Stéréologique Estimation du nombre de neurones dopaminergiques dans la Substantia Nigra de souris à l’aide de l’optique fractionnateur et l’équipement de microscopie Standard

Summary

Cet ouvrage présente un protocole étape par étape pour l’estimation non biaisée stéréologique des numéros des neurones dopaminergiques dans la substantia nigra de souris à l’aide d’équipement de microscopie standard (c'est-à-dire, un microscope optique, une table objet motorisé (x, y, z avion) et le logiciel du domaine public pour l’analyse d’image numérique.

Abstract

Dans la recherche de la maladie de Parkinson précliniques, analyse des voies sont, y compris la quantification de la perte de neurones dopaminergiques dans la substantia nigra, est essentielle. Pour estimer le nombre de neurones dopaminergiques total, stéréologie impartiale à l’aide de la méthode de fractionnement optique est actuellement considéré comme l’étalon-or. Parce que la théorie sous-jacente à la méthode de fractionnement optique est complexe et stéréologie étant difficile à atteindre sans équipement spécialisé, plusieurs systèmes de stéréologie complet disponible dans le commerce qui incluent les logiciels nécessaires existent, purement pour cellule de comptage des raisons. Puisque l’achat d’une configuration de stéréologie spécialisé n’est pas toujours réalisable, pour de nombreuses raisons, le présent rapport décrit une méthode pour l’estimation stéréologique des cellules neuronales dopaminergiques compte à l’aide de matériel de microscopie standard, y compris un microscope optique, une motorisé table objet (x, y, plan z) avec logiciel d’imagerie et d’un ordinateur pour analyse. Une explication détaillée est donnée sur la façon d’exécuter stéréologique quantification à l’aide de la méthode de fractionnement optique et fichiers préprogrammés pour le calcul des numérations estimées sont fournis. Pour évaluer la précision de cette méthode, une comparaison avec les données obtenues à partir d’un appareil de stéréologie disponibles dans le commerce a été réalisée. Nombre de cellules comparables ont été trouvé à l’aide de ce protocole et le dispositif de stéréologie, démontrant ainsi la précision du présent protocole pour stéréologie impartiale.

Introduction

La quantification du nombre de cellules neuronales est essentielle dans la recherche de la maladie de Parkinson précliniques pour déterminer le niveau de la neurodégénérescence dans la substantia nigra (SN)^1,2. L’estimation non biaisée stéréologique du nombre de cellules dans une région d’intérêt est considéré comme l’étalon-or^3,4,5.

Avant l’avènement de stéréologie impartiale, le nombre de neurones dans les sections a été évalué en manipulant les profils de cellules comptées pour corriger les probabilités variables que les neurones entrent en vue dans une section. Une des méthodes plus couramment utilisés est la correction des globules quantifiés décrite par Abercrombie⁶. Cette méthode a tenté de tenir compte du fait que les cellules peuvent être quantifiées plus d’une fois si les fragments de la même cellule sont trouvent dans les sections minces adjacentes. Par conséquent, Abercrombie et autres auteurs généré équations nécessitant des hypothèses concernant la forme, la taille et l’orientation des cellules compté^7,8. Cependant, ces hypothèses n’étaient généralement pas réalisés et donc conduits à des erreurs systématiques et de divergence du nombre de cellule réelle (p. ex., biais). En outre, le biais ne pourrait pas être réduit par échantillonnage supplémentaire³.

Pour l’estimation stéréologique du nombre de cellules à l’aide de l’optique fractionnateur, principes mathématiques sont appliquées pour estimer directement le nombre de cellules directement dans un volume défini, les 3 dimensions. L’avantage de cette méthode est qu’elle n’implique pas d’hypothèses sur la forme, la taille et l’orientation des cellules étant comptés. Ainsi, le nombre de cellules environ est plus proche des valeurs réelles et se rapprocher plus la taille de l’échantillon augmente (c'est-à-dire, non biaisée)³. Parce que de nombreuses règles doivent être suivies lors de l’utilisation de stéréologie de garder la méthode impartiale, prêt à l’emploi commercial stéréologie systèmes ont été développés (pour examen, voir Schmitz et Hof, 2005,⁴). Stéréologie spécialisés systèmes implémentent les méthodes stéréologiques axée sur la conception à priori définie de sondes et de plans d’échantillonnage pour stéréologiques quotes-parts qui conduisent à l’indépendance de la forme, taille, distribution spatiale et l’orientation de la cellules analysées^4,,⁹. Toutefois, les systèmes de stéréologie disponibles dans le commerce sont chers ; Cela peut limiter la mise en œuvre de nouvelles recherches.

Le but de cette étude était de développer une technique utilisable pour l’estimation stéréologique axée sur la conception du nombre de cellules dopaminergiques chez la souris SN, employant la méthode de fractionnement optique et à l’aide d’équipement de microscopie standard (i.e., lumière microscope, microscope ordinaire logiciels et un motorisé x, y, stade de z). Pour ce faire, un guide étape par étape sur comment traiter les tissus cérébraux de souris et comment estimer le nombre de cellules de SN à l’aide de stéréologie impartiale axée sur la conception est présenté. En outre, des modèles pour le calcul de l’estimation du nombre de cellules et les coefficients d’erreur (EC) sont fournis.

