Stereological estimativa do número de neurônios Dopaminergic na substância negra do Mouse usando o fracionador óptico e equipamento padrão de microscopia

Summary

Este trabalho apresenta um protocolo passo a passo para a estimativa stereological imparcial de números de celular neuronal dopaminérgicos na substância negra do mouse usando o equipamento padrão de microscopia (i.e., um microscópio de luz, uma tabela de objetos motorizado (x, y, z avião) e software de domínio público para análise de imagem digital.

Abstract

Em pesquisa pré-clínica da doença de Parkinson, análise do tracto nigrostriatal, incluindo a quantificação da perda de neurônio dopaminérgico dentro da substantia nigra, é essencial. Para estimar o número de neurônios dopaminérgicos total, imparcial stereology usando o método fracionador óptico atualmente é considerada o padrão-ouro. Porque a teoria por trás do método fracionador óptico é complexa e stereology é difícil de alcançar sem equipamento especializado, vários sistemas disponíveis comercialmente stereology completa que incluem o software necessário existe, puramente para celular contando razões. Uma vez que compra uma instalação especializada stereology não é sempre viável, por muitas razões, este relatório descreve um método para a estimativa stereological da célula neuronal dopaminergic conta usando equipamentos de microscopia padrão, incluindo um microscópio de luz, um motorizado objeto da tabela (x, y, z plano) com o software de imagem e um computador para análise. Uma explicação passo a passo é dada sobre como realizar a quantificação stereological usando o método fracionador óptico e arquivos previamente programados para o cálculo de contagem de células estimados são fornecidos. Para avaliar a precisão desse método, foi realizada uma comparação com dados obtidos de um aparelho stereology comercialmente disponível. Números de telemóvel comparáveis foram encontrados usando este protocolo e o dispositivo stereology, demonstrando assim a precisão do presente protocolo para stereology imparcial.

Introduction

A quantificação do número de células neuronais é crucial na investigação pré-clínica da doença de Parkinson, para determinar o nível de neurodegeneração dentro da substância negra (SN)^1,2. A imparcial stereological estimativa do número de células em uma região de interesse é considerada o padrão-ouro,^3,4,5.

Antes do advento do stereology imparcial, o número de neurônios em seções foi avaliado através da manipulação de células contadas perfis para corrigir as probabilidades variáveis que neurônios entram em vista em uma seção. Um dos métodos mais utilizados era a correção da contagem de células quantificados descrito por Abercrombie⁶. Este método tentou levar em conta que as células possam ser quantificadas mais uma vez se encontram-se fragmentos da mesma célula em seções finas adjacentes. Portanto, Abercrombie e outros autores geraram equações que exigia a suposições sobre a forma, tamanho e orientação de células contadas^7,8. No entanto, essas suposições foram geralmente não percebeu e, portanto, levou a erros sistemáticos e divergência do número real da célula (isto é, preconceito). Além disso, o preconceito não poderia ser reduzido por amostragem adicionais³.

Para a stereological estimativa do número de células usando o fracionador óptico, princípios matemáticos são aplicados para estimar diretamente o número de células diretamente em um volume definido, 3-dimensional. A vantagem deste método é que não envolve pressupostos sobre a forma, tamanho e orientação das células sendo contadas. Assim, o número de células estimado aproximam-se para os verdadeiros valores e se aproximar à medida que o tamanho da amostra aumenta (ou seja, imparcial)³. Porque muitas regras devem ser seguidas ao usar stereology para manter o método imparcial, foram desenvolvidos sistemas prontos para uso comercial stereology (para revisão, consulte Schmitz e Hof, 2005,⁴). Sistemas especializados stereology implementam métodos stereological design baseado com um priori definido sondas e esquemas de amostragem para as avaliações stereological que levam à independência da forma, tamanho, distribuição espacial e a orientação do células a ser analisados^4,9. No entanto, sistemas stereology comercialmente disponíveis são caros; Isto pode limitar a implementação em novas pesquisas.

O objetivo deste estudo foi desenvolver uma técnica útil para a estimativa stereological baseada em projeto de contagem de células dopaminérgicas no mouse SN, empregando o método fracionador óptico e usando equipamentos de microscopia padrão (ou seja, luz microscópio, microscópio padrão software e uma motorizada x, y, z estágio). Por isso, é apresentado um guia passo a passo sobre como processar o tecido de cérebro de rato e como estimar o número de células do SN usando stereology imparcial baseado em projeto. Além disso, os modelos para o cálculo dos números de célula estimado e coeficientes de erro (CE) são fornecidos.

O método descrito aqui não é limitado à análise da SN, mas pode ser adaptado para uso em outras regiões anatomicamente definidas do cérebro do rato ou rato. Por exemplo, stereology imparcial tem sido usada para estimar os números de celular neuronal no hipocampo¹⁰ e o locus coeruleus¹¹. Além disso, tipos de células que não sejam os neurônios, tais como astrócitos¹² e microglia¹³, podem ser avaliados também. Portanto, esse método pode ser útil para os cientistas que pretendem implementar stereology imparcial em suas pesquisas, mas não estão dispostos a gastar muito dinheiro para comprar um sistema stereology.

