Summary
이 작업 표준 현미경 장비 (즉, 가벼운 현미경 자동화 개체 테이블 (x, y, z를 사용 하 여 마우스 substantia nigra에서 dopaminergic 신경 세포 숫자의 편견된 stereological 추정에 대 한 단계별 프로토콜 제공 비행기), 그리고 디지털 이미지 분석을 위한 공개 소프트웨어.
Abstract
전 임상 파 킨 슨 병 연구에 substantia nigra에서 dopaminergic 신경 손실의 정량화를 포함 하 여 nigrostriatal로 분석은 필수적입니다. 총 dopaminergic 신경 세포 숫자를 예상 하려면 편견된 stereology 광학 fractionator 메서드를 사용 하 여 현재 이라고 여겨진다 금 표준. 광학 fractionator 메서드 뒤에 이론은 복잡 하 고 stereology 전문된 장비 없이 달성 하기 어렵습니다, 때문에 필요한 소프트웨어를 포함 하는 여러 상용 완료 stereology 시스템 존재, 순전히 있기 때문에 셀에 대 한 이유를 계산. 이 보고서에 dopaminergic 신경 세포의 stereological 추정 가벼운 현미경을 포함 하 여 표준 현미경 장비를 사용 하 여 계산에 대 한 방법을 설명 합니다 이후 특수 stereology 설치 구입은 항상 가능 하 고, 여러 가지 이유로, 한 이미징 소프트웨어와 분석에 대 한 컴퓨터 개체 테이블 (x, y, z 평면)를 자동화. 단계별 설명은 광학 fractionator 메서드를 사용 하 여 stereological 정량화를 수행 하는 방법에 부여 되 고 예상된 셀 개수 계산에 대 한 사전 프로그램 된 파일 제공 됩니다. 이 방법의 정확도 평가, 하 상용 stereology 장치에서 가져온 데이터에 대 한 비교는 수행 되었다. 유사한 핸드폰 번호가 프로토콜과 stereology 장치를 사용 하 여 따라서 편견된 stereology이이 프로토콜의 정밀도 보여주는 발견 됐다.
Introduction
신경 세포 수의 부 량은 neurodegeneration substantia nigra (SN)1,2에서 레벨을 전 임상 파 킨 슨 병 연구에. 관심의 영역에 셀 수의 편견된 stereological 추정 금3,,45으로 간주 됩니다.
편견된 stereology의 도래 하기 전에 섹션에서 신경 세포의 수는 뉴런 섹션에 광경에와 서 가변 확률에 대 한 수정 계산된 셀 프로 파일을 조작 하 여 평가 했다. 가장 일반적으로 사용 되는 방법 중 하나는 아베 크롬 비6에 의해 설명 된 정량된 셀의 정정 했다. 이 방법은 세포 조각 같은 셀의 인접 한 얇은 섹션에서 발견 되는 경우 여러 번 측정할 수는 계정에 걸릴 하려고 했습니다. 따라서, 아베 크롬 비와 다른 저자 모양, 크기, 및 계산된 셀7,8의 방향에 대 한 정의 요구 하는 방정식을 생성. 그러나, 이러한 가정 일반적으로 하지 실현 되었고 따라서 실제 휴대폰 번호 (즉, 바이어스)에서 체계적인 오류 및 분기에 led. 또한, 바이어스 추가 샘플링3으로 줄일 수 없습니다.
Stereological 광학 fractionator를 사용 하 여 셀 수 추정에 대 한 수학적 원리 직접 정의 3 차원 볼륨에 직접 셀 숫자를 추정에 적용 됩니다. 이 방법의 장점은 그것은 모양, 크기, 및 계산 셀의 방향에 대 한 가정을 포함 하지 않습니다. 따라서, 예상된 핸드폰 번호는 참 값에 가까운 고 가까이 샘플 크기가 증가 (즉, 편견)3. Stereology 편견 메서드를 계속 사용 하는 경우 많은 규칙을 따라야 합니다, 때문에 준비-사용 상업 stereology 시스템 개발 되었습니다 (검토를 위해 참조 슈 미 츠, 호프, 20054). 전문된 stereology 시스템 디자인-기반 stereological 메서드 구현 선험적 정의 프로브와 샘플링 방식을 모양, 크기, 공간 배급, 및의 방향에서 독립을 이끌어 내는 stereological 평가 분석 된4,9에 셀. 그러나, 상용 stereology 시스템 비싸다; 이 새로운 연구에서 제한할 수 있습니다.
이 연구의 목표는 SN, 광학 fractionator 메서드를 사용 하 고 표준 현미경 장비 (즉, 빛을 사용 하 여 마우스에서 dopaminergic 셀의 디자인 기반 stereological 추정에 대 한 사용 가능한 기술을 개발 했다 현미경, 표준 현미경 소프트웨어 및는 자동화 한 x, y, z 단계). 이 위해, 마우스 뇌 조직 처리 하는 방법과 편견된 stereology 디자인-기반을 사용 하 여 SN 셀 숫자를 예측 하는 방법에 대 한 단계별 가이드를 제시 합니다. 또한, 예상된 셀 숫자의 계산 및 오류 (CE)의 계수에 대 한 템플릿은 제공 합니다.
여기에 설명 된 메서드는 SN의 분석에 국한 되지 않습니다 하지만 마우스 또는 쥐 뇌의 해부학 적 정의 다른 영역에 사용 하기 위해 적용할 수 있습니다. 예를 들어, 편견된 stereology 마10 과 로커 스 coeruleus11신경 세포 숫자를 추정 사용 되었습니다. 또한, 신경, 이다12 와 microglia13, 등 다른 세포 유형 뿐만 평가 될 수 있다. 따라서,이 방법은 그들의 연구에서 편견된 stereology를 구현 하고자 하지만 많은 stereology 시스템을 구입 하는 돈 지출 하고자 하는 과학자에 게 유용할 수 있습니다.
