Stereologiche stima del numero di neuroni dopaminergici nel Nigra di Substantia del Mouse utilizzando il frazionatore ottica e microscopia Standard attrezzature

Summary

Questo lavoro presenta un protocollo passo-passo per la valutazione imparziale stereologiche dei numeri di un neurone delle cellule dopaminergiche nel nigra di substantia del mouse utilizzando attrezzature di microscopia standard (cioè, un microscopio ottico, una tabella di oggetto motorizzato (x, y, z aereo) e software di pubblico dominio per analisi digitale delle immagini.

Abstract

Nella ricerca pre-clinica la malattia del Parkinson, analisi del tratto nigrostriatal, compresa la quantificazione di perdita di neuroni dopaminergici nel nigra di substantia, è essenziale. Per stimare il numero di neuroni dopaminergici totale, imparziale stereology utilizzando il metodo ottico frazionatore è attualmente considerato il gold standard. Poiché la teoria dietro il metodo ottico frazionatore è complessa e stereology è difficile da raggiungere senza attrezzature specializzate, esistono vari sistemi commercialmente disponibili stereology completi che includono il software necessario, puramente per cella contando i motivi. Dal momento che l'acquisto di un setup stereology specializzato non è sempre fattibile, per molte ragioni, questo rapporto descrive un metodo per la stima stereologiche del cellulare di un neurone dopaminergico conteggi mediante microscopia standard attrezzature, compreso un microscopio ottico, un tavola di oggetto (x, y, z aereo) motorizzata con software di imaging e un computer per l'analisi. È dato una spiegazione dettagliata su come eseguire stereologiche quantificazione mediante il metodo ottico frazionatore, e file di pre-programmati per il calcolo dei conteggi delle cellule stimato vengono forniti. Per valutare la precisione di questo metodo, è stato effettuato un confronto con i dati ottenuti da un apparato di stereology commercialmente disponibili. Numeri paragonabili delle cellule sono stati trovati usando questo protocollo e il dispositivo stereology, dimostrando così la precisione di questo protocollo per stereology imparziali.

Introduction

La quantificazione del numero di cellulare di un neurone è fondamentale nella ricerca pre-clinica la malattia del Parkinson per determinare il livello della neurodegenerazione nel nigra di substantia (SN)^1,2. La valutazione imparziale stereologiche del numero delle cellule in una regione di interesse è considerata il gold standard^3,4,5.

Prima dell'avvento di stereology imparziale, il numero dei neuroni nelle sezioni è stato valutato mediante la manipolazione delle cellule contate profili per correggere le probabilità variabile che neuroni entrano in vista in una sezione. Uno dei metodi più comunemente usati era la correzione dell'emocromo quantificati descritto da Abercrombie⁶. Questo metodo ha tentato di prendere in considerazione che le cellule possono essere quantificate in più di una volta se frammenti della stessa cella si trovano nelle sezioni sottili adiacenti. Di conseguenza, Abercrombie e altri autori generato equazioni che ha richiesto le ipotesi circa la forma, dimensione e orientamento delle cellule contate^7,8. Tuttavia, questi presupposti erano solitamente non realizzati e quindi portati a errori sistematici e divergenza dal numero effettivo della cella (cioè, polarizzazione). Inoltre, il bias non potrebbe essere ridotto di campionamento supplementare³.

Per la stima stereologiche di numeri di cellulare usando il frazionatore ottico, principi matematici sono applicati per valutare direttamente i numeri di cellulare direttamente in un volume definito, 3-dimensionale. Il vantaggio di questo metodo è che non comporta ipotesi circa la forma, dimensione e orientamento delle cellule contate. Così, i numeri di cellulare stimato sono più vicini ai valori true e avvicinarsi man mano che aumenta la dimensione del campione (cioè, imparziali)³. Perché molte regole devono essere seguite quando usando stereology per mantenere il metodo imparziale, sono stati sviluppati sistemi di ready-to-use commerciale stereology (per la revisione, Vedi Schmitz e Hof, 2005,⁴). Sistemi specializzati stereology implementano metodi stereologiche basati su progettazione con aprioristicamente definite sonde e sistemi di campionamento per le valutazioni stereologiche che portano all'indipendenza dalla forma, dimensione, distribuzione spaziale e orientamento della cellule per essere analizzati^4,9. Tuttavia, i sistemi di stereology commercialmente disponibili sono costosi; Questo potrebbe limitare implementazione nella ricerca di nuove.

Lo scopo di questo studio era quello di sviluppare una tecnica utilizzabile per la stima stereologiche basati su progettazione della conta delle cellule dopaminergiche nel topo SN, impiegando il metodo ottico frazionatore e utilizzando attrezzature di microscopia standard (cioè, luce microscopio, microscopio standard software e un motorizzato x, y, z fase). Per questo, è presentata una guida passo passo su come elaborare del tessuto di cervello di topo e come stimare i numeri di cell SN utilizzando stereology imparziali basati su progettazione. Inoltre, sono disponibili modelli per il calcolo dei numeri di cellulare stimato e coefficienti di errore (CE).

Il metodo qui descritto non è limitato all'analisi dello SN, ma può essere adattato per l'uso in altre regioni anatomicamente definite del cervello di topo o ratto. Per esempio, stereology imparziale è stato utilizzato per stimare i numeri di cellulare di un neurone l' ippocampo¹⁰ e il locus coeruleus¹¹. Inoltre, tipi cellulari diversi da neuroni, astrociti¹² e microglia¹³, possono essere valutati come bene. Pertanto, questo metodo può essere utile agli scienziati che intendono attuare stereology imparziale nella loro ricerca, ma non sono disposti a spendere un sacco di soldi per l'acquisto di un sistema di ansia.