Protocol

todas as directrizes aplicáveis internacionais, nacionais e/ou institucionais para o cuidado e a utilização de animais foram seguidas. O protocolo foi aprovado pelas autoridades locais no Regierung von Unterfranken, Wuerzburg, Alemanha.

1. processamento de tecidos e imuno-histoquímica

1. Euthanize ratos com CO ₂ ou quaisquer outros métodos aprovaram.
2. Perfuse C56Bl/6N 12 semanas seis ratos masculinos transcardially com 10 mL de 0.1 M fosfato salino (PBS) usando uma agulha 25-G e uma bomba de infusão, seguido por 70 mL de paraformaldeído 4% (PFA) em PBS 0,1 M.
   Atenção: PFA é tóxico, alergênico e cancerígenas.
3. Dissecar o cérebro de rato no plano coronal com um fatiador de matriz cerebral na região de +0,74 mm do Bregma (figura 25, Paxinos Franklin rato cérebro atlas e ¹⁴).
4. Colocar a parte dorsal do cérebro, incluindo o SN, em 4% PFA em PBS 0,1 M d 1 a 4 ° C por imersão-fixação.
5. Trocar o PFA para solução de 30% sacarose/0.1 mol PBS para cryo-proteção e incubar durante outro d 2 a 4 ° C.
6. Colocar a parte dorsal do cérebro em uma cryomold cheia de temperatura de corte ideal (OCT) composto e lentamente, congelar o tecido no líquido refrigerado gelo seco isopentano.
   Atenção: Gelo seco é extremamente frio (-78 º C); Use equipamentos de proteção individual (EPI), incluindo luvas, enquanto trabalhava com gelo seco. Gelo seco evapora em CO ₂; Portanto, trabalhar sob uma coifa.
7. Em série 30-µm cryo-seções de corte no plano coronal e recolher as seções, iniciando a 2,46 mm da Bregma (Figura 51, Paxinos e Franklin rato cérebro atlas ¹⁴) e terminando em 4,04 mm do Bregma (Figura 64, Paxinos e Franklin rato cérebro atlas ¹⁴).
8. Armazenar quatro séries em tubos que são preenchidos com crioprotetor (30% de glicerol, etoxietanol 30% e 40% PBS) a-20 ° C. Durante o procedimento de corte, marcar o hemisfério direito por furar um pequeno buraco para a região superior do tronco encefálico.
9. Para coloração imuno-histoquímica, selecionar uma série de seções por rato. Preincubate seções flutuantes por 1h em 10% de soro de cabra normal (NGS)/2% BSA/0.5% em 0,1 mol PBS num agitador de detergente. Incubar as secções com coelho anti-rato Tirosina Hidroxilase (TH; 1:1,000 diluição) de anticorpos diluído em 2% NGS/2% BSA/0.5% detergente em 0.1 mol PBS durante a noite a 4 ° C.
10. Secundária de aplicar anticorpos contra coelho Igs (diluição de 1: 100) para 2 h à temperatura ambiente, seguido de reagente avidina/biotina (diluição de 1: 100). Incubar e mancha com tetrahydrochloride-3,3-diaminobenzidina (DAB) e H ₂ O ₂. Montar as seções depois da coloração-los nas corrediças revestidas objeto.
    Nota: TH + dopaminergic SN os neurônios são mostrados na Figura 1a. Por uma série de coloração, uma média de 13 seções de SN, estendendo-se desde o rostral para porções caudais do SN pars compacta (SNpc) e reticulata, estão manchadas por animal ( Figura 1b). As seções são separadas por 120 µm (1/4 série) ( Figura 1C).
    Atenção: DAB é um suspeito cancerígeno. É tóxico por inalação e contacto. Usar o EPI ao trabalhar com DAB.