La méthode décrite ici n’est pas limitée à l’analyse de la SN, mais peut être adaptée pour une utilisation dans d’autres régions anatomiquement définies du cerveau de souris ou rat. Par exemple, stéréologie impartiale a été utilisé pour estimer le nombre de neurones dans l' hippocampe¹⁰ et le locus coeruleus¹¹. En outre, les types de cellules autres que les neurones, tels que les astrocytes¹² et la microglie¹³, peuvent être évaluées ainsi. Par conséquent, cette méthode peut être utile aux scientifiques qui prévoient mettre en œuvre la stéréologie impartiaux dans leurs recherches, mais ne sont pas prêts à dépenser beaucoup d’argent pour acheter un système de stéréologie.

Protocol

toutes les directives internationales, nationales et/ou institutionnels pour le soin et l’utilisation d’animaux ont été suivies. Le protocole a été approuvé par les autorités locales à la Regierung von Unterfranken, Würzburg, Allemagne.

1. traitement des tissus et l’immunohistochimie

1. souris euthanasier avec CO ₂ ou toute autre méthode approuvée.
2. Perfuse six transcardially de souris mâles âgés de 12 semaines C56Bl/6N avec 10 mL de 0.1 M saline tamponnée au phosphate (PBS) à l’aide d’une aiguille 25 G et une pompe à perfusion, puis 70 mL de paraformaldéhyde à 4 % (PFA) dans du PBS de 0,1 M.
   Mise en garde : PFA est toxique et allergène cancérogènes.
3. Disséquer le cerveau de souris dans le plan coronal avec une trancheuse de matrice de cerveau à la région de +0,74 mm de Bregma (Figure 25, Paxinos et Franklin souris brain atlas ¹⁴).
4. Mettre la partie dorsale du cerveau, y compris le SN, chez 4 % PFA dans du PBS de 0,1 M pour 1D à 4 ° C pour la fixation de l’immersion.
5. Échanger l’IFP pour la solution à 30 % de sucrose/0,1 mol PBS pour cryo-protection et incuber pendant un autre 2 jours à 4 ° C.
6. Put la partie dorsale du cerveau dans un cryomold remplie de température coupe optimale (OCT) composé et geler lentement le tissu en liquide refroidissement cryogénique isopentane.
   Mise en garde : La glace sèche est très froide (-78 ° C) ; utiliser un équipement de protection individuelle (EPI), y compris les gants, alors qu’il travaillait à la glace sèche. La glace sèche s’évapore en CO ₂ ; par conséquent, travailler sous une hotte aspirante.
7. En série 30 µm cryo-coupes dans le plan coronal et recueillir les sections, à partir de 2,46 mm du Bregma (Figure 51, Paxinos et Franklin souris brain atlas ¹⁴) et se terminant à 4,04 mm du Bregma (Figure 64, Paxinos et Cerveau de souris Franklin atlas ¹⁴).
8. Stocker quatre séries dans des tubes qui sont remplis de cryoprotecteur (30 % de glycérol, éthoxyéthanol 30 % et 40 % PBS) à-20 ° C. Au cours de la procédure de sectionnement, marquer l’hémisphère droit de percer un petit trou dans la région supérieure du tronc cérébral.
9. Pour le marquage immunohistochimique, sélectionnez une série de sections par souris. Príncuber sections flottant librement pendant 1 h dans 10 % de sérum de chèvre normal (détergent NGS)/2% BSA/0.5% à 0,1 mol PBS sur un agitateur. Incuber les sections avec des anticorps de lapin antisouris tyrosine hydroxylase (TH ; dilution de 1 : 1 000) dilué dans 2 % NGS/2% BSA/0.5% détergent à 0,1 mol PBS pendant la nuit à 4 ° C.
10. Appliquer secondaires anticorps contre lapin Igs (dilution 1 : 100) pendant 2 h à température ambiante, suivie de réactif avidine/biotine (dilution 1 : 100). Incuber et tacher avec 3,3-diaminobenzidine-tétrahydrochlorure (DAB) et H ₂ O ₂. Monter les sections après leur coloration sur des lames de l’objet revêtu.
    NOTE : TH + certains neurones de SN sont montrées dans la Figure 1 a. Par une série de coloration, une moyenne de 13 sections de SN, s’étendant de la rostrale à la partie caudale des SN pars compacta (SNpc) et reticulata, sont colorées par animal ( Figure 1 b). Les sections sont séparées par 120 µm (série 1/4) ( Figure 1C).
    Mise en garde : DAB est une substance cancérogène. Il est toxique par contact et inhalation. Utiliser des EPI lorsque vous travaillez avec DAB.

