Stereological estimering av Dopaminergic Neuron nummer i musen Substantia Nigra optiske Fractionator og Standard mikroskopi utstyr

Summary

Dette arbeidet presenterer en trinnvis protokoll for upartisk stereological estimering dopaminergic neuronal cellen tallene i musen substantia nigra bruker standard mikroskopi utstyr (dvs. en lys mikroskop, en motorisert objekttabellen (x, y, z fly), og offentlige programvare for digital bildeanalyser.

Abstract

I pre-klinisk Parkinsons sykdom forskning er analyse av nigrostriatal-område, inkludert kvantifisering av dopaminergic Nevron tap i substantia nigra, avgjørende. For å beregne totalt dopaminergic Nevron nummeret, anses for tiden upartisk stereology med metoden optisk fractionator gull standard. Fordi teorien bak optisk fractionator metoden er komplekse og fordi stereology er vanskelig å oppnå uten spesialisert utstyr, eksisterer flere kommersielt tilgjengelig komplett stereology systemer som inkluderer nødvendig programvare, rent teller grunner for cellen. Siden kjøpe en spesialisert stereology oppsett ikke er alltid mulig, for mange grunner, denne rapporten beskriver en metode for dopaminergic neuronal celle stereological estimering teller bruker standard mikroskopi utstyr, inkludert en lett mikroskop, en motorisert objekttabellen (x, y, z-fly) med bildebehandlingsprogramvare og en datamaskin for analyse. Gis en trinnvis forklaring på hvordan du utfører stereological kvantifisering med metoden optiske fractionator og pre-programmerte filene for beregning av beregnet celletall tilbys. For å vurdere nøyaktigheten av denne metoden, ble en sammenligning til data fra et kommersielt tilgjengelig stereology apparatet utført. Sammenlignbare cellen tallene ble funnet ved hjelp av denne protokollen og stereology enheten, dermed demonstrere presisjonen for denne protokollen for upartisk stereology.

Introduction

Kvantifisering av neuronal celle nummer er sentral i pre-klinisk Parkinsons sykdom forskning for å bestemme nivået av neurodegeneration innen substantia nigra (SN)^1,2. Upartiske stereological estimering av celle nummer i et område av interesse anses gullstandarden^3,4,5.

Før objektiv stereology, ble antall nevroner i delene vurdert ved å manipulere telt celle profiler korrigere variabel sannsynligheten at nervecellene kommer til syne i en inndeling. En av de mest brukte metodene var korreksjon av kvantifisert celletall beskrevet av Abercrombie⁶. Denne metoden forsøkte å ta hensyn til at cellene kan kvantifiseres mer enn én gang hvis fragmenter av samme celle finnes i tilstøtende tynne snitt. Derfor generert Abercrombie og andre forfattere ligninger som nødvendige forutsetninger om form, størrelse og retning av telles cellene^7,8. Men var dette vanligvis ikke realisert og førte til systematisk feil og avvik fra hvor selve cellen (dvs. bias). Videre kunne bias ikke bli redusert med ytterligere prøvetaking³.

For stereological estimering celle tall ved hjelp av den optiske fractionator, brukes matematiske prinsipper for å anslå direkte celle tall direkte i et definert, 3-dimensjonale volum. Fordelen med denne metoden er at det ikke involverer antagelser om form, størrelse og retning av cellene blir regnet. Dermed anslagsvis cellen tallene er nærmere den sanne verdiene og komme nærmere som utvalgsstørrelsen (dvs. objektiv)³. Fordi mange regler må følges ved stereology for å holde metoden upartisk, klar til bruk kommersielle stereology systemer er utviklet (for vurdering, se Schmitz og Hof, 2005⁴). Spesialisert stereology systemer implementere design-baserte stereological metoder med en priori definert sonder og prøvetaking ordninger for stereological vurderinger som fører til uavhengighet fra form, størrelse, romlige fordelingen og retningen på de cellene skal analysert^4,9. Tilsvarede stereology systemer er imidlertid dyrt; Dette kan begrense implementering i ny forskning.

Målet med denne studien var å utvikle en brukervennlig teknikk for design-baserte stereological estimering dopaminergic celletall musen SN, sysselsetter metoden optiske fractionator og bruker standard mikroskopi utstyr (dvs. lys mikroskopet, standard mikroskop programvare og motoriserte x, y, z scenen). For dette vises en trinnvis veiledning på hvordan å behandle musen hjernevevet og beregne SN celle tall ved hjelp av design-baserte upartisk stereology. Dessuten tilbys maler for beregning av beregnet celle tall og koeffisientene til feil (CE).

Metoden beskrevet her er ikke begrenset til analyse av SN, men kan tilpasses for bruk i andre anatomisk definerte områder av mus eller rotte hjernen. For eksempel har upartisk stereology blitt brukt til å beregne neuronal cellen tallene i hippocampus¹⁰ og locus coeruleus¹¹. I tillegg kan celletyper enn neurons, som astrocyttene¹² og microglia¹³, vurderes også. Derfor kan denne metoden være nyttig for forskere som ønsker å implementere upartisk stereology i sin forskning, men er ikke villig til å bruke mye penger å kjøpe en stereology system.