2. Aquisição de imagens

1. immunohistochemically TH capturar manchado seções SN digitalmente usando software da imagem latente que é acoplado a um microscópio. Analisar separadamente cada seção de uma série.
2. Usar a opção de slide scan do software da imagem latente. Salvar no formato TIFF para imagens de alta qualidade (Figura 2).
   Nota: A resolução da imagem é 312 pixels por cm.
3. Imprensa " adquirir " para abrir a janela de aquisição (Figura 2a).
4. Definir o binning para " 2 " para imagens em tons de cinza.
   Nota: A aquisição de imagens em tons de cinza em vez de fotos cor reduz o tamanho do arquivo de imagem final pilha (Figura 2a).
5. Clique no " Show Live " na janela para abrir uma nova janela mostrando a imagem ao vivo da seção de aquisição (Figura 2 a e b).
6. Clique em " fase " na janela de aquisição. Escolha " digitalizar slides " no menu suspenso e marque a caixa (Figura 2C).
   Nota: Isto permite a aquisição e alinhamento de imagens altamente ampliadas de SN (ampliação de 630 X) em x, y-avião, bem como a aquisição de imagens de pilha com uma distância entre imagens consecutivas de 1 µm no plano z, abrangendo uma gama total de 13 µ m.
7. Selecione o objetivo X 2,5 para procurar o SN.
8. Mudar o objetivo de 63 x.
9. Definir o canto superior esquerdo (TopLeft) (Figura 2C) e o canto inferior direito (LowRight) (Figura 2d) da seção clicando no " Set. "
10. Clique em " Z-Series " e verificar o " série Z-plano " caixa (Figura 2e).
11. Determine a espessura real montada das seções em contagem selecionado aleatoriamente três sites por seção usando o software de imagem. Para isso, clique em " vista Top Offset " para definir a parte superior da seção (Figura 2e) e, em seguida, clique em " parar vista Top " (Figura 2f). Depois disso, clique em " vista inferior Offset " (Figura 2f) e, em seguida, clique em " parar vista inferior " (Figura 2 g). Anote a espessura da seção.
12. Subtrair 3 µm (zona de guarda) da parte superior de deslocamento e digite o resultado na ranhura superior deslocamento (Figura 2 h). Subtrair 13 µm (altura do disector óptico) do número de deslocamento superior e digite o resultado na ranhura inferior deslocamento (Figura 2i). Selecione os seguintes parâmetros: passos, 14; tamanho, 1,00 (Figura 2i).
    Nota: Isso corresponde a uma espessura em z-plano de 13 µm, com uma distância de 1 µm entre imagens consecutivas.
13. Selecione o diretório para salvar o arquivo (Figura 2j).
14. Clique em " sequência " para iniciar a aquisição (Figura 2j).
15. Clique em " de processamento " e selecione os seguintes parâmetros: " todos os aviões, " de " sequência; " " montagem; " e o " rápido " e " costura " caixas, com uma sobreposição de imagem de 10% (Figura 2C). Comece a costurar as imagens clicando no " começar ".
    Nota: Isto irá gerar imagens de pilha para análise (Figura 2 l, Figura 3a -e).

3. Sequência de avaliação Stereological

1. realizar a análise de imagens de pilha SN usando o ImageJ NIH software versão 4.7.
2. Baixar os dois plugins que são necessários no site da ImageJ.nih.gov: o " grade Overlay " plugin ¹⁵ e a " celular Counter " plugin ¹⁶. Instale os dois plugins conforme descrito.
3. Para avaliação stereological imparcial, definir os parâmetros de contagem da seguinte maneira: tamanho da grade, 130 x 130 µm; counting frame, 50 x 50 µm; e altura disector óptico, 13 & #181; m.
4. Abra a imagem clicando no " arquivo " → " aberto " (figura 4a) definir a escala da imagem usando o " Analyze " → " definir escala " comando (figura 4b). Para esta etapa, altere o tamanho definido de pixels para µm (Figura 4C).
   Nota: Para as imagens analisadas, 425 pixels corresponde a 100 µm.
5. Selecione o " Plugins " → " grade " → " tipo de grade: linhas " comando para inserir aleatoriamente uma grade. Verifique o " deslocamento aleatório " caixa. Definir o tamanho de um quadrado dentro da grade (grade-quadrado) como 130 µm µm x 130 = 16.900 µm ² ( Figura 3b e Figura 4 d e e).
6. Mudança de tipo de image de 16 bits de cor RGB (clique na " imagem " → " tipo " → " cor RGB ") (Figura 4f). Localize o SNpc, conforme descrito por Baquet et al ¹⁷. cercar o SNpc com o " ferramenta pincel " (escova largura: 11) ( Figura 3 c e g da Figura 4 -eu).
7. Desfazer o " definir escala " comando clicando " Analyze " → " definir escala de " → " clique para remover escala " (Figura 4j -l) para permitir que o desempenho dos cálculos em pixels um pouco µm.
8. Fazer uma captura de tela (Figura 4 m), salve o arquivo de imagem e abrir o novo arquivo com ImageJ (Figura 4n). Selecione " ponto " (Figura 4o) e uma largura de escova de 25 (Figura 4-p). Marca cada quadrado de grade que contata o SN para a colocação de uma óptica disector (Figura 4q). Realizar análise do número de células em todos os disectors ópticos que são localizadas totalmente ou parcialmente dentro do contorno SN.
9. Selecione um quadrado de grade que inclui partes do SN. Medida que o canto superior esquerdo desta praça com o cursor no ImageJ para definir x e y coordenadas para começar com (Figura 4r).
   Nota: Coordenadas serão inseridas para óptica disector posicionamento usando o " óptico disector posição " (Figura 4s), conforme descrito na etapa 4.
10. Calcular a posição de disector óptico usando o modelo de planilha intitulado, " óptica disector posição, " conforme descrito na etapa 4.
11. Calibrar o disector óptico (macro escrita pelos Christopher S. Ward, Arquivo suplementar) clicando no " Plugins " → " Macros " → " editar " (Figura 4t), abra o " opt_dis_ Grid.txt " arquivo (Figura 4u) e definir o tamanho da " usergrid " em pixels que corresponde com o x, y dimensão do disector óptico (Figura 4v). Selecione um tamanho de 50 µm x 50 µm, para que o tamanho de um lado do usergrid é definido como 212,5 pixel (pixel de 50 x 4,25).
12. Determinar a posição do disector ótico da imagem de pilha inserindo as coordenadas ImageX e ImageY que definem o centro do disector óptico (Figura 4v). Executar a macro (" Macros " → " executar Macro ") (Figura 4w).
    Nota: A grade vai desaparecer da imagem de pilha ( Figura 3d e Figura 4 x). O disector óptico persistirá quando se movendo para baixo no plano z ( Figura 3e e Figura 4 x).
13. Select " Plugins " → " celular Counter " para iniciar o plugin contador de célula (Figura 4y). Inicializar o contador de célula e selecione um tipo de marcador (Figura 4z). Zoom na imagem (clique na " + ") e realizar a avaliação stereological dos números de celular em uma ampliação de 200%.
14. Identificar dopaminergic neuronal perikarya pelo seu arredondado ou ovoide forma e célula tamanho ( Figura 1a). Quantificar o número de células usando regras stereological.
    Nota: Desde a ótica disector é um cubo 3-dimensional ( Figura 5a), definem os lados de exclusão como a frente, à esquerda e os lados superiores do cubo (vermelho). Portanto, don ' contagem t TH + células que vêm em contacto com a linha vermelha (esquerda e frontal) ou a lado de cima. Adicionar os resultados da contagem de células para o arquivo de planilha preparado intitulado, " cálculo de contagem de células " (passo 5).
15. De acordo com a imagem de SN, calcular o próximo quadrado de grade na qual deseja colocar o disector óptico para a próxima contagem de células, usando x, y etapas o tamanho da grade sobrejacente ( Figura 5b) e o " óptica disector posição " modelo de folha de cálculo, conforme descrito na etapa 4.
16. Realizar uma estimativa do número celular, usando o " cálculo de contagem de células " planilha (passo 5).