2. Acquisition d’Images

1. TH capturer immunohistochimique coupes de SN numériquement à l’aide de logiciels d’imagerie qui est couplé à un microscope colorées. Analyser séparément chaque article d’une série.
2. Utiliser l’option scan de diapositives du logiciel d’imagerie. Enregistrer au format TIFF pour des images de haute qualité (Figure 2).
   Remarque : La résolution des images est 312 pixels par cm.
3. Presse " Acquire " pour ouvrir la fenêtre d’acquisition (Figure 2 a).
4. La valeur du binning " 2 " pour les images en niveaux de gris.
   Remarque : L’acquisition d’images en niveaux de gris au lieu de photos couleur réduit la taille du fichier image pile final (Figure 2 a).
5. Cliquez sur " Show Live " dans la fenêtre d’acquisition pour ouvrir une nouvelle fenêtre montrant l’image en direct de la section (Figure 2 a et b).
6. Cliquez sur " stade " dans la fenêtre d’acquisition. Choisissez " Scan faites glisser " dans le menu déroulant et cocher la case (Figure 2c).
   NOTE : Cela permet l’acquisition et l’alignement des images fortement grossies de SN (grossissement de X 630) dans le x, y-avion, ainsi que l’acquisition d’images de la pile avec une distance entre les images consécutives de 1 µm dans le plan z, couvrant une gamme totale de 13 µ m.
7. Sélectionnez l’objectif X 2,5 pour rechercher la SN.
8. Changer l’objectif à 63 x.
9. Définir le coin supérieur gauche (TopLeft) (Figure 2c) et le coin inférieur droit (LowRight) (Figure 2d) de la section en cliquant sur " jeu. "
10. Cliquez sur " Z-Series " et vérifier la " série Z-Plane " boîte (Figure 2e).
11. Déterminer l’épaisseur réelle montée des sections à comptage choisis au hasard trois sites par section en utilisant le logiciel d’imagerie. Pour ce faire, cliquez sur " vue haut compensé " pour définir la partie supérieure de la section (Figure 2e) et puis cliquez sur " arrêter vue haut " (Figure 2f). Par la suite, cliquez sur " vue fond compensé " (Figure 2f) et cliquez ensuite sur " arrêter l’affichage bas " (Figure 2 g). Notez l’épaisseur de la section.
12. Soustraire 3 µm (zone de garde) du haut compensé et entrez le résultat dans l’emplacement de décalage supérieur (Figure 2 h). Soustraire 13 µm (hauteur de la disector optique) du numéro d’offset haut de la page et entrez le résultat dans la fente de compensation inférieure (Figure 2i). Sélectionnez les paramètres suivants : étapes, 14 ; taille, 1.00 (Figure 2i).
    Remarque : Cela correspond à une épaisseur dans le plan z de 13 µm, avec une distance de 1 µm entre images consécutives.
13. Sélectionner le répertoire pour enregistrer le fichier (Figure 2j).
14. Cliquez sur " séquence " pour démarrer l’acquisition (Figure 2j).
15. Cliquez sur " traitement " et sélectionnez les paramètres suivants : " tous les plans, " de " de séquence ; " " Montage ; " et le " rapide " et " Stitching " boîtes, avec un chevauchement de l’image de 10 % (Figure 2 k). Commencer à assembler les images en cliquant sur " commencer ".
    NOTE : Ceci va générer des images de pile pour l’analyse (Figure 2 l, Figure 3 a -e).

3. Séquence d’évaluation stéréologique

1. effectuer l’analyse d’images de pile de SN en utilisant le NIH ImageJ logiciel version 4.7.
2. Télécharger les deux plugins qui sont nécessaires sur le site de ImageJ.nih.gov : la " grille Overlay " plugin ¹⁵ et la " compteur de cellules " plugin ¹⁶. Installez les deux plugins comme décrit.
3. Pour l’évaluation impartiale stéréologique, définir les paramètres de compte comme suit : taille de la grille, 130 x 130 µm ; cadre de comptage, 50 x 50 µm ; et optique disector hauteur, 13 & #181 ; m.
4. Ouvrez l’image en cliquant sur " File " → " ouvert " (Figure 4 a) définir l’échelle de l’image en utilisant la " Analyze " → " échelle définie " commande (Figure 4 b). Pour cette étape, changer la taille définie de pixels à µm (Figure 4C).
   Remarque : Pour les images analysées, 425 pixels correspond à 100 µm.
5. Sélectionner le " Plugins " → " grille " → " Type de grille : lignes " commande d’insérer au hasard une grille. Vérifier la " décalage aléatoire " boîte. Définir la taille d’une case dans la grille (maille) comme 130 µm x 130 µm = 16 900 µm ² ( Figure 3 b et 4 de la Figure d et e).
6. Changement d’image type de 16 bits de couleur RVB (cliquez sur " Image " → " Type " → " couleur RVB ") (Figure 4f). Localiser la SNpc, tel que décrit par Baquet et al. ¹⁷. encercler la SNpc avec le " outil Pinceau " (largeur de brosse : 11) ( c de la Figure 3 et Figure 4 g -je).
7. Annuler le " échelle définie " commande en cliquant sur " Analyze " → " échelle Set " → " Cliquer pour supprimer échelle " (Figure 4j -l) pour permettre l’exécution des calculs en pixels plutôt à µm.
8. Faire une capture d’écran (Figure 4 m), enregistrez le fichier de l’image et ouvrir le nouveau fichier avec ImageJ (Figure 4n). Sélectionnez " Point " (Figure 4o) et une largeur de brosse de 25 (Figure 4 p). Marquez chaque maille qui contacte le SN pour le placement d’un disector optique (Figure 4). Effectuer une analyse du nombre de cellules dans tous les disectors optiques qui sont localisées entièrement ou partiellement au sein de la SN indiqué.
9. Sélectionner une maille qui inclut des parties de la SN. Mesure le coin supérieur gauche de ce carré avec le curseur dans ImageJ pour définir x et y coordonnées à commencer par (Figure 4r).
   NOTE : Coordonnées seront insérées pour optique disector positionnement à l’aide de la " optique disector position " (Figure 4 s), tel que décrit à l’étape 4.
10. Calculer la position de disector optique en utilisant le modèle de feuille de calcul intitulé, " optique disector poste, " tel que décrit à l’étape 4.
11. Calibrer l’optique disector (macro rédigé par Christopher S. Ward, Fichier supplémentaire) en cliquant sur " Plugins " → " Macros " → " modifier " (Figure 4 t), ouvrez le " opt_dis_ Grid.txt " fichier (Figure 4u) et définir la taille de la " usergrid " en pixels qui correspond avec le x, y de dimension de la disector optique (Figure 4v). Sélectionnez une taille de 50 µm x 50 µm, afin que la taille d’un côté de l’usergrid est définie comme 212,5 pixels (pixels de 50 x 4,25).
12. Déterminer la position de la disector optique dans l’image de la pile en insérant les coordonnées ImageX et ImageY qui définissent le centre de l’optique disector (Figure 4v). Exécutez la macro (" Macros " → " exécuter Macro ") (Figure 4w).
    Remarque : La grille vont disparaître de l’image de la pile ( Figure 3d et Figure 4 x). Le disector optique va persister lors d’un déplacement vers le bas dans le plan z ( Figure 3e et Figure 4 x).
13. Select " Plugins " → " compteur de cellules " pour démarrer le plugin compteur de cellules (Figure 4y). Initialiser le compteur de la cellule, puis sélectionnez un type de marqueur (Figure 4z). Zoom sur l’image (cliquez sur " + ") et d’effectuer l’évaluation stéréologique des numéros de cellule à un grossissement de 200 %.
14. Identifier dopaminergique péricaryons neuronaux par leur ronde ou ovoïde forme et cellule de taille ( Figure 1 a). Quantifier le nombre de cellules à l’aide de règles stéréologiques.
    NOTE : Depuis le disector optique est un cube en 3 Dimensions ( Figure 5 a), définir les côtés d’exclusion comme avant, de gauche et les côtés supérieurs du cube (rouge). Par conséquent, don ' comte t TH + cellules qui entrent en contact avec la ligne rouge (à gauche et avant) ou le haut côté. Ajouter les résultats du nombre de cellules dans le fichier de feuille de calcul prête intitulé, " calcul du nombre de cellules " (étape 5).
15. Selon l’image de SN, calculer la maille suivante dans lequel vous souhaitez placer le disector optique pour le nombre de cellules suivant, en utilisant x, y a pas la taille de la grille sus-jacente ( Figure 5 b) et le " optique disector position " modèle de feuille de calcul, tel que décrit à l’étape 4.
16. Effectuer d’estimer le nombre de cellules utilisant la " calcul du nombre de cellules " tableur (étape 5).