Protocol

alle gjeldende internasjonale, nasjonale eller institusjonelle retningslinjer og bruk av dyr ble fulgt. Protokollen ble godkjent av lokale myndigheter på Regierung von Unterfranken, Würzburg, Tyskland.

1. vev behandling og Immunohistochemistry

1. Euthanize mus med CO ₂ eller andre godkjent metode.
2. Perfuse seks 12-uke-gamle C56Bl/6N mannlige mus transcardially med 10 mL 0.1 M fosfat-bufret saltoppløsning (PBS) bruker en 25-G nål og en infusjon pumpe, etterfulgt av 70 mL 4% paraformaldehyde (PFA) i 0.1 M PBS.
   Forsiktig: PFA er giftig, allergifremkallende og kreftfremkallende.
3. Dissekere musen hjernen koronale flyet med en hjerne matrix slicer i regionen +0.74 mm fra Bregma (figur 25, Paxinos og Franklin musen hjernen atlas ¹⁴).
4. Sette den rygg delen av hjernen, inkludert SN, 4% PFA i 0.1 M PBS for 1 d på 4 ° C for nedsenking-fiksering.
5. Bytte PFA for 30% sukrose/0.1 mol PBS løsning på cryo-beskyttelse og Inkuber for en annen 2 d på 4 ° C.
6. Sette den rygg delen av hjernen i en cryomold fylt med optimal kutte temperatur (OCT) sammensatte og sakte fryse vevet i flytende tørris-avkjølt isopentane.
   Forsiktig: Tørris er ekstremt kaldt (-78 ° C); Bruk personlig verneutstyr (PVU), inkludert hansker, mens du arbeider med tørris. Tørris fordamper i CO ₂; Derfor fungerer under avtrekksvifte.
7. Serielt kuttet 30 µm cryo-partiene i koronale flyet og samle delene, starter på 2,46 mm fra Bregma (figur 51, Paxinos og Franklin musen hjernen atlas ¹⁴) og slutter ved 4.04 mm fra Bregma (figur 64, Paxinos og Franklin musen hjernen atlas ¹⁴).
8. Lagre fire serier i rør som er fylt med kryoprotektant (30% glyserol, 30% ethoxyethanol og 40% PBS) på 20 ° C. Under snitting prosedyren, merker du den høyre hjernehalvdelen ved punktering et lite hull i det øvre området av hjernestammen.
9. Immunohistochemical flekker, velger en rekke deler per musen. Preincubate frittflytende deler 1t i 10% normal geit serum (NGS)/2% BSA/0.5% vaskemiddel i 0.1 mol PBS på en shaker. Inkuber delene med kanin anti-musen tyrosin hydroksylase (TH, 1:1,000 fortynning) antistoff fortynnet i 2% NGS/2% BSA/0.5% vaskemiddel i 0.1 mol PBS overnatter 4 ° C.
10. Bruk sekundær antistoffer mot kanin Igs (1: 100 fortynning) for 2 timer ved romtemperatur, etterfulgt av avidin/biotin reagens (1: 100 fortynning). Ruge og flekker med 3,3-diaminobenzidine-tetrahydrochloride (DAB) og H ₂ O ₂. Montere delene etter farging dem på bestrøket objektet lysbilder.
    Merk: TH + dopaminergic SN neurons er vist i figur 1a. Av flekker serienavn, gjennomsnittlig 13 SN deler, strekker seg fra den rostral caudal deler av SN pars compacta (SNpc) og reticulata, er farget per dyr ( figur 1b). Delene er skilt med 120 µm (1/4 serie) ( figur 1 c).
    Forsiktig: DAB er et mulig karsinogen. Det er giftig ved kontakt og innånding. Bruke PPE når du arbeider med DAB.