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Protocol
관심과 동물의 사용에 대 한 모든 해당 국제, 국가, 또는 기관 지침에 따라 했다. 프로토콜 Regierung 폰 인 운터 프랑 켄, 뷔르츠부르크, 독일에서 지방 자치 단체에 의해 승인 되었다.
1. 조직 처리 및 Immunohistochemistry
- Euthanize 쥐 CO 2 또는 어떤 다른 승인 방법.
- Perfuse 6 12 주 된 C56Bl/6N 남성 쥐 transcardially 10 mL의 0.1 M 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 25 G 바늘과 주입 펌프를 사용 하 여 다음 0.1 M PBS에 4 %paraformaldehyde (PFA)의 70 mL.
주의: PFA는, 알레르기, 독성 및 발암 성. - Bregma (그림 25, Paxinos 및 프랭클린 마우스 뇌 아틀라스 14)에서 +0.74 m m의 영역에서 두뇌 매트릭스 슬라이서와 코로나 비행기에 쥐의 뇌를 해 부.
- SN를 포함 하 여 4%에서 뇌의 등 쪽 부분 침수-고정을 위한 4 ° C에서 1 d 0.1 M PBS에 PFA.
- Cryo-보호에 대 한 30% 자당/0.1 mol PBS 솔루션 PFA 교환 하 고 다른 2 d 4에서 품 어 ° c.
- 최적의 절삭 온도 (10 월)는 cryomold로 뇌의 등 쪽 부분 가득 넣어 컴파운드와 천천히 액체 드라이 아이스 냉각 isopentane는 조직의 동결.
주의: 드라이 아이스는 매우 추운 (-78 ° C); 드라이 아이스와 함께 작업 하면서, 장갑 등 개인 보호 장비 (PPE)를 사용 합니다. 드라이 아이스 증발 CO 2; 따라서, 연기 후드 작동. - 순차적으로 30 µ m cryo-섹션 코로나 비행기에서 잘라내어 Bregma (그림 51 Paxinos, 프랭클린 마우스 뇌 아틀라스 14)에서 2.46 m m에서 시작 및 끝 Bregma에서 4.04 m m 섹션을 수집 (그림 64, Paxinos 및 프랭클린 마우스 뇌 아틀라스 14).
- 는 Cryoprotectant (30% 글리세롤, 30 %ethoxyethanol, 및 40 %PBS)-20 ° c.에로 채워진 튜브에 4 개의 시리즈를 저장 단면화 절차 동안 표시 오른쪽 반구 brainstem의 상위 영역에 작은 구멍을 puncturing.
- Immunohistochemical 얼룩, 선택 마우스 당 섹션의 한 시리즈. 10% 정상 염소 혈 청 (0.1 mol 통에 PBS에에서 NGS)/2% BSA/0.5% 세제 1 시간에 대 한 preincubate 부동성 섹션. 섹션 4에서 하룻밤 2% NGS/2% BSA/0.5% 세제 0.1 mol PBS에에서 희석 토끼 반대로 마우스 티로신 hydroxylase (TH, 1:1,000 희석) 항 체로 품 어 ° c. 토끼에 대 한 항 체
- 적용 보조 Igs (1: 100 희석) 실 온에서 2 h 뒤 avidin/비오 틴 시 약 (1: 100 희석). 품 어와 3, 3-diaminobenzidine-tetrahydrochloride (한 덩어리) 및 H 2 O 2와 얼룩. 코팅된 개체 슬라이드에 얼룩 후 섹션을 탑재.
참고: 회 + dopaminergic SN 뉴런 그림 1a에 표시 됩니다. 얼룩 한 시리즈, 여 SN 동위 compacta (SNpc) 및 reticulata, 꼬리 부분에는 rostral에서 연장 13 SN 섹션의 평균은 동물 ( 그림 1b) 당 물 들 다. 섹션 120 µ m (1/4 시리즈)으로 구분 됩니다 ( 그림 1c).
주의: 소량은 의심 되는 발암 물질 이다. 그것은 접촉 및 흡입 독성입니다. 소량 작업 시 보호구를 사용.
2. 이미지의 수집
- 디지털 현미경에 결합 된 이미징 소프트웨어를 사용 하 여 SN 섹션 스테인드. 1 시리즈의 각 섹션을 별도로 분석.
참고: 이미지 해상도 cm 당 312 픽셀.
참고: 컬러 사진 대신 회색조 이미지의 인수 최종 스택 이미지 파일 (그림 2a)의 크기를 줄입니다.
참고: 그러면 수집 및 z-비행기, 13 μ의 전체 범위에서 1 µ m의 연속 이미지 사이의 거리를 사용 하 여 스택 이미지의 수집 뿐만 아니라 x, y 평면에 고도의 확대 SN 이미지 (630 X 배율)의 맞춤 m.
참고:이 연속 이미지 사이의 1 µ m 거리 13 µ m의 z 평면에 두께에 해당.
참고: 분석에 대 한 스택 이미지 생성 됩니다 (그림 2 l, 그림 3a -e).
3. Stereological 평가 순서
- NIH ImageJ 소프트웨어 버전 4.7 사용 하 여 SN 스택 이미지의 분석을 수행.
- ImageJ.nih.gov 웹사이트에서 필요한 두 개의 플러그인 다운로드:는 " 그리드 오버레이 " 플러그인 15와 " 셀 카운터 " 플러그인 16. 설명 된 대로 두 플러그인 설치.