4. Calcul de la Position de la Disector optique à l’aide du " optique Disector Position " modèle de feuille de calcul

1. calculer la taille et la position de chaque disector optique pour être placé dans la grille sous-jacente dans le contour de la (SN figure 5 b) à l’aide de la " optique disector position.xlsx " fichier de feuille de calcul (Fichier supplémentaire).
2. Insérer la conversion de pixel par µm, tel que défini par le " échelle définie " commande, dans les positions marquées jaunes de le " optique disector position.xlsx " fichier ( Figure 6 a et fichier supplémentaire ).
3. Insérer la taille prévue de le disector optique et la taille de la maille de la grille sus-jacente, définie par la longueur d’un côté (en µm), dans les emplacements marqués orange.
   Remarque : Les résultats sont représentés dans les cases en regard des cases orange à rouges.
4. Commencer avec la maille dans le contour de SN qui a déterminé que le point de départ (une maille a été sélectionné dans un premier temps, comme à l’étape 3.9, ci-dessus).
5. Insérer les coordonnées x et y, tel que mesuré à l’étape 3.9, dans les cases vertes du fichier (en utilisant les coordonnées y, x, ces valeurs sont calculées au centre de l’optique disector au sein de cette première place, et les résultats sont illustrés dans les cases bleues). Exécutez la macro opt_dis_grid.txt (Fichier supplémentaire).
6. Calculer x, coordonnées y de la disectors optique consécutives en insérant la distance de maille (mesurée en nombre de carrés) par rapport à la première maille (boîtes brunes).
   NOTE : + x: maille est situé vers la droite ; -x: maille se trouve vers la gauche ; + y: maille se trouve vers le bas ; -y: maille se trouve vers le haut. Résultats sont indiqués dans les cases grises.

5. Estimation du nombre de cellule à l’aide du " calcul du nombre de cellules " tableur

1. calculer le nombre de cellules TH + SN par animal (N) à l’aide de la formule publié par Ouest et al., 1991, ³, où ∑ Q ^– est défini comme le nombre total de TH + neurones comptés dans tous les disectors optiques de la section d’un cerveau.
   Remarque : La hauteur de l’optique disector (h) en ce qui concerne l’épaisseur mesurée de la section (t) est incluse dans l’équation. La fraction aréolaires (asf) est définie comme la proportion de la surface (A) de la taille d’image optique disector (une disector optique) dans la taille carrée de la grille (x, y étape) (une optique x disector/A, y étape) ( Figure 3 b) et le fraction de sondage section (ssf) est définie comme la proportion des sections du cerveau entier en série coupé :
   
   pour assurer la qualité quantitative des estimations, le coefficient de erreur (CE) doit être inférieure à 0,10. Déterminer le marquage CE selon la formule de Keuker et al., 2001 ¹⁰ :
   
2. permettant d’estimer le nombre de cellules au sein de la SN de chacun stéréologique souris, insérer les informations indiquées concernant le nombre total de séries générées par la souris, la hauteur de la disector optique, x, domaines de l’optique disector (une disector optique, en µm ²), x, y zone de la maille (x, y étape en µm ²), et la moyenne mesurée l’épaisseur de la section (en µm) dans les cases jaunes en utilisant le " calcul de cellule count.xlsx " fichier de tableur ( Figure 6 b et fichier supplémentaire ).
3. Analyser chaque section SN du même animal, tel que décrit à l’étape 5.
4. Insert numérations pour chaque disector optique dans les zones grises, chaque ligne se référant à un article de SN, en utilisant le " calcul de cellule count.xlsx " fichier de feuille de calcul (Fichier supplémentaire).
   Remarque : Le nombre estimé de cellules et la CE calculé sont représentés dans les cases bleues ( Figure 6 b).

