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Neuroscience

माउस Substantia नाइग्रा में Dopaminergic ंयूरॉन संख्या का Stereological आकलन ऑप्टिकल Fractionator और मानक माइक्रोस्कोपी उपकरण का उपयोग

Published: September 1, 2017 doi: 10.3791/56103
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Neurology, University Hospital of Würzburg

Summary

यह काम माउस substantia नाइग्रा मानक माइक्रोस्कोपी उपकरण (यानी, एक प्रकाश माइक्रोस्कोप, एक मोटर चालित वस्तु तालिका (एक्स, वाई, जेड का उपयोग कर में dopaminergic ंयूरॉन कोशिका संख्या के निष्पक्ष stereological आकलन के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है विमान), और डिजिटल छवि विश्लेषण के लिए सार्वजनिक डोमेन सॉफ्टवेयर ।

Abstract

पूर्व में नैदानिक पार्किंसंस रोग अनुसंधान, nigrostriatal पथ का विश्लेषण, substantia नाइग्रा के भीतर dopaminergic ंयूरॉन नुकसान के ठहराव सहित, आवश्यक है । कुल dopaminergic ंयूरॉन संख्या का अनुमान लगाने के लिए, ऑप्टिकल fractionator विधि का उपयोग कर निष्पक्ष stereology वर्तमान में सोने के मानक माना जाता है । क्योंकि ऑप्टिकल fractionator विधि के पीछे सिद्धांत जटिल है और क्योंकि stereology विशेष उपकरणों के बिना प्राप्त करने के लिए मुश्किल है, कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पूरा stereology सिस्टम है कि आवश्यक सॉफ्टवेयर शामिल हैं, शुद्ध रूप से मौजूद है सेल गिनती कारणों के लिए । क्रय के बाद से एक विशेष stereology सेटअप हमेशा संभव नहीं है, कई कारणों के लिए, इस रिपोर्ट के stereological आकलन के लिए एक विधि का वर्णन करता है dopaminergic न्यूरॉन सेल मानक माइक्रोस्कोपी उपकरणों का उपयोग कर गिना जाता है, एक प्रकाश माइक्रोस्कोप सहित, एक इमेजिंग सॉफ्टवेयर के साथ मोटर चालित वस्तु तालिका (एक्स, वाई, जेड विमान), और विश्लेषण के लिए एक कंप्यूटर. एक चरण दर चरण विवरण ऑप्टिकल fractionator विधि का उपयोग कर stereological ठहराव निष्पादित करने के लिए पर दिया जाता है, और अनुमानित कक्ष गणना की गणना के लिए पूर्व-क्रमादेशित फ़ाइलें प्रदान किए जाते हैं । इस विधि की सटीकता का आकलन करने के लिए, एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध stereology उपकरण से प्राप्त डेटा की तुलना की गई थी । तुलनीय सेल संख्या इस प्रोटोकॉल और stereology डिवाइस का उपयोग कर पाया गया, इस प्रकार निष्पक्ष stereology के लिए इस प्रोटोकॉल की परिशुद्धता का प्रदर्शन ।

Introduction

substantia नाइग्रा (SN)1,2के भीतर neurodegeneration के स्तर का निर्धारण करने के लिए पूर्व नैदानिक पार्किंसंस रोग अनुसंधान में न्यूरॉन कोशिका संख्या के ठहराव को निर्णायक है. ब्याज के एक क्षेत्र में सेल संख्या के निष्पक्ष stereological आकलन सोने के मानक3,4,5माना जाता है ।

निष्पक्ष stereology के आगमन से पहले, वर्गों में न्यूरॉन्स की संख्या चर संभावनाओं के लिए सही करने के लिए सेल प्रोफाइल गिना हेरफेर द्वारा मूल्यांकन किया गया था कि न्यूरॉन्स एक अनुभाग में नजर में आते हैं. सबसे अधिक इस्तेमाल किया तरीकों में से एक मात्रा सेल गिनती के सुधार Abercrombie6द्वारा वर्णित किया गया था । इस विधि को ध्यान में रखने का प्रयास किया है कि कोशिकाओं को एक से अधिक मात्रा जा सकता है अगर एक ही कोशिका के टुकड़े आसंन पतले वर्गों में पाए जाते हैं । इसलिए, Abercrombie और अंय लेखकों समीकरण है कि आकार, आकार, और गिने कोशिकाओं7,8के उंमुखीकरण के बारे में मांयताओं की आवश्यकता उत्पंन । हालांकि, इन मांयताओं आमतौर पर महसूस नहीं किया गया और इसलिए व्यवस्थित त्रुटियों और वास्तविक कोशिका संख्या से विचलन के नेतृत्व में (यानी, पूर्वाग्रह) । इसके अलावा, पूर्वाग्रह अतिरिक्त नमूना3से कम नहीं किया जा सकता है ।

कक्ष संख्या ऑप्टिकल fractionator का उपयोग कर के stereological आकलन के लिए, गणितीय सिद्धांतों को सीधे एक परिभाषित, 3 आयामी मात्रा में सीधे सेल संख्या का अनुमान लागू कर रहे हैं । इस विधि का लाभ यह है कि यह आकार, आकार के बारे में अनुमान शामिल नहीं करता है, और कोशिकाओं के उंमुखीकरण गिना जा रहा है । इस प्रकार, अनुमानित सेल संख्या सही मूल्यों के करीब हैं और नमूना आकार बढ़ जाती है के रूप में करीब हो (यानी, निष्पक्ष)3. चूंकि विधि को निष्पक्ष बनाए रखने के लिए stereology का उपयोग करते समय कई नियमों का पालन करना आवश्यक है, इसलिए तैयार करने के लिए उपयोग किया गया वाणिज्यिक stereology सिस्टम विकसित किया गया है (समीक्षा के लिए, Schmitz और Hof, २००५4देखें) । विशेषीकृत stereology प्रणालियों को लागू करने के साथ डिजाइन आधारित stereological तरीके एक प्राथमिकताओं परिभाषित जांच और stereological आकलन है कि आकार, आकार, स्थानिक वितरण से स्वतंत्रता के लिए नेतृत्व के लिए नमूना योजनाओं, और के उंमुखीकरण कोशिकाओं का विश्लेषण किया जा करने के लिए4,9. हालांकि, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध stereology सिस्टम महंगे हैं; इस नए शोध में कार्यांवयन की सीमा हो सकती है ।

इस अध्ययन का उद्देश्य माउस एसएन में dopaminergic कोशिका गिनती के डिजाइन आधारित stereological आकलन के लिए एक प्रयोग करने योग्य तकनीक विकसित करना था, ऑप्टिकल fractionator विधि को रोजगार और मानक माइक्रोस्कोपी उपकरणों का उपयोग (यानी, प्रकाश माइक्रोस्कोप, मानक माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर, और एक मोटर चालित एक्स, वाई, जेड चरण). इस के लिए, कैसे माउस मस्तिष्क ऊतक की प्रक्रिया पर एक कदम दर कदम गाइड और कैसे का अनुमान SN सेल नंबर डिजाइन आधारित निष्पक्ष stereology का उपयोग कर प्रस्तुत किया है । इसके अलावा, अनुमानित कक्ष संख्याओं और त्रुटि (CE) के गुणांक की गणना के लिए टेम्पलेट्स प्रदान किए जाते हैं.