2. Oppkjøpet av bilder

1. fange TH immunohistochemically farget SN inndelinger digitalt ved hjelp av bildebehandlingsprogramvare som er koblet til et mikroskop. Separat analysere hver del av en serie.
2. Bruk på lysbildet for skannealternativene av tenkelig programvare. Lagre i TIFF-format for høykvalitets bilder (figur 2).
   Merk: Bildeoppløsningen er 312 piksler per cm.
3. Trykk " Hent " å åpne vinduet oppkjøp (figur 2a).
4. Satt på binning til " 2 " for gråtonebilder.
   Merk: Oppkjøpet av gråtonebilder i stedet for fargebilder reduserer størrelsen på bildefilen siste stakken (figur 2a).
5. Klikk på " Vis Live " i vinduet oppkjøpet å åpne et nytt vindu viser live bildet av delen (figur 2 en og b).
6. Klikk på " scenen " i vinduet kjøp. Velg " skanne Skyv " i dropdown-menyen og merker (figur 2 c).
   Merk: Dette kan erverv og justering av sterkt forstørret SN bilder (630 X forstørrelse) i x, y-fly, samt oppkjøpet av stakk bilder med en avstand mellom påfølgende bilder på 1 µm i z-flyet, som dekker en total rekkevidde på 13 µ m.
7. Velg 2,5 X målsettingen søke etter SN.
8. Endre målet til 63 x.
9. Angi øverst til venstre (TopLeft) (figur 2 c) og nedre høyre hjørne (LowRight) (figur 2d) i delen ved å klikke på " sett. "
10. Klikk på " Z-serien " og sjekk det " Z-Plane serien " boksen (figur 2e).
11. Bestem faktisk montert tykkelsen av tre tilfeldig valgt dyktighet områder per delen ved hjelp av tenkelig programvare. For dette, klikk på " Vis topp Offset " definere toppen av delen (figur 2e) og klikk på " stoppe visningen toppen " (figur 2f). Deretter klikker du på " Vis bunnen Offset " (figur 2f) og klikk på " stoppe visningen nederst " (figur 2 g). Skriv ned tykkelsen på delen.
12. Trekke 3 µm (vakt sone) fra toppen forskyvning og skriv resultatet i topp offset sporet (figur 2 h). Trekke fra 13 µm (høyde av den optiske disector) fra det øverste offset nummeret og skriv resultatet i nederste utlignet sporet (figur 2i). Velg følgende parametere: trinn 14; størrelse, 1,00 (figur 2i).
    Merk: Dette tilsvarer en tykkelse i z-flyet på 13 µm, med en 1-µm avstand mellom påfølgende bilder.
13. Velg katalogen for å lagre filen (figur 2j).
14. Klikk på " rekkefølge " å starte oppkjøpet (figur 2j).
15. Klikk på " behandling " og velg følgende parametere: " alle fly, " fra " rekkefølge; " " montasje, " og " raskt " og " Stitching " boksene med overlapp bilde på 10% (figur 2 k). Begynne å sette bildene ved å klikke på " start ".
    Merk: Dette vil generere stakk bilder for analyse (figur 2 l, figur 3a -e).

3. Sekvens av Stereological vurdering

1. utføre analyse av SN stakk bilder bruker NIH ImageJ programvareversjonen 4.7.
2. Laste ned de to plugins som kreves fra webområdet ImageJ.nih.gov: den " rutenett overlegg " plugin ¹⁵ og " celle Counter " plugin ¹⁶. Installere både plugins som.
3. For upartisk stereological vurdering, definere parameterne teller som følger: Rutenettstørrelse, 130 x 130 µm; counting ramme, 50 x 50 µm; og optisk disector høyde, 13 & #181; m.
4. Åpne bildet ved å klikke på " filen " → " åpne " (figur 4a) Angi bildet skala ved hjelp av den " analyser " → " satt skala " kommandoen (figur 4b). For dette trinnet endrer definerte størrelsen fra piksler til µm (Figur 4 c).
   Merk: For analysert bilder, 425 piksler tilsvarer 100 µm.
5. Velg den " Plugins " → " rutenett " → " rutenett Type: linjer " kommandoen tilfeldig sette et rutenett. Sjekk den " tilfeldig forskyvning " boksen. Definere størrelsen på én firkant i rutenettet (-rute) som 130 µm x 130 µm = rundt 16 900 µm ² ( figur 3b og Figur 4 d og e).
6. Endre bilde type fra 16-biters RGB fargen (Klikk på " bilde " → " Type " → " RGB fargen ") (figur 4f). Finne SNpc, som beskrevet av Baquet et al. ¹⁷. omringe SNpc med de " pensel verktøyet " (børste bredde: 11) ( Figur 3 c og Figur 4 g -jeg).
7. Angre den " angi skala " kommando ved å klikke " analyser " → " satt skala " → " Klikk for å fjerne skala " (figur 4j -l) å aktivere resultatene av beregningene i piksler heller enn µm.
8. Gjør et skjermbilde (Figur 4 m), lagre bildefilen og åpne den nye filen med ImageJ (figur 4n). Velg " punkt " (figur 4o) og en pensel bredde 25 (Figur 4 p). Merk hver-rute som kontakter SN for plasseringen av en optisk disector (figur 4q). Utføre analyse av celle nummer alle optisk disectors som er lokalisert helt eller delvis i disponerte SN.
9. Velg en-rute som inneholder deler av SN. Måle det øverste venstre hjørnet på denne plassen med markøren i ImageJ definere x- og y-koordinater for å starte med (figur 4r).
   Merk: Koordinater settes for optisk disector posisjonering ved hjelp av den " optisk disector posisjon " (figur 4s), som beskrevet i trinn 4.
10. Beregne optisk disector posisjon ved hjelp av malen regneark kalt " optisk disector posisjon, " som beskrevet i trinn 4.
11. Kalibrere den optiske disector (makro skrevet av Christopher S. Ward, Ekstra filen) ved å klikke på " Plugins " → " makroer " → " Rediger " (figur 4t), åpne den " opt_dis_ Grid.txt " filen (figur 4u), og Definer størrelsen på den " usergrid " i piksler som samsvarer med x, y dimensjonen av den optiske disector (figur 4v). Velg en størrelse på 50 µm x 50 µm, slik at størrelsen på en side av usergrid er definert som 212.5 piksler (50 x 4,25 piksler).
12. Bestemmer plasseringen av den optiske disector i stakken bildet ved å sette inn ImageX og ImageY koordinatene definerer midten av den optiske disector (figur 4v). Kjøre makroen (" makroer " → " Kjør makro ") (figur 4w).
    Merk: Rutenettet vil forsvinne fra stakken ( figur 3d og Figur 4 x). Den optiske disector beholdes når du flytter i z-flyet ( figur 3e og Figur 4 x).
13. Velg " Plugins " → " celle Counter " å starte cellen Counter plugin (Figur 4 års dekning ved). Initialiser celle disken og velg en markør (figur 4z). Zoome inn på bildet (Klikk på " + ") og utføre stereological vurdering av cellen tallene på en forstørrelse på 200%.
14. Identifiserer dopaminergic neuronal perikarya av runde eller ovale figuren og celle størrelsen ( figur 1a). Kvantifisere antall celler ved å bruke stereological regler.
    Merk: Siden den optiske disector er en 3-dimensjonal kube ( figur 5a), definere utelukkelse sidene som front, venstre og topp sider av kuben (rød). Derfor don ' t greven TH + celler som kommer i kontakt med den røde linjen (venstre og front) eller toppen side. Legge til resultatet av celletall forberedt regnearkfilen rett, " beregning av celletall " (trinn 5).
15. Ifølge SN bildet, beregne den neste-rute å plassere den optiske disector for neste celle telling, bruker x, y trinn størrelsen på overliggende rutenettet ( figur 5b) og " optisk disector posisjon " regnearkmal, som beskrevet i trinn 4.
16. Utfører en vurdering av den cellen ved hjelp av " beregning av celletall " regneark (trinn 5).