6. Estimation du nombre de cellules à l’aide d’un système de stéréologie commercialement disponibles

1. Démarrer l’estimation des dopaminergiques SNpc nombre de cellules en cliquant sur " sondes " → " optique fractionnateur Workflow " pour ouvrir le fractionnateur optique Fenêtre de flux de travail.
   Remarque : Une nouvelle fenêtre s’affichera pour déterminer si une nouvelle série de SN va être compté.
2. Démarrer une nouvelle série de SN TH + sections en cliquant sur " commencer un nouveau sujet " dans la fenêtre pop-up.
3. Passer par les différentes étapes du Workflow fractionnateur optique. Mettre en place le sujet dans la première étape. Pour ce faire, insérez le chercheur ' nom, l’objet ' s nom (groupe SN) et autres informations utiles. Insérer les numéros de sections de compter pour ce SN. Insérez l’épaisseur des coupe des sections de tissu. Insérer l’intervalle de la section, qui est fixé à quatre dans ce cas. Inscrire le numéro de section aléatoirement déterminé à commencer par.
4. Dans la deuxième étape, définir le microscope à faible grossissement (X 2, objectif) et sélectionnez " 2 X lentille de Mag " danslemenu.
5. à l’étape 3, trace la zone concernée avec le bouton gauche de la souris, qui est de la SNpc, tel que décrit par Baquet et al., 2009 ¹⁷.
6. Régler le microscope à fort grossissement à l’étape 4. Pour ce faire, changez l’objectif 100 X et sélectionnez " 100 lentille X Mag " dans le menu déroulant.
7. Mesurer l’épaisseur monté à l’étape 5 en mettant l’accent vers le haut et vers le bas de la section.
8. à l’étape 6, définir la taille de l’image de comptage en 50 x 50 µm ; il s’agit de la taille de l’optique disector (x, y).
9. à l’étape 7, définir la taille de la grille d’échantillonnage aléatoire systématique (SRS) comme 130 x 130 µm.
10. Entrer dans une zone de garde de 3 µm à l’étape 8.
11. Enregistrer les paramètres de l’étape 9.
12. Enfin, compter les cellules TH + dopaminergique dans chacune de la disectors optique au sein de la grille SRS à l’étape 10 du flux optique de fractionnement. Pour ce faire, lancez en cliquant sur le " comptage " bouton.
13. Après avoir terminé une section, cliquez sur le " Section suivante commencer " le bouton pour démarrer le Workflow fractionnateur optique de la prochaine section de SN de la même série SN.
14. Lors de la dernière section de SN d’une série de SN a été quantifiée, cliquez sur " je ' ve Finished Counting. "
15. Cliquez sur le " afficher les résultats " bouton pour afficher les résultats de l’échantillonnage de stéréologie.

Representative Results

À l’aide de la méthode présentée, le nombre estimé de TH + neurones dopaminergiques dans le droit SN varie entre cellules 7 363 et 7 987 et, dans la gauche SN, entre cellules 7 446 et 7 904. Ainsi, le nombre moyen des neurones dopaminergiques (± SEM) était 7 647 ± 83 cellules pour le droit de SN et 7 675 ± 66 pour la gauche SN. L’EC calculée pour chaque animal était inférieure à 0,08 (gamme : 0,073-0,079) (Figure 7). Pour établir la comparabilité de cette méthode avec les systèmes de stéréologie commercialement disponibles et spécialisés, SN nombre de cellules ont été également quantifié à l’aide de la configuration de stéréologie (Figure 8). Les paramètres de comptage ont été : taille de la grille, 130 x 130 µm ; trame de comptage, 50 x 50 µm ; zone de garde, 3 µm. les articles ont été analysés avec un 100 x / 1,25 objectif ouverture numérique sur un microscope de BX53. La population estimée de neurones SN TH + à l’aide de l’épaisseur de coupe moyenne varie de 7 067 à 8 105 cellules/SN et 7 164 à 8 015 cellules/SN sur les côtés droite et gauche, respectivement. Le nombre moyen de neurones correspond à 7 535 ± 155 cellules pour avoir le droit de SN et 7 699 ± 128 cellules pour la gauche SN. Le marquage CE de Gundersen (m = 1) a été ≤0.08 dans chaque SN quantifié (Figure 7). L’analyse statistique en utilisant le test t de Student appariés n’a révélé aucune différence significative entre le nombre de cellules TH + des deux méthodes dans le droit ou le gauche SN (moyenne ± SEM ; à droite : t (5) = 0.9524, P > 0,05 ; gauche : t (5) = 0.2928, P > 0,05) (Figure 7 ).