4. Cálculo de óptica Disector posição usando o " óptico Disector posição " planilha modelo

1. calcular o tamanho e a posição de cada disector óptico para ser colocado na grade sobrejacente dentro da estrutura de tópicos da (SN Figura 5b) usando o " óptica disector position.xlsx " arquivo de planilha (Arquivo suplementar).
2. Inserir a conversão de pixels por µm, conforme definido pelo " definir escala " comando, para as posições marcadas amarelas do " óptica disector position.xlsx " arquivo ( Figura 6a e arquivo suplementar ).
3. Inserir o tamanho previsto do disector óptico e o tamanho da grade-Praça da grade sobrejacente, definida pelo comprimento de um lado (em µm), as posições marcadas laranja.
   Nota: Os resultados são descritos nas caixas ao lado das caixas de laranja vermelhas.
4. Começa com a grade-Praça dentro da estrutura de tópicos de SN que foi determinada como ponto de partida (uma grade quadrada foi seleccionada para início de conversa, como no passo 3.9, acima).
5. Inserir as coordenadas x e y, como medido em passo 3.9, nas caixas verdes do arquivo (usando esses valores, o x, y coordenadas para o centro do disector óptico dentro desta primeira praça são calculados, e os resultados são descritos nas caixas azuis). Executar a macro opt_dis_grid.txt (Arquivo suplementar).
6. Calcular x, y coordenadas do disectors óptico consecutivos, inserindo a distância grade quadrada (medida em número de quadrados) em relação ao primeiro quadrado de grade (caixas marrons).
   Nota: + x: grade-praça está localizada à direita; -x: grade quadrada está localizada à esquerda; + y: grade-praça está localizada na parte inferior; -y: grade-Praça situa-se no topo. Os resultados são mostrados nas caixas cinzentas.

5. Estimativa do número de células usando o " cálculo de contagem de células " planilha

1. calcular a estimativa do número de células TH + SN por animal (N) usando a fórmula publicada por West et al., 1991- ³, onde ∑ Q ^– é definido como o número total de TH + neurônios contados em todos os disectors ópticos de seção de um cérebro.
   Nota: A altura do disector óptico (h) em relação a espessura medida da seção (t) é incluída na equação. A fração de amostragem de área (asf) é definida como a proporção da área (A) do tamanho do quadro disector óptica (uma óptica disector) dentro do tamanho quadrado da grade (um x, y passo) (uma óptica disector/A x, y passo) ( Figura 3b) e o fração de amostragem de seção (ssf) é definida como a proporção de seções do cérebro em toda série de corte:
   
   para garantir alta qualidade quantitativa estima que o coeficiente de erro (CE) deve ser inferior a 0,10. Determinar o CE usando a fórmula por Keuker et al., 2001 ¹⁰:
   
2. de stereological estimativa do número de cada célula dentro do SN mouse, insira as informações indicadas sobre o número total de série gerado por rato, a altura do disector óptico, o x, y área do disector óptico (um disector óptico, em µm ²), x, y área da grade-Praça (um x, y passo em µm ²), e a média medida a espessura da seção (em µm) nas caixas amarelas usando o " cálculo da célula count.xlsx " arquivo de planilha ( Figura 6b e arquivo suplementar ).
3. Analisar cada seção SN do mesmo animal, conforme descrito na etapa 5.
4. Inserir célula conta para cada óptica disector nas caixas de cinza, cada linha, referindo-se a uma seção de SN, usando o " cálculo da célula count.xlsx " arquivo de planilha (Arquivo suplementar).
   Nota: O número estimado de célula e a CE calculado são retratados nas caixas azuis ( Figura 6b).

