 2. Оптические disector position.xlsx пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительного файла 3. Вычисление ячейки count.xlsx пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Stereology начинается с обработки ткани. Серийный резки SN ткани должны быть выполнены тщательно во избежание потери разделов во время стереологических анализа. Кроме того одним важным шагом является Марк одного полушария для того, чтобы отличить право от левый SN при выполнении stereology. Размещение небольшое отверстие в верхней части ствола мозга сгенерирована представленных исследовании наилучшие результаты. Кроме того начиная с работы с оптической фракционатор метод требования, которые ткани вырезать в толстые разделов около 30-40 мкм, а не 5-10 мкм, чаще используется в иммуногистохимии, антител и другие проникновения жидкости ткани инкубации во время Иммуногистохимическое окрашивание должна обеспечиваться, например, с помощью моющего средства.

Иммуногистохимическое окрашивание дофаминергических нейронов, используя й антитела этикетки SN нейронов, а также нейронов в брюшной области вентральная (VTA), который расположен медиально от SN, и нейроны, в поле retrorubral. Таким образом другой критической точке при выполнении stereology SN является знание мыши SN анатомии, так как SN нейроны не визуализированное исключительно стандартные иммуногистохимических или гистологических пятнать. Вместо этого признание анатомические ориентиры, как subthalamic ядра, retrorubral поля и VTA, важно определить всю степень SN17,18,19.

Оценки числа нейронов должна быть надежной и воспроизводимость. Хотя различные группы использовать коммерчески доступных stereology установок, количество й + дофаминергической SN нейронов в wt мышей, взятые из различных публикаций, различаются в число17,20. В Baquet et al., Дизайн-анализа на основе стереологических в 3 - 4-месячного мужские и женские C57BL/6J wt мышей с использованием системы коммерчески доступных stereology показали примерно 8,716 ± 338 тыс + дофаминергической SN нейронов (диапазон: 7,546-9,869)17 . В противоположность этому Smeyne и др. Найдено меньше й + SN клеток в 9 - для 16-недельных самцов мышей C57BL/6J, которые получил 0,9% солевой и.п., от 6,302 ± 262 клетки до 6,861 ± 338 клетки, с помощью более новой версии же системы stereology20. Однако первый автор был также последний автор в Baquet и др. Бумага, таким образом исключая различной степени опыт как причина для получения различных результатов. Эти противоречивые данные отражают необходимость стереологических количественное определение метода, который показывает меньше изменчивости. Чтобы проверить метод количественной оценки и формула, было выполнено сравнение результатов SN ячейку число с использованием метода описаны с количественной оценки, с помощью установки коммерчески доступных stereology. Статистический анализ не показали каких-либо значительные различия при сравнении чисел й + дофаминергических нейронов в правом и оставил SN мышей wt определяется с использованием обоих методов количественной оценки клеток, продемонстрировав тем самым, что этот метод является возможным для стереологических Оценка SN нейронов у мышей.

Основным преимуществом метода описаны является, что он снижает затраты, которые обычно связаны с осуществлением stereology методов для подсчета клеток. Второе преимущество состоит в том, что для метода описано, стек изображений SN сохраняются и могут быть проанализированы в любое время (даже в то же время), еще один следователь. Кроме того на приобретение и анализ изображений флуоресценции возможны с помощью этого метода, потому что изображения в градациях серого могут быть цветными с «Таблицы подстановки» в ImageJ. Однако существуют ограничения в этом исследовании. Во-первых количественная оценка количества клеток занимает больше времени (около 50%) чем количественная оценка с системой коммерчески доступных stereology. Это главным образом по двум причинам: 1. стек изображений SN должны быть приняты и 2. расчет оптических disector размещения в пределах каждой SN и расчет количества оценкам клеток и CE должна выполняться вручную с помощью шаблонов вычислений. Во-вторых по крайней мере с системой доступных в нашей лаборатории, анализ может выполняться только на изображения в градациях серого из-за большой размер файлов цветных изображений, которые не могут быть обработаны ImageJ. Это может создать проблему, если есть необходимость количественной оценки двух различных клеточных популяций в то же время в двойной пятно. Это может быть более трудно отличить два по-разному окрашенных клеточных популяций в изображения в оттенках серого. Таким образом хотя во многих лабораториях, работающих с гистологическим образцы доступны моторизованного столика (x, y, z плоскости) и соответствующее программное обеспечение, управление и качество стека изображений будет зависеть от Микроскоп программного обеспечения и производительность прилагаемый компьютер.