- 편견된 stereological 평가 대 한 다음과 같은 세 매개 변수 정의: 그리드 크기 130 x 130 µ m; 계산 프레임, 50 x 50 µ m; 광 disector 높이, 13 & #181, m.
- 클릭 하 여 이미지를 열고 " 파일 " → " 오픈 " (그림 4a)를 사용 하 여 이미지 축척을 설정에 " 분석 " → " 비율 설정 " 명령 (그림 4b). 이 단계에 대 한 정의 된 크기에서에서 변경 픽셀 µ m (그림 4c).
참고: 분석 된 이미지에 대 한 425 픽셀 100 µ m에 해당. - 선택은 " 플러그인 " → " 그리드 " → " 격자 유형: 라인 " 그리드를 무작위로 삽입 하는 명령. 검사는 " 임의의 오프셋 " 상자. 130 µ m x 130 µ m으로 grid (그리드 사각형) 내 하나의 사각형의 크기를 정의 = 16900 µ m 2 ( 그림 3b 및 그림 4 d 및 e).
- 변경 이미지에서 유형 16-비트 RGB 색상 (클릭 " 이미지 " → " 유형 " → " RGB 색상 ") (그림 4 층). Baquet 외에 설명 된 대로 SNpc를, 찾습니다 17.와 SNpc를 둘러싸 자는 " 페인트 브러시 도구 " (브러쉬 폭: 11) ( 그림 3 c 및 그림 4 g -난).
- 실행 취소는 " 비율 설정 " 클릭 하 여 명령 " 분석 " → " 비율 설정 " → " 제거 규모를 클릭 " (그림 4j -l) 오히려 픽셀에 계산의 성능을 사용할 수 있도록 µ m 보다.
- 화면 (그림 4 m)를 확인 하 고 이미지 파일 저장 ImageJ (그림 4n)으로 새 파일을 엽니다. 선택 " 포인트 " (그림 4o)와 25 (그림 4 p)의 브러시 폭. 그 연락처는 SN 광학 disector (그림 4 분기)의 배치에 대 한 모든 그리드 사각형을 표시 합니다. 개요 SN 부분적으로 또는 완전히 지역화 된 모든 광학 disectors에 셀 수의 분석을 수행.
- SN의 부분을 포함 한 그리드 사각형을 선택 합니다. ImageJ는 x와 y를 정의 하에 커서를 놓고이 사각형의 왼쪽된 위 모퉁이 좌표 (4r 그림)와 함께 시작 하는 측정.
참고: 광 disector를 사용 하 여 위치에 대 한 삽입 됩니다 좌표는 " 광학 disector 위치 " (그림 4s), 4 단계에서 설명한 대로. - , 스프레드시트 서식 파일을 사용 하 여 광학 disector 위치를 계산 " 광학 disector 위치, " 4 단계에서 설명한 대로.
- 보정 광학 disector (매크로 추가 파일 크리스토퍼 S. 구 음)를 클릭 하 여 " 플러그인 " → " 매크로 " → " 편집 " (그림 4t), 열은 " opt_dis_ grid.txt " (4u 그림) 파일, 그리고 정의의 크기는 " usergrid " x, y 차원 광학 disector (그림 4v)의 해당 픽셀에. 50 µ m x 50 µ m의 크기를 선택 하는 usergrid의 1 개의 측의 크기는 212.5 픽셀 (픽셀 50 x 4.25)로 정의 됩니다.
- 광학 disector (그림 4v)의 중심을 정의 하는 ImageX와 ImageY 좌표를 삽입 하 여 스택 이미지에서 광학 disector의 위치를 결정 합니다. 매크로 실행 (" 매크로 " → " 실행 매크로 ") (그림 4w).
참고: 격자 ( 3d 그림 및 그림 4 x) 스택 이미지에서 사라져 버릴 것 이다. Z-평면 ( 3e 그림 및 그림 4 x)에서 이동할 때 광 disector 유지 됩니다. - 선택 " 플러그인 " → " 셀 카운터 " 셀 카운터 플러그인 (그림 4y) 시작. 셀 카운터를 초기화 하 고 표식 유형 (그림 4z)를 선택 합니다. 이미지에 확대 (클릭 " + ") 200%의 확대에 핸드폰 번호의 stereological 평가 수행 하는 고.
- 식별 dopaminergic 신경 perikarya 그들의 둥근 또는 ovoid 모양 및 셀 크기 ( 그림 1a). Stereological 규칙을 사용 하 여 셀의 수를 계량.
참고: 광 disector 3 차원 큐브 ( 그림 5a) 이기 때문에, 왼쪽, 앞으로 제외 측 및 큐브 (빨간색)의 최고의 측면 정의 합니다. 따라서, 돈 ' t 수 회 + 셀 레드 라인 (왼쪽 및 전면) 또는 상단 측면의 접촉으로 그 어 서. 준비 된 스프레드시트 파일에는 셀의 결과 추가 "의 세포 수 계산 " (5 단계). - SN 이미지에 따라 계산 다음 셀 개수에 대 한 광학 disector를 다음 그리드 스퀘어 사용 하 여 x, y 단계 overlying 그리드 ( 그림 5b)의 크기와 " 광학 disector 위치 " 4 단계에서 설명한 대로 스프레드시트 서식 파일.
- 셀 번호 사용의 추정을 수행는 "의 세포 수 계산 " 스프레드시트 (5 단계).
4. 광학 Disector 위치를 사용 하 여 계산 된 " 광 Disector 위치 " 스프레드시트 서식 파일
- 계산 크기와 SN (윤곽선 overlying 그리드에 배치 각 광 disector의 위치 그림 5b) 사용 하는 " 광학 disector position.xlsx " 스프레드시트 파일 (파일 추가).