Protocol

tutte le linee guida internazionali, nazionali e/o istituzionali applicabili per la cura e l'uso di animali sono state seguite. Il protocollo è stato approvato dalle autorità locali presso il Regierung von Unterfranken, Wuerzburg, Germania.

1. trasformazione del tessuto e Immunohistochemistry

1. Euthanize topi con CO ₂ o qualsiasi altro metodo approvato.
2. Profumi sei via di topo maschio C56Bl/6N 12-week-old con 10 mL di 0.1 M tampone fosfato salino (PBS) utilizzando un ago 25-G e una pompa di infusione, seguito da 70 mL di paraformaldeide al 4% (PFA) in PBS 0.1 M.
   Attenzione: PFA è tossici, allergenici e cancerogeni.
3. Sezionare il cervello di topo nell'aereo della corona con un'affettatrice di matrice cervello alla regione di +0,74 mm dal Bregma (Figura 25, Paxinos e Franklin del mouse brain atlas ¹⁴).
4. Mettere la parte dorsale del cervello, compreso il SN, nel 4% PFA in 0.1 M PBS per 1D a 4 ° C per immersione-fissazione.
5. PFA per soluzione al 30% saccarosio/0.1 mol PBS per cryo-protezione di exchange e incubare per un altro 2 d a 4 ° C.
6. Mettere la parte dorsale del cervello in un cryomold riempita con temperatura di taglio ottimale (OCT) compound e lentamente congelare il tessuto in isopentano raffreddato a ghiaccio secco liquido.
   Attenzione: Il ghiaccio secco è estremamente freddo (-78 ° C); utilizzare dispositivi di protezione individuale (PPE), inclusi i guanti, mentre si lavora con ghiaccio secco. Ghiaccio secco evapora in CO ₂; Pertanto, lavorare sotto cappa aspirante.
7. In serie tagliare 30-µm cryo-sezioni nell'aereo della corona e raccogliere le sezioni, a partire 2,46 mm dal Bregma (Figura 51, Paxinos e Franklin del mouse brain atlas ¹⁴) e termina a 4,04 mm dal Bregma (Figura 64, Paxinos e Franklin del mouse brain atlas ¹⁴).
8. Memorizzare quattro serie in tubi che sono pieni di crioprotettore (30% glicerolo, ethoxyethanol 30% e 40% PBS) a-20 ° C. Durante la procedura di taglio, contrassegnare l'emisfero destro perforando un piccolo foro nella regione superiore del tronco cerebrale.
9. Per la macchiatura di immunohistochemical, seleziona una serie di sezioni per topo. Preincubate digalleggiante sezioni per 1 h a 10% di siero di capra normale (NGS)/2% BSA/0.5% detergente a 0.1 mol PBS su un agitatore. Incubare le sezioni con anticorpo di coniglio anti-topo tirosina idrossilasi (TH; 1:1,000 diluizione) diluito in 2% NGS/2% BSA/0.5% detergente a 0.1 mol PBS durante la notte a 4 ° C.
10. Applica secondaria anticorpi contro coniglio Igs (diluizione 1: 100) per 2 h a temperatura ambiente, seguita da reagente avidina/biotina (diluizione 1: 100). Incubare e macchia con 3,3-diaminobenzidina-tetrahydrochloride (DAB) e H ₂ O ₂. Montare i profili dopo la loro colorazione su vetrini rivestiti oggetto.
    Nota: TH + i neuroni dopaminergici SN sono mostrati in Figura 1a. Macchiando di una serie, una media di 13 sezioni di SN, che si estende dalla rostrale caudale porzioni del SN pars compacta (SNpc) e reticulata, sono macchiati per animale ( Figura 1b). Le sezioni sono separate da 120 µm (1/4 serie) ( Figura 1C).
    Attenzione: DAB è un sospetto cancerogeno. È tossico per inalazione e contatto. Uso dei DPI quando si lavora con DAB.