La figure 1. Des images représentatives de souris SN colorées pour les neurones dopaminergiques.
(a) un aperçu d’un SN de souris représentant s’affiche dans le panneau supérieur. Notez le petit trou dans la partie supérieure du tronc cérébral droit qui marque le côté droit. Grossissement de l’encart (boîte noire) dépeint TH + les neurones dopaminergiques. (b) une série de sections de SN TH tachée est indiqué, couvrant la souris toute SN de rostrale à la caudale. (c) chaque section est séparée de la section consécutive par 120 bars µm. échelle : un, panneau supérieur, 500 µm ; panneau inférieur, agrandir, 100 µm ; panneau inférieur, en médaillon, 50 µm ; b, 500 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

La figure 2. Acquisition d’images pour l’analyse stéréologique en utilisant le logiciel d’imagerie.
(a) flèche rouge : Ouvrez la fenêtre d’acquisition ; flèche verte : définir la sélection « 2 ; » flèche bleue : afficher l’image en direct. (b) ouvrira une nouvelle fenêtre montrant l’image live (flèche rouge). la flèche rouge (c) : sélectionnez le menu « Stade » ; flèche verte : sélectionnez l’option « Scan Slide » ; flèche bleue : cochez l’option « Scan Slide » ; flèche noire : définir le coin supérieur gauche. flèche noire (d) : Décrivez le coin inférieur droit. la flèche rouge (e) : sélectionnez le menu « Z-series » ; flèche verte : vérifier la « série de Z-Plane » ; flèche bleue : commencer la « vue Top Offset » pour rechercher la partie supérieure de la section. la flèche rouge (f) : cliquez sur « Arrêter vue supérieure » pour définir la partie supérieure de la section ; flèche verte : Démarrer « Vue fond Offset » pour rechercher la base de la section. la flèche rouge (g) : cliquez sur « Arrêter l’affichage bas » pour définir la base de la section. la flèche rouge (h) : soustraire la garde µm 3 zone de l’Offset « Top » et insérez le résultat dans la fente « Décalage de haut ». (i) flèche rouge : soustraire 13 µm du nombre « Top Offset » et insérez le résultat dans la fente « Décalage de fond ». flèche verte : définir 14 étapes qui correspond à une épaisseur de z-plane de 13 µm ; flèche bleue : définir une taille de 1,00 µm qui correspond à une distance de 1 µm entre images consécutives. la flèche rouge (j) : sélectionnez le répertoire pour enregistrer le fichier ; flèche bleue : cliquez sur « Séquence » pour démarrer l’acquisition d’images. flèche rouge (k) : cliquez sur « Traitement ; » vérifier les paramètres suivants : flèche verte : « Tous les avions ; » flèche bleue : « Séquences » ; flèche noire : « Montage » ; flèche grise : « Stitching ; » purple flèche : rapide. (l) cliquez sur la flèche jaune pour commencez à coudre les images. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

La figure 3. Traitement des images pour l’analyse stéréologique.
(a) une image de pile par exemple tirée une souris SN. (b et c) Après l’insertion aléatoire d’une grille recouvrant le SN (lignes turquoises, b), le SN est décrite dans un second temps (ligne bleue, c). (d) une disector optique est placé dans l’image de pile SN. (e) Six plans focaux consécutives au sein de l’image de pile SN couvrent 13 µm de total dans le plan z. Barreaux de l’échelle : a-d, 100 µm ; e, 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

La figure 4. Séquence d’évaluation stéréologique utilisant ImageJ.
(a) flèche rouge : cliquez sur « Fichier » → « Ouvrir » pour ouvrir une image de la pile. la flèche rouge (b) : cliquez sur « Analyser » → « Barème défini ». (c) les flèches rouges : définir les paramètres pour la « Distance en pixels, » « Distance connue » et « Unité de longueur ». la flèche rouge (d) : sélectionnez « Plugins » → « Grille ». la flèche rouge (e) : sélectionnez « Lignes » ; flèche verte : vérifier « Random Offset ; » flèche bleue : insérer la taille de la grille en µm². la flèche rouge (f) : cliquez sur « Image » → « Type » → « couleur RGB. » la flèche rouge (g) : sélectionnez l’outil « Pinceau » ; flèche verte : qualifier la « largeur de la brosse » 11. la flèche rouge (h) : commencer à encercler le SNpc. (i) rouge flèches représentent l’encerclée SNpc. (j) flèche rouge : cliquez sur « Analyser » → « Barème défini » et supprimer la balance (k) en cliquant sur « Cliquez pour supprimer échelle » représenté par le rouge flèche. Note du changement de µm (k, green arrow) pixels (l, rouge, flèche). (m) , prendre une capture d’écran (flèche rouge pointe vers la capture d’écran) et (n) ouvrir le fichier d’image capture d’écran avec ImageJ. la flèche rouge (o) : cliquez sur « Point ». la flèche rouge (p) : insérer une largeur de brosse de 25. (q) la flèche rouge représente les grille-carrés marqués qui contacter le SNpc. (r) la flèche rouge pointe vers le coin supérieur gauche d’une maille qui comprend une partie du SN. En plaçant le curseur à ce stade, le x, y coordonne pour la « position de disector optique » (étape 4) sont mesurées et inséré dans le modèle « optique disector position.xlsx » (s, rouge, flèche). la flèche rouge (t) : sélectionnez « Plugins » →« Macros » → « modifier. » la flèche rouge (u) : sélectionnez le fichier « opt_dis_grid.txt ». Une nouvelle fenêtre s’ouvrira (v). Insérer la taille de la « usergrid », en pixels (v, flèche rouge) et le x, y les coordonnées (v, flèche verte). (w) , exécutez la macro « opt_dis_grid.txt » (flèche rouge). (x) une disector optique apparaîtra au milieu de la maille défini précédemment (flèche rouge). la flèche rouge (y) : cliquez sur « Plugins » → « Compteur de cellules ». (z) initialiser le compteur de cellules (flèche rouge), puis sélectionnez un type de marqueur (flèche verte). S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