- 삽입 µ m, 당 픽셀의 변환에 의해 정의 된 대로 " 비율 설정 " 명령의 노란색 표시 된 위치에는 " 광학 disector position.xlsx " 파일 ( 그림 6a와 보충 파일 ).
- 광학 disector의 계획 된 크기와 삽입 (µ m)에서 1 개의 측의 길이 의해 정의 된 overlying 그리드의 모눈 정사각형의 크기 오렌지 표시 위치.
참고: 결과 주황색 상자 옆에 있는 빨간 상자에 묘사 된다. - 시작 지점으로 결정 했다 SN 윤곽선 그리드 사각형으로 시작 (하나의 그리드 사각형 선정 되었다로 시작 되기 위하여는, 단계 3.9에서 같이 위의).
- 삽입 x 및 y 좌표를 기준으로 측정 단계는 파일의 녹색 상자에 3.9에서 (이러한 값, x, y 좌표를 사용 하 여이 첫 번째 사각형 내에서 광학 disector의 센터 계산 되 고 결과 파란색 상자에 묘사에 대 한). Opt_dis_grid.txt 매크로 (추가 파일) 실행.
- 첫 번째 그리드 사각형 (갈색 상자) 기준으로 그리드 스퀘어 거리 (사각형의 수 측정)를 삽입 하 여 x, y 좌표 연속 광 disectors의 계산.
참고: + x: 그리드 사각형은 오른쪽; -x: 그리드 사각형은 왼쪽; + y: 그리드-광장은 아래쪽에 위치 하 고 있습니다. -y: 그리드 사각형은 상단에 위치 하 고 있습니다. 결과 회색 상자에 표시 됩니다.
5. 셀 번호를 사용 하 여 추정은 " 세포 수 계산 " 스프레드시트
- 계산 수식을 사용 하 여 동물 (N) 당 회 + SN 셀의 예상된 수 출판 서쪽 외 알., 1991 년 3, 어디 ∑ Q - 일 + 신경 한 뇌 섹션의 모든 광학 disectors에 계산의 총 수로 정의 됩니다.
참고: 측정된 두께 (t) 섹션의 관련 광학 disector (h)의 높이 방정식에 포함 됩니다. 지역 샘플링 분수 (asf) 표 (x, y 단계)의 사각형 크기 내에서 광학 disector (광 disector) 프레임 크기의 영역 (A)의 비율으로 정의 된다 (광 disector/A x, y 단계) ( 그림 3b), 그리고 섹션 샘플링 분수 (ssf) 전체 직렬 컷된 두뇌의 섹션의 비율으로 정의 됩니다:
양적 높은 품질을 보장 하기 위해 추정 계수 오류 (CE) 0.10 보다 낮은 되어야 합니다. Keuker 외에 의해 수식을 사용 하 여 CE 확인., 2001 년 10:
- 각각의 SN 내 휴대폰 번호 stereological 추정에 대 한 마우스, 마우스 당 생성 된 시리즈의 총 수, 광 disector, x, y 영역 광학 disector (µ m 2: 광 disector), x, y 영역 (x, y 단계 모눈 정사각형의 높이 대 한 지정 된 정보를 삽입 µ m 2에), 평균 측정 (µ m)에서 사용 하 여 노란색 상자에 섹션의 두께 " 셀 count.xlsx의 계산 " 스프레드시트 ( 그림 6b 파일 및 보조 파일 ).
- 같은 동물에서 각 SN 섹션 5 단계에서 설명한 대로 분석.
- 삽입 셀 카운트 회색 상자에 각 광 disector 한 SN 섹션을 참조를 사용 하 여 각 줄에서 " 셀 count.xlsx의 계산 " 스프레드시트 파일 (파일 추가).
참고: 예상된 휴대폰 번호 및 계산 된 CE 파란색 상자 ( 그림 6b)에서 묘사 된다.
6. 상업적으로 사용 가능한 Stereology 시스템을 사용 하 여 셀 번호의 추정
- 시작 dopaminergic SNpc의 추정 셀 번호를 클릭 하 여 " 프로브 " → " 광학 Fractionator 워크플로 " 광학 Fractionator 여 워크플로 창.
참고: 새 창이 나타납니다-SN의 새 시리즈 계산 될 것 이다 확인. - 클릭 하 여 일 + SN 섹션의 새로운 시리즈를 시작 " 새로운 주제를 시작 " 팝업 창에서.
- 광학 Fractionator 워크플로의 다른 단계를 통해 이동합니다. 첫 번째 단계에서 주제를 설정 합니다. 이 위해 조사를 삽입 ' s 이름, 주제, ' s 이름 (SN 그룹), 및 기타 유용한 정보. 이 SN에 대 한 계산 섹션의 숫자를 삽입 합니다. 잘라 조직 단면도의 두께 삽입 합니다. 4이 경우에 섹션 간격을 삽입 합니다. 시작으로 임의로 결정된 섹션 번호 삽입.
- 두 번째 단계에서 설정 낮은 확대 (2 X 목표)을 선택 현미경 " 탄 창 렌즈 X 2 " 메뉴에서.
- Baquet 외에 설명 된 대로 SNpc은 마우스 왼쪽된 버튼으로 관심 영역을 추적 3 단계에서., 2009 17.
- 4 단계에서 높은 확대에 현미경을 설정합니다. 이 위해 100 X 목표를 변경 하 고 선택 " 100 X 매기 렌즈 " 드롭다운 메뉴에서.
- 5 단계에서 초점을 맞춤 으로써 섹션의 하단을 상단에 탑재 된 두께 측정.