4. Beregning av optisk Disector posisjon ved hjelp av " optisk Disector posisjon " regnearkmal

1. beregne størrelsen og plasseringen av hver optisk disector settes i overliggende rutenettet i disposisjonen av SN ( figur 5b) bruker den " optisk disector position.xlsx " regnearkfilen (Ekstra fil).
2. Sette inn konvertering av piksel per µm, slik som definert av den " angi skala " kommandoen, i de gule merket posisjonene av den " optisk disector position.xlsx " filen ( figur 6a og ekstra fil ).
3. Sette inn planlagt størrelsen på den optiske disector og størrelsen på rutenett-kvadratet av overliggende rutenettet, definert av lengden på én-siden (i µm), i oransje merket stillingene.
   Merk: Resultater er vist i rødt boksene ved siden av boksene oransje.
4. Starter med rutenett-plassen i SN disposisjonen som ble fastsatt som utgangspunkt (en-rute ble valgt til å begynne med, som i trinn 3.9, ovenfor).
5. Sett inn x- og y-koordinater, målt i trinn 3.9, i de grønne boksene av filen (ved hjelp av disse verdiene, x, y-koordinater for midten av den optiske disector i denne første plassen beregnes, og resultatene vises i boksene blå). Kjør makroen opt_dis_grid.txt (Ekstra fil).
6. Beregner x, y koordinatene til den etterfølgende optisk disectors ved å sette inn-rute avstanden (målt i antall ruter) i forhold til den første rutenett-torget (brun bokser).
   Merk: + x:-rute er plassert til høyre; -x:-rute er plassert til venstre. + y:-rute ligger nederst; -y:-rute ligger øverst. Resultatene vises i de grå boksene.

5. Estimering av cellen tall ved hjelp av " beregning av celletall " regneark

1. Beregn anslått antall TH + SN celler per dyr (N) ved hjelp av formelen publisert ved West et al., 1991 ³, hvor ∑ Q ^- er definert som antall TH + neurons telles i alle optisk disectors én hjerne delen.
   Merk: Høyden av den optiske disector (h) i forhold til målt tykkelsen på delen (t) er inkludert i ligningen. Området prøvetaking brøken (asf) er definert som andelen av området (A) optisk disector (en optisk disector) rammestørrelsen i kvadrat størrelsen på rutenettet (x, y trinn) (en optisk disector/A x, y trinn) ( figur 3b), og delen prøvetaking brøkdel (ssf) er definert som andelen av deler av hele serielt kuttet hjernen:
   
   å sikre høy kvalitet kvantitative beregninger, koeffisient feil (CE) bør være lavere enn 0.10. Bestemme CE bruker formelen av Keuker et al., 2001 ¹⁰:
   
2. For celle antall SN av hver stereological estimering musa, sette inn den angitte informasjonen om antall genererte serie per musen, høyden av den optiske disector, x, y området av den optiske disector (en optisk disector, i µm ²), x, y området av rutenett-torget (en x, y trinn i µm ²), og gjennomsnittet tykkelsen på delen (i µm) i de gule boksene med den " beregningen av cellen count.xlsx " regnearkfilen ( figur 6b og supplerende fil ).
3. Analyserer hver SN delen fra samme dyret, som beskrevet i trinn 5.
4. Sett inn celle teller hver optisk disector i grå boksene hver linje henviser til en SN delen, bruker den " beregningen av cellen count.xlsx " regnearkfilen (Ekstra fil).
   Merk: Anslått celle nummer og beregnede CE er avbildet i boksene blå ( figur 6b).

