Stereological raming van de Dopaminerge Neuron nummer in de muis Substantia Nigra met behulp van de optische Fractionator en standaard microscopie apparatuur

Summary

Dit werk presenteert een stapsgewijze protocol voor de onbevooroordeelde stereological schatting van Dopaminerge neuronale cel nummers in de muis substantia nigra met behulp van standaard microscopie apparatuur (dat wil zeggen, een lichte Microscoop, een tabel van de gemotoriseerde object (x, y, z vliegtuig), en publiek domein-software voor digitale beeldanalyse.

Abstract

In pre-klinische van Parkinson onderzoek is analyse van het nigrostriatal-darmkanaal, met inbegrip van de kwantificering van de Dopaminerge neuron verlies in de substantia nigra, essentieel. Voor het inschatten van de totale Dopaminerge neuron nummer, onbevooroordeelde stereology met behulp van de optische fractionator-methode wordt momenteel beschouwd als de gouden standaard. Omdat de theorie achter de optische fractionator methode complex is en stereology moeilijk is te bereiken zonder gespecialiseerde apparatuur, bestaan verschillende verkrijgbare volledige stereology systemen die de benodigde software bevatten, zuiver tellen de redenen voor de cel. Sinds de aankoop van een gespecialiseerde stereology setup is niet altijd haalbaar is, om vele redenen, dit verslag wordt een methode beschreven voor de stereological schatting van Dopaminerge neuronale cel met behulp van standaard microscopie apparatuur telt, met inbegrip van een lichte Microscoop, een gemotoriseerd tabel object (x, y, z vliegtuig) met beeldbewerkingssoftware, en een computer voor analyse. Een stapsgewijze uitleg wordt gegeven over het uitvoeren van stereological kwantificering met behulp van de methode van de optische fractionator en voorgeprogrammeerde bestanden voor de berekening van de geschatte cellen worden geleverd. Om te beoordelen van de juistheid van deze methode, werd een vergelijking met gegevens die zijn verkregen uit een commercieel verkrijgbare stereology apparaat uitgevoerd. Vergelijkbare cel nummers werden gevonden met behulp van dit protocol en de stereology apparaat, dus het aantonen van de precisie van dit protocol voor onbevooroordeelde stereology.

Introduction

De kwantificering van de neuronale cel nummer is cruciaal in de pre-klinische van Parkinson onderzoek om te bepalen van het niveau van neurodegeneratie binnen de substantia nigra (SN)^1,2. De onbevooroordeelde stereological schatting van het aantal cellen in een gebied van belang wordt beschouwd als de gouden standaard^3,4,5.

Vóór de komst van onpartijdige stereology, was het aantal neuronen in secties beoordeeld door het manipuleren van de getelde cel profielen om te corrigeren voor de variabele waarschijnlijkheid dat neuronen in zicht in een sectie komen. Een van de meest gebruikte methoden was de correctie van de graven van de gekwantificeerde cel beschreven door Abercrombie⁶. Deze methode geprobeerd rekening dat cellen meer dan één keer kunnen worden gekwantificeerd, als fragmenten van dezelfde cel in aangrenzende dunne secties worden gevonden. Daarom, Abercrombie en andere auteurs gegenereerd vergelijkingen die veronderstellingen over de vorm, grootte en oriëntatie van de getelde cellen^{7,8 vereist}. Deze aannames waren echter meestal niet gerealiseerd en dus geleid tot systematische fouten en divergentie van de werkelijke celaantal (dat wil zeggen, bias). Bovendien kon de bias niet verlaagd worden door aanvullende monsters³.

Voor de stereological schatting van cel nummers met behulp van de optische fractionator, worden wiskundige beginselen toegepast om direct de cel nummers direct in een gedefinieerde, 3-dimensionale volume schatten. Het voordeel van deze methode is dat het geen veronderstellingen over de vorm, grootte en oriëntatie van de cellen wordt geteld. Dus de geschatte cel nummers zijn dichter bij de werkelijke waarden en dichter als de grootte van de steekproef (dat wil zeggen, onbevooroordeelde)^{3 toeneemt}. Omdat vele regels moeten worden gevolgd bij het gebruik van stereology om te houden van de methode onbevooroordeelde, kant-en-klare commerciële stereology systemen zijn ontwikkeld (Zie voor herziening, Schmitz en Hof, 2005⁴). Gespecialiseerde stereology systemen implementeren ontwerp gebaseerde stereological methoden met een vooraf gedefinieerd sondes en bemonsteringsplannen voor stereological evaluaties die tot onafhankelijkheid van vorm, grootte, ruimtelijke verdeling en oriëntatie van leiden de cellen die moeten worden geanalyseerd^4,9. Echter zijn commercieel verkrijgbare stereology systemen duur; deze kan uitvoering in nieuw onderzoek beperken.

Het doel van deze studie was het ontwikkelen van een bruikbare techniek voor de ontwerp-gebaseerd stereological schatting van Dopaminerge cel graven in de muis SN, dienst van de optische fractionator methode en met behulp van standaard microscopie apparatuur (dat wil zeggen, licht Microscoop, standaard Microscoop software en een gemotoriseerde x, y, z toneel). Hiervoor is een geleidelijke gids op hoe verwerken muis hersenweefsel en hoe te schatten SN cel nummers met behulp van ontwerp gebaseerde onbevooroordeelde stereology gepresenteerd. Bovendien worden de sjablonen voor de berekening van de geschatte cel nummers en coëfficiënten van fout (CE) geleverd.