La figure 5. Mise en place de l’optique disector.
(a) Illustration de le disector optique utilisé pour stéréologie impartiale. Le disector optique est un cube en 3 dimensions. Trois cellules schématiques sont visibles dans l’optique disector. Les règles stéréologiques pour la quantification des cellules indiquent que les cellules toucher les côtés rouges marquées de la disector optique sont exclus (hématies), alors que les cellules qui en contact avec le vert côtés marquées sont incluses dans les cellules (cellules vertes). (b) une disector optique est placé dans chaque maille en contact direct avec le SN. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

La figure 6. Calcul de la position disector optique et l’estimation du nombre de cellules.
(a) un exemple de calcul effectué pour le positionnement de l’optique disector. (b) un exemple de l’estimation du nombre total de cellules. Le nombre de cellules chiffrés est inséré dans les cases grises, tandis que les paramètres de quantification stéréologique sont insérés dans les cases jaunes. Le nombre estimatif de cellules et le marquage CE s’affichent dans les cases bleues. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

La figure 7. Comparaison des cellules paramètre.
(a) comparant le TH + cellule nombre estimé de la souris droite et gauche SN obtenu à partir de la méthode stéréologique décrite avec les données acquises de l’analyse en utilisant le système de stéréologie disponibles dans le commerce n’ont pas montré de différences significatives quant. Une liste détaillée des données obtenues du droit (b) et gauche (c) SN est donnée avec le nombre de cellules estimée par animal, le nombre de cellules comptées en fait, le nombre de sections comptés et le nombre de sites d’échantillonnage (c.-à-d., le nombre de mailles compté) pour les deux méthodes. Les valeurs dans les graphiques à barres sont la moyenne ± SEM des données de 6 souris. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

La figure 8. Quantification des cellules avec le système de stéréologie disponibles dans le commerce.
(a-b) Le contour de la SN est dessiné et (c) les positions de la disectors optique sont automatiquement déterminés. (d-e) Chaque disector optique est analysée pour le nombre de cellules en mettant l’accent sur le plan z. Six plans focaux consécutives au sein de la SN sont indiqués. Les lignes rouges et vertes correspondent à l’optique disector. Barreaux de l’échelle : a-d, 100 µm ; e, 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Supplémentaire 1 fichier. opt_dis_grid.txt S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 2. Optique disector position.xlsx s’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 3. Calcul de cellule count.xlsx s’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Stéréologie commence avec le traitement de tissus. La série Coupe du tissu SN doit être effectuée avec soin afin d’éviter la perte des articles au cours de l’analyse stéréologique. En outre, une étape essentielle consiste à marquer un hémisphère afin de distinguer la droite de la gauche SN lors de l’exécution de stéréologie. Placer un petit trou à la partie supérieure du tronc cérébral généré les meilleurs résultats dans l’étude présentée. En outre, depuis le travail avec les exigences de méthode de fractionnement optique que le tissu est coupé en coupes épaisses d’environ 30 à 40 µm, plutôt que le 5-10 µm plus couramment utilisés en immunohistochimie, anticorps et autre pénétration de tissu fluide incubation pendant marquage immunohistochimique doit être assurée, tel que par l’utilisation d’un détergent.

IMMUNOHISTOCHEMICAL souillant pour les neurones dopaminergiques en utilisant le TH anticorps étiquettes neurones SN, mais aussi des neurones dans l’aire tegmentale ventrale (VTA), qui se trouve en dedans de la SN, et les neurones dans le domaine de la retrorubral. Un autre point critique lors de l’exécution de stéréologie du SN est donc connaissance de l’anatomie de SN, la souris puisque les neurones SN ne peut pas être visualisés exclusivement par immunohistochimique standard ou coloration histologique. Au lieu de cela, la reconnaissance des repères anatomiques, tels que le noyau sous-thalamique, le domaine de la retrorubral et l’aire tegmentale ventrale, sont importants déterminer toute l’étendue de la SN^17,18,19.

Évaluer le nombre de neurones doit être fiable et reproductible. Bien que divers groupes utilisent des configurations de stéréologie disponibles dans le commerce, numéros des TH + neurones dopaminergiques SN de souris wt, tirées de différentes publications, varient en nombre^17,20. Dans le Baquet et al., conception fondée sur l’analyse stéréologique chez 3 à 4-mois-vieux mâles et femelles C57BL/6J wt en utilisant un système de stéréologie commercialement disponibles a révélé une estimée 8 716 ± 338 TH + SN neurones dopaminergiques (gamme : 7 546-9 869)¹⁷ . En revanche, Smeyne et al. trouvé moins de cellules TH + SN chez les souris C57BL/6J mâles âgés de 9 à 16 semaines ayant reçu i.p. saline 0,9 %, allant de 6 302 ± 262 cellules à ± 6 861 338 cellules, en utilisant une version plus récente du même système stéréologie²⁰. Cependant, le premier auteur était également le dernier auteur dans Baquet et al. papier, c'est-à-dire à l’exclusion des degrés d’expérience comme motif pour les différents résultats. Ces données contradictoires reflètent la nécessité d’une méthode de quantification stéréologique qui affiche moins de variabilité. Pour vérifier la technique de quantification et de la formule utilisée, une comparaison des résultats de SN numéro globules à l’aide de la méthode décrite avec une quantification en utilisant la configuration de stéréologie disponibles dans le commerce a été réalisée. Analyse statistique n’a pas montré de différences significatives quant lorsqu’on compare le nombre de TH + les neurones dopaminergiques dans le droit et gauche SN de souris wt déterminé en utilisant les deux techniques de dosage de la cellule, ce qui prouve que cette méthode est réalisable pour la stéréologique estimation des neurones SN chez la souris.