6. Estimering av celle nummer ved å bruke en kommersielt tilgjengelig Stereology

1. Start estimering av dopaminergic SNpc celle nummer ved å klikke på " sonder " → " optisk Fractionator arbeidsflyt " åpne den optiske Fractionator Arbeidsflyt vinduet.
   Merk: Et nytt vindu vil popup til å bestemme om den nye serien av SN skal telles.
2. Starter en ny serie med TH + SN inndelinger ved å klikke " starte et nytt emne " i hurtigvinduet.
3. Gå gjennom de ulike trinnene i optisk Fractionator arbeidsflyten. Angi emnet i første omgang. For dette, setter du inn etterforskeren ' s navn, emnet ' s navn (SN gruppe) og annen nyttig informasjon. Sett inn antall avsnitt teller denne SN. Sett inn tykkelsen på delene kuttet vev. Sette inn delen intervallet som er fire i dette tilfellet. Sett inn tilfeldig bestemt inndelingsnummeret med.
4. i det andre trinnet, angi mikroskopet lav forstørrelse (2 X mål) og velg " 2 X Mag linsen " menyen.
5. i trinn 3, spore regionen rundt med venstre museknapp, som er SNpc, som beskrevet av Baquet et al., 2009 ¹⁷.
6. Angi mikroskopet forstørring i trinn 4. For dette, endre målet til 100 X, og velg " 100 X Mag linsen " fra nedtrekksmenyen.
7. Måle montert tykkelsen i trinn 5 ved å fokusere toppen og bunnen av avsnittet.
8. i trinn 6, definerer counting rammestørrelse som 50 x 50 µm, og dette er størrelsen på det optiske disector (x, y).
9. i trinn 7, angir du størrelsen på systematisk stikkprøvekontroll (SRS) rutenettet som 130 x 130 µm.
10. Angir en 3-µm vakt sone i trinn 8.
11. Lagre innstillingene i trinn 9.
12. Endelig telle TH + dopaminergic celler i hver av det optiske disectors i SRS rutenettet i trinn 10 av optisk Fractionator arbeidsflyten. For dette, starter ved å klikke på den " Counting " knappen.
13. Når én del, klikk på den " begynne avsnittet " for å starte optisk Fractionator arbeidsflyten SN avsnittet av samme SN serien.
14. Når den siste SN delen av SN serier har vært kvantifisert, klikk på " jeg ' ve ferdig Counting. "
15. Klikk på den " vise resultater av " for å vise resultatene av stereology prøvetaking.

Representative Results

Med metoden presentert, beregnet antall TH + dopaminergic neurons SN varierte mellom 7,363 og 7,987 celler til høyre og venstre SN, mellom 7,446 og 7,904 celler. Dermed var gjennomsnittlig antall dopaminergic nevroner (± SEM) 7,647 ± 83 celler for høyre SN og 7,675 ± 66 for venstre SN. Beregnet CE for hvert dyr var lavere enn 0,08 (område: 0.073-0.079) (figur 7). For å konstatere sammenlignbarheten metoden med kommersielt tilgjengelig og spesialisert stereology systemer, kvantifisert SN cellen tallene også bruk stereology (Figur 8). Parameterne teller var: Rutenettstørrelse, 130 x 130 µm; Counting ramme, 50 x 50 µm; vakt sone, 3 µm. deler ble analysert med en 100 x / 1,25 numeriske blenderåpning mål på BX53 mikroskop. Antatt folketall TH + SN neurons bruker mener snittykkelsen varierte fra 7,067 til 8,105 celler/SN og 7,164 å 8,015 celler/SN på høyre og venstre sider, henholdsvis. Mener neuronal antallet beregnet som 7,535 ± 155 cellene for retten SN og 7,699 ± 128 for venstre SN. Gundersen CE (m = 1) var ≤0.08 i hver SN kvantifisert (figur 7). Statistisk analyse med parvis Student t-test ikke avsløre noen betydelige forskjeller mellom TH +-celletall av de to metodene i høyre eller venstre SN (mener ± SEM; rett: t (5) = 0.9524, P > 0,05; venstre: t (5) = 0.2928, P > 0,05) (figur 7 ).