De hier beschreven methode is niet beperkt tot de analyse van de SN, maar kan worden aangepast voor gebruik in andere anatomisch gedefinieerde regio's van de muis of rat hersenen. Bijvoorbeeld, is onbevooroordeelde stereology gebruikt voor het schatten van de neuronale cel nummers in de hippocampus¹⁰ en de locus coeruleus¹¹. Celtypes dan neuronen, zoals astrocyten¹² en microglia¹³, kunnen daarnaast ook worden beoordeeld. Deze methode kan dus nuttig aan wetenschappers die willen implementeren onbevooroordeelde stereology in hun onderzoek, maar zijn niet bereid om te besteden een heleboel geld voor de aankoop van een stereology systeem.

Protocol

alle internationale, nationale en/of institutionele richtsnoeren van toepassing voor de zorg en het gebruik van dieren werden gevolgd. Het protocol is goedgekeurd door de plaatselijke autoriteiten op de Regierung von Unterfranken, Würzburg, Duitsland.

1. verwerking van weefsel en Immunohistochemistry

1. euthanaseren muizen met CO ₂ of een andere goedgekeurde methode.
2. Perfuse zes 12-week-oude C56Bl/6N mannelijke muizen transcardially met 10 mL 0,1 M met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met behulp van een 25-G naald en een infusiepomp, gevolgd door 4% paraformaldehyde (PFA) in 0,1 M PBS 70 mL.
   Let op: PFA is toxische, allergene en kankerverwekkende.
3. Ontleden van de hersenen van de muis in de coronale vlak met een hersenen matrix slicer op de regio van +0.74 van Bregma (figuur 25, Paxinos en Franklin muis hersenen atlas ¹⁴) mm.
4. Zet het dorsale deel van de hersenen, met inbegrip van de SN, in 4% PFA in 0,1 M PBS voor 1 d bij 4 ° C voor onderdompeling-fixatie.
5. De PFA naar 30% sacharose/0,1 mol PBS oplossing voor cryo-bescherming uit te wisselen en incubeer voor een ander 2 d bij 4 ° C.
6. Zet het dorsale deel van de hersenen in een cryomold gevuld met optimale scherpe temperatuur (OCT) samengestelde en langzaam het bevriezen van het weefsel in vloeibare droogijs-gekoelde tolueen.
   Let op: Droogijs is extreem koude (-78 ° C); gebruik van persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM), met inbegrip van handschoenen, tijdens het werken met droogijs. Droogijs verdampt in CO ₂; Daarom werken in een zuurkast.
7. Serieel gesneden 30-µm cryo-secties in de coronale vlak en het verzamelen van de secties, begint op 2,46 mm van Bregma (figuur 51, Paxinos en Franklin muis hersenen atlas ¹⁴) en eindigt bij 4,04 mm van Bregma (figuur 64, Paxinos en Franklin muis hersenen atlas ¹⁴).
8. Slaan vier reeksen in buizen die zijn gevuld met cryoprotectant (30% glycerol ethoxyethanol van 30% en 40% PBS) bij-20 ° C. Tijdens de vectorafbeeldingsbestanden procedure, de rechter hersenhelft te markeren door een klein gaatje prikken in de bovenste regio van de hersenstam.
9. Voor de immunohistochemische kleuring, selecteert u een aantal secties per muis. Preincubate vrij zwevende secties voor 1 h in 10% normale geit serum (NGS)/2% BSA/0.5% wasmiddel in 0,1 mol PBS op een shaker. Incubeer de secties met konijn anti-muis tyrosine hydroxylase (TH; 1:1,000 verdunning) antilichaam verdund in 2% NGS/2% BSA/0.5% wasmiddel in 0,1 mol PBS's nachts bij 4 ° C.
10. Toepassen secundaire antilichamen tegen konijn Igs (1:100 verdunning) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur, gevolgd door avidin/Biotine reagens (1:100 verdunning). Incubeer en vlek met 3,3-diaminobenzidine-tetrahydrochloride (DAB) en H ₂ O ₂. De secties na kleuring hen op gecoate object dia's mount.
    Opmerking: TH + Dopaminerge SN neuronen worden weergegeven in Figuur 1a. Door kleuring van één reeks, zijn een gemiddelde van 13 SN secties, zich uitstrekt van de rostraal tot caudal gedeelten van de SN pars compacta (SNpc) en reticulata, gekleurd per dier ( Figuur 1b). De secties worden gescheiden door 120 µm (1/4-serie) ( Figuur 1 c).
    Let op: DAB is een verdachte kankerverwekkend. Het is giftig bij contact en inhalatie. Gebruik van PPE wanneer u werkt met DAB.