6. Estimativa do número de célula, usando um sistema comercialmente disponível Stereology

1. iniciar a estimativa de dopaminergic SNpc celular clicando na " sondas " → " óptico fracionadores Workflow " para abrir o fracionador óptico Janela de fluxo de trabalho.
   Nota: Uma nova janela irá abrir para determinar se uma nova série de SN vai ser contadas.
2. Iniciar uma nova série de seções TH + SN clicando " iniciar um novo assunto " na janela pop-up.
3. Percorrer as diversas etapas do fluxo de trabalho fracionador óptico. Configure o assunto na primeira etapa. Para isso, insira o investigador ' o nome, o assunto ' nome s (grupo de SN) e outras informações úteis. Inserir os números de seções para contar para este SN. Inserir a espessura da corte de seções do tecido. Introduza o intervalo de seção é quatro neste caso. Inserir o número de seção aleatoriamente determinado para começar com.
4. Na segunda etapa, defina o microscópio para baixa ampliação (objetivo de X 2) e selecione " 2 X Mag lente " do menu.
5. Na etapa 3, rastrear a região de interesse com o botão esquerdo do mouse, que é o SNpc, conforme descrito por Baquet et al., 2009 ¹⁷.
6. Definir o microscópio de alta ampliação na etapa 4. Para isso, altere o objetivo para 100 X e selecione " 100 lente X Mag " no menu suspenso.
7. Medir a espessura montada no passo 5, centrando-se no topo e no fundo da seção.
8. Na etapa 6, definir o tamanho do quadro contando como 50 x 50 µm; este é o tamanho da disector óptica (x, y).
9. Na etapa 7, definir o tamanho da grade de amostragem aleatória sistemática (SRS) como 130x130 µm.
10. Entrar numa zona de guarda de 3 µm na etapa 8.
11. Salvar as configurações na etapa 9.
12. Finalmente, contar as células TH + dopaminérgico em cada um do disectors óptico dentro da grade SRS na etapa 10 do fluxo de trabalho fracionador óptico. Por isso, comece clicando na " Counting " botão.
13. Depois de terminar uma seção, clique no " começar a próxima seção " o botão para iniciar o fluxo de trabalho do fracionador óptico da próxima seção da mesma série SN SN.
14. Quando a última seção de uma série de SN SN foi quantificada, clique no " eu ' ve Finished Counting. "
15. Clique no " ver resultados " botão para exibir os resultados da amostragem a stereology.

Representative Results

Usando o método apresentado, o número estimado de TH + neurônios dopaminérgicos no direito SN variou entre células 7.363 e 7.987 e, no canto esquerdo da SN, entre as células 7.446 e 7.904. Assim, o número médio de neurônios dopaminérgicos (± SEM) foi 7.647 ± 83 células para a direita, SN e 7.675 ± 66 para a esquerda, SN. O CE calculado para cada animal foi inferior a 0,08 (intervalo: 0.073-0.079) (Figura 7). Para verificar a comparabilidade desse método com sistemas comercialmente disponíveis e especializada stereology, SN celulares também foram quantificados usando a configuração stereology (Figura 8). Os parâmetros de contagem foram: tamanho da grade, 130 x 130 µm; quadro de contagem, 50 x 50 µm; zona guarda, 3 µm. seções foram analisados com uma 100x / 1.25 objetivo abertura numérica em um microscópio BX53. A população estimada de neurônios TH + SN usando da espessura média variou de 7.067 a 8.105 células/SN e 7.164 de 8.015 células/SN nos lados direito e esquerdos, respectivamente. O número médio de neuronal foi calculado como 7.535 ± 155 células para a direita, SN e 7.699 ± 128 células para a esquerda, SN. O CE Gundersen (m = 1) foi ≤0.08 em cada SN quantificado (Figura 7). Análise estatística utilizando o teste t de Student emparelhado não revelaram diferenças significativas entre a contagem de células TH + dos dois métodos no direito ou no esquerdo SN (quer dizer SEM ±; certo: t (5) = 0.9524, P > 0,05; esquerda: t (5) = 0.2928, P > 0,05) (Figura 7 ).