- 단계에서 6, 50 x 50 µ m로 계산 프레임 크기를 정의; 광학 disector (x, y)의 크기입니다.
- 7 단계에서 체계적인 무작위 샘플링 (SRS) 격자의 크기 130 x 130 µ m 설정.
- 8 단계에서 3 µ m 감시 영역을 입력.
- 9 단계에서 설정을 저장.
- 는 마지막으로, 광학 Fractionator 워크플로의 단계 10에서에서 SRS 격자 내에서 광학 disectors의 각 목 + dopaminergic 셀을 계산합니다. 이 클릭 하 여 시작 된 " 계산 " 버튼.
- 클릭 한 부분을 마치고는 " 다음 섹션 시작 " 같은 SN 시리즈의 다음 SN 섹션의 광학 Fractionator 워크플로 시작 하는 버튼.
- 1 SN 시리즈의 마지막 SN 섹션 계량 되었습니다 때 클릭 " 나 ' ve 완료 센다. "
- 클릭 합니다 " 결과 보기 " stereology 샘플링의 결과 표시 하려면 단추.
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Representative Results
제시 방법, 일 + 오른쪽 SN 7,363 및 7,987 세포 사이 원거리로 하 고, SN, 왼쪽에서 dopaminergic 신경의 예상된 번호를 사용 하 여 7,446 및 7,904 세포 사이. 따라서, dopaminergic 신경 (± SEM)의 평균 수 SN 오른쪽과 왼쪽 SN 7,675 ± 66에 대 한 7,647 ± 83 셀 이었다. 각 동물에 대 한 계산 된 CE는 0.08 보다 낮은 (범위: 0.073 0.079) (그림 7). 상업적으로 사용 가능 하 고 전문 stereology 시스템과이 메서드의 comparability 확인, SN 핸드폰 번호 stereology 설치 (그림 8)를 사용 하 여 정량도 했다. 세 매개 변수 했다: 그리드 크기, 130 x 130 µ m; 계산 프레임, 50 x 50 µ m; 100 x 가드 영역, 3 µ m. 섹션 분석 되었다 / 1.25 BX53 현미경에 조리개 수치 목표. 일 + SN 뉴런에서에서 배열 했다 7,067 8,105 셀/SN 및 7,164 8,015 셀/SN 오른쪽과 왼쪽 양쪽에 각각 의미 섹션 두께 사용 하 여의 예상된 인구. 말은 신경 수 7,535 ± 155 셀 SN 오른쪽 및 왼쪽 SN 7,699 ± 128 셀으로 계산 되었다. Gundersen CE (m = 1) 각 SN 계량 (그림 7)에서 ≤0.08 이었다. 통계 분석 짝된 스튜던트 t-검정을 사용 하 여 오른쪽에서 또는 왼쪽된 SN에는 두 가지 방법의 일 + 세포 수 간의 중요 한 차이 공개 하지 않았다 (오른쪽 ± SEM; 의미: t (5) 0.9524, P = > 0.05; 왼쪽: t (5) 0.2928, P = > 0.05) (그림 7 ).
그림 1입니다. 마우스 SN의 대표 이미지 dopaminergic 신경 세포에 대 한 스테인드.
(a) 대표 마우스 SN의 개요 표시 됩니다 상단 패널에서. 오른쪽을 표시 하는 오른쪽 brainstem의 상단 부분에 작은 구멍 note 삽입 (블랙 박스)의 더 높은 확대 일 + dopaminergic 신경 묘사. (b) 일 얼룩진 SN 섹션의 1 개의 시리즈 전체 마우스 SN rostral에서 꼬리를 취재 표시 됩니다. (c) 각 섹션은 구분 연속 섹션에서 120 µ m. 스케일 바:, 위쪽 패널, 500 µ m; 하단 패널, 큰 이미지, 100 µ m; 하단 패널, 삽입, 50 µ m; b, 500 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. 이미징 소프트웨어를 사용 하 여 stereological 분석에 대 한 이미지의 취득.
(a) 빨간색 화살표가: 엽니다 수집 창; 녹색 화살표: "2." binning 설정 파란색 화살표: 라이브 이미지를 표시. (b) 라이브 이미지 (빨간색 화살표)을 보여주는 새 창이 열립니다. (c) 빨간색 화살표: 선택 메뉴에서 "단계"; 녹색 화살표: 선택 합니다 "스캔 슬라이드"; 파란색 화살표: "슬라이드 스캔" 옵션; 검은색 화살표: 왼쪽된 위 모퉁이 정의. (d) 검은 화살표: 오른쪽 아래 모서리를 정의. (e) 빨간색 화살표: 선택 메뉴에서 "Z-시리즈"; 녹색 화살표: 확인 "Z-비행기 시리즈;" 파란색 화살표:는 "보기 상단 오프셋" 섹션의 상단에 대 한 검색 시작. (f) 빨간색 화살표: 위에"그만 보기" 섹션; 위쪽의 정의를 클릭 합니다 녹색 화살표: "보기 아래쪽 오프셋" 섹션의 하단에 대 한 검색 시작. (g) 빨간색 화살표: 정의 섹션의 하단에 "보기 하단 중지"를 클릭 하십시오. (h) 빨간색 화살표: 빼기 3 µ m 가드 영역에서 "상위 오프셋"와 "탑 오프셋" 슬롯에 결과 삽입. (i) 빨간 화살표: 빼기 "상단 오프셋" 번호에서 13 µ m와 "아래쪽 오프셋" 슬롯; 결과 삽입 녹색 화살표: 13 µ m;의 z-비행기 두께에 해당 하는 14 단계를 정의 파란색 화살표: 연속 이미지 사이의 1 µ m 거리에 해당 하는 1.00 µ m의 크기를 정의. (j) 빨간색 화살표:; 파일을 저장할 디렉터리 선택 파란색 화살표: "시퀀스" 이미지의 수집을 시작 하려면 클릭 하십시오. (k) 붉은 화살표: "처리;" 클릭 다음 매개 변수를 확인: 녹색 화살표: "모든 비행기;" 파란색 화살표: "시퀀스;" 검은 화살표: "몽타주;" 회색 화살표: "바느질;" 보라색 화살표: 빠른. (l)는 노란색 화살표는 이미지를 바느질 시작를 클릭 합니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3입니다. Stereological 분석을 위한 이미지 처리.