2. Overname van afbeeldingen

1. vangen TH immunohistochemisch gekleurd SN secties digitaal via imaging software die is gekoppeld aan een microscoop. Apart analyseren van elke sectie één reeks.
2. De optie dia scan van de imaging-software gebruiken. Opslaan in TIFF-indeling voor afbeeldingen van hoge kwaliteit (Figuur 2).
   Opmerking: Beeldresolutie is 312 pixels per cm.
3. Pers " ophaal " te openen van het venster van de overname (Figuur 2a).
4. Stelt de weggooien op " 2 " voor grijswaardenafbeeldingen.
   Opmerking: De verwerving van grijswaardenafbeeldingen in plaats van kleurenafbeeldingen vermindert de grootte van het afbeeldingsbestand definitieve stack (Figuur 2a).
5. Klik op " Toon Live " in het venster van de overname een nieuw venster weergegeven: het live beeld van de sectie te openen (Figuur 2 een en b).
6. Klik op " stadium " in het venster van de overname. Kies " scannen dia " in het dropdownmenu en het selectievakje het vak (Figuur 2 c).
   Opmerking: Hierdoor is de overname en de uitlijning van sterk vergrote SN beelden (630 X vergroting) in de x, y-vlak, alsmede de overname van stapel beelden met een afstand tussen opeenvolgende beelden van 1 µm in het z-vlak, die betrekking hebben op een totaal bereik van 13 µ m.
7. Selecteer de 2.5 X doelstelling om te zoeken naar de SN.
8. De doelstelling tot en met 63 x. wijzigen
9. De linker bovenhoek (TopLeft) (Figuur 2 c) en de lagere juiste hoek (LowRight) (figuur 2d) van de sectie definiëren door te klikken op " Set. "
10. Klik op " Z-serie " en controleer de " Z-Plane serie " vak (figuur 2e).
11. Bepalen de werkelijke gemonteerde dikte van de secties op drie tellen van de willekeurig geselecteerde sites per sectie met behulp van het imaging software. Voor dit, klikt u op " weergave Top Offset " aan de bovenkant van de sectie (figuur 2e) definiëren en klik vervolgens op " Stop weergave Top " (figuur 2f). Daarna, klik op " weergave onder Offset " (figuur 2f) en klik vervolgens op " Stop weergave onder " (Figuur 2 g). Noteer de dikte van de sectie.
12. Aftrekken 3 µm (guard zone) vanaf de bovenkant gecompenseerd en typt u het resultaat in de bovenste offset sleuf (Figuur 2 h). Aftrekken van 13 µm (hoogte van de optische disector) van het nummer van de bovenste marge en typt u het resultaat in de bodem offset sleuf (figuur 2i). Selecteer de volgende parameters: stappen, 14; grootte, 1,00 (figuur 2i).
    Opmerking: Dit komt overeen met een dikte in het z-vlak van 13 µm, met een 1-µm afstand tussen opeenvolgende beelden.
13. Selecteer de map voor het opslaan van het bestand (figuur 2j).
14. Klik op " reeks " om te beginnen met de overname (figuur 2j).
15. Klik op " verwerking " en selecteer de volgende parameters: " alle vliegtuigen, " van " volgorde; " " Montage; " en de " snel " en " Stitching " vakken, met een afbeelding overlapping van 10% (Figuur 2 k). Steek de beelden door te klikken op Start " start ".
    Opmerking: Dit zal genereren stapel afbeeldingen p.a. (Figuur 2 l, Figuur 3a -e).

3. Volgorde van Stereological evaluatie

1. uitvoeren van de analyse van SN stapel afbeeldingen met behulp van de NIH ImageJ softwareversie 4.7.
2. Downloaden de twee plugins die nodig zijn op de website van ImageJ.nih.gov: de " raster Overlay " plugin ¹⁵ en de " cel teller " plugin ¹⁶. Installeer beide plugins zoals beschreven.
3. Voor onbevooroordeelde stereological beoordeling, het tellen om parameters te definiëren als volgt: rastergrootte, 130 x 130 µm; counting frame, 50 x 50 µm; en optische disector hoogte, 13 & #181; m.
4. Open de afbeelding door te klikken op " bestand " → " Open " (figuur 4a) schaal van het beeld instellen met behulp van de " analyseren " → " Set schaal " opdracht (figuur 4b). Voor deze stap, veranderen de gedefinieerde grootte van pixels naar µm (Figuur 4 c).
   Opmerking: Voor de geanalyseerde beelden, 425 pixels komt overeen met 100 µm.
5. Selecteer de " Plugins " → " raster " → " raster Type: lijnen " opdracht willekeurig invoegen een raster. Controleer de " willekeurige Offset " vak. Definieer de grootte van een vierkant binnen het raster (raster-plein) als 130 µm x 130 µm = 16,900 µm ² ( Figuur 3b en Figuur 4 d en e).
6. Verandering image type uit 16-bits RGB-kleur (Klik op " Image " → " Type " → " RGB kleur ") (figuur 4f). Zoek de SNpc, zoals beschreven door Baquet et al. ¹⁷. de SNpc met omcirkelen de " gereedschap Penseel " (borstel breedte: 11) ( Figuur 3 c en Figuur 4 g -Ik).
7. Ongedaan maken de " schaal instellen " command door te klikken op " analyseren " → " Set schaal " → " Klik op schaal verwijderen " (figuur 4j -l) om de prestaties van de berekeningen in pixels eerder dan µm.
8. Maken van een screenshot (Figuur 4 m), uitgezonderd naar de spiegelbeeld vijl en open het nieuwe bestand met ImageJ (figuur 4n). Selecteer " punt " (figuur 4o) en de breedte van een borstel van 25 (Figuur 4 p). Markeer elke raster-plein dat contacten de SN voor plaatsing van een optische disector (figuur 4q). Analyses van het celaantal uit te voeren in alle optische disectors, die volledig zijn gelokaliseerd of gedeeltelijk binnen de contour SN.
9. Selecteer een raster-vierkant dat bestaat uit delen van de SN. Maatregel de linker bovenhoek van dit plein met de cursor in ImageJ te definiëren van de x- en y-coördinaten om te beginnen met (figuur 4r).
   Opmerking: Coördinaten wordt ingevoegd voor optische disector positionering met behulp van de " positie van de optische disector " (figuur 4s), zoals beschreven in stap 4.
10. Berekenen van de positie van de optische disector met behulp van de sjabloon van de spreadsheet getiteld " optische disector positie, " zoals beschreven in stap 4.
11. Kalibreren de optische disector (macro geschreven door Christopher S. Ward, Aanvullende bestand) door te klikken op " Plugins " → " macro's " → " bewerken " (figuur 4t), opent de " opt_dis_ grid.txt " bestand (figuur 4u) en definieer de grootte van de " usergrid " in pixels die overeenkomt met de x, y dimensie van de optische disector (figuur 4v). Selecteer een formaat van 50 µm x 50 µm, zodat de grootte van één kant van de usergrid wordt gedefinieerd als 212.5 pixels (50 x 4,25 pixels).
12. Bepalen de positie van de optische disector in het beeld van de stack door het invoegen van de ImageX en ImageY coördinaten die het midden van de optische disector (figuur 4v bepalen). De macro uitvoeren (" macro's " → " Macro uitvoeren ") (figuur 4w).
    Opmerking: De grid zal verdwijnen uit de stapel afbeelding ( Zie afbeelding 3d en Figuur 4 x). De optische disector zullen blijven bestaan wanneer neer het bewegen in het z-vlak ( 3e cijfer en Figuur 4 x).
13. Selecteer " Plugins " → " cel teller " om te beginnen de cel Counter plugin (Figuur 4). Initialiseren van de teller van de cel en selecteert u een markeringstype (figuur 4z). Inzoomen op de afbeelding (Klik op " + ") en het uitvoeren van de stereological beoordeling van de nummers van de cel bij een vergroting van 200%.
14. Identificeren Dopaminerge neuronale perikarya door hun ronde of ovale vorm en cel grootte ( Figuur 1a). Het aantal cellen met behulp van stereological regels kwantificeren.
    Opmerking: Aangezien de optische disector is een 3-dimensionale kubus ( figuur 5a), definiëren de uitsluiting als de voorkant, links, en top kanten van de kubus (rood). Daarom, don ' t graaf TH + cellen die komen in contact met de rode lijn (linker- en voorzijde) of de bovenkant kant. De resultaten van de graven van de cel toevoegen aan het bereid werkbladbestand recht, " berekening van cel graaf " (stap 5).
15. Volgens de SN-afbeelding, berekenen het volgende raster-vierkant op waarin de optische disector voor de volgende cel telling, met x, y stappen de grootte van het bovenliggende raster ( Figuur 5b) en de " optische disector positie " werkblad sjabloon, zoals beschreven in stap 4.
16. Uitvoeren van een schatting van de cel nummer met behulp van de " berekening van cel graaf " werkblad (stap 5).