2. Acquisizione di immagini

1. TH catturare immunohistochemically macchiate sezioni SN digitalmente utilizzando software di imaging che è accoppiato ad un microscopio. Analizzare separatamente ogni sezione della one serie.
2. Utilizzare l'opzione di diapositiva di scansione del software di imaging. Salvare in formato TIFF per immagini di alta qualità (Figura 2).
   Nota: La risoluzione dell'immagine è 312 pixel per cm.
3. Press " Acquire " per aprire la finestra di acquisizione (Figura 2a).
4. Impostare il binning " 2 " per le immagini in scala di grigi.
   Nota: L'acquisizione di immagini in scala di grigi invece di immagini a colori riduce le dimensioni del file di immagine dello stack finale (Figura 2a).
5. Fare clic su " Show Live " nella finestra di acquisizione per aprire una nuova finestra che mostra l'immagine dal vivo della sezione (Figura 2 un e b).
6. Fare clic su " palco " nella finestra di acquisizione. Scegliere " Scan Slide " nel menu a discesa e selezionare la casella (Figura 2C).
   Nota: In questo modo l'acquisizione e l'allineamento delle immagini SN altamente ingrandite (630 ingrandimenti) in x, y-aereo, nonché l'acquisizione di immagini di pila con una distanza tra due immagini consecutive di 1 µm nel piano z, che coprono una gamma totale di 13 µ m.
7. selezionare l'obiettivo X 2,5 per cercare il SN.
8. Cambiare l'obiettivo a 63 x.
9. Definire l'angolo superiore sinistro (TopLeft) (Figura 2C) e l'angolo inferiore destro (LowRight) (figura 2d) della sezione cliccando su " Set. "
10. Fare clic su " serie Z " e controllare la " serie Z-Plane " scatola (Figura 2e).
11. Determinare lo spessore effettivo montato delle sezioni a conteggio scelti tre siti per ogni sezione utilizzando il software di imaging. Per questo, fare clic su " Vista Top Offset " per definire la parte superiore della sezione (Figura 2e) e quindi fare clic su " interrompere Vista Top " (Figura 2f). Successivamente, fare clic su " vista inferiore Offset " (Figura 2f) e quindi fare clic su " smettere di vedere a fondo " (Figura 2 g). Annotare lo spessore della sezione.
12. Sottrarre 3 µm (zona di guardia) dall'alto offset e digitare il risultato nello slot offset superiore (Figura 2 h). Sottrarre 13 µm (altezza del disector ottico) dal numero di offset superiore e digitare il risultato nello slot offset inferiore (Figura 2i). Selezionare i seguenti parametri: passaggi, 14; dimensioni, 1.00 (Figura 2i).
    Nota: Questo corrisponde allo spessore del piano z-13 µm, con una distanza da 1 µm tra due immagini consecutive.
13. Selezionare la directory dove salvare il file (Figura 2j).
14. Fare clic su " sequenza " per avviare l'acquisizione (Figura 2j).
15. Fare clic su " elaborazione " e selezionare i seguenti parametri: " tutti i piani, " da " di sequenza; " " Montage; " e la " veloce " e " impunture " scatole, con una sovrapposizione di immagine del 10% (Figura 2 k). Iniziare a cucire le immagini cliccando su " avviare ".
    Nota: Questo genererà immagini dello stack per l'analisi (Figura 2 l, Figura 3a -e).

3. Sequenza di valutazione stereologiche

1. eseguire l'analisi di immagini di stack SN utilizzando il NIH ImageJ software versione 4.7.
2. Scaricare i due plugin che sono necessari dal sito ImageJ.nih.gov: la " griglia Overlay " plugin ¹⁵ e la " contatore di cellule " plugin ¹⁶. Installare entrambi i plugin come descritto.
3. Per valutazione stereologiche imparziali, definire i parametri di conteggio come segue: dimensione della griglia, 130 x 130 µm; counting frame, 50 x 50 µm; e ottica disector altezza, 13 & n.181; m.
4. Aprire l'immagine facendo clic sul " File " → " aperto " (Figura 4a) impostare la scala dell'immagine utilizzando la " Analyze " → " Imposta scala " comando (Figura 4b). Per questo passaggio, modificare le dimensioni definite da pixel a µm (Figura 4c).
   Nota: Per le immagini analizzate, 425 pixel corrisponde a 100 µm.
5. Seleziona il " plugin " → " griglia " → " tipo di griglia: linee " comando per inserire in modo casuale una griglia. Verifica la " Offset casuale " casella. Definire le dimensioni di un quadrato all'interno della griglia (griglia-Piazza) come 130 µm x 130 µm = 16.900 µm ² ( Figura 3b e Figura 4 d ed e).
6. Cambiamento di immagine tipo da 16-bit di colore RGB (fare clic su " immagine " → " tipo " → " colore RGB ") (Figura 4f). Individuare la Scissura, come descritto da Baquet et al. ¹⁷. circondare la Scissura con il " strumento pennello " (larghezza della spazzola: 11) ( c nella figura 3 e Figura 4 g -io).
7. Annulla la " Imposta scala " comando facendo clic su " Analyze " → " Imposta scala " → " fare clic su per rimuovere scala " (Figura 4j -l) per consentire l'esecuzione di calcoli in pixel piuttosto di µm.
8. Fare uno screenshot (Figura 4 m), salvare il file di immagine e aprire il nuovo file con ImageJ (Figura 4n). Selezionare " punto " (Figura 4o) e una larghezza del pennello di 25 (p di figura 4). Contrassegnare ogni quadrato della griglia che contattano il SN per il posizionamento di un ottico disector (Figura 4q). Eseguire l'analisi del numero delle cellule in tutti i disectors ottici che sono localizzate completamente o parzialmente all'interno il delineato SN.
9. Selezionare un quadrato della griglia che include parti dello SN. Misura l'angolo superiore sinistro di questa piazza con il cursore in ImageJ per definire gli assi x e y coordinate per iniziare con (Figura 4r).
   Nota: Le coordinate verranno inserite per ottica disector posizionamento utilizzando il " ottico disector posizione " (Figura 4s), come descritto nel passaggio 4.
10. Calcolare la posizione di disector ottico utilizzando il modello di foglio di calcolo dal titolo, " ottica disector posizione, " come descritto nel passaggio 4.
11. Calibrare l'ottica disector (macro scritta da Christopher S. Ward, File supplementare) cliccando su " plugin " → " macro " → " modifica " (Figura 4t), aprire il " opt_dis_ Grid.txt " il file (Figura 4u) e definire le dimensioni del " usergrid " in pixel che corrisponde con la x, dimensione y della disector ottico (Figura 4B). Selezionare una dimensione di 50 µm x 50 µm, in modo che la dimensione di un lato della usergrid è definita come 212,5 pixel (pixel 50 x 4,25).
12. Determinare la posizione del disector ottico nell'immagine dello stack inserendo le coordinate ImageX e ImageY che definiscono il centro della disector ottico (Figura 4B). Eseguire la macro (" macro " → " Esegui Macro ") (Figura 4w).
    Nota: La griglia sparirà dall'immagine dello stack ( figura 3d e Figura 4 x). L'ottica disector verranno mantenute quando si abbassa il piano z ( Figura 3e e Figura 4 x).
13. Selezionare " plugin " → " contatore di cellule " per avviare il plugin di contatore di cellule (Figura 4y). Inizializzare il contatore di cella e selezionare un tipo di marcatore (Figura 4z). Ingrandire l'immagine (fare clic su " + ") ed eseguire la valutazione stereologiche dei numeri delle cellule ad un ingrandimento del 200%.
14. Identificazione dopaminergici neuronale perikarya dalla loro arrotondati o ovoidale delle cellule e forma dimensione ( Figura 1a). Quantificare il numero di celle utilizzando regole STEREOLOGICHE.
    Nota: Poiché il disector ottico è un cubo 3-dimensionale ( Figura 5a), definire i lati di esclusione come davanti, a sinistra e i lati superiore del cubo (rosso). Di conseguenza, don ' conteggio t TH + cellule che vengono a contatto con la linea rossa (sinistra e frontale) o il lato superiore. Aggiungere i risultati dei conteggi delle cellule per il file di foglio di calcolo preparato dal titolo, " calcolo del conteggio delle cellule " (passo 5).
15. Secondo l'immagine di SN, calcolare il quadrato della griglia successivo in cui inserire il disector ottico per il successivo conteggio delle cellule, utilizzando x, y passi la dimensione della griglia sovrastante ( Figura 5b) e il " ottico disector posizione " modello di foglio di calcolo, come descritto nel passaggio 4.
16. Eseguire una stima della cella numero utilizzando il " calcolo del conteggio delle cellule " foglio di calcolo (passo 5).