यहां वर्णित विधि SN के विश्लेषण तक ही सीमित नहीं है, लेकिन माउस या चूहे मस्तिष्क के अंय शारीरिक परिभाषित क्षेत्रों में उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, निष्पक्ष stereology हिप्पोकैंपस10 और लोकस coeruleus11में न्यूरॉन सेल संख्या अनुमान लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है. साथ ही, astrocytes12 और microglia13जैसे न्यूरॉन्स के अलावा कक्ष प्रकार, के रूप में अच्छी तरह से मूल्यांकन किया जा सकता है । इसलिए, यह विधि उन वैज्ञानिकों के लिए उपयोगी हो सकती है जो अपने शोध में निष्पक्ष stereology को लागू करने का इरादा रखते हैं लेकिन एक stereology प्रणाली की खरीद के लिए बहुत सारा पैसा खर्च करने को तैयार नहीं हैं ।

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Protocol

< p class = "jove_content" > पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए सभी लागू अंतर्राष्ट्रीय, राष्ट्रीय और/या संस्थागत दिशानिर्देशों का पालन किया गया । प्रोटोकॉल Regierung वॉन Unterfranken, Wuerzburg, जर्मनी में स्थानीय अधिकारियों द्वारा अनुमोदित किया गया था ।

< p class = "jove_title" > 1. टिशू प्रोसेसिंग और Immunohistochemistry

  1. Euthanize चूहों को कं 2 या किसी अन्य अनुमोदित विधि के साथ.
  2. Perfuse ६ १२-सप्ताहीय C56Bl/6N नर चूहों के 10 मिलीलीटर के साथ transcardially ०.१ मीटर फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) एक 25-जी सुई और एक अर्क पंप का उपयोग कर, ०.१ एम पंजाब में 4% paraformaldehyde (पीएफए) के ७० मिलीलीटर के बाद.
    सावधानी: पीएफए विषाक्त, एलर्जी, और यलो है ।
  3. टुकड़े Bregma (चित्रा 25, Paxinos और फ्रेंकलिन माउस ब्रेन एटलस < सुप वर्ग = "xref" > 14 ) से ०.७४ मिमी के क्षेत्र में एक मस्तिष्क मैट्रिक्स स्लाइसर के साथ राज्याभिषेक विमान में माउस मस्तिष्क ।
  4. ने मस्तिष्क के पृष्ठीय भाग को, SN सहित, 4% पीएफए में ०.१ मीटर पंजाबियों में 1 डी के लिए 4 & #176; विसर्जन-निर्धारण के लिए सी.
  5. एक्सचेंज के लिए पीएफए 30% सुक्रोज/0.1 मॉल पंजाब क्रायो के लिए समाधान-संरक्षण और एक और 2 डी के लिए मशीन 4 & #176; C.
  6. एक इष्टतम काटने के तापमान (OCT) यौगिक से भरा cryomold में मस्तिष्क के पृष्ठीय भाग डाल और धीरे तरल सूखी बर्फ में ऊतक फ्रीज-ठंडा isopentane.
    सावधानी: सूखी बर्फी बेहद ठंडी (-७८ & #176; C); सूखी बर्फ के साथ काम करते हुए, दस्ताने सहित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) का उपयोग करें । सूखी बर्फ सह 2 में वाष्पीकरण; इसलिए, एक धुएं डाकू के तहत काम करते हैं ।
  7. प्रश्नपत्र कट 30-& #181; एम क्रायो-राज्याभिषेक विमान में वर्गों और वर्गों को इकट्ठा, Bregma से २.४६ मिमी से शुरू (आंकड़ा ५१, Paxinos और फ्रेंकलिन माउस ब्रेन एटलस < सुप वर्ग = "xref" > 14 ) और Bregma से ४.०४ मिमी पर समाप्त (आंकड़ा ६४, Paxinos और फ्रेंकलिन माउस ब्रेन एटलस < सुप वर्ग = "xref" > 14 ).
  8. स्टोर चार ट्यूबों में श्रृंखला है कि cryoprotectant से भर रहे है (30% ग्लिसरॉल, 30% ethoxyethanol, और ४०% पंजाब) पर-20 & #176; सी. अनुभागण कार्यविधि के दौरान, दाएं गोलार्द्ध को brainstem के ऊपरी क्षेत्र में एक छोटा सा छिद्र puncturing करके चिह्नित करें ।
    9. immunohistochemical धुंधला के लिए
  9. , प्रति माउस वर्गों की एक श्रृंखला का चयन करें । 10% सामान्य बकरी सीरम (NGS) में 1 एच के लिए नि: शुल्क अस्थायी वर्गों और एक शेखर पर ०.१ मॉल में डिटर्जेंट 2% BSA/ खरगोश विरोधी माउस tyrosine hydroxylase के साथ वर्गों की मशीन (गु; 1:1000 कमजोर पड़ने) एंटीबॉडी 2% NGS में पतला/०.१ मॉल पंजाबियों में रात भर 4 & #176; C. BSA
  10. खरगोश Igs (1:100 कमजोर पड़ने) के खिलाफ माध्यमिक एंटीबॉडी कमरे के तापमान पर 2 ज, avidin/बायोटिन रिएजेंट (1:100 कमजोर पड़ने) के बाद लागू होते हैं । 3, 3-diaminobenzidine-tetrahydrochloride (ढाब) और एच 2 ओ 2 के साथ मशीन और दाग । माउंट उंहें लेपित ऑब्जेक्ट स्लाइड पर धुंधला करने के बाद अनुभाग ।
    नोट: TH + dopaminergic SN न्यूरॉन्स में दिखाया < मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1a . एक श्रृंखला, 13 sn वर्गों के एक औसत से धुंधला करके, sn pars compacta (SNpc) और रेटिकुलाटा के rostral से caudal भागों तक फैली, प्रति जानवर दाग रहे है (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1b ) । वर्गों से अलग हैं १२० & #181; म (1/4 खला) (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 1c ).
    सावधानी: ढाब एक संदिग्ध यलो है । यह संपर्क और साँस लेना से विषाक्त है । उपयोग पीपीई जब ढाब के साथ काम कर रहे.
< p class = "jove_title" > 2. छवियों का अधिग्रहण