4. Berekening van de optische Disector positie met behulp van de " optische Disector positie " werkblad sjabloon

1. berekenen de grootte en de positie van elke optische disector te worden geplaatst in het bovenliggende net binnen de omtrek van de SN ( Figuur 5b) met behulp van de " optische disector position.xlsx " werkbladbestand (Aanvullende bestand).
2. Invoegen de conversie van pixel per µm, zoals gedefinieerd door de " Set schaal " commando, in de geel gemarkeerde posities van de " optische disector position.xlsx " bestand ( Figuur 6a en aanvullende bestand ).
3. Invoegen de geplande grootte van de optische disector en de grootte van het raster-plein van het bovenliggende raster, gedefinieerd door de lengte van een zijde (in µm), de Oranje gemarkeerde posities.
   Opmerking: De resultaten worden afgebeeld in de rood vakken naast de oranje vakken.
4. Start met het raster-plein binnen de SN-omtrek die werd bepaald als het startpunt (een raster-plein was geselecteerd om mee te beginnen, zoals in stap 3.9, hierboven).
5. Invoegen de x- en y-coördinaten, uitgedrukt in stap 3.9, in de groene vakken van het bestand (met behulp van deze waarden, de x-, y-coördinaten voor het midden van de optische disector binnen dit eerste plein zijn berekend, en de resultaten worden afgebeeld in de blauwe dozen). Voer de macro opt_dis_grid.txt (Aanvullende bestand).
6. Berekenen de x, y-coördinaten van de opeenvolgende optische disectors door het invoegen van de afstand van de grid-plein (gemeten in aantal pleinen) ten opzichte van het eerste raster-vierkant (bruine dozen).
   Nota: + x: raster-square ligt aan de rechterkant; -x: raster-square ligt aan de linkerkant; + y: raster-square ligt aan de bodem; -y: raster-square ligt naar de top. Resultaten worden weergegeven in de grijze vakken.

5. Schatting van de cel nummer met behulp van de " berekening van de telling van de cel " werkblad

1. berekenen het geschatte aantal TH + SN cellen per dier (N) met behulp van de formule gepubliceerd door West et al.., 1991 ³, waar ∑ Q ^- is gedefinieerd als het totale aantal TH + neuronen in alle optische disectors van één hersenen sectie geteld.
   Opmerking: De hoogte van de optische disector (h) met betrekking tot de gemeten dikte van de sectie (t) is opgenomen in de vergelijking. Het gebied bemonstering breuk (asf) wordt gedefinieerd als het aandeel van de ruimte (A) van de framegrootte van de optische disector (een optische disector) binnen de vierkante grootte van het raster (een x, y stap) (een optische disector/A x, y stap) ( Figuur 3b), en de sectie bemonstering breuk (ssf) wordt gedefinieerd als het aandeel van de secties van de hele serieel gesneden hersenen:
   
   om kwalitatief hoogwaardige kwantitatieve ramingen van de coëfficiënt van fout (CE) moet lager zijn dan 0,10. Bepalen de CE met behulp van de formule door Keuker et al.., 2001 ¹⁰:
   
2. voor de stereological schatting van het nummer van de cel binnen de SN van elk muis, plaatst u de aangegeven gegevens met betrekking tot het totale aantal gegenereerde reeks per muis, de hoogte van de optische disector, x, y ruimte van de optische disector (een optische disector, in µm ²), de x, y ruimte van het raster-plein (een x, y stap in µm ²), en de gemiddelde gemeten de dikte van de sectie (in µm) in de gele vakken met behulp van de " berekening van de cel count.xlsx " werkbladbestand ( Figuur 6b en aanvullende bestand ).
3. Analyseren van elke sectie SN van hetzelfde dier, zoals beschreven in stap 5.
4. Invoegen cel telt voor elke optische disector in de grijze vakken, elke regel die verwijst naar een SN sectie, met behulp van de " berekening van de cel count.xlsx " werkbladbestand (Aanvullende bestand).
   Opmerking: Het geschatte celaantal en de berekende CE worden afgebeeld in de blauwe dozen ( Figuur 6b).