(a) 마우스 SN에서에서 가져온 예제 스택 이미지. (b와 c) (청록색 선, b) SN overlying 격자의 무작위 삽입 후 SN (블루 라인, c) 두 번째 단계에서 요약. (d)는 광학 disector SN 스택 이미지에 배치 됩니다. (e) SN 스택 이미지 내에서 6 연속 초점 비행기 z-평면에서 총 13 µ m 커버. 스케일 바:-d, 100 µ m; e, 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4입니다. ImageJ를 사용 하 여 stereological 평가의 순서입니다.
(a) 빨간색 화살표: "파일" → "열기" 스택 이미지를 열 클릭 하십시오. (b) 붉은 화살표: "분석" → "비율 설정"을 클릭. (c) 빨간색 화살표: 픽셀, "거리"에 대 한 매개 변수 정의 "알려진 거리,"와 "단위의 길이." (d) 빨간색 화살표: "플러그인"을 선택 → "그리드" (e) 빨간색 화살표: "선;"을 선택 녹색 화살표: 확인 "임의 오프셋;" 파란색 화살표: µ m2에 모눈의 크기를 삽입. (f) 빨간색 화살표: 클릭 "이미지" → "유형" → "RGB 색상." (g) 빨간색 화살표: 선택 "붓 도구;" 녹색 화살표: 11 "브러시 폭" 정의. (h) 빨간색 화살표:는 SNpc. (i) 빨간색을 둘러싸 자 시작 화살표 묘사는 원된 SNpc. (j) 빨간색 화살표: 클릭 "" → "설정 규모"를 분석 하 고 규모 (k) "클릭을 제거 규모," 빨간색으로 표시를 클릭 하 여 제거 화살표입니다. 픽셀 (l, 빨간 화살표) µ m (k, 녹색 화살표)에서 변경 note (m) 화면 (화면 쪽으로 빨간색 화살표 포인트) 고 (n) ImageJ로 스크린샷 이미지 파일을 엽니다. 빨간색 화살표 (o) : "포인트"를 클릭 (p) 빨간색 화살표: 25의 브러쉬 폭을 삽입. (q) 빨간색 화살표 표시 된 그리드 사각형 문의 SNpc. (r) 빨간색 화살표는 SN의 일부를 포함 하는 모눈 정사각형의 왼쪽된 위 모퉁이에 포인트를 묘사. 이 시점에서 커서를 넣어, x, y 좌표 "광학 disector 위치" (4 단계) 측정 하 고 (s, 빨간 화살표) "광 disector position.xlsx" 서식 파일에 삽입 됩니다. (t) 빨간색 화살표: "플러그인"을 선택 →"매크로" → "편집 합니다." 빨간색 화살표 (u) : "opt_dis_grid.txt" 파일을 선택 합니다. 새 창 (v)를열 것 이다. 픽셀 (v, 빨간색 화살표)와 x, y 좌표 (v, 녹색 화살표) "usergrid,"의 크기를 삽입 합니다. (w) "opt_dis_grid.txt" 매크로 (빨간색 화살표)을 실행합니다. (x)는 광학 disector 이전에 정의 된 그리드 스퀘어 (빨간색 화살표)의 중간에 표시 됩니다. (y) 빨간색 화살표: "플러그인" 클릭 → "셀 카운터." (z) 셀 카운터 (빨간색 화살표)을 초기화 하 고 표식 유형 (녹색 화살표)를 선택 합니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5입니다. 광학 disector의 배치입니다.
(a) 편견된 stereology 사용 광학 disector의 그림. 광학 disector 3 차원 입방체 이다. 세 개의 도식 셀 광 disector 내에서 볼 수 있습니다. 셀의 정량화에 대 한 stereological 규칙 광 disector의 빨간 표시 측면을 건드리지 셀 제외 (레드 셀), 문의 레이블이 측 (녹색 세포)를 계산 하는 셀에 포함 된 그린 셀 동안 나타냅니다. (b) 광학 disector SN 연락 오는 모든 그리드 사각형에 배치 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6입니다. 광학 disector 위치와 휴대폰 번호의 추정을 계산 합니다.
(a) 광 disector의 위치에 대 한 예를 들어 계산 수행. (b) 총 세포 수의 추정의 예입니다. 계량된 셀의 숫자는 stereological 정량화의 매개 변수는 노란색 상자에 삽입 된 회색 상자에 삽입 됩니다. 예상된 휴대폰 번호와 CE 파란색 상자에 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7입니다. 매개 변수를 계산 하는 셀의 비교입니다.