  1. पर कब्जा गु immunohistochemically दाग एसएन वर्गों डिजिटल इमेजिंग सॉफ्टवेयर है कि एक खुर्दबीन के लिए युग्मित है का उपयोग कर । अलग से एक श्रृंखला के प्रत्येक खंड का विश्लेषण ।
  2. इमेजिंग सॉफ़्टवेयर के स्कैन स्लाइड विकल्प का उपयोग करें । उच्च-गुणवत्ता वाले चित्रों के लिए TIFF स्वरूप में सहेजें ( figure 2 ).
    नोट: छवि संकल्प है ३१२ पिक्सेल प्रति सेमी.
  3. प्रेस & #34; मोल & #34; अधिग्रहण विंडो खोलने के लिए ( चित्रा 2a ).
  4. सेट करने के लिए बिन्नी को & #34; 2 & #34; ग्रेस्केल छवियों के लिए.
    नोट: रंग चित्रों के बजाय ग्रेस्केल छवियों का अधिग्रहण अंतिम स्टैक छवि फ़ाइल ( आरेख 2a ) का आकार घटाता है ।
  5. पर क्लिक करें & #34; Show live & #34; खंड की लाइव छवि दिखाने वाली नई विंडो खोलने के लिए प्राप्ति विंडो में ( figure 2 a and b ).
  6. & #34; चरण & #34; अर्जन खिड़की पर क्लिक करें । चुनें & #34; स्कैन Slide & #34; ड्रॉपडाउन मेनू में और बॉक्स चेक करें ( figure 2c ).
    नोट: इससे x, y-विमान में अत्यधिक बढ़ाया SN images (630X आवर्धन) के अधिग्रहण और संरेखण को सक्षम करता है, साथ ही साथ ढेर छवियों के अधिग्रहण में 1 & #181; m z-विमान में, 13 & #181 की कुल सीमा को कवर कर रहा है; m.
  7. SN.
    8. के लिए खोज करने के लिए 2.5 x उद्देश्य का चयन करें
  8. परिवर्तन गर्ने उद्देश्य 63x.
  9. को परिभाषित ऊपरी बायां कोना (TopLeft) ( figure 2c ) और निचले दाएँ कोने (LowRight) ( figure 2d ) पर क्लिक करके सेक्शन के & #34; Set. & #34;
  10. पर क्लिक करें & #34; z-Series & #34; और चेक द & #34; z-विमान शृंखला & #34; बॉक्स ( figure 2e ).
  11. इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर अनुभाग के प्रति तीन बेतरतीब ढंग से चयनित गिनती साइटों पर वर्गों की वास्तविक घुड़सवार मोटाई निर्धारित करते हैं । इसके लिए & #34 पर क्लिक करें; देखें टॉप ऑफ़सेट & #34; खंड ( figure 2e ) के शीर्ष को परिभाषित करने के लिए और उसके बाद & #34 पर क्लिक करें; स्टॉप व्यू टॉप & #34; ( फिगर 2f ). इसके बाद, & #34 पर क्लिक करें; देखें बॉटम ऑफ़सेट & #34; ( figure 2f ) और उसके बाद & #34 पर क्लिक करें; स्टॉप व्यू बॉटम & #34; ( फिगर 2g ). नीचे अनुभाग की मोटाई लिखें.
  12. घटाना 3 & #181; एम (गार्ड जोन) ऊपर ऑफ़सेट से और शीर्ष ऑफ़सेट स्लॉट ( figure 2h ) में परिणाम टाइप करें । घटाएँ 13 & #181; मीटर (ऑप्टिकल disector की ऊंचाई) ऊपर ऑफसेट संख्या से और नीचे ऑफसेट स्लॉट में परिणाम टाइप ( चित्रा 2i ) । निंन पैरामीटर्स का चयन करें: चरण, 14; साइज, १.०० ( figure 2i ).
    नोट: यह 13 & #181 के z-विमान में एक मोटाई से मेल खाती है; m, एक 1-& #181 के साथ; मी दूरी लगातार छवियों के बीच.
  13. फ़ाइल ( चित्रा 2j ) को सहेजने के लिए निर्देशिका का चयन करें ।
  14. पर क्लिक करें & #34; अनुक्रम & #34; अर्जन ( figure 2j ) सुरु.
  15. & #34;P rocessing & #34; पर क्लिक करें और निम्नलिखित मापदंडों का चयन करें: & #34; सभी विमानों, & #34; से & #34; अनुक्रम; & #34; & #34; असेंबल; & #34; और द & #34; फास्ट & #34; और & #34; टांका & #34; बक्से, एक छवि के साथ 10% ( चित्रा 2k ) ओवरलैप. पर क्लिक करके छवियों सिलाई शुरू & #34; प्रारंभ & #34;.
    नोट: यह विश्लेषण के लिए स्टैक छवियाँ जेनरेट करेगा ( figure 2 l, < सबल वर्ग = "xfig" > फिगर 3 ए -e ).
< p class = "jove_title" > 3. Stereological असेसमेंट के अनुक्रम

  1. NIH ImageJ सॉफ़्टवेयर संस्करण का उपयोग करके SN स्टैक छवियों का विश्लेषण निष्पादित करें ४.७.
  2. डाउनलोड दो plugins है कि ImageJ.nih.gov वेबसाइट से की जरूरत है: & #34; ग्रिड ओवरले & #34; प्लगइन < सुप क्लास = "xref" > 15 और द & #34; सेल काउंटर & #34; प्लगइन < सुप क्लास = "xref" > 16 . दोनों plugins स्थापित के रूप में वर्णित है ।
  3. निष्पक्ष stereological मूल्यांकन के लिए, इस प्रकार के रूप में गिनती मापदंडों को परिभाषित: ग्रिड आकार, १३० x १३० & #181; एम; काउंटिंग फ्रेम, ५० x ५० & #181; m; और ऑप्टिकल disector कद, 13 & #181; m.
  4. & #34 पर क्लिक करके इमेज खोलें; File & #34; & #160; & #8594; & #34; ओपन & #34; ( फिगर 4a ) का उपयोग कर छवि स्केल सेट करें & #34; श्लेष & #34; & #160; & #8594; & #34; सेट स्केल & #34; आदेश ( चित्रा 4b ). इस चरण के लिए, निर्धारित आकार को पिक्सल से बदल कर & #181; m ( figure 4c ).
    नोट: विश्लेषण छवियों के लिए, ४२५ पिक्सल के अनुरूप १०० & #181; m.
  5. selection & #34;P lugins & #34; & #160; & #8594; & #34; ग्रीड & #34; & #160; & #8594; & #34; ग्रिड प्रकार: लाइंस & #34; आदेश को बेतरतीब ढंग से एक ग्रिड डालने के लिए । चेक & #34; रैंडम ऑफ़सेट & #34; बॉक्स । ग्रिड के भीतर एक वर्ग के आकार को परिभाषित (ग्रिड वर्ग) के रूप में १३० & #181; म x १३० & #181; म = १६,९०० & #181; m 2 (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 3 बी व फिगर 4d व e ).
  6. बदलें छवि प्रकार से 16-bit करने के लिए आरजीबी रंग (पर क्लिक करें & #34; इमेज & #34; & #160; & #8594; & #34; प्रकार & #34; & #160; & #8594; & #34; RGB color & #34;) ( figure 4f ). SNpc का पता लगाएँ, के रूप में Baquet एट अल. द्वारा वर्णित < सुप वर्ग = "xref" > १७ . घेरना SNpc के साथ & #34;P aintbrush Tool & #34; (ब्रश चौड़ाई: 11) (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 3 सी और फिगर 4g -i ).
  7. पूर्ववत & #34; सेट केल & #34; पर क्लिक करके आदेश & #34; श्लेष & #34; & #8594; & #34; सेट केल & #34; & #8594; & #34; को हटाने के लिए क्लिक करें केल & #34; ( फिगर 4j -l ) पिक्सेल में गणना के प्रदर्शन को सक्षम करने के लिए बजाय भन्दा & #181; m.
  8. एक स्क्रीनशॉट ( चित्रा 4m ) बनाने के लिए, छवि फ़ाइल को बचाने के लिए, और ImageJ ( चित्रा 4n ) के साथ नई फ़ाइल को खोलने. Select & #34;P oint & #34; ( फिगर 4o ) और एक ब्रश की चौड़ाई 25 ( figure 4p ) । प्रत्येक ग्रिड-वर्ग है कि एक ऑप्टिकल disector ( चित्रा 4q ) के स्थान के लिए एसएन संपर्क मार्क । पूर्ण या आंशिक रूप से बाह्यरेखांकित SN.
    9. में स्थानीयकृत हैं सभी ऑप्टिकल disectors में कक्ष संख्या का विश्लेषण निष्पादित करें
  9. एक ग्रिड-वर्ग का चयन करें जिसमें SN के भाग शामिल हैं । ImageJ में कर्सर के साथ इस वर्ग के ऊपरी बाएं कोने उपाय एक्स और वाई को परिभाषित करने के लिए निर्देशांक ( चित्रा 4r ) के साथ शुरू करने के लिए.
    नोट: निर्देशांक ऑप्टिकल disector पोजिशनिंग के लिए डाला जाएगा & #34; ऑप्टिकल disector पोजीशन & #34; ( फिगर 4s ), जैसा कि चरण 4 में वर्णित है ।
  10. का हकदार स्प्रेडशीट टेंपलेट का उपयोग करके ऑप्टिकल disector स्थिति की गणना, & #34; ऑप्टिकल disector स्थिति, & #34; जैसा चरण 4 में वर्णित है ।
  11. ऑप्टिकल disector जांचना (मैक्रो क्रिस्टोफर एस द्वारा लिखित वार्ड, पूरक फाइल ) पर क्लिक करके & #34;P lugins & #34; & #8594; & #34; मैक्रोज़ & #34; & #8594; & #34; Edit & #34; ( चित्रा 4t ), खुला द & #34; opt_dis_ ग्रीड. txt & #34; फ़ाइल ( figure ), और & #34 के आकार को परिभाषित करें; usergrid & #34; पिक्सल में जो कि x के साथ संगत हो, ऑप्टिकल disector ( figure 4v ) के y आयाम । ५० & #181 के आकार का चयन करें; m x ५० & #181; m, ताकि usergrid के एक ओर का आकार २१२.५ पिक्सेल (५० x ४.२५ पिक्सेल) के रूप में परिभाषित किया गया है ।
  12. ImageX और छवि निर्देशांक कि ऑप्टिकल disector ( चित्रा 4v ) के केंद्र को परिभाषित डालने के द्वारा स्टैक छवि में ऑप्टिकल disector की स्थिति का निर्धारण । मैक्रो चलाएं (& #34; मैक्रोज़ & #34; & #8594; & #34; रन स्थूल & #34;) ( figure 4w ).
    नोट: ग्रिड स्टैक छवि से लुप्त हो जाएगा (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्र 3d and figure 4x ). जब z-विमान में नीचे चलते हुए ऑप्टिकल disector बनी रहेगी (< मज़बूत वर्ग = "xfig" > फिगर 3e and figure 4x ).
  13. Select & #34;P lugins & #34; & #160; & #8594; & #34; सेल काउंटर & #34; सेल काउंटर प्लगइन ( figure 4y ) शुरू करने के लिए. कक्ष काउंटर को प्रारंभ करें और किसी मार्कर प्रकार ( figure 4z ) चुनें । इमेज पर ज़ूम इन करें (& #34 पर क्लिक करे; + & #34;) और सेल नंबरों का stereological असेसमेंट २००% की इज़ाफ़ा पर परफॉर्म करे ।
  14. उनके गोल या अंडाकार शेप और सेल साइज (< मजबूत वर्ग = "xfig" > फिगर 1a ) द्वारा dopaminergic न्यूरॉन perikarya की पहचान करें । stereological नियमों का उपयोग करके कक्षों की संख्या को बढ़ाता है ।
    नोट: चूंकि ऑप्टिकल disector एक 3-आयामी क्यूब है (< सशक्त वर्ग = "xfig" > चित्र 5 ए ), घन के सामने, बाएँ और शीर्ष किनारों के रूप में बहिष्करण पक्षों को परिभाषित करें (लाल). इसलिए, डॉन & #39; टी गणना गु + कोशिकाओं है कि या तो लाल रेखा के साथ संपर्क में आते है (बाएं और सामने) या ऊपर की ओर । कक्ष की गणना के परिणाम तैयार स्प्रेडशीट फ़ाइल में जोड़ें हकदार, & #34; सेल काउंट की गणना & #34; (step 5).
  15. एसएन इमेज के मुताबिक, अगला ग्रिड-वर्ग परिकलित करें जिसमें अगले कक्ष गणना के लिए ऑप्टिकल disector को रखने के लिए, x का उपयोग करते हुए, y चरणों को लेट ग्रिड का आकार (< सशक्त वर्ग = "xfig" > आरेख 5b ) और द & #34; ऑप्टिकल disector पोजीशन & #34; चरण 4.
    16. में वर्णित के रूप में स्प्रेडशीट टेम्पलेट,
  16. का उपयोग कर कक्ष संख्या का एक अनुमान निष्पादित करें & #34; गणना कक्ष गणना & #34; स्प्रेडशीट (चरण 5).
< p class = "jove_title" > 4. ऑप्टिकल Disector स्थिति का परिकलन & #34; ऑप्टिकल Disector वरून & #34; स्प्रेडशीट टेम्पलेट