Есть возможные пути преодоления ограничений. Используя шаблоны вычислений, которую мы разработали, программирование макросов для автоматизации некоторых процессов, выполняемых в настоящее время вручную может уменьшить ошибки или неточности в ходе стереологических оценки и ускорить скорость работы. Кроме того с поступательное развитие ImageJ и других изображений программное обеспечение, а также увеличения вычислительной мощности компьютера, большой размер файла изображения не должно быть проблемой в ближайшем будущем. Таким образом анализ светлые области изображения будет управляемым с описанной техники.

Метод, описанный не ограничивается анализ й + SN клетки, но может быть расширена для анализа других типов клеток и регионах мозга грызунов. Для этого анатомические границы области интереса должны быть определены, и должны быть выполнены соответствующие пятнать. Кроме того этот метод может быть адаптирована к толще секций. Для этого приобретение стека изображений должны быть адаптированы для обеспечения более стека изображений. Например 40 мкм толстые секции, если они необходимы фактические установлены толщина секции после окрашивания тканей должны оцениваться для определения необходимой высоты оптических disector. Вычесть 6 мкм (зона гвардии 3 мкм в верхней и нижней) из ткани средней толщины и принять результат как высота оптических disector.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

C. W. I. служил в научных советах Мерц Фармацевтика, ООО и Тева; получил финансирование для путешествия из Ipsen, Мерц Фармацевтика, LLC и Allergan, Inc; и получила спикер гонораров от Мерц, TEVA и Allergan, Inc вне представленной работы. J. V. работал в качестве консультанта в Бостоне, Medtronic, научно-AbbVie и получила вознаграждение от Medtronic, Бостонский научная, AbbVie, Лалбагх, Allergan и GlobalKinetics вне представленной работы.