6. Schatting aantal cel met behulp van een commercieel beschikbare systeem van de Stereology

1. Start de schatting van de Dopaminerge SNpc mobiele nummer door te klikken op " Probes " → " optische Fractionator Workflow " te openen van de optische Fractionator Werkstroom venster.
   Opmerking: Een nieuw venster zal pop-up om te bepalen of een nieuwe reeks van SN gaat worden geteld.
2. Beginnen met een nieuwe serie van TH + SN secties door te klikken op " beginnen een nieuw onderwerp " in het pop-upvenster.
3. Gaan door de verschillende stappen van de optische Fractionator Workflow. Instellen van het onderwerp in de eerste stap. Plaats hiertoe de onderzoeker ' s naam, het onderwerp ' s naam (SN groep), en andere nuttige informatie. Voeg de nummers van de secties te tellen voor deze SN. De dikte van het van de geknipte weefselsecties invoegen Voeg de sectie interval, die in dit geval vier is. Om te beginnen met het willekeurig bepaald Sectienummer invoegen.
4. Instellen in de tweede stap, de Microscoop te lage vergroting (2 X doelstelling) en selecteer " 2 X Mag Lens " in het menu.
5. In stap 3, het traceren van de regio van belang met de linker muisknop, oftewel de SNpc, zoals beschreven door Baquet et al.., 2009 ¹⁷.
De Microscoop
6. ingesteld op hoge vergroting in stap 4. Hiervoor wijzigt u de doelstelling naar 100 X en selecteer " 100 X Mag lens " van het dropdownmenu.
7. Meten van de gemonteerde dikte in stap 5 door zich te richten tot de bovenkant en de onderkant van de sectie.
8. In stap 6, definiëren de framegrootte van counting als 50 x 50 µm; dit is de grootte van de optische disector (x, y).
9. In stap 7, stelt u de grootte van het raster van systematische aselecte steekproef (SRS) als 130 x 130 µm.
10. Geef een 3-µm guard zone in stap 8.
11. De instellingen opslaan in stap 9.
12. Ten slotte de TH + Dopaminerge cellen in elk van de optische disectors binnen het raster van de SRS in stap 10 van de optische Fractionator werkstroom tellen. Hiervoor start u door te klikken op de " Counting " knop.
13. Na het beëindigen van een sectie, klik op de " volgende gedeelte begint " knop voor voorsprong naar de optische Fractionator Workflow van de volgende sectie van de SN van dezelfde serie SN.
14. Wanneer de laatste SN sectie één SN reeks heeft gekwantificeerd, klikt u op " ik ' ve Gereedgemeld Counting. "
15. Klik op de " Bekijk resultaten " knop om weer te geven van de resultaten van de bemonstering stereology.

Representative Results

Met behulp van de onderhavige methode, het geschatte aantal TH + Dopaminerge neuronen in het recht SN varieerden tussen 7,363 en 7,987 cellen en, in de linker SN, tussen 7,446 en 7,904 cellen. Zo was het gemiddelde aantal Dopaminerge neuronen (± SEM) 7,647 ± 83 cellen voor het recht SN en 7,675 ± 66 voor links SN. De berekende CE voor elk dier was lager dan 0,08 (bereik: 0.073-0.079) (Figuur 7). Om na te gaan van de vergelijkbaarheid van deze methode met commercieel beschikbaar en gespecialiseerde stereology systemen, waren SN cel nummers ook gekwantificeerd aan de hand de stereology setup (Figuur 8). De parameters die tellen zijn: rastergrootte, 130 x 130 µm; Counting frame, 50 x 50 µm; Guard zone, 3 µm. secties zijn geanalyseerd met een 100 x / 1.25 numerieke diafragma doelstelling op een BX53 Microscoop. De geschatte bevolking van TH + SN neuronen met behulp van de dikte van de gemiddelde sectie varieerden van 7,067 tot 8,105 cellen/SN en 7,164 aan de 8,015 cellen/SN aan de rechter en linker zijkanten, respectievelijk. De gemiddelde neuronale nummer werd berekend door 7,535 ± 155 cellen voor het recht SN en 7,699 ± 128 cellen voor links SN. De Gundersen CE (m = 1) was ≤0.08 in elke SN gekwantificeerd (Figuur 7). Statistische analyse met behulp van de gepaarde t-toets openbaarde niet eventuele aanzienlijke verschillen tussen de cel graven TH + van de twee methoden in het recht of in de linker SN (bedoel ± SEM; rechts: t (5) = 0.9524, P > 0,05; links: t (5) = 0.2928, P > 0.05) (Figuur 7 ).