  1. की गणना आकार और प्रत्येक ऑप्टिकल Disector की स्थिति की रूपरेखा के भीतर एक ग्रिड में रखी जा करने के लिए SN ( < सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 5b ) का उपयोग कर & #34; ऑप्टिकल disector स्थिति. xlsx & #34; स्प्रेडशीट फ़ाइल ( पूरक फ़ाइल ).
  2. पिक्सेल प्रति & #181 का रूपांतरण संमिलित करें; m, ारा निर्धारित & #34; सेट केल & #34; आदेश, के पीले चिन्हित पदों में & #34; ऑप्टिकल disector पोजिशन. xlsx & #34; फाइल (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 6a र पूरक फाइल ).
  3. ऑप्टिकल disector की योजनाबद्ध आकार और ग्रिड के आकार को संमिलित करें--ग्रिड के वर्ग, एक पक्ष की लंबाई द्वारा परिभाषित (& #181; मी), नारंगी चिह्नित पदों में ।
    नोट: परिणाम नारंगी बक्से के बगल में लाल बक्से में चित्रित कर रहे हैं.
  4. प्रारंभ बिंदु के रूप में निर्धारित किया गया था जो SN बाह्यरेखा के भीतर ग्रिड-वर्ग के साथ शुरू (एक ग्रिड-वर्ग के साथ शुरू करने के लिए चुना गया था, के रूप में चरण ३.९, ऊपर) ।
  5. सम्मिलित करें x और y निर्देशांक, चरण ३.९ में मापा के रूप में, फ़ाइल के हरे बक्से में (इन मानों का उपयोग करके, x, y इस प्रथम वर्ग के भीतर ऑप्टिकल disector के केंद्र के लिए निर्देशांक परिकलित किए जाते हैं, और परिणाम नीले बक्से में चित्रित किए गए हैं). opt_dis_grid. txt मैक्रो ( पूरक फ़ाइल ) चलाएँ ।
  6. गणना ग्रिड-स्क्वायर दूरी (वर्गों की संख्या में मापा) पहले ग्रिड वर्ग (भूरे रंग के बक्से) के सापेक्ष डालने के द्वारा लगातार ऑप्टिकल disectors के y निर्देशांक ।
    नोट: + एक्स: ग्रिड-स्क्वायर सही करने के लिए स्थित है; -x: ग्रिड-स्क्वायर बाईं ओर स्थित है; + y: ग्रिड-स्क्वायर नीचे करने के लिए स्थित है; -y: ग्रिड-वर्ग शीर्ष करने के लिए स्थित है । परिणाम धूसर बक्सों में दिखाए जाते हैं ।
< p class = "jove_title" > 5. कक्ष संख्या का आकलन & #34 का उपयोग करना; सेल काउंट & #34 की गणना; स्प्रेडशीट

  1. प्रति जानवर (N) की अनुमानित संख्या की गणना प्रकाशित सूत्र का उपयोग करते हुए वेस्ट एट अल ., 1991 < सुप क्लास = "xref" > 3 , where & #8721; Q - एक मस्तिष्क अनुभाग के सभी ऑप्टिकल disectors में गिना गु + न्यूरॉन्स की कुल संख्या के रूप में परिभाषित किया गया है.
    नोट: खंड (टी) की मापी मोटाई के संबंध में ऑप्टिकल disector (एच) की ऊंचाई समीकरण में शामिल है । क्षेत्र नमूना अंश (asf) के क्षेत्र के अनुपात के रूप में परिभाषित किया गया है (a) ऑप्टिकल disector (एक ऑप्टिकल disector) ग्रिड के वर्ग आकार के भीतर फ्रेम आकार (एक एक्स, y step) (a ऑप्टिकल disector/a x, y step) (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्र बी ), और धारा नमूना अंश (ssf) पूरे प्रश्नपत्र कट मस्तिष्क के वर्गों के अनुपात के रूप में परिभाषित किया गया है:
    < img alt = "समीकरण 1" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56103/56103eq1.jpg"/>
    उच्च गुणवत्ता वाले मात्रात्मक अनुमानों को सुनिश्चित करने के लिए, के गुणांक त्रुटि (CE) ०.१० से कम होना चाहिए । Keuker एट अल द्वारा सूत्र का उपयोग कर CE निर्धारित करें., 2001 < सुप वर्ग = "xref" > 10 :
    < img alt = "समीकरण 2" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56103/56103eq2.jpg"/>
  2. प्रत्येक के SN के भीतर कक्ष संख्या के stereological अनुमान के लिए माउस, प्रति माउस उत्पंन श्रृंखला की कुल संख्या के बारे में संकेत दिया जानकारी डालें, ऑप्टिकल disector की ऊंचाई, x, y क्षेत्र की ऑप्टिकल disector (a ऑप्टिकल disector, in & #181; m 2 ), ग्रिड के x, y क्षेत्र-वर्ग (a x, y step , म & #181; m 2 ), और खंड की निकृष्ट मापी गई मोटाई (& #181; m) का प्रयोग कर पीले बक्से में & #34; गणना कक्ष की गणना. xlsx & #34; स्प्रेडशीट फ़ाइल (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा घमण्ड और पूरक फाइल ).
  3. चरण 5.
    4. में वर्णित के रूप में एक ही जानवर से प्रत्येक SN अनुभाग का विश्लेषण करें ।
  4. सम्मिलित करें प्रत्येक ऑप्टिकल disector के लिए कक्ष गणना धूसर बक्सों में, प्रत्येक पंक्ति एक SN अनुभाग का उल्लेख करते हुए, & #34 का उपयोग करते हुए, कक्ष गणना का परिकलन. xlsx & #34; स्प्रेडशीट फ़ाइल ( पूरक फ़ाइल ).
    नोट: अनुमानित कक्ष संख्या और परिकलित CE नीले बक्से में चित्रित कर रहे हैं (< सशक्त वर्ग = "xfig" > चित्रा घमण्ड ).
< p class = "jove_title" > 6. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध Stereology प्रणाली का उपयोग करके कक्ष संख्या का अनुमान