Figur 1. Representant bilder av musen SN farget for dopaminergic neurons.
(a) en oversikt over en representant musen SN vises i det øvre panelet. Merk det lille hullet i den øvre delen av høyre hjernestammen som merker til høyre. Høyere forstørrelsen av rammemargen (svart boks) viser TH + dopaminergic neurons. (b) en rekke TH-farget SN deler vises, som dekker hele musen SN fra rostral caudal. (c) hver del er adskilt fra den etterfølgende delen av 120 µm. skala barer: en, øvre panel, 500 µm; nedre panel, store bildet, 100 µm; nedre panel, senket, 50 µm; b, 500 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2. Oppkjøpet av bilder for stereological analyse ved hjelp av tenkelig programvare.
(a) rød pil: åpne vinduet oppkjøpet; grønn pil: Angi binning til "2," blå pil: Vis det levende bildet. (b) åpnes et nytt vindu viser live bildet (rød pil). (c) rød pil: Velg "Scenen"; grønn pil: Velg alternativet "Scan Slide"; blå pil: alternativet "Scan Slide"; svarte pilen: Angi øverst til venstre. (d) svarte pilen: definere nederst til høyre. (e) rød pil: Velg "Z-serien"; grønn pil: Sjekk "Z-Plane serien;" blå pil: starte den "Vis topp Offset" søke etter toppen av delen. (f) rød pil: Klikk på "Stoppe visningen Top" definere toppen av delen; grønn pil: starte "Vis bunnen Offset" søke etter nederst delen. (g) rød pil: Klikk på "Stoppe visningen bunnen" definere nederst delen. (h) rød pil: trekke fra 3-µm vakt sone fra "Topp Offset" og sett resultatet i "Topp Offset" sporet. (i) rød pil: trekker 13 µm fra hvor "Topp Offset" og setter inn resultatet i det "Bunnen Offset" sporet; grønn pil: definere 14 trinn som svarer til en z-fly tykkelse på 13 µm; blå pil: definere en størrelse på 1.00 µm som svarer til en 1-µm avstand mellom påfølgende bilder. (j) rød pil: Velg katalogen for å lagre filen. blå pil: Klikk på "Sequence" starte oppkjøpet av bilder. (k) rød pil: Klikk på "Behandling;" sjekk følgende parametere: grønn pil: "Alle fly;" blå pil: "Sekvens," svarte pilen: "Montasje;" grå pil: "Søm;" lilla pil: rask. (l) Klikk på den gule pilen starte stikkende bilder. Klikk her for å laste ned denne filen.

Figur 3. Bildebehandling for stereological analyse.
(a) et eksempel stabel bilde tatt fra en mus SN. (b og c) Etter randomisert innsetting av et rutenett overliggende SN (turkis linjer, b), er SN skissert i andre trinnet (blå linje, c). (d) en optisk disector plasseres i SN stabel bildet. (e) seks påfølgende fokal fly i SN stabel bilde dekker 13 µm sum i z-flyet. Skalere barer: a-d, 100 µm; e, 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4. Sekvens av stereological vurdering bruker ImageJ.
(a) rød pil: Klikk på "Fil" → "Åpne" for å åpne en stabel bilde. (b) rød pil: Klikk på "Analysere" → "Angi skala". (c) røde piler: Definer parameterne for "Avstanden i piksler," "Kjent avstand" og "Måleenhet." (d) rød pil: Velg "Plugins" → "Rutenett." (e) rød pil: Velg "Linjer;" grønn pil: Sjekk "Tilfeldig forskyvning;" blå pil: setter størrelsen på rutenettet i µm². (f) rød pil: Klikk på "Image" → "Type" → "RGB Color." (g) rød pil: Velg "Pensel verktøyet;" grønn pil: definere "pensel bredde" som 11. (h) rød pil: begynner å omringe den SNpc. (i) rød pilene viser omsluttede SNpc. (j) rød pil: Klikk på "Analysere" → "Angi skala" og fjerne skala (k) ved å klikke på "Klikk å fjerne skala," avbildet av røde pil. Merke endringen fra µm (k, grønn pil) til piksler (l, rød pil). (m) ta et skjermbilde (røde pilen peker mot skjermbilde) og (n) åpne bildefilen skjermbilde med ImageJ. (o) rød pil: Klikk på "Punkt." (p) rød pil: sette inn en pensel bredde 25. (q) den røde pilen viser merkede rutenett-rutene som kontakte SNpc. (r) den røde pilen peker på øvre venstre hjørne av et rutenett-kvadrat som inkluderer SN. Ved å sette markøren på dette punktet, x, y-koordinater for "optiske disector stillingen" (trinn 4) måles og settes inn i malen "optisk disector position.xlsx" (s, rød pil). (t) rød pil: Velg "Plugins" →"Makroer" → "Rediger." (u) rød pil: Velg filen "opt_dis_grid.txt". Et nytt vindu åpnes (v). Sette inn størrelsen på den "usergrid", i piksler (v, rød pil), og x, y-koordinater (v, grønn pil). (w) kjøre makroen "opt_dis_grid.txt" (rød pil). (x) en optisk disector vises i midten av tidligere definerte rutenett-plassen (rød pil). (y) rød pil: Klikk på "Plugins" → "Celle Counter." (z) starte cellen telleren (rød pil), og velg en markør (grønn pil). Klikk her for å laste ned denne filen.