Figuur 1. Representatieve beelden van muis SN gekleurd voor Dopaminerge neuronen.
(a) een overzicht van een vertegenwoordiger muis SN wordt weergegeven in het bovenste deelvenster. Opmerking de klein gaatje in het bovenste gedeelte van de juiste hersenstam dat de rechterkant markeert. Hogere vergroting van de inzet (zwarte doos) beeldt TH + Dopaminerge neuronen. (b) een reeks van TH gebeitste SN secties wordt weergegeven, die betrekking hebben op de hele muis SN van rostraal caudal. (c) elke sectie is gescheiden van de opeenvolgende sectie door 120 µm. schaal bars: een, bovenste paneel, 500 µm; lagere paneel, grote afbeelding, 100 µm; lagere paneel, inzet, 50 µm; b, 500 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2. Overname van foto's voor stereological analyse met behulp van het imaging software.
(a) rode pijl: open het venster van de overname; groene pijl: Stel de weggooien "2;" blauwe pijl: Toon het live beeld. (b) een nieuw venster met daarin het live beeld (rode pijl) wordt geopend. (c) rode pijl: Selecteer het "Stage"-menu; groene pijl: Selecteer de optie "Scan Slide"; blauwe pijl: Vink de optie "Scan Slide"; zwarte pijl: definiëren van de linker bovenhoek. (d) zwarte pijl: definiëren van de lagere juiste hoek. (e) rode pijl: Selecteer het menu "Z-serie"; groene pijl: Controleer de "Z-Plane series;" blauwe pijl: start de "weergave Top Offset" om te zoeken naar de top van de sectie. de rode pijl (f) : Klik op "Stop weergave Top" te definiëren van de top van de gespecialiseerde afdeling; groene pijl: start "Weergave onder Offset" om te zoeken naar de onderkant van de sectie. de rode pijl (g) : Klik op "Stop weergave onder" te definiëren van de onderkant van de sectie. (h) rode pijl: aftrekken van de 3-µm guard zone van de "Top Offset" en plaats het resultaat in de "Top Offset" sleuf. (i) rode pijl: aftrekken van 13 µm van het nummer "Top Offset" en plaats het resultaat in de "Onderste Offset" sleuf; groene pijl: definiëren van 14 stappen die komt overeen met een z-plane dikte van 13 µm; blauwe pijl: Definieer een grootte van 1.00 µm die overeenkomt met een 1-µm afstand tussen opeenvolgende beelden. (j) rode pijl: Selecteer de map voor het opslaan van het bestand; blauwe pijl: Klik op "Sequence" om te beginnen met de overname van afbeeldingen. (k) rode pijl: Klik op "Processing;" Controleer de volgende parameters: groene pijl: "Alle planes;" blauwe pijl: "Volgorde"; zwarte pijl: "Montage;" grijze pijl: pijl "Stitching;" paars: snel. (l) Klik op de gele pijl om te beginnen met het naaien van de beelden. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Figuur 3. Het verwerken van de beelden voor stereological analyse.
(a) een voorbeeld stapel foto genomen van een muis SN. (b en c) Na de gerandomiseerde invoeging van een raster overliggende de SN (turquoise lijnen, b), is de SN uiteengezet in een tweede stap (blauwe lijn, c). (d) een optische disector wordt geplaatst in het beeld van de stapel SN. (e) zes opeenvolgende focal vliegtuigen binnen het beeld van de stapel SN dekking van 13 µm totale in het z-vlak. Schaal bars: a-d, 100 µm; e, 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 4. Volgorde van stereological evaluatie met behulp van ImageJ.
(a) rode pijl: Klik op "Bestand" → "Open" om een stapel-afbeelding te openen. (b) rode pijl: Klik op "Analyseren" → "Schaal instellen". de rode pijlen (c) : Definieer de parameters voor de "afstand in pixels," "De afstand van de bekende" en "Eenheid van lengte." (d) rode pijl: Selecteer "Plugins" → "Grid." (e) rode pijl: Selecteer "Regels;" groene pijl: "Random Offset;" Controleer blauwe pijl: de grootte van het raster in µm²invoegen. de rode pijl (f) : Klik op "Image" → "Type" → "RGB kleur." (g) rode pijl: Selecteer het "gereedschap Penseel;" groene pijl: de "borstel breedte" definiëren als 11. (h) rode pijl: beginnen te omsingelen de SNpc. (i) rode pijlen verbeelden de omringde SNpc. (j) rode pijl: Klik op "Analyseren" → "Schaal instellen" en de schaal (k) verwijderen door te klikken op "Klik te verwijderen schaal," afgebeeld door de rode pijl. Opmerking de overgang van µm (k, groene pijl) naar pixels (l, rode pijl). (m) een screenshot (rode pijl wijst naar de screenshot) en (n) de screenshot spiegelbeeld vijl met ImageJ openen. de rode pijl (o) : Klik op "Punt." de rode pijl (p) : de breedte van een borstel van 25 invoegen. (q) de rode pijl toont de gemarkeerde-vakjes die contact maken met de SNpc. (r) de rode pijl wijst op de linker bovenhoek van een vierkante raster dat deel van de SN omvat. Door de cursor op dit punt, de x, y-coördinaten voor de "optische disector positie" (stap 4) worden gemeten en de "optische disector position.xlsx" sjabloon (s, rode pijl) ingevoegd. (t) rode pijl: Selecteer "Plugins" →"Macro's" → "bewerken." (u) rode pijl: Selecteer het bestand "opt_dis_grid.txt". Een nieuw venster wordt geopend (v). De grootte van de "usergrid," invoegen in pixels (v, rode pijl) en de x, y-coördinaten (v, groene pijl). (w) Voer de macro "opt_dis_grid.txt" (rode pijl). (x) is een optisch disector verschijnt in het midden van de eerder gedefinieerde raster-plein (rode pijl). de rode pijl (y) : Klik op de "Plugins" → "Cel Counter." (z) initialiseren van de cel teller (rode pijl) en selecteer een type markeerteken (groene pijl). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Figuur 5. Plaatsing van de optische disector.
(a) illustratie van de optische disector voor onbevooroordeelde stereology gebruikt. De optische disector is een 3-dimensionale kubus. Drie schematische cellen zijn zichtbaar in de optische disector. De stereological regels voor de kwantificering van de cellen aangeven dat cellen raken van de rode gelabelde zijden van de optische disector zijn uitgesloten (rode cel), terwijl cellen die contact maken met de groene gelabelde zijden zijn opgenomen in een cel tellen (groene cellen). (b) een optische disector is geplaatst in elke vierkante raster die in contact met de SN komt. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 6. Berekening van de positie van de optische disector en de schatting van het aantal cellen.
(a) een voorbeeld berekening uitgevoerd voor de positionering van de optische disector. (b) een voorbeeld van de schatting van de totale mobiele nummer. Het aantal gekwantificeerde cellen worden ingevoegd in de grijze vakjes, terwijl de parameters van stereological kwantificering worden ingevoegd in de gele vakken. De geschatte celaantal en de CE-worden weergegeven in de blauwe dozen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 7. Vergelijking van cel parameter tellen.
(a) vergelijking van de geschatte TH + aantal cellen van de rechter en linker muis SN verkregen van de beschreven methode van de stereological met de gegevens die zijn verkregen uit analyse met behulp van het systeem van de verkrijgbare stereology toonde geen significante verschillen. Een gedetailleerde lijst van de verkregen gegevens van de juiste (b) en links (c) SN wordt gegeven met de geschatte celaantal per dier, het aantal cellen eigenlijk geteld, het aantal secties geteld, en het aantal bemonsteringsplaatsen (d.w.z., het aantal vakjes geteld) voor beide methoden. De waarden in de bar grafieken zijn de gemiddelde ± SEM van de gegevens van 6 muizen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 8. Kwantificering van de cellen met de verkrijgbare stereology systeem.
(a-b) De omtrek van de SN wordt getekend en (c) de posities van de optische disectors zijn automatisch bepaald. (d-e) Elke optische disector is geanalyseerd voor celaantal door nadruk te leggen langs de z-plane. Zes opeenvolgende focal vliegtuigen binnen de SN worden weergegeven. De rode en groene regels komen overeen met de optische disector. Schaal bars: a-d, 100 µm; e, 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Aanvullende bestand 1. opt_dis_grid.txt Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende bestand 2. Optische disector position.xlsx Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende bestand 3. Berekening van de cel count.xlsx Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Stereology begint met de verwerking van het weefsel. De seriële snijden van SN weefsel moet zorgvuldig worden uitgevoerd om te voorkomen dat het verlies van secties tijdens de stereological analyse. Daarnaast is een essentiële stap ter gelegenheid van een halfrond teneinde te onderscheiden van het recht van de links SN bij het uitvoeren van stereology. Plaatsen van een klein gaatje in het bovenste deel van de hersenstam gegenereerd de beste resultaten in de gepresenteerde studie. Bovendien, sinds het werken met de optische fractionator methode eisen die het weefsel is gesneden in dik secties van ongeveer 30-40 µm, in plaats van de 5-10 µm meer algemeen gebruikt in immunohistochemistry, antilichaam en andere incubatie vloeibaar weefsel penetratie tijdens Immunohistochemische kleuring moet worden gewaarborgd, zulke zoals door met een sopje.

Immunohistochemische kleuring voor Dopaminerge neuronen met behulp van de TH antilichaam etiketten SN neuronen, evenals de neuronen in het ventrale tegmental gebied (VTA), die mediaal van de SN ligt, en neuronen in het retrorubral veld. Dus, is een ander kritisch punt bij het uitvoeren van stereology voor de SN kennis van de muis SN anatomie, aangezien SN neuronen kunnen niet uitsluitend door standaard immunohistochemische of histologische kleuring worden gevisualiseerd. In plaats daarvan, de erkenning van anatomische bezienswaardigheden, zoals de subthalamicus kern, het retrorubral-veld en de VTA, zijn belangrijk voor het bepalen van de hele omvang van de SN^17,18,19.

Beoordeling van de neuronale nummer moet betrouwbaar en reproduceerbaar. Hoewel verschillende groepen verkrijgbare stereology opstellingen gebruiken, variëren de nummers van TH + SN Dopaminerge neuronen in wt muizen, ontleend aan verschillende publicaties, in nummer^17,20. In Baquet et al.., ontwerp gebaseerde stereological analyse in 3 - tot 4-maanden oude mannelijke en vrouwelijke C57BL/6J wt muizen met behulp van een systeem van commercieel beschikbare stereology bleek een geschatte 8,716 ± 338 TH + SN Dopaminerge neuronen (bereik: 7,546-9,869)¹⁷ . In tegenstelling, Smeyne et al. minder TH + SN cellen gevonden in 9 - tot 16-week-oude mannelijke C57BL/6J muizen die ontvangen van 0,9% zout i.p., variërend van 6,302 ± 262 cellen tot 6,861 ± 338 cellen, met behulp van een nieuwere versie van de zelfde stereology systeem²⁰. Echter, de eerste schrijver was ook de laatste auteur in de Baquet et al.. papier, dus met uitzondering van variërende graden van ervaring als reden voor de verschillende resultaten. Deze tegenstrijdige gegevens weerspiegelen de behoefte voor een kwantificering van de stereological-methode die minder variabiliteit toont. Om te controleren of de techniek van kwantificering en de formule gebruikt, werd een vergelijking van de resultaten van SN cel nummer graaf de beschreven methode met een kwantificering met behulp van de verkrijgbare stereology setup uitgevoerd. Statistische analyse toonde geen significante verschillen bij het vergelijken van de nummers van TH + Dopaminerge neuronen in het recht en verliet SN van wt muizen bepaald met behulp van beide technieken van cel kwantificering, aldus waaruit blijkt dat deze methode haalbaar is voor de stereological raming van SN neuronen in muizen.

Het belangrijkste voordeel van de beschreven methode is dat het vermindert de kosten die meestal geassocieerd met de toepassing van stereology technieken voor het tellen van de cel zijn. Een tweede voordeel is dat voor het beschreven methode, stapel beelden van de SN worden opgeslagen en kunnen elk moment (zelfs tegelijkertijd) door een andere onderzoeker worden geanalyseerd. De verwerving en analyses van fluorescentie beelden zijn bovendien mogelijk met deze methode, omdat afbeeldingen met grijswaarden kunnen worden gekleurd met de "opzoektabellen" in ImageJ. Er zijn echter beperkingen aan deze studie. Ten eerste, de kwantificering van celaantal is meer tijd in beslag (ongeveer 50%) dan kwantificering met de verkrijgbare stereology systeem. Dit is voornamelijk vanwege twee redenen: 1. stack moeten worden gehouden met beelden van de SN en 2. berekening van de plaatsing van de optische disector binnen elke SN en berekening van de geschatte celaantal en CE moet worden uitgevoerd handmatig met behulp van de sjablonen van de berekening. Ten tweede, ten minste met het systeem beschikbaar in ons laboratorium, de analyse kan alleen worden uitgevoerd op grijswaardenafbeeldingen vanwege de grote bestandsgrootte van kleurenafbeeldingen, die kan niet worden verwerkt door ImageJ. Dit kan een probleem opleveren als er een noodzaak om te kwantificeren van twee verschillende cel populaties op hetzelfde moment in een dubbele vlek. Het zou moeilijker zijn te onderscheiden van twee verschillend gekleurde cel populaties in grijswaardenafbeeldingen. Daarom, hoewel een gemotoriseerde etappe (x, y, z vliegtuig) en de bijbehorende software beschikbaar in veel laboratoria die werken met histologische specimens zijn, het beheer en de kwaliteit van de stapel afbeeldingen zal afhangen van de Microscoop software en de prestaties van de aangesloten computer.

Er zijn mogelijke manieren om de beperkingen te overwinnen. Met behulp van de sjablonen van de berekening die hebben we ontwikkeld, kan de programmering van macro's voor het automatiseren van enkele van de momenteel handmatig uitgevoerde processen verminderen van fouten of onnauwkeurigheden tijdens stereological beoordeling en versnellen van de snelheid van werken. Bovendien, met de verdere ontwikkeling van ImageJ en andere denkbaar software, alsook met toenemende computer verwerkingskracht, grotere bestandsgrootte van de afbeelding moeten niet een probleem vormen in de nabije toekomst. Analyses van kleurenafbeeldingen met heldere-veld zal dus beheersbaar met de beschreven techniek.

De techniek beschreven is niet beperkt tot analyses van TH + SN cellen, maar kan worden uitgebreid om andere celtypes en hersengebieden van knaagdieren te analyseren. Dit, de anatomische grenzen van de regio van belang moeten worden bepaald, en de respectieve kleuring moet worden uitgevoerd. Bovendien, kan deze techniek worden aangepast aan de dikkere secties. Voor dit, moet de verwerving van stapel afbeeldingen worden aangepast aan het bieden meer stapel beeld. Bijvoorbeeld, als 40 µm dik sectie vereist zijn, de werkelijke gemonteerd dikte van de sectie nadat weefsel kleuring moet worden beoordeeld om te bepalen van de benodigde hoogte van de optische disector. 6 µm (3-µm guard zone op de boven- en onderkant) aftrekken van de dikte van de gemiddelde weefsel en het nemen van het resultaat als de hoogte van de optische disector.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paxinos mouse atlas			The Mouse Brain George Paxinos Keith B.J.FranklinCopyright @2001 by Academic Press CD Rom designet & created by Paul Halasz
brain matrix slicer mouse	Zivic Instruments	BSMAS 001-1
paraformaldehyde	Merck	1040051000
sucrose /D(+) Saccharose	Roth	4621.1
isopentane	Roth	3927.1
glycerol	Merck	1040931000
Ethanol	Sigma Aldrich	32205-1L
Name	Company	Catalog Number	Comments
phosphate buffered saline ingredients:
sodium chloride	Sigma Aldrich	31434-1KG-R
potassium dihydrogen phosphate	Merck	1048731000
di-sodium hydrogen phosphate dihydrate	Merck	1065801000
potassium chloride	Merck	1049360500
normal goat serum	Dako	X0907
bovine serum albumin	Sigma	A4503-100G
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100-100ml	detergent
3,3-Diaminobenzidine-tetrahydrochlorid/DAB tablets 10mg pH 7.0	Kem En Tec	4170
H2O2/ Hydrogen peroxide 30%	Merck	1072090250
avidin/biotin reagent	Thermo Scientific	32050	Standard Ultra Sensitive ABC Staining Kit, 1:100
rabbit anti mouse tyrosine hydroxylase antibody	abcam	Ab112	1:1000
biotinylated goat-anti-rabbit IgG H+L	vector laboratories	BA-1000	1:100
StereoInvestigator version 11.07	MBF
BX53 microscope	Olympus
Visiview	Visitron Systems GmbH	3.3.0.2
Axiophot2	Zeiss
ImageJ software	NIH	Version 4.7
Tissue-TEK OCT	Sakura	4583
dry ice
grid overlay plugin	Wayne Rasband		https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html
cell counter plugin	Kurt de Vos		https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html).
optical disector macro	Christopher Ward
C57Bl/6N male mice	Charles River, Germany
SuperFrost Plus coated object slides	Langenbrinck, Germany
25G needle Microlance 3	BD	300400
REGLO Analog Infusion pump	Ismatec	ISM 829
StereoInvestigator system			StereoInvestigator version 11.07
BX53 microscope			BX53 microscope
self-assorted stereology			Visiview
Axiophot2			Axiophot2