  1. पर क्लिक करके dopaminergic SNpc सेल नंबर का अनुमान लगाना प्रारंभ करें & #34;P वस्त्र & #34; & #8594; & #34; ऑप्टिकल Fractionator कार्यप्रवाह & #34; ऑप्टिकल Fractionator खोलने के लिए कार्यप्रवाह विंडो.
    नोट: यदि SN की एक नई श्रृंखला गिनी जा रही है, तो यह निर्धारित करने के लिए एक नई विंडो पॉप-अप होगी ।
  2. & #34 पर क्लिक करके TH + SN sections की नई श्रृंखला प्रारंभ करें; पॉप-अप विंडो में कोई नया विषय & #34; प्रारंभ करें ।
  3. ऑप्टिकल Fractionator कार्यप्रवाह के विभिंन चरणों के माध्यम से जाना । पहले चरण में विषय सेट करें । इसके लिए, जांचकर्ता & #39; s नाम, विषय & #39; s name (SN group), और अंय उपयोगी जानकारी संमिलित करें । इस SN के लिए गणना करने के लिए अनुभागों की संख्याएं संमिलित करें । कट ऊतक वर्गों की मोटाई डालें । अनुभाग अंतराल संमिलित करें, जो इस मामले में चार है । के साथ प्रारंभ करने के लिए यादृच्छिक रूप से निर्धारित अनुभाग संख्या सम्मिलित करें.
    4. दूसरे चरण में
  4. , कम आवर्धन (2x उद्देश्य) के लिए माइक्रोस्कोप सेट और & #34 का चयन करें; 2x पत्रिका लेंस & #34; मेनू से.
    5. चरण 3 में
  5. , बाएं माउस बटन के साथ रुचि के क्षेत्र का पता लगाएँ, जो SNpc है, जैसा कि Baquet एट अल द्वारा वर्णित है., 2009 < सुप वर्ग = "xref" > १७ .
  6. चरण 4 में उच्च आवर्धन के लिए माइक्रोस्कोप सेट । इसके लिए, उद्देश्य को 100X में बदलें और & #34 का चयन करें; 100X पत्रिका लेंस & #34; ड्रॉपडाउन मेनू से.
  7. शीर्ष करने के लिए और अनुभाग के नीचे करने के लिए ध्यान केंद्रित करके कदम 5 में घुड़सवार मोटाई उपाय.
  8. चरण 6 में, निर्धारित करें गणना फ़्रेम आकार के रूप में ५० x ५० & #181; m; यह ऑप्टिकल disector (x, y) का आकार है ।
  9. चरण 7 में, व्यवस्थित रैंडम नमूना (एसआरएस) ग्रिड का आकार सेट के रूप में १३० x १३० & #181; m.
  10. चरण 8 में 3-& #181; मी गार्ड जोन दर्ज करें ।
  11. चरण 9 में सेटिंग्स सहेजें ।
  12. अंत में, ऑप्टिकल Fractionator कार्यप्रवाह के चरण 10 में एसआरएस ग्रिड के भीतर ऑप्टिकल disectors में से प्रत्येक में गु + dopaminergic कोशिकाओं की गणना । इसके लिए & #34 पर क्लिक करके प्रारंभ करें; counting & #34; बटन.
  13. एक सेक्शन खत्म करने के बाद & #34 पर क्लिक करे; अगला सेक्शन & #34 शुरू करें; बटन समान sn श्रृंखला के अगले sn अनुभाग का ऑप्टिकल Fractionator कार्यप्रवाह प्रारंभ करने के लिए ।
  14. जब एक sn श्रृंखला का अंतिम sn अनुभाग मात्रा किया गया है, तो & #34 पर क्लिक करें; I & #39; जें मतगणना समाप्त । & #34;
  15. पर क्लिक करें & #34; देखें परिणाम & #34; बटन stereology नमूना के परिणाम प्रदर्शित करने के लिए.

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Representative Results

प्रस्तुत विधि का उपयोग करना, गु + dopaminergic न्यूरॉन्स के अधिकार sn में अनुमानित संख्या ७,३६३ और ७,९८७ कोशिकाओं के बीच में और, बाएँ sn में ७,४४६ और ७,९०४ कोशिकाओं के बीच की दूरी पर । इस प्रकार, dopaminergic न्यूरॉन्स की मतलब संख्या (± SEM) सही sn के लिए ७,६४७ ± ८३ कोशिकाओं था और ७,६७५ ± ६६ के लिए छोड़ दिया sn. प्रत्येक जानवर के लिए परिकलित CE से कम था ०.०८ (रेंज: 0.073-0.079) (चित्रा 7). व्यावसायिक रूप से उपलब्ध और विशेषीकृत stereology प्रणालियों के साथ इस पद्धति की तुलना का पता लगाने के लिए, SN कक्ष संख्याएं भी stereology सेटअप (चित्र 8) का उपयोग करके मात्रा की गईं । गिनती मापदंडों थे: ग्रिड आकार, १३० x १३० µm; गिनती फ्रेम, ५० x ५० µm; गार्ड जोन, 3 µm. sections एक BX53 माइक्रोस्कोप पर एक 100x/1.25 संख्यात्मक एपर्चर उद्देश्य के साथ विश्लेषण किया गया । गु + sn न्यूरॉन्स की अनुमानित जनसंख्या माध्य अनुभाग मोटाई का उपयोग करते हुए क्रमशः दाईं और बाईं ओर ७,०६७ से ८,१०५ कक्षों/sn और ७,१६४ से ८,०१५ कक्षों/ मतलब न्यूरॉन संख्या ७,५३५ ± १५५ कोशिकाओं के रूप में सही sn और ७,६९९ ± १२८ कोशिकाओं के लिए बाईं sn के लिए गणना की गई थी । Gundersen CE (एम = 1) ≤ ०.०८ में प्रत्येक SN मात्रा (चित्र 7) था । सांख्यिकीय विश्लेषण युग्मित छात्र टी परीक्षण का उपयोग कर गु के बीच किसी भी महत्वपूर्ण अंतर को उजागर नहीं किया + सही में या छोड़ दिया SN में दो विधियों के सेल मायने रखता है (± SEM मतलब; right: t (5) = 0.9524, p & #62; ०.०५; बायां: t (5) = 0.2928, p & #62; ०.०५) (चित्र 7 ).