(a) 오른쪽과 왼쪽 마우스 상용 stereology 시스템을 사용 하 여 분석에서 얻은 데이터로 설명 stereological 메서드에서 얻은 SN의 예상된 일 + 셀 수 비교 어떤 큰 차이가 표시 하지 않았습니다. 오른쪽 (b) 와 왼쪽된 (c) SN의 취득된 데이터의 자세한 목록은 동물, 실제로 계산, 계산, 섹션의 수와 샘플링 사이트 (즉, 셀 개수 당 예상된 휴대폰 번호와 함께 제공 됩니다. 그리드-사각형의 수 계산) 두 가지 방법에 대 한. 막대 그래프에 값은 평균 ± SEM 6 쥐에서 데이터의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 8입니다. 상용 stereology 시스템과 셀 부 량이 고
(a-b) SN의 개요 그리고 (c) 광 disectors의 위치는 자동으로 결정 됩니다. (d-e) 각 광 disector z 평면 초점을 맞춤 으로써 휴대폰 번호에 대 한 분석 이다. SN 내 6 연속 초점 평면 표시 됩니다. 빨간색과 녹색 선 광 disector에 해당합니다. 스케일 바:-d, 100 µ m; e, 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 파일 1. opt_dis_grid.txt 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
보조 파일 2입니다. 광학 disector position.xlsx 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 파일 3입니다. 계산 셀 count.xlsx 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
Stereology는 조직 처리를 시작합니다. SN 조직의 직렬 절단 stereological 분석 하는 동안 섹션의 손실을 방지 하기 위해 신중 하 게 수행 되어야 합니다. 또한, 하나의 필수 단계 stereology 수행할 때 SN 왼쪽에서 오른쪽을 구별 하기 위해 한 반구를 표시 하는. Brainstem의 상단 부분에 작은 구멍을 배치 제시 연구에서 최상의 결과 생성. 또한, 조직이 광학 fractionator 방법 요구 작업 이후 약 30-40 µ m 보다는 더 일반적으로 immunohistochemistry, 항 체 및 다른 외피 유체 조직 침투 동안에 사용 하는 5-10 µ m의 두꺼운 부분에서 잘라 immunohistochemical 얼룩 해야 합니다 보장 되어야, 같은 세제를 사용 하 여.
Immunohistochemical dopaminergic 신경 TH 항 체를 사용 하 여에 대 한 얼룩 라벨 SN 신경으로 복 부 tegmental 지역 (VTA), SN에서 medially 있는 내 신경 및 retrorubral 필드에 신경. 따라서, 다른 중요 한 포인트는 SN의 stereology 수행할 때 SN 뉴런 표준 immunohistochemical 또는 조직학에 게 얼룩이 지기에 의해 독점적으로 시각화 수 없습니다 이후 마우스 SN 해부학의 지식을 이다. 대신, 시상 핵, retrorubral 필드와 VTA, 같은 해부학 적 랜드마크의 인정은 SN17,,1819의 전체 범위를 결정 하는 것이 중요.
신경 수의 평가 안정적이 고 재현 될 필요가 있다. 상용 stereology 설정을 사용 하는 다양 한 그룹, 비록 번호17,20회 + wt 쥐, 다른 간행물에서 가져온 dopaminergic SN 뉴런의 숫자 다. Baquet 외에., 3-4 개월 남성과 여성의 C57BL/6J wt 쥐 시중 stereology 시스템을 사용 하 여 디자인 기반 stereological 분석 계시는 약된 8,716 ± 338 회 + SN dopaminergic 신경 (범위: 7,546 9,869)17 . 반면, Smeyne 외. 9-에 16 주-오래 된 남성 C57BL/6J 쥐 같은 stereology 시스템20의 최신 버전을 사용 하 여 6,861 ± 338 셀, 6,302 ± 262 셀에서까지 0.9% 염 분 i.p. 받은 적은 일 + SN 셀을 발견. 그러나, 첫 번째 저자 또한 Baquet 외에 마지막 저자가 했다. 종이, 따라서 다른 결과 대 한 이유로 서 경험의 다양 한 각도 제외. 이러한 모순 된 데이터 적은 가변성을 보여주는 stereological 정량화 방법에 대 한 필요성을 반영 합니다. 정량화 및 수식 사용의 기법을 확인 하려면 SN 셀 번호 수 상용 stereology 설치를 사용 하 여 정량화와 설명된 방법을 사용 하 여 결과의 비교를 수행 했습니다. 통계 분석 일 + 오른쪽에서 dopaminergic 신경의 숫자를 비교할 때 어떤 큰 차이가 나타나지 않았다 및 따라서이 메서드는 가능한 위해 보여주는 wt 쥐 세포 정량화의 두 기술을 사용 하 여 결정의 SN 왼쪽에 마우스에 SN 뉴런의 stereological 추정입니다.
설명된 방법의 주요 장점은 그것은 일반적으로 관련된 셀 카운팅을 위한 stereology 기술의 구현 비용을 줄일 수 있습니다. 두 번째 장점은, 설명 방법, SN의 스택 이미지 저장 되 고 다른 수 사관에 의해 (동시)에 언제 든 지 분석할 수 있습니다. 또한, 수집 및 분석의 형광 이미지는이 방법으로 가능 때문에 회색조 이미지 ImageJ의 "조회 테이블"와 착 색 될 수 있다. 그러나,이 연구에 한계가 있다. 첫째, 휴대폰 번호의 정량화는 더 많은 시간이 소요 (약 50%) 보다 상용 stereology 시스템 정량화. 이것은 주로 두 가지 이유 때문에: 1. SN의 이미지를 촬영 해야 합니다 스택 및 2. 각 SN 내의 광 disector 배치의 계산 및 계산 예상된 휴대폰 번호와 CE의 계산 서식 파일을 사용 하 여 수동으로 수행 되어야 합니다. 둘째, 적어도 우리의 실험실에서 사용할 수 있는 시스템, 분석만 수행할 수 있습니다 회색 음영 이미지에 ImageJ로 처리할 수 없습니다 컬러 이미지의 큰 파일 크기 때문에. 이중 얼룩에 동시에 두 개의 서로 다른 세포 인구를 정할 필요가 문제를 내포 하 고 있습니다. 그것은 회색 음영 이미지에서 두 다르게 스테인드 세포 인구를 구별 하기 어려운 수 있습니다. 따라서, 조직학 표본 작업 많은 실험실에서 (x, y, z 평면) 자동화 된 단계 및 해당 소프트웨어를 사용할 수 있습니다, 비록 관리 및 스택 이미지의 품질에 따라 달라 집니다 현미경 소프트웨어의 성능 연결 된 컴퓨터입니다.