Figura 1. Imagens representativas de rato SN manchado para os neurônios dopaminérgicos.
(a) uma visão geral de uma representante do mouse SN é mostrada no painel superior. Observe o pequeno buraco na parte superior do tronco cerebral direito que marca o lado direito. Maior ampliação da inserção (caixa preta) retrata TH + neurônios dopaminérgicos. (b) uma série de seções manchadas de TH SN é mostrado, cobrindo o mouse todo SN da rostral ao caudal. (c) cada seção é separadoda da seção consecutiva por 120 µm. barras de escala: um, painel superior, 500 µm; painel inferior, a imagem grande, 100 µm; painel inferior, baixo-relevo, 50 µm; b, 500 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Aquisição de imagens para análise stereological usando o software de imagem.
(a) seta vermelha: abrir a janela de aquisição; Arqueiro Verde: definir o binning para "2"; seta azul: mostrar a imagem ao vivo. (b) uma nova janela mostrando a imagem ao vivo (seta vermelha) será aberto. a seta vermelha (c) : selecione o menu "Estágio"; Arqueiro Verde: selecione a opção "Scan Slide"; seta azul: marque a opção "Scan Slide"; seta preta: definir o canto superior esquerdo. seta preta (d) : definir o canto inferior direito. a seta vermelha (e) : selecione o menu "Série Z"; Arqueiro Verde: Verifique a "série Z-plano"; seta azul: começar a "deslocamento de topo do vista" para procurar o topo da seção. a seta vermelha (f) : clique em "Parar Top View" para definir a parte superior da seção; Arqueiro Verde: começar a "Vista inferior Offset" para procurar a parte inferior da seção. a seta vermelha (g) : clique em "Parar vista inferior" para definir a parte inferior da seção. a seta vermelha (h) : subtrair a guarda de 3 µm zona desde o topo "Offset" e insira o resultado no slot "Top Offset". (i) seta vermelha: subtrair 13 µm do número "Top Offset" e insira o resultado no slot "Deslocamento inferior"; Arqueiro Verde: definir os 14 passos que corresponde a uma espessura de z-plano de 13 µm; seta azul: definir um tamanho de 1,00 µm que corresponde a uma distância de 1 µm entre imagens consecutivas. a seta vermelha (j) : selecione o diretório para salvar o arquivo; seta azul: clique em "Sequência" para iniciar a aquisição de imagens. seta vermelha (k) : clique em "Processamento"; Verifique os seguintes parâmetros: Arqueiro Verde: "Todos os aviões"; seta azul: "Sequência"; seta preta: "Montagem"; seta cinza: "Costura"; roxo seta: rápido. (l) , clique na seta amarela para iniciar a costura as imagens. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 3. Processamento de imagens para análise stereological.
(a) uma imagem de pilha do exemplo tirada de um rato, SN. (b e c) Após a inserção aleatória de uma grade sobrejacente o SN (linhas turquesas, b), o SN é descrito em um segundo passo (linha azul, c). (d) um disector óptico é colocado na imagem da pilha do SN. (e) seis consecutivos planos focais dentro da imagem de pilha SN cobrem 13 µm total no plano z. Barras de escala: a-d, 100 µm; e, 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. Sequência de avaliação stereological usando o ImageJ.
(a) seta vermelha: clique em "Arquivo" → "Abrir" para abrir uma imagem de pilha. a seta vermelha (b) : clique em "Analisar" → "Definir escala". (c) setas vermelhas: definir os parâmetros para a "distância em pixels," "distância conhecidos" e "Unidade de comprimento." a seta vermelha (d) : selecione "Plugins" → "Grade". a seta vermelha (e) : selecione "Linhas"; seta verde: verificar "Random deslocamento;" seta azul: Insira o tamanho da grade em µm². a seta vermelha (f) : clique em "Imagem" → "Tipo" → "RGB da cor." a seta vermelha (g) : selecione a "ferramenta de pincel;" Arqueiro Verde: definir a largura de"escova" como 11. seta vermelha (h) : começar a cercar o SNpc. (i) vermelho setas retratam o círculo SNpc. (j) seta vermelha: clique em "Analisar" → "Definir escala" e remover a escala (k) , clicando em "Clique para remover escala," retratado por vermelho seta. Observe a mudança de µm (setak, verde) para pixels (seta del, vermelho). (m) fazer uma captura de tela (pontos de seta vermelha para a captura de tela) e (n) Abra o arquivo de imagem de captura de tela com ImageJ. a seta vermelha (o) : clique no "Ponto". a seta vermelha (p) : Insira uma largura de escova de 25. (q) a seta vermelha mostra os grade-quadrados marcados que contatar o SNpc. (r) a seta vermelha aponta para o canto superior esquerdo de um quadrado de grade que inclui parte do SN. Colocando o cursor neste ponto, a coordenadas x, y para a "posição de disector óptico" (passo 4) são medidos e inserido no modelo de "óptica disector position.xlsx" (setas, vermelho). a seta vermelha (t) : selecione "Plugins" →"Macros" → "Editar". a seta vermelha (u) : selecione o arquivo "opt_dis_grid.txt". Uma nova janela será aberta (v). Insira o tamanho da "usergrid", em pixels (v, seta vermelha) e o x, y coordenadas (v, seta verde). (w) executar a macro "opt_dis_grid.txt" (seta vermelha). (x) uma óptica disector aparecerá no meio da grade-Praça definida anteriormente (seta vermelha). a seta vermelha (y) : clique em "Plugins" → "Contador de célula". (z) inicializar o contador de célula (seta vermelha) e selecione um tipo de marcador (seta verde). Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 5. Colocação do disector óptico.
(a) ilustração do disector óptico usado para stereology imparcial. O disector óptico é um cubo 3-dimensional. Três células esquemáticas são visíveis dentro do disector óptico. As regras stereological para a quantificação de células indicam que as células tocando os lados rotulados vermelhos do disector óptico são excluídos (glóbulos vermelhos), enquanto as células que entre em contato com o verde rotulado os lados estão incluídos na célula (células verdes) a contar. (b) um disector óptico é colocado em cada quadrado de grade que entra em contato com o SN. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6. Cálculo da posição disector óptico e estimativa do número de células.
(a) um cálculo exemplo realizada para o posicionamento do disector óptico. (b) um exemplo da estimativa do número total de células. Os números de células quantificados são inseridos nas caixas de cinza, enquanto os parâmetros de quantificação stereological são inseridos nas caixas amarelas. O número estimado de célula e o CE são exibidos nas caixas de azul. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7. Comparação da célula contagem de parâmetro.
(a) comparar TH + celular número estimado do mouse direito e esquerdo SN obtido a partir do método descrito stereological com os dados adquiridos da análise usando o sistema stereology comercialmente disponíveis não mostrou diferenças significativas. Uma lista detalhada dos dados obtidos da direita (b) e esquerdo (c) SN é dado com o número de células estimado por animal, o número de células contadas na verdade, o número de seções contados e o número de sítios de amostragem (i.e., contado o número de quadrados de grade) para ambos os métodos. Os valores dos gráficos de barra são a média ± SEM os dados de 6 ratos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8. Quantificação de células com o sistema stereology comercialmente disponível.
(a-b) O contorno de SN é desenhado e (c) as posições da disectors óptico são automaticamente determinada. (d-e) Cada disector óptico é analisado para celular concentrando-se ao longo do z-plano. Seis aviões focais consecutivos dentro do SN são mostrados. As linhas vermelhas e verdes correspondem a disector óptico. Barras de escala: a-d, 100 µm; e, 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivo suplementar 1. opt_dis_grid.txt Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar 2. Ótica disector position.xlsx por favor clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar 3. Cálculo da célula count.xlsx por favor clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

Stereology começa com o processamento do tecido. O serial corte de tecido SN deve ser realizado com cuidado para evitar a perda de seções durante a análise stereological. Além disso, é um passo essencial para marcar um hemisfério a fim de distinguir a direita da esquerda SN ao executar stereology. Colocação de um pequeno orifício na parte superior do tronco cerebral gerou os melhores resultados no estudo apresentado. Além disso, desde que está com as exigências do método fracionador óptico que o tecido é cortado em seções grossas de cerca 30-40 µm, em vez da 5-10 µm mais comumente usado em imuno-histoquímica, anticorpo e outra penetração de tecido fluido de incubação durante Coloração imuno-histoquímica deve ser assegurada, tais como, usando um detergente.

Imuno-histoquímica de coloração para os neurônios dopaminérgicos usando o anticorpo TH rótulos neurônios SN, bem como neurônios dentro da área tegmental ventral (VTA), que localiza-se medialmente da SN e neurônios no campo retrorubral. Assim, outro ponto crítico ao executar stereology de SN é conhecimento do mouse anatomia SN, desde que os neurônios SN não podem ser visualizados exclusivamente por padrão imuno-histoquímica ou coloração histológica. Em vez disso, o reconhecimento dos pontos anatômicos, como o núcleo subtalâmica, o campo de retrorubral e o VTA, são importantes para determinar a extensão inteira da SN^17,18,19.

Avaliação do número neuronal precisa ser confiável e reprodutível. Embora vários grupos usam configurações stereology comercialmente disponível, números de TH + neurônios dopaminérgicos SN em camundongos wt, extraídos de publicações diferentes, variam em número de^17,20. Em Baquet et al., análise de stereological design baseado em 3 a 4 meses de idade machos e fêmeas C57BL/6J wt ratos usando um sistema comercialmente disponível stereology revelou um estimado 8.716 ± 338 TH + dopaminergic SN neurónios (intervalo: 7.546-9.869)¹⁷ . Em contraste, Smeyne et al. encontrados menos células TH + SN em 9 a 16 semanas de idade masculino C57BL/6J ratos que receberam i.p. salina 0,9%, variando de 6.302 ± 262 células a 6.861 ± 338 células, usando uma versão mais recente do mesmo sistema stereology²⁰. No entanto, o primeiro autor foi também o último autor no Baquet et al. papel, excluindo, portanto, diferentes graus de experiência como a razão para os diferentes resultados. Estes dados contraditórias refletem a necessidade de um método de quantificação stereological que mostra menor variabilidade. Para verificar se a técnica de quantificação e a fórmula utilizada, foi realizada uma comparação dos resultados da contagem de número de células SN usando o método descrito com uma quantificação usando a configuração stereology comercialmente disponível. Análise estatística não mostrou diferenças significativas quando se comparam os números de TH + neurônios dopaminérgicos na direita e deixou o SN de camundongos wt determinado usando ambas as técnicas de quantificação de célula, demonstrando assim que esse método é viável para o stereological estimativa de SN os neurônios em ratos.