Figure 1
चित्रा 1. dopaminergic न्यूरॉन्स के लिए दाग माउस एसएन के प्रतिनिधि छवियाँ.
(a) एक प्रतिनिधि माउस SN का ओवरव्यू ऊपरी फलक में दिखाया गया है । दाएं brainstem के ऊपरी भाग में छोटे छेद को नोट करें जो दाईं ओर के निशान होते हैं । इनसेट (ब्लैक बॉक्स) के उच्च आवर्धन गु + dopaminergic ंयूरॉंस को दर्शाया गया है । (ख) गु-सना sn अनुभागों की एक श्रृंखला दिखाई गई है, जो rostral से caudal तक पूरे माउस को कवर कर रही है । (c) प्रत्येक अनुभाग १२० µm द्वारा लगातार अनुभाग से पृथक किया जाता है । स्केल बार्स: a, अपर पैनल, ५०० µm; लोअर पैनल, बड़ी छवि, १०० µm; लोअर पैनल, इनसेट, ५० µm; बी, ५०० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्र 2. इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर stereological विश्लेषण के लिए छवियों का अधिग्रहण ।
(a) लाल तीर: प्राप्ति विंडो खोलें; हरा तीर: बिन्नी को "2;" नीला तीर: लाइव छवि दिखाएं पर सेट करें । (b) एक नई विंडो दिखाई देगी जो लाइव छवि (लाल तीर) खोलेगा । (c) लाल तीर: "चरण" मेनू का चयन करें; हरा तीर: "स्कैन स्लाइड" विकल्प का चयन करें; नीला तीर: "स्कैन स्लाइड" विकल्प की जाँच करें; काला तीर: ऊपरी बाएँ कोने को परिभाषित करें. (d) काला तीर: निचले दाएं कोने को परिभाषित करें । (e) लाल तीर: "Z-श्रृंखला" मेनू का चयन करें; हरा तीर: जांच "Z-विमान श्रृंखला;" नीला तीर: अनुभाग के शीर्ष के लिए खोज करने के लिए "देखें शीर्ष ऑफ़सेट" प्रारंभ करें । (f) लाल तीर: अनुभाग के शीर्ष को परिभाषित करने के लिए "स्टॉप व्यू टॉप" पर क्लिक करें; हरा तीर: अनुभाग के नीचे के लिए खोज करने के लिए "देखें नीचे ऑफ़सेट" प्रारंभ करें । (g) लाल तीर: अनुभाग के नीचे परिभाषित करने के लिए "दृश्य नीचे रोकें" पर क्लिक करें । (h) लाल तीर: घटाना 3-µm guard ज़ोन से "शीर्ष ऑफ़सेट" और "शीर्ष ऑफ़सेट" स्लॉट में परिणाम संमिलित करें । (i) लाल तीर: "शीर्ष ऑफ़सेट" संख्या से 13 µm घटाना और परिणाम को "नीचे ऑफ़सेट" स्लॉट में डालें; हरा तीर: 13 µm की z-विमान मोटाई के संगत 14 चरणों को परिभाषित करें; नीला तीर: १.०० µm का एक आकार निर्धारित करें जो लगातार छवियों के बीच एक 1-µm दूरी से मेल खाती है । (j) लाल तीर: फ़ाइल को सहेजने के लिए निर्देशिका का चयन करें; नीला तीर: छवियों के अधिग्रहण शुरू करने के लिए "अनुक्रम" पर क्लिक करें । (k) लाल तीर: "प्रसंस्करण;" पर क्लिक करें निंनलिखित मापदंडों की जांच: ग्रीन एरो: "सभी विमानों;" नीला तीर: "अनुक्रम;" काला तीर: "असेंबल;" धूसर तीर: "सिलाई;" बैंगनी तीर: तेज़ । (l) चित्र सिलाई शुरू करने के लिए पीले तीर पर क्लिक करें । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3. stereological विश्लेषण के लिए छवियों प्रसंस्करण ।
(a) किसी माउस SN से लिया गया उदाहरण स्टैक छवि । (b और c) sn (फ़िरोज़ा लाइंस, b) को एक ग्रिड की यादृच्छिक प्रविष्टि के बाद, sn एक दूसरे चरण (नीली रेखा, c) में उल्लिखित है । (d) एक ऑप्टिकल disector को SN स्टैक छवि में रखा गया है । (ङ) SN स्टैक छवि के भीतर छह लगातार फोकल विमानों ने z-विमान में 13 µm कुल कवर किया । स्केल बार्स: a-d, १०० µm; ई, ५० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्र 4. ImageJ का उपयोग कर stereological भत का अनुक्रम ।
(क) लाल तीर: एक ढेर छवि खोलने के लिए "फ़ाइल" → "ओपन" पर क्लिक करें । (b) लाल तीर: "विश्लेषण" → "सेट स्केल" पर क्लिक करें । (c) लाल तीर: "पिक्सेल में दूरी," "ज्ञात दूरी", और "लंबाई की इकाई" के लिए पैरामीटर्स निर्धारित करें । (d) लाल तीर: "प्लगइंस" → "ग्रिड" चुनें । (e) लाल तीर: "पंक्तियां;" हरा तीर का चयन करें: "यादृच्छिक ऑफ़सेट;" नीला तीर: µm2में ग्रिड का आकार संमिलित करें । (f) लाल तीर: "छवि" → "प्रकार" → "RGB रंग" पर क्लिक करें । (g) लाल तीर: "तूलिका उपकरण का चयन करें;" हरा तीर: 11 के रूप में "ब्रश चौड़ाई" को परिभाषित । (h) लाल तीर: SNpc को घेरना शुरू करें । (मैं) लाल तीर घेर SNpc. (जंमू) लाल तीर: "विश्लेषण" → "सेट स्केल" पर क्लिक करें और स्केल निकालें (कश्मीर) पर क्लिक करके "पैमाने को दूर करने के लिए," लाल रंग द्वारा चित्रित दर्शाया तीर. µm (k, हरा तीर) से पिक्सेल (l, लाल तीर) में परिवर्तन नोट करें । (एम) एक स्क्रीनशॉट ले (स्क्रीनशॉट की ओर लाल तीर अंक) और (एन) ImageJ के साथ स्क्रीनशॉट छवि फ़ाइल खोलें. (o) लाल तीर: "बिंदु" पर क्लिक करें । (p) लाल तीर: 25 की एक ब्रश चौड़ाई संमिलित करें । (क्यू) लाल तीर SNpc. (r) एक ग्रिड-वर्ग के ऊपरी बाएँ कोने में लाल तीर अंक है कि संपर्क करने के लिए चिह्नित ग्रिड वर्गों का चित्रण किया है कि एन एस के भाग शामिल हैं । इस बिंदु पर कर्सर रखकर, x, y "ऑप्टिकल disector स्थिति" (चरण 4) के लिए निर्देशांक मापा जाता है और "ऑप्टिकल disector स्थिति. xlsx" टेम्पलेट (s, लाल तीर) में संमिलित हैं । (t) लाल तीर: "प्लगइंस" → का चयन करें"मैक्रोज़" → "संपादित करें." (u) लाल तीर: "opt_dis_grid. txt" फ़ाइल का चयन करें । एक नई विंडो खुलेगी (v)। पिक्सेल्स में "usergrid," का आकार डालें (v, लाल तीर), और x, y निर्देशांक (v, हरा तीर) । (w) "opt_dis_grid. txt" मैक्रो (लाल तीर) चलाएं । (x) एक ऑप्टिकल disector पहले से निर्धारित ग्रिड-स्क्वायर (लाल तीर) के बीच में दिखाई देगा । (y) लाल तीर: "प्लगइंस" → "सेल काउंटर" पर क्लिक करें । (z) कक्ष काउंटर (लाल तीर) प्रारंभ करें और एक मार्कर प्रकार (हरा तीर) चुनें । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5. ऑप्टिकल disector की नियुक्ति ।
(क) ऑप्टिकल disector का चित्रण निष्पक्ष stereology के लिए इस्तेमाल किया । ऑप्टिकल disector एक 3 आयामी घन है । तीन योजनाबद्ध कक्ष ऑप्टिकल disector के भीतर दिखाई दे रहे हैं । कक्षों की ठहराव के लिए stereological नियम इंगित करते हैं कि ऑप्टिकल disector के लाल लेबल वाले पार्श्वों को स्पर्श करने वाले कक्ष (लाल कक्ष) शामिल नहीं किए गए हैं, जबकि हरे लेबल वाले पक्षों से संपर्क करने वाले कक्ष गणना (हरी कक्ष) में सम्मिलित हैं. (ख) एक ऑप्टिकल disector हर ग्रिड वर्ग है कि SN के संपर्क में आता है में रखा गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6. ऑप्टिकल disector स्थिति और कक्ष संख्या के अनुमान की गणना ।
(क) एक उदाहरण गणना ऑप्टिकल disector की स्थिति के लिए प्रदर्शन किया । (b) कुल कक्ष संख्या के अनुमान का एक उदाहरण । मात्रा कोशिकाओं की संख्या ग्रे बक्से में डाला जाता है, जबकि stereological ठहराव के मापदंडों पीले बक्से में डाला जाता है । अनुमानित सेल नंबर और CE नीले बक्से में प्रदर्शित कर रहे हैं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7. सेल गिनती पैरामीटर की तुलना ।
(क) वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध stereology प्रणाली का उपयोग करके विश्लेषण से प्राप्त आंकड़ों के साथ वर्णित stereological विधि से प्राप्त सही और बाएँ माउस SN की अनुमानित गु + सेल संख्या की तुलना करना कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखा पाया. सही के प्राप्त डेटा की एक विस्तृत सूची (b) और बाएं (c) SN प्रति पशु अनुमानित कक्ष संख्या के साथ दिया जाता है, वास्तव में गिना कोशिकाओं की संख्या, गिना वर्गों की संख्या, और नमूना साइटों की संख्या (यानी, दोनों पद्धतियों के लिए गणना की गई ग्रिड-वर्गों की संख्या) । बार रेखांकन में मूल्यों 6 चूहों से डेटा का मतलब ± SEM कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 8
चित्र 8. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध stereology प्रणाली वाले कक्षों का ठहराव ।
(a-b) SN की रूपरेखा तैयार की गई है और (c) ऑप्टिकल disectors की स्थितियां स्वचालित रूप से निर्धारित होती हैं । (डी-ई) प्रत्येक ऑप्टिकल disector z-विमान के साथ ध्यान केंद्रित करके सेल नंबर के लिए विश्लेषण किया है । SN के भीतर लगातार छह फोकल विमानों को दिखाया गया है । लाल और हरी लाइनों ऑप्टिकल disector के अनुरूप हैं । स्केल बार्स: a-d, १०० µm; ई, ५० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 1. opt_dis_grid. txt इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 2. ऑप्टिकल disector स्थिति. xlsx कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें ।