Figur 5. Plassering av den optiske disector.
(a) illustrasjon av den optiske disector brukes for upartisk stereology. Den optiske disector er en 3-dimensjonal kube. Tre skjematisk celler vises i den optiske disector. Stereological reglene for kvantifisering av celler viser at cellene berører de røde merket sidene av den optiske disector er utelukket (røde celle), mens celler som kontakt grønne merket sider er inkludert i celle teller (grønne celler). (b) en optisk disector er plassert i hver-rute som kommer i kontakt med SN. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6. Beregning av optisk disector posisjon og estimering av celle nummer.
(a) en eksempel beregning utføres for posisjonering av den optiske disector. (b) et eksempel på estimering av totale celle nummer. Antall kvantifisert celler settes i grå boksene mens parameterne for stereological kvantifisering settes i gule bokser. Det estimerte celle nummeret og CE vises i boksene blå. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 7. Sammenligning av cellen teller parameteren.
(a) sammenligne beregnet TH + celle antall høyre og venstre museknapp SN innhentet fra metoden beskrevet stereological med data fra analyse ved hjelp av kommersielt tilgjengelig stereology systemet ikke viste noen betydelige forskjeller. En detaljert liste over innhentet data fra høyre (b) og venstre (c) SN er gitt med anslagsvis celle nummer per dyr, antall celler faktisk telles, antall deler telt, og antall målestasjoner (dvs. antall ruter telt) i begge. Verdiene i stolpediagrammer er gjennomsnittlig ± SEM data fra 6 mus. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 8. Kvantifisering av celler med kommersielt tilgjengelig stereology systemet.
(a-b) Omrisset av SN er trukket og (c) plasseringen av den optiske disectors er automatisk bestemt. (d-e) Hver optisk disector er analysert for celle nummer ved å fokusere langs z-flyet. Seks påfølgende fokal fly i SN vises. De røde og grønne linjene tilsvarer den optiske disector. Skalere barer: a-d, 100 µm; e, 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Ekstra fil 1. opt_dis_grid.txt Klikk her for å laste ned denne filen.

Ekstra fil 2. Optisk disector position.xlsx Klikk her for å laste ned denne filen.

Ekstra filen 3. Beregningen av cellen count.xlsx Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Stereology starter med vev behandling. Seriell skjæring av SN vev må utføres med forsiktighet for å hindre tap av delene under stereological analyse. Dessuten er en viktig skritt å merke en halvkule for å skille rett fra venstre SN når du utfører stereology. Plassere et lite hull i den øvre delen av hjernestammen generert beste resultatene presentert studien. Videre siden jobbet med optisk fractionator metoden krav som vevet skjær i tykke snitt ca 30-40 µm, i stedet for 5-10 µm mer vanlig i immunohistochemistry, antistoffer og andre inkubasjon flytende vev gjennomtrengning i løpet Immunohistochemical flekker må sikres, slik som ved hjelp av et vaskemiddel.

Immunohistochemical flekk dopaminergic neurons bruker TH antistoff etiketter SN nerveceller, i tillegg til neurons i det ventrale tegmental området (VTA), som ligger på medialt fra SN, og nerveceller i feltet retrorubral. Således, en annen kritisk punkt når du utfører stereology av SN er kunnskap om musen SN anatomi, siden SN neurons kan visualiseres utelukkende av standard immunohistochemical eller histologiske flekker. I stedet, anerkjennelse av anatomiske landemerker, som nucleus subthalamicus, feltet retrorubral og VTA, er viktig å fastslå hele omfanget av SN^17,18,19.

Vurdering av neuronal nummeret må være pålitelig og reproduserbar. Selv om ulike grupper bruke kommersielt tilgjengelige stereology oppsett, varierer antall TH + dopaminergic SN nerveceller i wt mus, tatt fra ulike publikasjoner, i nummer^17,20. I Baquet et al., design-baserte stereological analyse i 3 - 4-måneden-gamle mannlige og kvinnelige C57BL/6J wt mus med en kommersielt tilgjengelig stereology system avdekket en estimert 8,716 ± 338 TH + dopaminergic SN neurons (område: 7546-9,869)¹⁷ . I kontrast, Smeyne et al. fant færre TH + SN celler i 9 - 16-uke-gamle mannlige C57BL/6J mus mottatt 0,9% saltvann IP, alt fra 6,302 ± 262 celler i 6,861 ± 338 celler, med en nyere versjon av den samme stereology system²⁰. Men var den første forfatteren også den siste forfatteren i Baquet et al. papir, derfor unntatt varierende erfaring som årsak til de ulike resultatene. Disse motstridende data reflekterer behovet for en stereological kvantifisering metode som viser mindre variasjon. Du kan kontrollere teknikken for kvantifisering og formelen som brukes ved ble en sammenligning av resultatene av SN celle antall med metoden beskrevet med en kvantifisering bruk kommersielt tilgjengelig stereology utført. Statistisk analyse viste ikke noen betydelige forskjeller når du sammenligner tallene av TH + dopaminergic nerveceller i høyre og venstre SN wt mus bestemmes ved hjelp av begge teknikkene for cellen kvantifisering, dermed demonstrere at denne metoden er gjennomførbar for den stereological estimering av SN nerveceller i mus.