A principal vantagem do método descrito é que reduz os custos que são normalmente associados com a implementação de técnicas stereology para a contagem de células. Uma segunda vantagem é que, para o método descrito, imagens de pilha de SN são salvos e podem ser analisadas a qualquer momento (mesmo ao mesmo tempo) por outro investigador. Além disso, a aquisição e análise de imagens de fluorescência é possível com este método, porque imagens em tons de cinza podem ser coloridas com as tabelas de"pesquisa" no ImageJ. No entanto, existem limitações para este estudo. Primeiro, a quantificação do número do celular é mais demorada (cerca de 50%) do que a quantificação com o sistema stereology comercialmente disponível. Isto é principalmente por causa de dois motivos: 1. pilha imagens de SN devem ser tomadas e 2. cálculo da colocação dentro de cada SN disector óptico e cálculo do número estimado de célula e CE devem ser executadas manualmente usando os modelos de cálculo. Em segundo lugar, pelo menos com o sistema disponível em nosso laboratório, a análise pode somente ser executada em imagens em tons de cinza por causa do grande tamanho do arquivo de imagens em cores, que não poderia ser processado pelo ImageJ. Isso pode representar um problema se há uma necessidade de quantificar duas populações de células diferentes ao mesmo tempo em uma dupla mancha. Pode ser mais difícil distinguir duas populações de células coradas diferentemente em imagens em tons de cinza. Portanto, embora um palco motorizado (x, y, z plano) e o software correspondente estão disponíveis em muitos laboratórios que trabalham com amostras histológicas, a gestão e a qualidade das imagens de pilha dependerá do software do microscópio e o desempenho de o computador ligado.

Existem maneiras possíveis para superar as limitações. Usando os modelos de cálculo que desenvolvemos, a programação de macros para automatizar alguns dos processos realizados atualmente manualmente poderia reduzir erros ou imprecisões durante avaliação stereological e acelerar a velocidade de trabalho. Além disso, com o desenvolvimento contínuo do ImageJ e outro software de imagem, bem como com o crescente poder de processamento do computador, maiores tamanhos de arquivo de imagem não deverá levantar um problema em um futuro próximo. Portanto, análises de imagens de cor brilhante-campo será manejáveis com a técnica descrita.

A técnica descrita não está restrita a análises de células TH + SN, mas pode ser expandida para analisar outros tipos de células e regiões do cérebro de roedores. Para isso, as fronteiras anatômicas da região de interesse devem ser determinadas, e as respectivas manchas devem ser executada. Além disso, essa técnica pode ser adaptada para seções mais espessas. Por isso, a aquisição de imagens de pilha deve ser adaptada para fornecer mais fotos de pilha. Por exemplo, se 40 µm de espessura seção é necessários, o real montado espessura da seção após coloração de tecido deve ser avaliado para determinar a altura necessária do disector óptico. Subtrair a espessura do tecido média 6 µm (3 µm zona de guarda na parte superior e parte inferior) e ter o resultado como a altura do disector óptico.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paxinos mouse atlas			The Mouse Brain George Paxinos Keith B.J.FranklinCopyright @2001 by Academic Press CD Rom designet & created by Paul Halasz
brain matrix slicer mouse	Zivic Instruments	BSMAS 001-1
paraformaldehyde	Merck	1040051000
sucrose /D(+) Saccharose	Roth	4621.1
isopentane	Roth	3927.1
glycerol	Merck	1040931000
Ethanol	Sigma Aldrich	32205-1L
Name	Company	Catalog Number	Comments
phosphate buffered saline ingredients:
sodium chloride	Sigma Aldrich	31434-1KG-R
potassium dihydrogen phosphate	Merck	1048731000
di-sodium hydrogen phosphate dihydrate	Merck	1065801000
potassium chloride	Merck	1049360500
normal goat serum	Dako	X0907
bovine serum albumin	Sigma	A4503-100G
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100-100ml	detergent
3,3-Diaminobenzidine-tetrahydrochlorid/DAB tablets 10mg pH 7.0	Kem En Tec	4170
H2O2/ Hydrogen peroxide 30%	Merck	1072090250
avidin/biotin reagent	Thermo Scientific	32050	Standard Ultra Sensitive ABC Staining Kit, 1:100
rabbit anti mouse tyrosine hydroxylase antibody	abcam	Ab112	1:1000
biotinylated goat-anti-rabbit IgG H+L	vector laboratories	BA-1000	1:100
StereoInvestigator version 11.07	MBF
BX53 microscope	Olympus
Visiview	Visitron Systems GmbH	3.3.0.2
Axiophot2	Zeiss
ImageJ software	NIH	Version 4.7
Tissue-TEK OCT	Sakura	4583
dry ice
grid overlay plugin	Wayne Rasband		https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html
cell counter plugin	Kurt de Vos		https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html).
optical disector macro	Christopher Ward
C57Bl/6N male mice	Charles River, Germany
SuperFrost Plus coated object slides	Langenbrinck, Germany
25G needle Microlance 3	BD	300400
REGLO Analog Infusion pump	Ismatec	ISM 829
StereoInvestigator system			StereoInvestigator version 11.07
BX53 microscope			BX53 microscope
self-assorted stereology			Visiview
Axiophot2			Axiophot2