पूरक फ़ाइल 3. सेल काउंट की गणना. xlsx कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें ।

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Discussion

Stereology ऊतक प्रसंस्करण के साथ शुरू होता है । stereological विश्लेषण के दौरान अनुभागों की हानि को रोकने के लिए SN ऊतक का सीरियल कटिंग सावधानीपूर्वक किया जाना चाहिए । साथ ही, stereology प्रदर्शन करते समय बाएं SN से दाईं ओर भेद करने के लिए एक गोलार्द्ध को चिह्नित करने के लिए एक आवश्यक चरण है । brainstem के ऊपरी भाग में एक छोटे से छेद रखकर प्रस्तुत अध्ययन में सबसे अच्छा परिणाम उत्पंन । इसके अलावा, ऑप्टिकल fractionator विधि के साथ काम करने की मांग है कि ऊतक के बारे में 30-40 µm की मोटी वर्गों में कटौती की है, बल्कि 5-10 µm अधिक सामांयतः immunohistochemistry, एंटीबॉडी और अंय मशीन द्रव ऊतक पैठ के दौरान में इस्तेमाल के बाद से immunohistochemical धुंधला इस तरह के रूप में एक डिटर्जेंट का उपयोग करके, सुनिश्चित किया जाना चाहिए ।

Immunohistochemical dopaminergic ंयूरॉंस के लिए गु एंटीबॉडी लेबल SN ंयूरॉंस का उपयोग कर, साथ ही साथ ंयूरॉंस ventral tegmental क्षेत्र (VTA) है, जो औसत दर्जे का है sn से स्थित है, और retrorubral क्षेत्र में ंयूरॉंस । इस प्रकार, एक और महत्वपूर्ण बात जब एसएन के stereology प्रदर्शन माउस sn एनाटॉमी का ज्ञान है, के बाद से sn ंयूरॉंस विशेष रूप से मानक immunohistochemical या ऊतकीय धुंधला द्वारा visualized नहीं किया जा सकता है । इसके बजाय, subthalamic नाभिक, retrorubral क्षेत्र, और VTA की तरह संरचनात्मक स्थलों की मांयता, SN17,18,19की पूरी हद तक निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं ।

न्यूरॉन की संख्या का आकलन करने के लिए विश्वसनीय और प्रतिलिपि की जरूरत है. हालांकि विभिन्न समूहों वाणिज्यिक उपलब्ध stereology setups का उपयोग, wt चूहों में गु + dopaminergic SN न्यूरॉन्स की संख्या, विभिन्न प्रकाशनों से लिया गया, संख्या17,20में भिन्नता. Baquet एट अलमें, डिजाइन आधारित stereological विश्लेषण में 3-से 4 महीने पुराने पुरुष और महिला C57BL/6J wt एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध stereology प्रणाली का उपयोग चूहों एक अनुमानित ८,७१६ ± ३३८ गु + dopaminergic SN न्यूरॉन्स (रेंज: 7546-9869)17 से पता चला . इसके विपरीत, Smeyne एट अल। 9 में कम गु + SN कोशिकाओं को मिला 16-सप्ताह पुराने पुरुष C57BL/6J चूहों कि ०.९% खारा आईएफसआई प्राप्त किया, ६,३०२ ± २६२ कोशिकाओं से ६,८६१ ± ३३८ कोशिकाओं को लेकर, एक ही stereology प्रणाली के एक नए संस्करण का उपयोग कर20। हालांकि, पहले लेखक Baquet एट अलमें भी आखिरी लेखक थे । कागज, इसलिए अलग परिणाम के लिए कारण के रूप में अनुभव की डिग्री बदलती छोड़कर । ये विरोधाभासी डेटा stereological ठहराव पद्धति की आवश्यकता को प्रतिबिंबित करते हैं जो कम परिवर्तनशीलता दिखाता है. ठहराव की तकनीक और उपयोग किए गए सूत्र को सत्यापित करने के लिए, वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध stereology सेटअप का उपयोग करके ठहराव के साथ वर्णित विधि का उपयोग करके SN कक्ष संख्या गणना के परिणामों की तुलना की गई थी । सांख्यिकीय विश्लेषण किसी भी महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखा जब गु + dopaminergic ंयूरॉंस की संख्या की तुलना में सही और wt चूहों के बाएं SN सेल ठहराव की दोनों तकनीकों का उपयोग निर्धारित किया है, इस प्रकार का प्रदर्शन है कि इस विधि के लिए संभव है stereological चूहों में SN ंयूरॉंस का अनुमान ।