4. Calcolo di ottica Disector posizione utilizzando il " ottico Disector posizione " Spreadsheet Template

1. calcolare la dimensione e la posizione di ogni ottico disector per essere inserito in griglia sovrastante all'interno della struttura del (SN Figura 5b) utilizzando il " ottico disector position.xlsx " file di foglio di calcolo (File supplementare).
2. Inserire la conversione del pixel al µm, come definito dal " Imposta scala " comando, nelle posizioni di giallo marcate del " ottico disector position.xlsx " file ( Figura 6a e File supplementare ).
3. Inserire la dimensione prevista del disector ottico e la dimensione del quadrato della griglia della griglia sovrastante, definita dalla lunghezza di un lato (in µm), nelle posizioni contrassegnate arancione.
   Nota: I risultati sono raffigurati nelle caselle accanto alle caselle arancione rosse.
4. Iniziare con il quadrato della griglia all'interno della struttura di SN che è stata determinata come il punto di partenza (un-quadrato della griglia è stato selezionato per cominciare, come al punto 3.9, sopra).
5. Inserisci le coordinate x e y, come misurato nel passaggio 3.9, nelle caselle verdi del file (utilizzando questi valori, la x, y coordinate per il centro della disector ottico all'interno di questa piazza prima vengono calcolate e i risultati sono raffigurati nelle caselle blu). Eseguire la macro opt_dis_grid.txt (File supplementare).
6. Calcolare la x, y coordinate del disectors ottico consecutivi inserendo la distanza del quadrato della griglia (misurata in numero di quadrati) rispetto al primo quadrato della griglia-(scatole marroni).
   Nota: + x: quadrato della griglia si trova a destra; -x:-quadrato della griglia si trova a sinistra; + y:-quadrato della griglia si trova nella parte inferiore; -y:-quadrato della griglia si trova nella parte superiore. Risultati sono riportati nelle caselle grigie.

5. Stima della cella numero utilizzando il " calcolo del conteggio delle cellule " foglio di calcolo

1. Calcola la stima del numero di cellule TH + SN per animale (N) utilizzando la formula pubblicata da West et al., 1991 ³, dove ∑ Q ^– è definito come il numero totale di TH + neuroni contati in tutte le disectors ottico della sezione di un cervello.
   Nota: L'altezza dell'ottica disector (h) in relazione allo spessore misurato della sezione (t) è incluso nell'equazione. La frazione di campionamento di zona (asf) è definita come la proporzione della zona (A) delle dimensioni della cornice ottica disector (un disector ottico) nelle dimensioni del quadrato della griglia (x, y passo) (un ottico disector/A x, y passo) ( Figura 3b) e la frazione di campionamento di sezione (ssf) è definita come la proporzione delle sezioni del cervello intero in serie taglio:
   
   per garantire alta qualità quantitativa una stima, il coefficiente di errore (CE) deve essere inferiore a 0,10. Determinare la CE utilizzando la formula di Keuker et al., 2001 ¹⁰:
   
2. per la stereologiche stima del numero di ogni cella all'interno del SN mouse, inserire le informazioni indicate per quanto riguarda il numero totale di serie generato per topo, l'altezza della disector ottico, la x, y della disector ottico (un disector ottico, in µm ²), x, y zona del quadrato della griglia (x, y passo in µm ²), e il valore medio misurato lo spessore della sezione (in µm) nelle caselle gialle utilizzando il " calcolo della cella count.xlsx " file di foglio di calcolo ( Figura 6b e File supplementare ).
3. Analizzare ogni sezione SN dall'animale stesso, come descritto nel passaggio 5.
I conteggi delle cellule
4. insert per ogni ottica disector nelle caselle grigie, ogni riga che fa riferimento a una sezione di SN, utilizzando il " calcolo della cella count.xlsx " file di foglio di calcolo (File supplementare).
   Nota: Il numero stimato delle cellule e la CE calcolata sono raffigurati nelle caselle blu ( Figura 6b).

6. Stima del numero di cellule utilizzando un sistema Stereology commercialmente disponibili

numero di cellulare

1. Start la stima di dopaminergici SNpc cliccando su " sonde " → " ottico frazionatore Workflow " aprire il frazionatore ottico Finestra Workflow.
   Nota: Una nuova finestra apparirà per determinare se una nuova serie di SN sta per essere contati.
2. Avviare una nuova serie di sezioni di TH + SN facendo " avviare un nuovo soggetto " nella finestra pop-up.
3. Passare attraverso le varie fasi del flusso di lavoro frazionatore ottico. Impostare il soggetto nel primo passaggio. Per questo, inserire l'investigatore ' s nome, l'oggetto ' nome s (SN group) e altre informazioni utili. Inserire i numeri delle sezioni a contare per questo SN. Inserire lo spessore del taglio delle sezioni del tessuto. Inserire l'intervallo di sezione, che in questo caso è di quattro. Inserire il numero a caso determinata sezione per iniziare con.
4. Nel secondo passaggio, impostare il microscopio a basso ingrandimento (obiettivo 2 X) e selezionare " Mag obiettivo 2x " dal menu.
5. Nel passaggio 3, tracciare l'area di interesse con il tasto sinistro del mouse, che è la Scissura, come descritto da Baquet et al., 2009 ¹⁷.
6. Impostare il microscopio ad alto ingrandimento nel passaggio 4. Per questo, modificare l'obiettivo a 100 X e selezionare " lente X Mag 100 " dal menu a discesa.
7. Misurare lo spessore montato nel passaggio 5 di messa a fuoco verso l'alto e verso il basso della sezione.
8. Nel passaggio 6, definire le dimensioni della cornice di conteggio come 50 x 50 µm; questa è la dimensione dell'ottica disector (x, y).
9. Nel passaggio 7, impostare la dimensione della griglia di campionamento casuale sistematico (SRS) come 130 x 130 µm.
10. Entrare in una zona di guardia 3-µm nel passaggio 8.
11. Salvare le impostazioni nel passaggio 9.
12. Infine, contare le cellule dopaminergiche TH + in ognuna del disectors ottico all'interno della griglia SRS nel passaggio 10 del Workflow frazionatore ottico. Per questo, avviare cliccando sul " conteggio " pulsante.
13. Dopo aver terminato una sezione, fare clic sui " iniziare la sezione successiva " pulsante per avviare il flusso di lavoro frazionatore ottico della prossima sezione SN della stessa serie e SN.
14. Quando l'ultima sezione di SN della serie SN one è stata quantificata, fare clic su " ho ' ve finito Counting. "
15. Fare clic sul " Visualizza i risultati del " pulsante per visualizzare i risultati del campionamento stereology.

Representative Results

Usando il metodo presentato, il numero stimato di TH + neuroni dopaminergici in SN ha variato fra cellule 7.363 e 7.987 a destra e, nella parte sinistra SN, tra le celle di 7.446 e 7.904. Così, il numero medio dei neuroni dopaminergici (± SEM) era 7.647 ± 83 cellule per il diritto SN e 7.675 ± 66 per la sinistra SN. La CE calcolata per ciascun animale è stato inferiore a 0,08 (gamma: 0,073-0,079) (Figura 7). Per accertare la comparabilità di questo metodo con i sistemi disponibili in commercio e specializzata stereology, SN i numeri delle cellule inoltre sono stati quantificati utilizzando il programma di installazione di stereology (Figura 8). I parametri di conteggio sono stati: dimensione della griglia, 130 x 130 µm; Counting frame, 50 x 50 µm; zona di guardia, 3 µm. sezioni sono stati analizzati con un 100x / 1.25 obiettivo di apertura numerica su un microscopio BX53. La popolazione stimata di neuroni di TH + SN utilizzando lo spessore di sezione media variato da 7.067 a 8.105 cellule/SN e 7.164 a 8.015 cellule/SN sui lati sinistro e destro, rispettivamente. Il numero medio di un neurone è stato calcolato come 7.535 ± 155 cellule per il diritto SN e 7.699 ± 128 celle per la sinistra SN. La CE Gundersen (m = 1) è stato ≤0.08 in ogni SN quantificato (Figura 7). Analisi statistica utilizzando il test t di Student accoppiati non ha rivelato differenze significative tra i conteggi delle cellule TH + dei due metodi a destra o a sinistra SN (media ± SEM; a destra: t (5) = 0.9524, P > 0,05; sinistra: t (5) = 0.2928, P > 0.05) (Figura 7 ).

Figura 1. Immagini rappresentative di mouse SN macchiato per i neuroni dopaminergici.
(a) una panoramica di un rappresentante del mouse SN viene visualizzata nel pannello superiore. Si noti il piccolo foro nella parte superiore del tronco cerebrale destro che segna il lato destro. Maggiore ingrandimento di inset (scatola nera) raffigura TH + i neuroni dopaminergici. (b) una serie di sezioni SN TH-macchiato è mostrato, che copre l'intero mouse SN da rostrale per caudale. (c) ogni sezione è separato dalla sezione consecutiva da 120 µm. barre della scala: un, pannello superiore, 500 µm; pannello inferiore, grande immagine, 100 µm; pannello inferiore, inserto, 50 µm; b, 500 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Nella figura 2. Acquisizione di immagini per analisi stereologiche utilizzando il software di imaging.
(a) freccia rossa: aprire la finestra di acquisizione; freccia verde: impostare il binning "2;" freccia blu: Visualizza l'immagine dal vivo. (b) si aprirà una nuova finestra che mostra l'immagine dal vivo (freccia rossa). freccia rossa (c) : selezionare il menu "Stage"; freccia verde: selezionare l'opzione "Scansione diapositiva"; freccia blu: selezionare l'opzione "Scansione Slide"; freccia nera: definire l'angolo superiore sinistro. freccia nera (d) : definire l'angolo inferiore destro. freccia rossa (e) : selezionare il menu "Serie Z"; freccia verde: verifica della "serie Z-Plane"; freccia blu: avviare la "Vista Top Offset" per cercare la parte superiore della sezione. freccia rossa (f) : fare clic su "Stop Top View" per definire la parte superiore della sezione; freccia verde: avviare "Vista inferiore Offset" per cercare la parte inferiore della sezione. freccia rossa (g) : fare clic su "Stop vista inferiore" per definire la parte inferiore della sezione. freccia rossa (h) : sottrarre la guardia 3-µm zona da "Top Offset" e inserisce il risultato nella fessura "Top Offset". freccia rossa (i) : sottrarre 13 µm dal numero "Top Offset" e inserire il risultato nella fessura "Offset di fondo"; freccia verde: definire 14 gradini che corrisponde allo spessore piano z di 13 µm; freccia blu: definire una dimensione di 1.00 µm che corrisponde ad una distanza di 1-µm tra due immagini consecutive. freccia rossa (j) : selezionare la directory in cui salvare il file; freccia blu: fare clic su "Sequenza" per avviare l'acquisizione delle immagini. freccia rossa (k) : fare clic su "Elaborazione;" controllare i seguenti parametri: freccia verde: "Tutti i piani;" freccia blu: "Sequenza"; freccia nera: "Montage"; freccia grigia: "Cuciture"; viola freccia: veloce. (l) fare clic sulla freccia gialla per iniziare a cucire le immagini. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

Nella figura 3. Elaborazione delle immagini per analisi STEREOLOGICHE.
(a) un'immagine dello stack di esempio tratto da un mouse SN. (b e c) Dopo l'inserimento randomizzato di una griglia che ricopre la SN (linee turchese, b), la SN è delineato in una seconda fase (linea blu, c). (d) un disector ottico viene inserita l'immagine dello stack SN. (e) sei piani focali consecutivi all'interno dell'immagine dello stack SN coprono totale nel piano z-13 µm. Barre di scala: a-d, 100 µm; e, 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Nella figura 4. Sequenza di valutazione stereologiche usando ImageJ.
(a) freccia rossa: fare clic su "File" → "Apri" per aprire un immagine dello stack. freccia rossa (b) : fare clic su "Analizzare" → "Imposta scala". frecce rosse (c) : definire i parametri per la "distanza in pixel," "Noto distanza" e "Unità di lunghezza." freccia rossa (d) : selezionare "Plugin" → "Griglia." freccia rossa (e) : selezionare "Linee;" freccia verde: verifica "Random Offset;" freccia blu: inserire la dimensione della griglia in µm². freccia rossa (f) : fare clic su "Immagine" → "Tipo" → "RGB colore." freccia rossa (g) : selezionare lo strumento"pennello" freccia verde: definire la larghezza del"pennello" come 11. freccia rossa (h) : inizia a circondare la scissura. (i) rosso frecce raffigurano circondata SNpc. (j) freccia rossa: fare clic su "Analizzare" → "Imposta scala" e rimuovere la scala (k) cliccando su "Fare clic per rimuovere scala," raffigurato dal rosso freccia. Nota il cambiamento da µm (k, verde freccia) per pixel (freccial, rosso). (m) prendere uno screenshot (freccia rossa punta verso lo screenshot) e (n) aprire il file di immagine screenshot con ImageJ. freccia rossa (o) : fare clic sul "Punto". freccia rossa (p) : inserire una larghezza del pennello di 25. (q) la freccia rossa raffigura la marcata griglia-piazze che contattare la scissura. (r) la freccia rossa indica l'angolo superiore sinistro di un quadrato della griglia che include parte del SN. Mettendo il cursore a questo punto, le coordinate x, y per la "posizione ottico disector" (passaggio 4) vengono misurati e inserito il modello "ottico disector position.xlsx" (freccias, rosso). freccia rossa (t) : selezionare "Plugin" →"Macro" → "modifica". freccia rossa (u) : selezionare il file "opt_dis_grid.txt". (V)si aprirà una nuova finestra. Inserire le dimensioni del "usergrid", in pixel (v, freccia rossa) e la x, y coordinate (v, freccia verde). (w) eseguire la macro "opt_dis_grid.txt" (freccia rossa). (x) un disector ottico apparirà al centro della griglia-Piazza precedentemente definita (freccia rossa). freccia rossa (y) : fare clic su "Plugins" → "Contatore di cellule". (z) inizializzare il contatore di cellule (freccia rossa) e selezionare un tipo di indicatore (freccia verde). Per favore clicca qui per scaricare questo file.

Nella figura 5. Posizionamento del disector ottico.
(a) illustrazione della disector ottico utilizzato per stereology imparziali. Il disector ottico è un cubo 3-dimensionale. Tre celle schematiche sono visibili all'interno del disector ottico. Le regole stereologiche per la quantificazione delle cellule indicano che cellule toccare i lati con etichettati rossi del disector ottico sono escluso (globulo rosso), mentre le cellule che a contatto con il verde con etichettati lati sono inclusi nella cella conteggio (cellule verde). (b) un disector ottico viene inserito in ogni quadrato della griglia che viene a contatto con il SN. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Nella figura 6. Calcolo della posizione ottico disector e stima del numero di cellulare.
(a) un esempio di calcolo effettuato per il posizionamento del disector ottico. (b) un esempio di stima del numero totale delle cellule. I numeri delle cellule quantificati sono inseriti nelle caselle grigie, mentre i parametri di quantificazione stereologiche vengono inseriti nelle caselle gialle. Il numero stimato delle cellule e la CE vengono visualizzati nelle caselle blu. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Nella figura 7. Confronto della cella conteggio parametro.
(a) confrontando il numero stimato TH + delle cellule del mouse destro e sinistro SN ottenuti dal metodo stereologiche descritto con i dati acquisiti da analisi utilizzando il sistema commercialmente disponibile stereology non ha mostrato differenze significative. Un elenco dettagliato dei dati ottenuti della destra (b) e sinistra (c) SN è dato con il numero stimato delle cellule per animale, il numero di cellule contate in realtà, il numero di sezioni contati e il numero di siti di campionamento (cioè, contato il numero di quadrati della griglia) per entrambi i metodi. I valori nei grafici a barre sono la media ± SEM dei dati da 6 topi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8. Quantificazione delle cellule con il sistema stereology commercialmente disponibili.
(a-b) Viene disegnato il contorno dello SN e (c) le posizioni del disectors ottico sono automaticamente determinato. (d-e) Ogni disector ottico viene analizzato per numero di cellulare di messa a fuoco lungo il piano z. Sei piani focali consecutivi all'interno del SN sono mostrati. Le linee rosse e verdi corrispondono alla disector ottico. Barre di scala: a-d, 100 µm; e, 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Supplementare File 1. opt_dis_grid.txt Per favore clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 2. Ottica disector position.xlsx per favore clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 3. Calcolo della cella count.xlsx per favore clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

Stereology inizia con lavorazione del tessuto. Il taglio seriale del tessuto SN deve essere eseguito con attenzione per evitare la perdita delle sezioni durante l'analisi STEREOLOGICHE. Inoltre, un passo essenziale consiste nel contrassegnare un emisfero al fine di distinguere la destra dalla sinistra SN durante l'esecuzione di ansia. Immissione di un piccolo foro nella parte superiore del tronco cerebrale generato i risultati migliori nello studio presentato. Inoltre, dal lavorare con le esigenze di metodo frazionatore ottico che il tessuto è tagliato in sezioni spesse di circa 30-40 µm, anziché il più comunemente usato in immunoistochimica, anticorpi e altre penetrazione del tessuto fluido di incubazione durante 5-10 µm la macchiatura di Immunohistochemical deve essere garantita la necessaria, come utilizzando un detergente.

La macchiatura immunohistochemical per i neuroni dopaminergici usando l'anticorpo TH etichette SN neuroni, così come i neuroni all'interno area tegmentale ventrale (VTA), che si trova medialmente da SN e neuroni nel campo retrorubral. Così, un altro punto critico quando si eseguono stereology dello SN è conoscenza del mouse anatomia SN, dato che i neuroni SN non possono essere visualizzati esclusivamente di immunohistochemical standard o colorazione istologica. Invece, il riconoscimento dei limiti anatomici, come il nucleo subtalamico, il campo retrorubral e il VTA, sono importanti per determinare l'intera estensione del SN^17,18,19.

Valutazione del numero un neurone deve essere affidabile e riproducibile. Anche se vari gruppi utilizzano configurazioni stereology commercialmente disponibili, numeri di TH + neuroni dopaminergici SN nei topi wt, prelevati da diverse pubblicazioni, variano in numero^17,20. A Baquet et al., analisi stereologiche basati su progettazione in 3 a 4-mese-vecchio maschi e femminili C57BL/6J topi wt utilizzando un sistema disponibile in commercio stereology ha rivelato un stimato 8.716 ± 338 TH + SN i neuroni dopaminergici (gamma: 7.546-9.869)¹⁷ . Al contrario, Smeyne et al. nei meno cellule TH + SN topo C57BL/6J maschio 9 a 16-week-old che ha ricevuto i.p. Salina 0,9%, che vanno da 6.302 ± 262 celle a 6.861 ± 338 celle, utilizzando una versione più recente della stessa stereology sistema²⁰. Tuttavia, il primo scrittore fu anche l'ultimo autore nella Baquet et al. carta, escludendo quindi i vari gradi di esperienza come il motivo per i risultati differenti. Questi dati contraddittori riflettono l'esigenza di un metodo di quantificazione stereologiche che Mostra meno variabilità. Per verificare la tecnica di quantificazione e la formula utilizzata, è stato effettuato un confronto dei risultati del conteggio del numero delle cellule SN utilizzando il metodo descritto con una quantificazione utilizzando l'installazione stereology commercialmente disponibili. Analisi statistica non ha mostrato differenze significative quando si confrontano i numeri di TH + neuroni dopaminergici nella parte destra e sinistra SN dei topi wt determinato utilizzando entrambe le tecniche di quantificazione delle cellule, così dimostrando che questo metodo è fattibile per la stereologiche stima dei neuroni SN in topi.

Il vantaggio principale del metodo descritto è che riduce i costi che sono associati solitamente con l'applicazione delle tecniche di ansia per il conteggio delle cellule. Un secondo vantaggio è che, per il metodo descritto, pila immagini dello SN vengono salvati e possono essere analizzati in qualsiasi momento (anche contemporaneamente) da un altro ricercatore. Inoltre, l'acquisizione e l'analisi delle immagini di fluorescenza sono possibili con questo metodo, perché immagini in scala di grigi possono essere colorati con le "tabelle di ricerca" in ImageJ. Tuttavia, ci sono limitazioni a questo studio. In primo luogo, la quantificazione del numero delle cellule è più tempo (50% circa) di quantificazione con il sistema stereology commercialmente disponibili. Questo è principalmente per due motivi: 1. stack immagini dello SN devono essere prese e 2. calcolo del posizionamento ottico disector all'interno di ogni SN e calcolo del numero di cellule stimato e CE devono essere eseguite manualmente mediante i modelli di calcolo. In secondo luogo, almeno con il sistema disponibile nel nostro laboratorio, l'analisi può essere eseguita solo su immagini in scala di grigi a causa del formato di file di grandi dimensioni di immagini a colori, che non può essere elaborato da ImageJ. Questo potrebbe rappresentare un problema se c'è un bisogno di quantificare due popolazioni differenti delle cellule allo stesso tempo in una doppia macchia. Potrebbe essere più difficile distinguere due popolazioni di cellule diversamente colorate nelle immagini in scala di grigi. Pertanto, sebbene un tavolino motorizzato (x, y, z aereo) e il corrispondente software sono disponibili in molti laboratori che lavorano con campioni istologici, la gestione e la qualità delle immagini dello stack dipenderà il software di microscopio e le prestazioni di il computer collegato.

Ci sono modi possibili per superare i limiti. Utilizzando i modelli di calcolo che abbiamo sviluppato, la programmazione di macro per automatizzare alcuni processi eseguiti attualmente manualmente potrebbe ridurre errori o imprecisioni durante la valutazione stereologiche e accelerare la velocità di lavoro. Inoltre, con il continuo sviluppo di ImageJ e altro software di imaging, come pure con sempre maggiore potenza di elaborazione del computer, dimensioni di file immagine non dovrebbero rappresentare un problema nel prossimo futuro. Di conseguenza, analisi di immagini a colori luminoso-campo saranno gestibili con la tecnica descritta.

La tecnica descritta non è limitata all'analisi di cellule TH + SN, ma può essere espansa per analizzare altri tipi di cellule e le regioni del cervello di roditori. Per questo, devono essere determinati i confini anatomici della regione di interesse e la macchiatura rispettivo deve essere eseguita. Inoltre, questa tecnica può essere adattata alle sezioni più spesse. Per questo, l'acquisizione di immagini dello stack dovrà essere adattato per fornire altre immagini dello stack. Ad esempio, se 40 µm di spessore sezione è necessari, l'effettivo montato spessore della sezione dopo colorazione tissutale deve essere valutato per determinare l'altezza necessaria della disector ottico. Sottrarre 6 µm (zona di guardia 3-µm nella parte superiore e inferiore) dello spessore medio del tessuto e prendere il risultato come l'altezza della disector ottico.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paxinos mouse atlas			The Mouse Brain George Paxinos Keith B.J.FranklinCopyright @2001 by Academic Press CD Rom designet & created by Paul Halasz
brain matrix slicer mouse	Zivic Instruments	BSMAS 001-1
paraformaldehyde	Merck	1040051000
sucrose /D(+) Saccharose	Roth	4621.1
isopentane	Roth	3927.1
glycerol	Merck	1040931000
Ethanol	Sigma Aldrich	32205-1L
Name	Company	Catalog Number	Comments
phosphate buffered saline ingredients:
sodium chloride	Sigma Aldrich	31434-1KG-R
potassium dihydrogen phosphate	Merck	1048731000
di-sodium hydrogen phosphate dihydrate	Merck	1065801000
potassium chloride	Merck	1049360500
normal goat serum	Dako	X0907
bovine serum albumin	Sigma	A4503-100G
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100-100ml	detergent
3,3-Diaminobenzidine-tetrahydrochlorid/DAB tablets 10mg pH 7.0	Kem En Tec	4170
H2O2/ Hydrogen peroxide 30%	Merck	1072090250
avidin/biotin reagent	Thermo Scientific	32050	Standard Ultra Sensitive ABC Staining Kit, 1:100
rabbit anti mouse tyrosine hydroxylase antibody	abcam	Ab112	1:1000
biotinylated goat-anti-rabbit IgG H+L	vector laboratories	BA-1000	1:100
StereoInvestigator version 11.07	MBF
BX53 microscope	Olympus
Visiview	Visitron Systems GmbH	3.3.0.2
Axiophot2	Zeiss
ImageJ software	NIH	Version 4.7
Tissue-TEK OCT	Sakura	4583
dry ice
grid overlay plugin	Wayne Rasband		https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html
cell counter plugin	Kurt de Vos		https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html).
optical disector macro	Christopher Ward
C57Bl/6N male mice	Charles River, Germany
SuperFrost Plus coated object slides	Langenbrinck, Germany
25G needle Microlance 3	BD	300400
REGLO Analog Infusion pump	Ismatec	ISM 829
StereoInvestigator system			StereoInvestigator version 11.07
BX53 microscope			BX53 microscope
self-assorted stereology			Visiview
Axiophot2			Axiophot2