Acknowledgments

Авторы благодарны Keali Röhm, Луиза Frieß и Хайке Menzel за их экспертной технической помощи; в Helga Брюннер для ухода за животными; и Chistopher S. палату для генерации и распространения оптических disector сетка плагинов для ImageJ программного обеспечения.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Paxinos mouse atlas The Mouse Brain George Paxinos Keith B.J.FranklinCopyright @2001 by Academic Press CD Rom designet & created by Paul Halasz
brain matrix slicer mouse Zivic Instruments BSMAS 001-1
paraformaldehyde Merck 1040051000
sucrose /D(+) Saccharose Roth 4621.1
isopentane Roth 3927.1
glycerol Merck 1040931000
Ethanol Sigma Aldrich 32205-1L
Name Company Catalog Number Comments
phosphate buffered saline ingredients:
sodium chloride Sigma Aldrich 31434-1KG-R
potassium dihydrogen phosphate Merck 1048731000
di-sodium hydrogen phosphate dihydrate Merck 1065801000
potassium chloride Merck 1049360500
normal goat serum Dako X0907
bovine serum albumin Sigma A4503-100G
Triton X-100 Sigma Aldrich X100-100ml detergent
3,3-Diaminobenzidine-tetrahydrochlorid/DAB tablets 10mg pH 7.0 Kem En Tec 4170
H2O2/ Hydrogen peroxide 30% Merck 1072090250
avidin/biotin reagent Thermo Scientific 32050 Standard Ultra Sensitive ABC Staining Kit, 1:100
rabbit anti mouse tyrosine hydroxylase antibody abcam Ab112 1:1000
biotinylated goat-anti-rabbit IgG H+L vector laboratories BA-1000 1:100
StereoInvestigator version 11.07 MBF
BX53 microscope Olympus
Visiview Visitron Systems GmbH 3.3.0.2
Axiophot2 Zeiss
ImageJ software NIH Version 4.7
Tissue-TEK OCT Sakura 4583
dry ice
grid overlay plugin Wayne Rasband https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html
cell counter plugin Kurt de Vos https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html). 
optical disector macro Christopher Ward
C57Bl/6N male mice Charles River, Germany
SuperFrost Plus coated object slides Langenbrinck, Germany
25G needle Microlance 3 BD 300400
REGLO Analog Infusion pump Ismatec ISM 829
StereoInvestigator system StereoInvestigator version 11.07
BX53 microscope BX53 microscope
self-assorted stereology Visiview
Axiophot2 Axiophot2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ip, C. W., et al. AAV1/2-induced overexpression of A53T-alpha-synuclein in the substantia nigra results in degeneration of the nigrostriatal system with Lewy-like pathology and motor impairment: a new mouse model for Parkinson's disease. Acta Neuropathol Commun. 5 (1), 11 (2017).
  2. Ip, C. W., Beck, S. K., Volkmann, J. Lymphocytes reduce nigrostriatal deficits in the 6-hydroxydopamine mouse model of Parkinson's disease. J Neural Transm (Vienna). 122 (12), 1633-1643 (2015).
  3. West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Anat Rec. 231 (4), 482-497 (1991).
  4. Schmitz, C., Hof, P. R. Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience. 130 (4), 813-831 (2005).
  5. Tieu, K. A guide to neurotoxic animal models of Parkinson's disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 1 (1), e009316 (2011).
  6. Abercrombie, M. Estimation of nuclear population from microtome sections. Anat Rec. 94, 239-247 (1946).
  7. Rose, R. D., Rohrlich, D. Counting sectioned cells via mathematical reconstruction. J Comp Neurol. 263 (3), 365-386 (1987).
  8. Weibel, E. R., Gomez, D. M. A principle for counting tissue structures on random sections. J Appl Physiol. 17, 343-348 (1962).
  9. West, M. J. Design-based stereological methods for counting neurons. Prog Brain Res. 135, 43-51 (2002).
  10. Keuker, J. I., Vollmann-Honsdorf, G. K., Fuchs, E. How to use the optical fractionator: an example based on the estimation of neurons in the hippocampal CA1 and CA3 regions of tree shrews. Brain Res Brain Res Protoc. 7 (3), 211-221 (2001).
  11. Mouton, P. R., et al. The effects of age and lipopolysaccharide (LPS)-mediated peripheral inflammation on numbers of central catecholaminergic neurons. Neurobiol Aging. 33 (2), e427-e436 (2012).
  12. Barreto, G. E., Sun, X., Xu, L., Giffard, R. G. Astrocyte proliferation following stroke in the mouse depends on distance from the infarct. PLoS One. 6 (11), e27881 (2011).
  13. Robinson, S., et al. Microstructural and microglial changes after repetitive mild traumatic brain injury in mice. J Neurosci Res. 95 (4), 1025-1035 (2017).
  14. Paxinos, G., Franklin, K. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (2001).
  15. Rasband, W. Grid_Overlay.java. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html (2010).
  16. De Vos, K. cell_counter.jar. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html (2010).
  17. Baquet, Z. C., Williams, D., Brody, J., Smeyne, R. J. A comparison of model-based (2D) and design-based (3D) stereological methods for estimating cell number in the substantia nigra pars compacta (SNpc) of the C57BL/6J mouse. Neuroscience. 161 (4), 1082-1090 (2009).
  18. Fu, Y., et al. A cytoarchitectonic and chemoarchitectonic analysis of the dopamine cell groups in the substantia nigra, ventral tegmental area, and retrorubral field in the mouse. Brain Struct Funct. 217 (2), 591-612 (2012).
  19. German, D. C., Manaye, K. F. Midbrain dopaminergic neurons (nuclei A8, A9, and A10): three-dimensional reconstruction in the rat. J Comp Neurol. 331 (3), 297-309 (1993).
  20. Smeyne, R. J., et al. Assessment of the Effects of MPTP and Paraquat on Dopaminergic Neurons and Microglia in the Substantia Nigra Pars Compacta of C57BL/6 Mice. PLoS One. 11 (10), e0164094 (2016).

Tags

Нейробиология выпуск 127 stereology оптические фракционатор болезнь Паркинсона клеток дофаминергические нейроны substantia nigra
Стереологических Оценка числа дофаминергических нейронов в Substantia мыши, с помощью оптических фракционатор и стандартных микроскопии оборудование
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ip, C. W., Cheong, D., Volkmann, J.… More

Ip, C. W., Cheong, D., Volkmann, J. Stereological Estimation of Dopaminergic Neuron Number in the Mouse Substantia Nigra Using the Optical Fractionator and Standard Microscopy Equipment. J. Vis. Exp. (127), e56103, doi:10.3791/56103 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter