Stereologischen Schätzung der dopaminergen Neuron Nummer in der Maus Substantia Nigra mit dem optischen Plasmafraktionierer und Standard-Mikroskopie-Ausrüstung

Summary

Dieses Werk stellt eine schrittweise Protokoll für die unparteiischen stereologischen Schätzung der dopaminergen neuronalen Zellzahlen in der Maus Substantia Nigra mit standard-Mikroskopie-Ausrüstung (z. B. einem Lichtmikroskop eine motorisierte Objekttabelle (X, y, z Flugzeug) und Public Domain-Software für die digitale Bildanalyse.

Abstract

In präklinischen Krankheit Parkinson Forschung unbedingt Analyse des Nigrostriatal Trakt, einschließlich Quantifizierung der dopaminergen Neuronenverlust in der Substantia Nigra. Um die gesamte dopaminergen Neuron Anzahl abschätzen zu können, gilt unvoreingenommene Stereologie mit der optischen Plasmafraktionierer-Methode heute der Goldstandard. Da die Theorie hinter der optischen Plasmafraktionierer Methode Komplex ist und Stereologie schwierig ist, ohne spezielle Ausrüstung zu erreichen, sind mehrere handelsübliche komplette Stereologie-Systeme, die die notwendige Software enthalten, rein vorhanden für Zelle zählen Gründe. Da Kauf eine spezialisierte Stereologie Setup nicht immer möglich, aus vielen Gründen ist, dieser Bericht beschreibt eine Methode für die stereologischen Schätzung der dopaminergen neuronale Zelle mit standard-Mikroskopie zählt, einschließlich einem Lichtmikroskop eine motorisierte Objekttabelle (X, y, Z-Ebene) mit imaging-Software und einem Computer für Analyse. Eine schrittweise Erklärung wird zum stereologischen Quantifizierung der optischen Plasmafraktionierer Methode durchführen, und vorprogrammierte Dateien für die Berechnung der geschätzten Zellzahlen werden zur Verfügung gestellt. Um die Genauigkeit dieser Methode zu bewerten, wurde ein Vergleich mit Daten aus einem handelsüblichen Stereologie Apparat durchgeführt. Vergleichbare Zellzahlen wurden durch dieses Protokoll und dem Stereologie Gerät, so zeigen die Präzision dieses Protokolls für unvoreingenommene Stereologie gefunden.

Introduction

Die Quantifizierung der neuronalen Zellennummer ist von zentraler Bedeutung in der präklinischen Krankheit Parkinson Forschung zur Bestimmung der Höhe der Neurodegeneration in der Substantia Nigra (SN)^1,2. Die unparteiische stereologischen Schätzung der Zellzahl in einer Region von Interesse gilt als der Goldstandard^3,4,5.

Vor dem Aufkommen der unvoreingenommene Stereologie wurde die Anzahl der Neuronen in den Abschnitten bewertet, durch Manipulation der gezählten Zelle Profile für die Variable Wahrscheinlichkeiten zu korrigieren, dass Neuronen in Sicht in einem Abschnitt kommen. Eine der am häufigsten verwendeten Methoden wurde die Korrektur des quantifizierten Zellenzahlen von Abercrombie⁶beschrieben. Diese Methode versucht, zu berücksichtigen, dass die Zellen mehr als einmal quantifiziert werden können, wenn in benachbarten Dünnschliffe Fragmente der gleichen Zelle gefunden werden. Aus diesem Grund generiert Abercrombie und anderen Autoren Gleichungen, die Annahmen über die Form, Größe und Ausrichtung der gezählten Zellen^7,8erforderlich. Diese Annahmen wurden jedoch in der Regel nicht realisiert und daher führte zu systematischen Fehlern und Abweichungen von der tatsächlichen Zellzahl (d. h. Bias). Darüber hinaus konnte die Vorspannung nicht durch zusätzliche Probenahme³reduziert werden.

Für die stereologischen Schätzung der Zelle Zahlen mit Hilfe der optischen Plasmafraktionierer sind mathematische Prinzipien angewandt, um direkt die Zellzahlen direkt in einem definierten, 3-dimensionale Volumen schätzen. Der Vorteil dieser Methode ist, dass es nicht Annahmen über die Form, Größe und Ausrichtung der Zellen gezählt werden. So geschätzte Zellzahlen sind näher an die wahren Werte und näher als die Größe der Stichprobe (d.h., unvoreingenommene)³erhöht. Weil viele Regeln befolgt werden müssen, wenn Sie Stereologie verwenden, um die Methode neutral zu halten, Ready-to-Use kommerzielle Stereologie Systeme wurden entwickelt (Übersicht finden Sie unter Schmitz und Hof, 2005-⁴). Spezialisierte Stereologie Systeme implementieren Sie Design-basierte stereologischen Methoden mit a priori definiert Sonden und Stichprobenpläne für stereologischen Bewertungen, die zur Unabhängigkeit von Form, Größe, räumliche Verteilung und Ausrichtung der führen die Zellen zu analysierten^4,9. Handelsübliche Stereologie Systeme sind jedoch teuer; Dies kann die Umsetzung in neue Forschung einschränken.

Das Ziel dieser Studie war es, eine brauchbare Technik für die Design-basierte stereologischen Schätzung der dopaminergen Zellzahlen in der Maus SN, beschäftigt die optische Plasmafraktionierer-Methode und mit standard-Mikroskopie Ausrüstung (z. B. Licht entwickeln Mikroskop, Mikroskop standard Software und einer motorisierten X, y, Z-Phase). Hierfür ist eine Anleitung, wie Sie Maus Hirngewebe zu verarbeiten und SN Zellzahlen mit Design-basierte unvoreingenommene Stereologie abzuschätzen vorgestellt. Darüber hinaus sind Vorlagen für die Berechnung der geschätzten Zellzahlen und Koeffizienten der Fehler (CE) zur Verfügung gestellt.

Die hier beschriebene Methode beschränkt sich nicht auf die Analyse der SN, aber für den Einsatz in anderen anatomisch definierten Regionen des Gehirns Maus oder Ratte angepasst werden kann. Zum Beispiel, wurde unvoreingenommene Stereologie zur neuronalen Zellzahlen in der Hippocampus-¹⁰ und den Locus Coeruleus¹¹zu schätzen. Darüber hinaus können auch Zelltypen als Neuronen, wie Astrozyten¹² und Mikroglia¹³, beurteilt werden. Diese Methode kann daher nützlich für Wissenschaftler, die unvoreingenommene Stereologie in ihrer Forschung durchführen wollen, aber nicht bereit sind, eine Menge Geld um ein Stereologie System zu kaufen.

Protocol

allen anwendbare internationalen, nationalen und/oder institutionellen Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Tieren folgten. Das Protokoll wurde von den lokalen Behörden bei der Regierung von Unterfranken, Würzburg genehmigt.

1. Verarbeitung von Gewebe und Immunohistochemistry

1. einschläfern Mäuse mit CO ₂ oder einem anderen zugelassenen Methode.
2. Perfuse sechs 12 Wochen alten C56Bl/6N männliche Mäuse Transcardially mit 10 mL 0,1 M Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit einer 25-G-Nadel und eine Infusionspumpe, gefolgt von 70 mL 4 % Paraformaldehyd (PFA) in 0,1 M PBS.
   Vorsicht: PFA ist giftig, Allergene und karzinogen.
3. Sezieren das Gehirn der Maus in der koronalen Ebene mit einem Gehirn Matrix Hobel in der Region von +0,74 mm Bregma (Abbildung 25, Paxinos und Franklin Maus Gehirn Atlas ¹⁴).
4. Setzen die dorsale Teil des Gehirns, einschließlich der SN, in 4 % PFA in 0,1 M PBS für 1D bei 4 ° C für Immersion-Fixierung.
5. Tauschen die PFA für 30 % Saccharose/0,1 Mol PBS-Lösung für Cryo-Schutz und inkubieren Sie für ein weiteres 2 d bei 4 ° c
6. Put die dorsale Teil des Gehirns in eine Cryomold mit optimale Arbeitstemperatur (OCT gefüllt) zusammengesetzte und langsam Einfrieren des Gewebes in flüssigen Trockeneis gekühlte Isopentane.
   Vorsicht: Trockeneis ist extrem kalt (-78 ° C); Verwenden Sie persönliche Schutzausrüstung (PSA), einschließlich Handschuhe, während der Arbeit mit Trockeneis. Trockeneis verdampft in CO ₂; Daher arbeiten unter einer Abzugshaube.
7. Seriell 30 µm Cryo-Abschnitte in der koronalen Ebene schneiden und sammeln die Abschnitten 2,46 mm vom Bregma (Abbildung 51, Paxinos und Franklin Maus Gehirn Atlas ¹⁴) beginnend und endend bei 4,04 mm von Bregma (Abbildung 64, Paxinos und Franklin Maus Gehirn Atlas ¹⁴).
8. Speichern vier Serien in Röhren, die mit Kryoprotektivum (30 % Glycerin, Ethoxyethanol 30 % und 40 % PBS) bei-20 ° c gefüllt werden Während des speziellen Verfahrens kennzeichnen die rechte Hemisphäre durch Punktion ein kleines Loch in den oberen Bereich des Hirnstamm.
9. Für immunhistochemische Färbung, wählen Sie eine Reihe von Abschnitten per Mausklick. Preincubate frei schwebenden Abschnitte für 1 h in 10 % normalem Ziegenserum (NGS)/2% BSA/0.5% Waschmittel in 0,1 Mol PBS auf einem Boston-Shaker. Inkubieren Sie die Abschnitte mit Kaninchen Anti-Maus-Tyrosin Hydroxylase (TH; 1:1,000 Verdünnung) Antikörper in 2 % NGS/2% BSA/0.5% Waschmittel in 0,1 Mol PBS verdünnt über Nacht bei 4 ° c
10. Anwenden sekundäre Antikörper gegen Kaninchen Igs (1: 100 Verdünnung) für 2 h bei Raumtemperatur, gefolgt von Avidin/Biotin Reagenz (1: 100 Verdünnung). Inkubieren und Flecken mit 3,3-Diaminobenzidine-Tetrahydrochloride (DAB) und H ₂ O ₂. Montieren Sie die Abschnitte nach dem Färben sie auf beschichteten Objekt Folien.
    Hinweis: TH + dopaminergen SN Neuronen sind in Figur 1a angezeigt. Durch eine Reihe Färbung, sind durchschnittlich 13 SN Abschnitte, erstreckt sich von der Höhlung bis kaudalen Teile der SN Pars Compacta (SNpc) und Reticulata, pro Tier ( Abbildung 1 b) gefärbt. Die Bereiche werden von 120 µm (1/4 Serie) getrennt ( Abbildung 1 c).
    Vorsicht: DAB ist karzinogenverdächtig. Es ist giftig durch Kontakt und Inhalation. PSA zu verwenden, bei der Arbeit mit DAB.

2. Erwerb von Bildern

1. erfassen TH-Proteins gebeizt SN Abschnitte über digital imaging-Software, die an ein Mikroskop gekoppelt ist. Jeder Abschnitt einer Reihe separat zu analysieren.
2. Die Option Scan Dia der imaging-Software. Speichern im TIFF-Format für qualitativ hochwertige Bilder (Abbildung 2).
   Hinweis: Bildauflösung beträgt 312 Pixel pro cm.
3. Presse " erwerben " Erwerb Fenster (Abbildung 2a).
4. Soll das binning " 2 " für Graustufenbilder.
   Hinweis: Die Übernahme von Graustufenbildern statt Farbe Bilder reduziert die Größe der letzte Stapel-Image-Datei (Abbildung 2a).
5. Klicken Sie auf " Show Live " im Erfassungsfenster öffnet ein neues Fenster mit dem live-Bild des Abschnitts (Abbildung 2 ein und b).
6. Klicken Sie auf " Stufe " im Fenster "Übernahme". Wählen Sie " Scan-Dia " im Dropdown-Menü und aktivieren Sie das Kontrollkästchen (Abbildung 2 c).
   Hinweis: Dies ermöglicht den Erwerb und die Ausrichtung der stark vergrößerten SN Bilder (630 X Vergrößerung) in der X, y-Ebene sowie die Übernahme von Stapel Bilder mit einem Abstand zwischen aufeinanderfolgenden Bildern von 1 µm in der Z-Ebene, für eine Gesamtreichweite von 13 µ m.
7. Wählen Sie 2,5 X Ziel zu suchen, die SN.
8. Ändern Sie das Ziel auf 63 x.
9. Definieren Sie die obere linke Ecke (Hi) (Abbildung 2 c) und unten rechts (LowRight) (Abb. 2d) des Abschnitts durch Anklicken " Satz. "
10. Klicken Sie auf " Z-Serie " und überprüfen Sie die " Z-Plane Serie " Feld (Abb. 2e).
11. Bestimmen die tatsächliche montierten dicke Abschnitte an drei zufällig ausgewählte zählen Websites pro Abschnitt über die imaging-Software. Klicken Sie dazu auf " Ansicht oben versetzt " zu definieren, die oben im Abschnitt (Abb. 2e) und klicken dann auf " stoppen Blick Top " (Abb. 2f). Klicken Sie danach auf " Ansicht unten versetzt " (Abb. 2f) und klicken Sie dann auf " stoppen Ansicht unten " (Abbildung 2 g). Notieren Sie sich die Dicke des Abschnitts.
12. Subtrahieren 3 µm (Schutzbereichen) von oben versetzt und geben Sie das Ergebnis in den Top-Offset-Slot (Abb. 2 h). Subtrahieren Sie 13 µm (Höhe des optischen Disector) von der oberen Offset Nummer und geben Sie das Ergebnis in den unteren Versatz Schlitz (Abb. 2i). Wählen Sie die folgenden Parameter: Schritte, 14; Größe, 1.00 (Abbildung 2i).
    Hinweis: Dies entspricht einer Dicke in der Z-Ebene von 13 µm, mit einem 1-µm-Abstand zwischen aufeinanderfolgenden Bildern.
13. Wählen Sie das Verzeichnis zum Speichern der Datei (Abb. 2j).
14. Klicken Sie auf " Sequenz " den Erwerb (Abbildung 2j) beginnen.
15. Klicken Sie auf " Verarbeitung " und wählen Sie die folgenden Parameter: " allen Ebenen, " aus " Sequenz; " " Montage; " und die " schnell " und " Stitching " Boxen mit einer Bildüberlappung von 10 % (Abbildung 2-k). Beginnen Sie, die Bilder zu nähen, indem er auf " starten ".
    Hinweis: Dies erzeugt Bilder stapeln für die Analyse (Abbildung 2 l, Abbildung 3a -e).

3. Reihenfolge der stereologischen Bewertung

1. führen Sie die Analyse von SN Stapel Bilder mithilfe der NIH ImageJ Software-Version 4.7.
2. Die beiden Plugins, die benötigt werden von der ImageJ.nih.gov-Website herunterladen: die " Overlay-Netz " Plugin ¹⁵ und die " Cell Counter " Plugin ¹⁶. Beide Plugins zu installieren, wie beschrieben.
3. Für die unparteiischen stereologischen Bewertung, definieren Sie die Zählung Parameter wie folgt: Rastergröße, 130 x 130 µm; Counting Rahmen, 50 x 50 µm; und optische Disector Höhe, 13 & #181; m.
4. Öffnen Sie das Bild durch Anklicken " Datei " → " offene " (Abb. 4a) legen Sie die Bildgröße mithilfe der " Analyze " → " Set Maßstab " Befehl (Abbildung 4 b). In diesem Schritt ändern die definierte Größe von Pixel in µm (Abb. 4 c).
   Hinweis: Für die analysierten Bilder, 425 Pixel entspricht 100 µm.
5. Wählen Sie die " Plugins " → " Raster " → " Rastertyp: Linien " Befehl nach dem Zufallsprinzip ein Raster einfügen. Überprüfen Sie die " Random Offset " Feld. Definieren Sie die Größe von einem Quadratmeter innerhalb des Rasters (Planquadrat) 130 µm X 130 µm = 16.900 µm ² ( Abb. 3 b und Abbildung 4 d und e).
6. Änderung Bildtyp aus 16-Bit-RGB-Farbe (Klicken Sie auf " Bild " → " Typ " → " RGB-Farbe ") (Abb. 4f). Suchen Sie die SNpc wie von Baquet Et Al. beschrieben ¹⁷. umschließen die SNpc mit den " Pinsel-Werkzeug " (Breite Pinsel: 11) ( Abbildung 3 c und Abbildung 4 g -Ich).
7. "Rückgängig" der " Maßstab gesetzt " Befehl, indem Sie auf " Analyze " → " Skala eingestellt " → " maßstabsgetreu zu entfernen klicken Sie auf " (Abbildung 4j -l) um die Leistung der Berechnungen in Pixeln eher zu ermöglichen als µm.
8. Machen Sie einen Screenshot (Abbildung 4 m), die Image-Datei speichern und öffnen Sie die neue Datei mit ImageJ (Abbildung 4n). Wählen Sie " Punkt " (Abbildung 4o) und einer Bürste-Breite von 25 (Abbildung 4-p). Markieren Sie jedes Planquadrat, dass Kontakte der SN für die Platzierung von einem optischen Disector (Abbildung 4q). Analysieren von der Zellzahl in allen optischen Disectors, die vollständig lokalisiert werden oder teilweise innerhalb der skizzierten SN.
9. Wählen Sie ein Planquadrat, die Bauteile der SN enthält. Maßnahme die obere linke Ecke des Platzes mit dem Cursor in ImageJ zum Definieren der x und y Koordinaten um zu beginnen mit (Abbildung 4r).
   Hinweis: Koordinaten für optische Disector positionieren mit eingefügt werden die " optische Disector Position " (Abbildung 4 s), wie in Schritt 4 beschrieben.
10. Der optischen Disector Position zu berechnen, mit der Kalkulationstabelle Vorlage berechtigt, " optische Disector Lage, " wie in Schritt 4 beschrieben.
11. Kalibrieren der optischen Disector (Makro geschrieben von Christopher S. Ward, Ergänzende Datei) durch Anklicken " Plugins " → " Makros " → " bearbeiten " (Abbildung 4 t), öffnen Sie die " Opt_dis_ Grid.txt " Datei (Abbildung 4u), und definieren Sie die Größe von der " Usergrid " in Pixeln, die die x-und y-Dimension des optischen Disector (Abbildung 4v) entspricht. Wählen Sie eine Größe von 50 µm X 50 µm, so dass die Größe einer Seite von der Usergrid als 212,5 Pixel (50 x 4,25 Pixel) definiert ist.
12. Bestimmen Sie die Position des optischen Disector im Stapel Bild durch die ImageX und ImageY Koordinaten, die den Mittelpunkt der optischen Disector (Abbildung 4v) definieren einfügen. Führen Sie das Makro (" Makros " → " Makro ausführen ") (Abbildung 4w).
    Hinweis: Das Gitter wird aus dem Stapel Bild ( Abbildung 3d und Abbildung 4 X) verschwinden. Die optische Disector bleiben erhalten, wenn in der Z-Ebene ( Abbildung 3e und Abbildung 4 X) nach unten bewegen,.
13. Select " Plugins " → " Cell Counter " Cell Counter Plugin (Abbildung 4y) starten. Initialisieren Sie die Zelle-Zähler und wählen Sie einen Marker (Abbildung 4z). Vergrößern Sie das Bild (Klicken Sie auf " + "), und führen Sie die stereologischen Bewertung der Zelle Zahlen bei einer Vergrößerung von 200 %.
14. Identifizieren dopaminergen neuronale Perikarya durch ihre abgerundeten oder eiförmige Form und Zelle Größe ( Abbildung 1a). Die Anzahl der Zellen mit stereologischen Regeln zu quantifizieren.
    Hinweis: Da die optische Disector eines 3-dimensionalen Würfels ( Abb. 5a) ist, definieren Sie die Ausgrenzung Seiten als vorne, links, und Top Seiten des Würfels (rot). Also, don ' t Graf TH + Zellen kommen in Kontakt mit der roten Linie (links und vorne) oder die Oberseite. Die vorbereiteten Kalkulationstabellendatei berechtigt, die Ergebnisse der Zellzahlen hinzufügen " Berechnung der Zellzahl " (Schritt 5).
15. Nach dem SN-Bild berechnen der nächsten Planquadrat, legen Sie die optische Disector für die nächste Zellzahl mit x, y tritt die Größe des Rasters darüberliegenden ( Abb. 5 b) und die " optische Disector Position " Arbeitsblattvorlage, wie in Schritt 4 beschrieben.
16. Führen Sie eine Schätzung der Zelle Nummer mit Hilfe der " Berechnung der Zellzahl " Tabelle (Schritt 5).

4. Berechnung der optischen Disector Position mit Hilfe der " optische Disector Position " Arbeitsblattvorlage

1. zu berechnen, die Größe und Position der einzelnen optischen Disector in das darüber liegende Netz innerhalb der Gliederung der SN (platziert werden Abbildung 5 b) mit der " optische Disector position.xlsx " Tabellenkalkulationsdatei (Ergänzende Datei).
2. Legen Sie die Umwandlung von Pixel pro µm, entsprechend den Festlegungen der " Skala eingestellt " Befehl, in den gelben markierten Stellen von der " optische Disector position.xlsx " Datei ( Abbildung 6a und zusätzliche Datei ).
3. Der geplanten Größe des optischen Disector und die Größe des Platzes Raster des darüberliegenden Rasters, definiert durch die Länge einer Seite (in µm), in den orangenen markierten Stellen einfügen.
   Hinweis: Ergebnisse sind dargestellt in den roten Kästchen neben der orange Box.
4. Beginnen mit dem Planquadrat innerhalb der SN-Gliederung, die als Ausgangspunkt bestimmt wurde (ein Planquadrat wurde zunächst wie in Schritt 3.9, oben ausgewählt).
5. Legen Sie die x- und y-Koordinaten, gemessen in Schritt 3.9, in die grünen Felder der Datei (unter Verwendung dieser Werte, die X, y-Koordinaten für die Mitte des optischen Disector innerhalb dieser ersten Platz berechnet, und die Ergebnisse werden in den blauen Kästen dargestellt). Führen Sie das opt_dis_grid.txt-Makro (Ergänzende Datei).
6. Berechnen die x-, y-Koordinaten der aufeinander folgenden optischen Disectors durch Einfügen der Planquadrat Entfernung (gemessen in Anzahl der Quadrate) bezogen auf die erste Planquadrat (braune Kisten).
   Hinweis: + x: Planquadrat befindet sich auf der rechten Seite; -x: Planquadrat befindet sich auf der linken Seite; + y: Planquadrat befindet sich an der Unterseite; -y: Planquadrat befindet sich an der Spitze. Ergebnisse sind in die grauen Felder gezeigt.

5. Schätzung der Zelle Nummer mit Hilfe der " Berechnung der Zellzahl " Tabelle

1. die geschätzte Anzahl der TH + SN Zellen pro Tier (N) mit der Formel veröffentlicht berechnen von West Et Al., 1991 ³, wo ∑ Q ^– ist definiert als die Gesamtzahl der TH + Neuronen in allen optischen Disectors von einem Gehirn Abschnitt gezählt.
   Hinweis: Die Höhe der optischen Disector (h) in Bezug auf die gemessene Dicke der Sektion (t) ist in der Gleichung enthalten. Der Bereich Probenahme Bruch (Asf) ist definiert als der Anteil der Fläche (A) der optischen Disector (optische Disector) Bildgröße innerhalb der quadratischen Größe des Rasters (X, y-Schritt) (optische Disector/A X, y-Schritt) ( Abb. 3 b), und die Abschnitt Probenahme Bruchteil (Ssf) ist definiert als der Anteil der Abschnitte des gesamten seriell geschnittenen Gehirns:
   
   Sicherstellung qualitativ hochwertiger quantitative Schätzungen, der Koeffizient der Fehler (CE) sollte kleiner als 0,10 sein. Bestimmen der CE mit Hilfe der Formel von Keuker Et Al., 2001 ¹⁰:
   
2. für die stereologischen Schätzung der Zellzahl innerhalb der SN der einzelnen Maus, legen Sie die angegebenen Informationen über die Gesamtzahl der generierten Serie per Mausklick, die Höhe der optischen Disector, X, y-Bereich der optischen Disector (eine optische Disector in µm ²), X, y-Fläche von Planquadrat (X, y-Schritt im µm-²), und der Mittelwert gemessen Dicke des Abschnitts (in µm) in die gelben Felder mit den " Berechnung der Zelle count.xlsx " Tabellenkalkulationsdatei ( Abb. 6 b und ergänzende Datei ).
3. Abschnitts SN vom gleichen Tier, zu analysieren, wie in Schritt 5 beschrieben.
4. Insert Zelle zählt für jede optische Disector in die grauen Felder jeder Zeile bezieht sich auf eine SN-Sektion, unter Verwendung der " Berechnung der Zelle count.xlsx " Tabellenkalkulationsdatei (Ergänzende Datei).
   Hinweis: Die geschätzten Handynummer und die berechnete CE sind dargestellt in den blauen Kästen ( Abb. 6 b).

6. Schätzung der Anzahl von Zellen mit einem kommerziell verfügbaren Stereologie System

1. Start der Schätzung der dopaminergen SNpc Zelle Nummer durch Anklicken " Sonden " → " optische Plasmafraktionierer Workflow ", optische Plasmafraktionierer zu öffnen Workflow Fenster.
   Hinweis: Ein neues Fenster öffnet sich um festzustellen, ob eine neue Serie von SN wird gezählt werden.
2. Starten eine neue Serie von TH + SN Abschnitte mit einem Klick " starten Sie ein neues Thema " im Popupfenster.
3. Gehen durch die verschiedenen Schritte des optischen Plasmafraktionierer Workflows. Das Thema im ersten Schritt eingerichtet. Hierzu legen Sie die Ermittler ' Namen, den Betreff ' s Name (SN-Gruppe) und andere hilfreiche Informationen. Legen Sie die Anzahl der Abschnitte für diese SN rechnen. Legen Sie die Dicke der geschnittenen Gewebeschnitten. Fügen Sie das Abschnitt-Intervall vier in diesem Fall ist. Legen Sie die nach dem Zufallsprinzip ermittelten Abschnittsnummer zu.
4. Im zweiten Schritt legen Sie das Mikroskop zu geringe Vergrößerung (2 X Objektiv) und wählen " 2 X Mag Objektiv " aus dem Menü ".
5. In Schritt 3, zeichnen die Region von Interesse mit der linken Maustaste, die die SNpc wie von Baquet Et al. beschrieben., 2009 ¹⁷.
6. Stellen Sie das Mikroskop auf hohe Vergrößerung in Schritt 4. Dazu ändern Sie das Ziel auf 100 X und wählen Sie " 100 X Mag Objektiv " aus dem Dropdown-Menü.
7. Messen Sie die montierte Dicke in Schritt 5 durch die Konzentration auf der Oberseite und an der Unterseite des Abschnitts.
8. In Schritt 6, definieren die Counting Rahmengröße 50 x 50 µm; Dies ist die Größe des optischen Disector (X, y).
9. In Schritt 7 legen Sie die Größe des Rasters systematische Stichproben (SRS) 130 x 130 µm.
10. Geben Sie eine 3-µm-Schutzbereichen in Schritt 8.
11. Speichern Sie die Einstellungen in Schritt 9.
12. Zählen schließlich die TH + dopaminergen Zellen in jedem optischen Disectors innerhalb des SRS-Rasters in Schritt 10 des optischen Plasmafraktionierer Workflows. Hierzu starten Sie durch Anklicken der " zählen " Schaltfläche ".
13. Nach Abschluss einen Abschnitt, klicken Sie auf die " beginnen nächsten Abschnitt "-Taste, um die optische Plasmafraktionierer-Workflow des nächsten Abschnitts SN der gleichen SN Serie starten.
14. Wenn der letzte Abschnitt der SN einer SN Serie quantifiziert worden, klicken Sie auf " ich ' Ve Finished Counting. "
15. Klicken Sie auf die " View Results " Schaltfläche zum Anzeigen der Ergebnisse der Probenahmen Stereologie.

Representative Results

Die vorgestellte Methode, die geschätzte Anzahl der TH + dopaminergen Neuronen in der rechten Ecke SN lag zwischen 7.363 und 7.987 Zellen und in der linken SN, verwenden zwischen 7.446 und 7.904 Zellen. So war die durchschnittliche Anzahl von dopaminergen Neuronen (± SEM) 7.647 ± 83 Zellen für die Rechte SN und 7.675 ± 66 für die linke SN. Die berechneten CE für jedes Tier war niedriger als 0,08 (Bereich: 0.0.73.-0.079) (Abbildung 7). Um die Vergleichbarkeit dieser Methode mit handelsüblicher und spezialisierten Stereologie Systemen zu ermitteln, wurden auch SN Zellzahlen quantifiziert mit dem Stereologie Setup (Abbildung 8). Die Zählung Parameter waren: Rastergröße, 130 x 130 µm; Counting-Rahmen, 50 x 50 µm; Schutzbereichen, 3 µm. Abschnitte wurden analysiert mit einem 100 X / 1,25 numerische Apertur Ziel am BX53 Mikroskop. Die geschätzte Bevölkerung von TH + SN Neuronen mit reichten von 7.067 8.105 Zellen/SN und 7.164 auf 8.015 Zellen/SN auf der rechten und linken Seite jeweils mittlere Schnittdicke. Die mittlere Anzahl der neuronale wurde als 7.535 ± 155 für das Recht SN und 7.699 ± 128 Zellen für die linke SN berechnet. Die Gundersen-CE (m = 1) war ≤0.08 in jeder SN quantifiziert (Abbildung 7). Statistische Analyse mit gepaarten Student t-Test ergab keine signifikanten Unterschiede zwischen den TH + Zellzahlen der beiden Methoden in der rechten oder der linken SN (meine ± SEM; rechts: t (5) = 0.9524, P > 0,05; links: t (5) = 0.2928, P > 0,05) (Abbildung 7 ).

Abbildung 1. Repräsentative Bilder von Maus SN gebeizt für dopaminergen Neuronen.
(a) ein Überblick über einen Vertreter Maus SN wird im oberen Bereich angezeigt. Beachten Sie das kleine Loch im oberen Teil der rechten Hirnstamm, der der rechten Seite markiert. Höherer Vergrößerung der Inset (Black Box) zeigt TH + dopaminergen Neuronen. (b) eine Reihe von TH-gefärbten SN Abschnitten wird gezeigt, für die ganze Maus SN von rostral zur kaudalen. (c) jeder Abschnitt ist von aufeinander folgenden Abschnitt durch 120 µm. Maßstabsleisten getrennt: a, oberen Bereich 500 µm; untere Leiste, großes Bild, 100 µm; untere Leiste, Inset, 50 µm; b, 500 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2. Erwerb von Bildern für die stereologischen Analyse über die imaging-Software.
(a) roter Pfeil: Öffnen Sie das Fenster Erwerb; grüner Pfeil: gesetzt, binning, "2;" "blauer Pfeil: das live-Bild zeigen. (b) ein neues Fenster mit dem live-Bild (roter Pfeil) wird geöffnet. (c) roter Pfeil: Wählen Sie das Menü "Bühne"; grüner Pfeil: Wählen Sie die Option "Scan-Slide"; blauer Pfeil: Aktivieren Sie die Option "Scan-Slide"; schwarzer Pfeil: definieren die linke obere Ecke. Schwarzer Pfeil (d) : definieren die untere rechte Ecke. (e) roter Pfeil: Wählen Sie das Menü "Z-Serie"; grüner Pfeil: Überprüfen Sie die "Z-Plane-Serie"; blauer Pfeil: "Ansicht oben Offset" zu suchen, die oben im Abschnitt zu beginnen. Roter Pfeil (f) : Klicken Sie auf "Stop Blick Top" zu definieren, die oben im Abschnitt; grüner Pfeil: "Ansicht unten Offset" zu suchen, die unten im Abschnitt zu beginnen. (g) roter Pfeil: Klicken Sie auf "Stop Ansicht unten", die unten im Abschnitt zu definieren. (h) roter Pfeil: subtrahieren 3-µm-Guard zone aus der "Top-Offset" und legen Sie das Ergebnis in die "Offset Top" Slot. (i) roter Pfeil: 13 µm aus der "Top-Offset" Zahl subtrahieren und legen Sie das Ergebnis in den Schlitz "unten Offset"; grüner Pfeil: definieren Sie 14 Stufen, das entspricht einer Z-Ebene Stärke von 13 µm; blauer Pfeil: eine Größe von 1,00 µm, das entspricht einer 1 µm Abstand zwischen aufeinanderfolgenden Bildern definieren. (j) roter Pfeil: Wählen Sie das Verzeichnis zum Speichern der Datei; blauer Pfeil: Klicken Sie auf "Sequenz" den Erwerb von Bildern beginnen. (k) roter Pfeil: Klicken Sie auf "In Bearbeitung"; überprüfen Sie die folgenden Parameter: grüner Pfeil: "Alle Ebenen"; blauer Pfeil: "Sequence"; schwarzer Pfeil: "Montage"; grauer Pfeil: "Nähte"; lila Pfeil: schnell. (l) klicken Sie auf den gelben Pfeil beginnen Nähte die Bilder. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Abbildung 3. Verarbeitung der Bilder für die stereologischen Analyse.
(a) ein Beispielbild Stack eine Maus SN entnommen. (b und c) Nach dem randomisierten einsetzen eines Rasters darüberliegende SN (türkisfarbene Linien, b) wird die SN in einem zweiten Schritt (blaue Linie, c) beschrieben. (d) eine optische Disector ist in das SN-Stack-Bild eingefügt. (e) sechs aufeinander folgenden fokalen Flugzeuge im SN-Stack Bild decken in der Z-Ebene insgesamt 13 µm. Skalieren Sie Bars: a-d, 100 µm; e, 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 4. Reihenfolge der stereologischen Bewertung mit ImageJ.
(a) roter Pfeil: Klicken Sie auf "Datei" → "Öffnen", um ein Stack-Bild zu öffnen. (b) roter Pfeil: Klicken Sie auf "Analysieren" → "Set Scale". (c) rote Pfeile: definieren Sie die Parameter für den "Abstand in Pixel," "Bekannte Distanz" und "Einheit der Länge." (d) roter Pfeil: Wählen Sie "Plugins" → "Raster." (e) roter Pfeil: Wählen Sie "Linien"; grüner Pfeil: Überprüfen Sie "Random Offset;" blauer Pfeil: Legen Sie die Größe des Rasters in µm². Roter Pfeil (f) : Klicken Sie auf "Bild" → "Typ" → "RGB-Farbe." Roter Pfeil (g) : Wählen Sie das Pinselwerkzeug; grüner Pfeil: definieren Sie die "Pinsel Breite" als 11. Roter Pfeil (h) : anfangen einzukreisen der SNpc. (i) rote Pfeile zeigen die eingekreisten SNpc. (j) roter Pfeil: Klicken Sie auf "Analysieren" → "Set Scale" und entfernen Sie die Skala (k) durch Klicken auf "Klicken Sie auf Entfernen Scale," dargestellt durch die rote Pfeil. Beachten Sie die Änderung von µm (k, grüner Pfeil) Pixel (l, roter Pfeil). (m) einen Screenshot (rote Pfeil zeigt in Richtung der Screenshot) und (n) öffnen Sie die Screenshot-Image-Datei mit ImageJ. (o) roter Pfeil: Klicken Sie auf "Punkt." (p) roter Pfeil: einfügen eine Bürste-Breite von 25. (Q) der rote Pfeil zeigt die markierten Planquadrate, die die SNpc. (R) wenden Sie sich an der rote Pfeil in der oberen linken Ecke ein Planquadrat verweist, die die SN gehört. Setzen Sie den Cursor an dieser Stelle, die x-und y-Koordinaten für die "optische Disector-Position" (Schritt 4) gemessen und in die "optische Disector position.xlsx" Vorlage (s, roter Pfeil) eingefügt. Roter Pfeil (t) : Wählen Sie "Plugins" →"Makros" → "bearbeiten." Roter Pfeil (u) : Wählen Sie die Datei "opt_dis_grid.txt". Ein neues Fenster öffnet sich (V). Legen Sie die Größe des "Usergrid", in Pixeln (V, roter Pfeil) und die x-und y-Koordinaten (V, grüner Pfeil). (w) führen Sie das Makro "opt_dis_grid.txt" (roter Pfeil). (X) eine optische Disector erscheint in der Mitte der zuvor definierten Planquadrat (roter Pfeil). Roter Pfeil (y) : Klicken Sie auf "Plugins" → "Cell Counter." (Z) Initialisieren der Zelle Zähler (roter Pfeil) und wählen Sie eine Markierung (grüner Pfeil). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Abbildung 5. Platzierung der optischen Disector.
(a) Darstellung der optischen Disector für unvoreingenommene Stereologie verwendet. Die optische Disector besteht aus einem 3-dimensionalen Würfel. Drei schematische Zellen sind innerhalb der optischen Disector sichtbar. Die stereologischen Regeln für die Quantifizierung der Zellen zeigen, dass Zellen berühren die roten beschrifteten Seiten des optischen Disector ausgeschlossen (Erythrozyten), während Zellen, die das Grün Kontakt beschriftete Seiten in Zelle zählen (grüne Zellen) enthalten sind. (b) eine optische Disector wird in jedes Planquadrat platziert, die in Kontakt mit der SN kommt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 6. Berechnung der optischen Disector und Abschätzung der Anzahl von Zellen.
(a) eine Beispielrechnung für die Positionierung des optischen Disector durchgeführt. (b) ein Beispiel für die Schätzung der gesamten Zellennummer. Die Zahl der quantifizierten Zellen werden in die grauen Felder eingefügt, während die Parameter der stereologischen Quantifizierung in die gelben Felder eingefügt werden. Die geschätzte Handynummer und die CE werden in die blauen Felder angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 7. Vergleich der Zelle Parameter zählen.
(a) vergleicht den geschätzten TH + Zellzahl der rechten und linken Maus SN erhalten von der beschriebenen stereologischen Methode mit den Daten aus der Analyse mit dem im Handel erhältlichen Stereologie System erworben zeigten keine signifikanten Unterschiede. Eine detaillierte Liste der erhaltenen Daten des Rechts (b) und Links (c) SN ist mit den geschätzten Zellzahl pro Tier, die Anzahl der Zellen, die tatsächlich gezählt, die Anzahl der Abschnitte gezählt und die Anzahl der Probenahmestellen (z. B. gegeben. die Anzahl der Raster-Quadrate gezählt) für beide Methoden. Die Werte in die Balkendiagramme sind der Mittelwert ± SEM Daten aus 6 Mäuse. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 8. Quantifizierung der Zellen mit dem im Handel erhältlichen Stereologie System.
(b) Der Umriss der SN wird gezeichnet und (c) die Positionen der optischen Disectors werden automatisch ermittelt. (d-e) Jedes optische Disector für Zellzahl von konzentriert sich entlang der Z-Ebene analysiert. Sechs aufeinander folgenden fokale Flächen innerhalb der SN werden angezeigt. Die roten und grünen Linien entsprechen der optischen Disector. Skalieren Sie Bars: a-d, 100 µm; e, 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Ergänzende Datei 1. opt_dis_grid.txt Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Ergänzende Datei 2. Optische Disector position.xlsx Klicken Sie bitte hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 3. Berechnung der Zelle count.xlsx Klicken Sie bitte hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Stereologie beginnt mit Gewebe Verarbeitung. Das serielle Schneiden von SN Gewebe muss sorgfältig durchgeführt werden, zur Verhinderung des Verlusts der Abschnitte während der stereologischen Analyse. Darüber hinaus ist ein wesentlicher Schritt, eine Hemisphäre zu kennzeichnen, um das Recht von links SN zu unterscheiden, bei der Durchführung der Stereologie. Platzieren ein kleines Loch am oberen Teil der Hirnstamm erzeugt die besten Ergebnisse in der vorgestellten Studie. Darüber hinaus schneiden da die Arbeit mit den Anforderungen der optischen Plasmafraktionierer-Methode, die das Gewebe in dicke Schichten von ca. 30-40 µm, anstatt die 5-10 µm häufiger in Immunohistochemistry, Antikörper und andere Inkubation Fluid Gewebe eindringen während verwendet immunhistochemische Färbung muss gewährleistet werden, so wie mit einem Waschmittel.

Immunhistochemische Färbung für dopaminergen Neuronen mit der TH-Antikörper Etiketten SN Neuronen sowie Neuronen im ventralen Haubengebiet (VTA), befindet sich medial aus der SN und Neuronen im Retrorubral Bereich. Somit ist ein weiterer kritischer Punkt bei der Durchführung der Stereologie von der SN Wissen der Maus SN-Anatomie, da SN Neuronen ausschließlich durch standard immunhistochemische oder histologische Färbung sichtbar gemacht werden können nicht. Stattdessen sind die Anerkennung der anatomischen Landmarken wie subthalamic Nucleus, das Retrorubral-Feld und das VTA wichtig zu bestimmen, das ganze Ausmaß der SN^17,18,19.

Bewertung der neuronalen Zahl muss zuverlässig und reproduzierbar sein. Obwohl verschiedene Gruppen im Handel erhältlichen Stereologie Setups verwenden, unterscheiden sich Zahlen von TH + SN dopaminergen Neuronen im wt Mäuse, entnommen aus verschiedenen Publikationen, in Nummer^17,20. In Baquet Et Al., Design-basierte stereologischen Analyse in 3 bis 4 Monate alten männlichen und weiblichen C57BL/6J wt Mäuse mit einem handelsüblichen Stereologie System ergab eine geschätzte 8.716 ± 338 TH + SN dopaminergen Neuronen (Bereich: 7.546-9.869)¹⁷ . Im Gegensatz dazu Smeyne Et Al. gefunden Sie in 9 bis 16 Wochen alten männlichen C57BL/6J Mäuse, die 0,9 % Kochsalzlösung i.p, von 6.302 ± 262 Zellen bis hin zu 6.861 ± 338 Zellen, mit einer neueren Version des gleichen Stereologie System²⁰erhielten weniger TH + SN Zellen. Allerdings war der erste Autor auch der letzte Autor in dem Baquet Et Al. Papier, daher unterschiedlichem Erfahrungsschatz als Grund für die unterschiedlichen Ergebnisse ausschließen. Diese widersprüchlichen Daten spiegeln die Notwendigkeit für eine stereologischen Quantifizierungsmethode, die weniger Variabilität zeigt. Um die Technik der Quantifizierung und die Formel zu überprüfen, wurde ein Vergleich der Ergebnisse der SN Nummer Zellzahl mit der beschriebenen Methode mit einer Quantifizierung mit dem im Handel erhältlichen Stereologie-Setup durchgeführt. Statistische Analyse zeigte keine signifikante Unterschiede beim Vergleich der Zahlen von TH + dopaminergen Neuronen in der rechten Ecke und links SN wt Mäuse mit beiden Techniken der Zelle Quantifizierung bestimmt damit zeigen, dass diese Methode für die stereologischen Schätzung der SN Neuronen in den Mäusen.

Der wesentliche Vorteil des beschriebenen Verfahrens ist, dass es die Kosten, die in der Regel verbunden mit der Umsetzung der Stereologie Techniken reduziert für die Zellzählung sind. Ein zweiter Vorteil ist, dass für das beschriebene Verfahren Stapel Bilder von der SN gespeichert werden und jederzeit (auch gleichzeitig) durch einen anderen Prüfer analysiert werden können. Darüber hinaus sind die Akquisition und Analysen der Fluoreszenzbilder mit dieser Methode möglich, weil Graustufenbilder mit "Lookup-Tabellen" in ImageJ gefärbt werden können. Es gibt jedoch Einschränkungen zu dieser Studie. Erstens ist die Quantifizierung der Handynummer mehr Zeit in Anspruch (ca. 50 %) als Quantifizierung mit dem im Handel erhältlichen Stereologie System. Dies ist vor allem aus zwei Gründen: 1. Stapel Bilder von den SN getroffen werden und 2. Berechnung der optischen Disector Platzierung innerhalb jeder SN und Berechnung der geschätzten Zellzahl und CE muss manuell unter Verwendung der Berechnung Vorlagen durchgeführt werden. Zweitens kann mindestens mit dem System in unserem Labor, die Analyse nur auf Graustufenbildern wegen der Dateigröße von Farbbildern, erfolgen die von ImageJ nicht verarbeitet werden konnte. Dies kann ein Problem darstellen, wenn es notwendig ist, zwei unterschiedliche Zellpopulationen zur gleichen Zeit einen doppelten Fleck zu quantifizieren. Es wäre schwieriger, zwei unterschiedlich gefärbten Zell-Populationen in Graustufenbilder zu unterscheiden. Obwohl eine motorisierte Bühne (X, y, Z-Ebene) und die entsprechende Software in vielen Laboratorien arbeiten mit histologischen Proben zur Verfügung stehen, werden die Verwaltung und die Qualität der Bilder stapeln die Mikroskop-Software und die Leistung der verlassen sich daher auf die angeschlossenen Rechner.

Es gibt Möglichkeiten, die Beschränkungen zu überwinden. Indem die Berechnung-Vorlagen, die wir entwickelt, könnte die Programmierung von Makros, einige der derzeit manuell ausgeführten Prozesse zu automatisieren reduzieren Sie Fehler oder Ungenauigkeiten während stereologischen Bewertung und beschleunigen die Geschwindigkeit der Arbeit. Darüber hinaus sollte mit der Weiterentwicklung von ImageJ und andere imaging-Software, sowie mit zunehmender Rechenleistung der Computer, größere Bild-Dateien kein Problem in naher Zukunft dar. Daher werden Analysen der Hellfeld Farbbilder mit der beschriebenen Technik beherrschbar.

Die beschriebene Technik beschränkt sich nicht auf Analysen von TH + SN Zellen jedoch erweitert werden, um andere Zelltypen und Hirnregionen von Nagetieren zu analysieren. Hierzu die anatomischen Grenzen der Region von Interesse müssen ermittelt werden, und die jeweiligen Färbung durchgeführt werden muss. Darüber hinaus kann diese Technik zu dickeren Bereiche angepasst werden. Hierzu muss die Übernahme der Bilder stapeln mehr Stapel Bilder liefern angepasst. Zum Beispiel wenn 40 µm dicken Abschnitt erforderlich sind, montiert die tatsächliche Dicke des Abschnitts nach Gewebe Färbung bewertet werden muss, um die notwendige Höhe der optischen Disector zu bestimmen. Subtrahieren Sie 6 µm (3 µm Schutzbereichen oben und unten) aus der mittleren Gewebe Dicke und nehmen Sie das Ergebnis als die Höhe des optischen Disector.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paxinos mouse atlas			The Mouse Brain George Paxinos Keith B.J.FranklinCopyright @2001 by Academic Press CD Rom designet & created by Paul Halasz
brain matrix slicer mouse	Zivic Instruments	BSMAS 001-1
paraformaldehyde	Merck	1040051000
sucrose /D(+) Saccharose	Roth	4621.1
isopentane	Roth	3927.1
glycerol	Merck	1040931000
Ethanol	Sigma Aldrich	32205-1L
Name	Company	Catalog Number	Comments
phosphate buffered saline ingredients:
sodium chloride	Sigma Aldrich	31434-1KG-R
potassium dihydrogen phosphate	Merck	1048731000
di-sodium hydrogen phosphate dihydrate	Merck	1065801000
potassium chloride	Merck	1049360500
normal goat serum	Dako	X0907
bovine serum albumin	Sigma	A4503-100G
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100-100ml	detergent
3,3-Diaminobenzidine-tetrahydrochlorid/DAB tablets 10mg pH 7.0	Kem En Tec	4170
H2O2/ Hydrogen peroxide 30%	Merck	1072090250
avidin/biotin reagent	Thermo Scientific	32050	Standard Ultra Sensitive ABC Staining Kit, 1:100
rabbit anti mouse tyrosine hydroxylase antibody	abcam	Ab112	1:1000
biotinylated goat-anti-rabbit IgG H+L	vector laboratories	BA-1000	1:100
StereoInvestigator version 11.07	MBF
BX53 microscope	Olympus
Visiview	Visitron Systems GmbH	3.3.0.2
Axiophot2	Zeiss
ImageJ software	NIH	Version 4.7
Tissue-TEK OCT	Sakura	4583
dry ice
grid overlay plugin	Wayne Rasband		https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html
cell counter plugin	Kurt de Vos		https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html).
optical disector macro	Christopher Ward
C57Bl/6N male mice	Charles River, Germany
SuperFrost Plus coated object slides	Langenbrinck, Germany
25G needle Microlance 3	BD	300400
REGLO Analog Infusion pump	Ismatec	ISM 829
StereoInvestigator system			StereoInvestigator version 11.07
BX53 microscope			BX53 microscope
self-assorted stereology			Visiview
Axiophot2			Axiophot2