Den største fordelen med metoden beskrevet er at det reduserer kostnadene som er vanligvis forbundet med implementeringen av stereology teknikker for cellen opptelling. En annen fordel er at for metoden beskrevet stakk bilder av SN lagres og kan analyseres helst (selv på samme tid) av en annen. Videre er oppkjøp og analyser av fluorescens bilder mulig med denne metoden fordi gråtonebilder kan være farget med "Oppslagstabeller" i ImageJ. Det er imidlertid begrensninger i denne studien. Først er kvantifisering av celle nummer mer tidkrevende (rundt 50%) enn kvantifisering med kommersielt tilgjengelig stereology systemet. Dette er hovedsakelig på grunn av to grunner: 1. stakk bilder av SN må tas og 2. beregningen av optisk disector plassering i hver SN og beregning av beregnet celle nummer og CE må utføres manuelt ved hjelp av beregning maler. Andre, minst med systemet tilgjengelig i vårt laboratorium, analysen kan bare utføres på gråtonebilder på grunn av den store filstørrelsen på fargebilder, som ikke kunne behandles av ImageJ. Dette kan være et problem hvis det er behov for å kvantifisere to ulike celle populasjoner samtidig i en dobbel flekk. Det kan være vanskeligere å skille to annerledes farget celle populasjoner i gråtonebilder. Derfor selv om en motorisert scene (x, y, z-fly) og den tilhørende programvaren er tilgjengelig i mange laboratorier arbeider med histologiske prøver, avhenger ledelse og kvaliteten på stakk bilder av mikroskopet programvaren og ytelse vedlagt datamaskinen.

Det finnes mulige måter å overvinne begrensningene. Ved hjelp av beregningsmalene vi utviklet, kan programmering av makroer for å automatisere noen av de aktuelle manuelt utført prosessene redusere feil eller unøyaktigheter i løpet stereological vurdering og akselerere hastigheten på arbeidet. I tillegg bør med den pågående utviklingen av ImageJ og andre bilderedigeringsprogrammer, samt med økende datamaskinen prosesseringskraft, større image filstørrelser ikke være et problem i fremtiden. Analyser av lyse-feltet fargebilder vil derfor være håndterbart beskrevet teknikken.

Teknikken er beskrevet er ikke begrenset til analyser av TH + SN celler, men kan bli utvidet til å analysere andre celletyper og områder av hjernen av gnagere. For dette anatomiske grenser regionen rundt må bestemmes, og den respektive flekker må utføres. I tillegg, kan denne teknikken tilpasses til tykkere deler. For dette må oppkjøpet av stakk bilder tilpasses å gi mer stakk bilder. For eksempel hvis 40 µm tykke delen, montert faktisk tykkelsen på delen etter vev flekker må vurderes for å bestemme nødvendige høyden på den optiske disector. Trekke 6 µm (3-µm vakt sone øverst og nederst) fra mener vev tykkelsen og ta resultatet som høyden av den optiske disector.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paxinos mouse atlas			The Mouse Brain George Paxinos Keith B.J.FranklinCopyright @2001 by Academic Press CD Rom designet & created by Paul Halasz
brain matrix slicer mouse	Zivic Instruments	BSMAS 001-1
paraformaldehyde	Merck	1040051000
sucrose /D(+) Saccharose	Roth	4621.1
isopentane	Roth	3927.1
glycerol	Merck	1040931000
Ethanol	Sigma Aldrich	32205-1L
Name	Company	Catalog Number	Comments
phosphate buffered saline ingredients:
sodium chloride	Sigma Aldrich	31434-1KG-R
potassium dihydrogen phosphate	Merck	1048731000
di-sodium hydrogen phosphate dihydrate	Merck	1065801000
potassium chloride	Merck	1049360500
normal goat serum	Dako	X0907
bovine serum albumin	Sigma	A4503-100G
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100-100ml	detergent
3,3-Diaminobenzidine-tetrahydrochlorid/DAB tablets 10mg pH 7.0	Kem En Tec	4170
H2O2/ Hydrogen peroxide 30%	Merck	1072090250
avidin/biotin reagent	Thermo Scientific	32050	Standard Ultra Sensitive ABC Staining Kit, 1:100
rabbit anti mouse tyrosine hydroxylase antibody	abcam	Ab112	1:1000
biotinylated goat-anti-rabbit IgG H+L	vector laboratories	BA-1000	1:100
StereoInvestigator version 11.07	MBF
BX53 microscope	Olympus
Visiview	Visitron Systems GmbH	3.3.0.2
Axiophot2	Zeiss
ImageJ software	NIH	Version 4.7
Tissue-TEK OCT	Sakura	4583
dry ice
grid overlay plugin	Wayne Rasband		https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html
cell counter plugin	Kurt de Vos		https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html).
optical disector macro	Christopher Ward
C57Bl/6N male mice	Charles River, Germany
SuperFrost Plus coated object slides	Langenbrinck, Germany
25G needle Microlance 3	BD	300400
REGLO Analog Infusion pump	Ismatec	ISM 829
StereoInvestigator system			StereoInvestigator version 11.07
BX53 microscope			BX53 microscope
self-assorted stereology			Visiview
Axiophot2			Axiophot2