वर्णित विधि का मुख्य लाभ यह है कि यह आमतौर पर सेल की गिनती के लिए stereology तकनीकों के कार्यांवयन के साथ जुड़े रहे है लागत कम कर देता है । एक दूसरा फायदा यह है कि, वर्णित विधि के लिए, SN के ढेर छवियों को बचाया और किसी भी समय (यहां तक कि एक ही समय में) एक और अंवेषक द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है । इसके अलावा, प्रतिदीप्ति छवियों के अधिग्रहण और विश्लेषण इस विधि के साथ संभव हो रहे हैं, क्योंकि ग्रेस्केल छवियों ImageJ में "लुकअप तालिकाओं" के साथ रंगीन किया जा सकता है । हालांकि, इस अध्ययन के लिए सीमाएं हैं । सबसे पहले, सेल संख्या के ठहराव अधिक समय लगता है (लगभग ५०%) ठहराव से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध stereology प्रणाली के साथ । यह मुख्य रूप से दो कारणों की वजह से है: 1. SN के ढेर छवियों और लिया जाना चाहिए 2 । प्रत्येक SN और अनुमानित कक्ष संख्या और CE की गणना के भीतर ऑप्टिकल disector प्लेसमेंट की गणना मैंयुअल रूप से गणना टेंपलेट्स का उपयोग किया जाना चाहिए । दूसरा, हमारी प्रयोगशाला में उपलब्ध प्रणाली के साथ, विश्लेषण केवल रंग छवियों के बड़े फ़ाइल आकार के कारण ग्रेस्केल छवियों पर किया जा सकता है, जिसे ImageJ द्वारा संसाधित नहीं किया जा सकता । यह एक समस्या पैदा अगर वहां एक डबल दाग में एक ही समय में दो अलग सेल आबादी यों तो है की जरूरत हो सकती है । यह और अधिक मुश्किल हो सकता है ग्रेस्केल छवियों में दो अलग दाग सेल आबादी भेद । इसलिए, हालांकि एक मोटर चालित चरण (एक्स, वाई, जेड विमान) और इसी सॉफ्टवेयर कई ऊतकीय नमूनों के साथ काम कर प्रयोगशालाओं में उपलब्ध हैं, प्रबंधन और स्टैक छवियों की गुणवत्ता माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर और के प्रदर्शन पर निर्भर करेगा अनुलग्न कंप्यूटर ।

सीमाओं पर काबू पाने के लिए संभव तरीके हैं । गणना टेम्पलेट्स का उपयोग करके हम विकसित, वर्तमान में मैन्युअल रूप से प्रदर्शन प्रक्रियाओं के कुछ स्वचालित करने के लिए मैक्रोज़ की प्रोग्रामिंग stereological आकलन के दौरान त्रुटियों या अशुद्धियों को कम करने और काम की गति में तेजी लाने सकता है. इसके अतिरिक्त, ImageJ और अंय इमेजिंग सॉफ्टवेयर के चल रहे विकास के साथ, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कंप्यूटर प्रसंस्करण शक्ति बढ़ाने के साथ, बड़ी छवि फ़ाइल आकार निकट भविष्य में एक समस्या पैदा नहीं करना चाहिए । इसलिए, उज्ज्वल क्षेत्र रंग छवियों का विश्लेषण वर्णित तकनीक के साथ प्रबंध किया जाएगा ।

वर्णित तकनीक गु + SN कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए प्रतिबंधित नहीं है, लेकिन अन्य सेल प्रकार और कुतर के मस्तिष्क क्षेत्रों का विश्लेषण करने के लिए विस्तारित किया जा सकता है । इस के लिए, ब्याज के क्षेत्र की संरचनात्मक सीमाओं का निर्धारण किया जाना चाहिए, और संबंधित धुंधला प्रदर्शन किया जाना चाहिए । इसके अतिरिक्त, इस तकनीक को मोटा वर्गों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । इस के लिए, ढेर छवियों के अधिग्रहण के लिए और अधिक स्टैक छवियां प्रदान अनुकूलित किया जाना चाहिए । उदाहरण के लिए, यदि ४० µm-मोटी अनुभाग की आवश्यकता है, ऊतक दाग के बाद खंड की वास्तविक घुड़सवार मोटाई ऑप्टिकल disector की आवश्यक ऊंचाई निर्धारित करने के लिए मूल्यांकन किया जाना चाहिए । 6 µm घटाना (3-µm गार्ड जोन शीर्ष पर और नीचे) मतलब ऊतक मोटाई से और ऑप्टिकल disector की ऊंचाई के रूप में परिणाम ले ।

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Disclosures

सी. डब्ल्यू. आई. ने मर्ज फार्मास्यूटिकल्स, LLC और टेवा के लिए वैज्ञानिक बोर्डों पर सेवा की है; Ipsen, मर्ज फार्मास्यूटिकल्स, LLC, और Allergan, Inc से यात्रा के लिए धन प्राप्त हुआ है; और प्राप्त किया है अध्यक्ष मानदेय से मर्ज, टेवा, और Allergan, Inc प्रस्तुत काम के बाहर । जे. वी. बोस्टन वैज्ञानिक, Medtronic, और AbbVie के लिए एक सलाहकार के रूप में सेवा की है और Medtronic, बोस्टन वैज्ञानिक, AbbVie, ब्याल, Allergan से मानदेय प्राप्त किया है, और GlobalKinetics प्रस्तुत काम के बाहर ।

Acknowledgments

लेखक अपने विशेषज्ञ तकनीकी सहायता के लिए Keali Röhm, Louisa Frieß, और हाइके Menzel के प्रति कृतज्ञ हैं; पशु देखभाल के लिए हेल्गा Brünner करना; और जनरेशन और ImageJ सॉफ्टवेयर के लिए ऑप्टिकल disector ग्रिड प्लगइन के वितरण के लिए Chistopher एस वार्ड के लिए ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Paxinos mouse atlas The Mouse Brain George Paxinos Keith B.J.FranklinCopyright @2001 by Academic Press CD Rom designet & created by Paul Halasz
brain matrix slicer mouse Zivic Instruments BSMAS 001-1
paraformaldehyde Merck 1040051000
sucrose /D(+) Saccharose Roth 4621.1
isopentane Roth 3927.1
glycerol Merck 1040931000
Ethanol Sigma Aldrich 32205-1L
Name Company Catalog Number Comments
phosphate buffered saline ingredients:
sodium chloride Sigma Aldrich 31434-1KG-R
potassium dihydrogen phosphate Merck 1048731000
di-sodium hydrogen phosphate dihydrate Merck 1065801000
potassium chloride Merck 1049360500
normal goat serum Dako X0907
bovine serum albumin Sigma A4503-100G
Triton X-100 Sigma Aldrich X100-100ml detergent
3,3-Diaminobenzidine-tetrahydrochlorid/DAB tablets 10mg pH 7.0 Kem En Tec 4170
H2O2/ Hydrogen peroxide 30% Merck 1072090250
avidin/biotin reagent Thermo Scientific 32050 Standard Ultra Sensitive ABC Staining Kit, 1:100
rabbit anti mouse tyrosine hydroxylase antibody abcam Ab112 1:1000
biotinylated goat-anti-rabbit IgG H+L vector laboratories BA-1000 1:100
StereoInvestigator version 11.07 MBF
BX53 microscope Olympus
Visiview Visitron Systems GmbH 3.3.0.2
Axiophot2 Zeiss
ImageJ software NIH Version 4.7
Tissue-TEK OCT Sakura 4583
dry ice
grid overlay plugin Wayne Rasband https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html
cell counter plugin Kurt de Vos https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html). 
optical disector macro Christopher Ward
C57Bl/6N male mice Charles River, Germany
SuperFrost Plus coated object slides Langenbrinck, Germany
25G needle Microlance 3 BD 300400
REGLO Analog Infusion pump Ismatec ISM 829
StereoInvestigator system StereoInvestigator version 11.07
BX53 microscope BX53 microscope
self-assorted stereology Visiview
Axiophot2 Axiophot2

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References

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तंत्रिका इश्यू १२७ stereology ऑप्टिकल fractionator पार्किंसंस रोग सेल काउंट्स dopaminergic न्यूरॉन्स substantia नाइग्रा
माउस Substantia नाइग्रा में Dopaminergic ंयूरॉन संख्या का Stereological आकलन ऑप्टिकल Fractionator और मानक माइक्रोस्कोपी उपकरण का उपयोग
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Ip, C. W., Cheong, D., Volkmann, J.… More

Ip, C. W., Cheong, D., Volkmann, J. Stereological Estimation of Dopaminergic Neuron Number in the Mouse Substantia Nigra Using the Optical Fractionator and Standard Microscopy Equipment. J. Vis. Exp. (127), e56103, doi:10.3791/56103 (2017).

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