한계를 극복 하기 위해 가능한 방법이 있다. 우리가 개발 계산 서식 파일을 사용 하 여 현재 수동으로 수행된 하는 프로세스의 일부를 자동화 하는 매크로 프로그래밍 stereological 평가 하는 동안 오류 또는 부정확을 감소 하 고 작업의 속도 가속 수 있습니다. 또한, ImageJ 및 기타 이미징 소프트웨어의 지속적인 개발 뿐만 아니라 증가 컴퓨터 처리 능력, 큰 이미지 파일 크기 해야 하지 포즈 문제가 가까운 장래에. 따라서, 밝은 필드 컬러 이미지의 분석 설명된 기법으로 관리 될 것입니다.
설명 하는 기술 일 + SN 셀의 분석을 제한 하지만 분석 하는 다른 세포 유형 및 설치류의 뇌 영역에 확장 될 수 있다. 이 대 한 관심 영역의 해 부 경계를 결정 해야 합니다, 그리고 각각 얼룩을 수행 해야 합니다. 또한,이 기술은 두꺼운 섹션을 적용할 수 있습니다. 이 위해, 스택 이미지의 수집 적응 더 많은 스택 이미지를 제공 하 여야 합니다. 예를 들어 40 µ m 두께 섹션 필요한 경우, 실제 후에 탑재 섹션의 두께 조직 얼룩 광학 disector의 필요한 높이 결정 하기 위해 평가 되어야 합니다. 6 µ m (상단 및 하단에서 3 µ m 가드 영역) 평균 조직 두께에서 뺍니다 고 결과 광 disector의 높이.
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Disclosures
C. W. I. 즈 제약, LLC 및 TEVA; 과학 보드에서 제공 하는 Ipsen, 즈, LLC는, 제약과 엘 러간, Inc.;에서 여행에 대 한 자금 지원을 받고 있다 제출된 작품 외부 스피커 honoraria Merz, TEVA, 엘 러간, i n c.에서 받았다. J. V. 보스턴 과학, Medtronic, 및 AbbVie에 대 한 컨설턴트 역임 했다 고 제출된 작품 밖에 honoraria Medtronic, 보스턴 과학, AbbVie, Bial, 엘 러간, 및 GlobalKinetics에서 받고 있다.
Acknowledgments
저자는 그들의 전문 기술 지원; Keali 룀, 루이자 Frieß, 하이 케 멘 젤 감사 헬가 Brünner 동물 보호; 대 하 그리고 생성 및 ImageJ 소프트웨어에 대 한 광학 disector 그리드 플러그인의 배포에 대 한 Chistopher S. 병 동.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paxinos mouse atlas | The Mouse Brain George Paxinos Keith B.J.FranklinCopyright @2001 by Academic Press CD Rom designet & created by Paul Halasz | ||
| brain matrix slicer mouse | Zivic Instruments | BSMAS 001-1 | |
| paraformaldehyde | Merck | 1040051000 | |
| sucrose /D(+) Saccharose | Roth | 4621.1 | |
| isopentane | Roth | 3927.1 | |
| glycerol | Merck | 1040931000 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 32205-1L | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| phosphate buffered saline ingredients: | |||
| sodium chloride | Sigma Aldrich | 31434-1KG-R | |
| potassium dihydrogen phosphate | Merck | 1048731000 | |
| di-sodium hydrogen phosphate dihydrate | Merck | 1065801000 | |
| potassium chloride | Merck | 1049360500 | |
| normal goat serum | Dako | X0907 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A4503-100G | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ml | detergent |
| 3,3-Diaminobenzidine-tetrahydrochlorid/DAB tablets 10mg pH 7.0 | Kem En Tec | 4170 | |
| H2O2/ Hydrogen peroxide 30% | Merck | 1072090250 | |
| avidin/biotin reagent | Thermo Scientific | 32050 | Standard Ultra Sensitive ABC Staining Kit, 1:100 |
| rabbit anti mouse tyrosine hydroxylase antibody | abcam | Ab112 | 1:1000 |
| biotinylated goat-anti-rabbit IgG H+L | vector laboratories | BA-1000 | 1:100 |
| StereoInvestigator version 11.07 | MBF | ||
| BX53 microscope | Olympus | ||
| Visiview | Visitron Systems GmbH | 3.3.0.2 | |
| Axiophot2 | Zeiss | ||
| ImageJ software | NIH | Version 4.7 | |
| Tissue-TEK OCT | Sakura | 4583 | |
| dry ice | |||
| grid overlay plugin | Wayne Rasband | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html | |
| cell counter plugin | Kurt de Vos | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html). | |
| optical disector macro | Christopher Ward | ||
| C57Bl/6N male mice | Charles River, Germany | ||
| SuperFrost Plus coated object slides | Langenbrinck, Germany | ||
| 25G needle Microlance 3 | BD | 300400 | |
| REGLO Analog Infusion pump | Ismatec | ISM 829 | |
| StereoInvestigator system | StereoInvestigator version 11.07 | ||
| BX53 microscope | BX53 microscope | ||
| self-assorted stereology | Visiview | ||
| Axiophot2 | Axiophot2 |
References
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