Le principal avantage de la méthode décrite est qu’il réduit les coûts généralement associés à la mise en œuvre des techniques de stéréologie pour le comptage des cellules. Un deuxième avantage est que, pour la méthode décrite, empiler les images du SN sont enregistrées et peuvent être analysés à tout moment (même en même temps) par un autre enquêteur. En outre, l’acquisition et l’analyse des images de fluorescence est possibles avec cette méthode, parce que les images en niveaux de gris peuvent être colorés avec les « Tables » dans ImageJ. Cependant, il y a des limites à cette étude. Tout d’abord, la quantification du nombre de cellules est plus longue (environ 50 %) que la quantification avec le système de stéréologie disponibles dans le commerce. Il s’agit principalement pour deux raisons : 1. pile d’images du SN doivent être prises et 2. calcul du placement au sein de chaque SN disector optique et calcul du nombre de cellules environ et CE doivent être effectuée manuellement en utilisant les modèles de calcul. En second lieu, au moins avec le système disponible dans notre laboratoire, l’analyse peut être effectuée uniquement sur des images en niveaux de gris en raison de la taille de fichier de grande taille des images en couleur, qui n’ont pas été traitées par ImageJ. Cela pourrait poser un problème si il est nécessaire de quantifier des deux populations de cellules différentes en même temps dans une double tache. Il pourrait être plus difficile de distinguer les deux populations de cellules colorées différemment dans les images en niveaux de gris. Par conséquent, même si une platine motorisée (x, y, plan z) et le logiciel correspondant sont disponibles dans de nombreux laboratoires travaillant avec des spécimens histologiques, la gestion et la qualité des images de la pile dépendra du logiciel du microscope et la performance des l’ordinateur relié.

Il y a des façons de dépasser les limites. En utilisant les modèles de calcul, que nous avons développé, la programmation de macros pour automatiser certains processus actuellement manuellement exécutées pourrait réduire des erreurs ou des inexactitudes au cours de l’évaluation stéréologique et accélérer la vitesse de travail. En outre, avec le développement continu de ImageJ et autre logiciel d’imagerie, ainsi qu’avec l’augmentation de puissance de traitement informatique, grandes tailles de fichier image ne devraient pas poser un problème dans un avenir proche. Par conséquent, les analyses d’images couleur lumineux-zone pourront être gérés avec la technique décrite.

La technique décrite n’est pas limitée aux analyses des cellules TH + SN, mais peut être étendue pour analyser d’autres types de cellules et des régions du cerveau des rongeurs. Pour ce faire, les frontières anatomiques de la région d’intérêt doivent être déterminées et la coloration respectifs doit être effectuée. En outre, cette technique peut être adaptée aux sections plus épaisses. Pour ce faire, l’acquisition d’images de la pile doit être adaptée pour fournir des images plus de pile. Par exemple, si l’article 40 µm d’épaisseur est nécessaires, le réel monté épaisseur de la section après que coloration de tissu doit être évaluée pour déterminer la hauteur nécessaire de l’optique disector. Soustraire l’épaisseur moyenne de tissu de 6 µm (zone de garde 3 µm en haut et en bas) et prendre le résultat comme la hauteur de l’optique disector.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paxinos mouse atlas			The Mouse Brain George Paxinos Keith B.J.FranklinCopyright @2001 by Academic Press CD Rom designet & created by Paul Halasz
brain matrix slicer mouse	Zivic Instruments	BSMAS 001-1
paraformaldehyde	Merck	1040051000
sucrose /D(+) Saccharose	Roth	4621.1
isopentane	Roth	3927.1
glycerol	Merck	1040931000
Ethanol	Sigma Aldrich	32205-1L
Name	Company	Catalog Number	Comments
phosphate buffered saline ingredients:
sodium chloride	Sigma Aldrich	31434-1KG-R
potassium dihydrogen phosphate	Merck	1048731000
di-sodium hydrogen phosphate dihydrate	Merck	1065801000
potassium chloride	Merck	1049360500
normal goat serum	Dako	X0907
bovine serum albumin	Sigma	A4503-100G
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100-100ml	detergent
3,3-Diaminobenzidine-tetrahydrochlorid/DAB tablets 10mg pH 7.0	Kem En Tec	4170
H2O2/ Hydrogen peroxide 30%	Merck	1072090250
avidin/biotin reagent	Thermo Scientific	32050	Standard Ultra Sensitive ABC Staining Kit, 1:100
rabbit anti mouse tyrosine hydroxylase antibody	abcam	Ab112	1:1000
biotinylated goat-anti-rabbit IgG H+L	vector laboratories	BA-1000	1:100
StereoInvestigator version 11.07	MBF
BX53 microscope	Olympus
Visiview	Visitron Systems GmbH	3.3.0.2
Axiophot2	Zeiss
ImageJ software	NIH	Version 4.7
Tissue-TEK OCT	Sakura	4583
dry ice
grid overlay plugin	Wayne Rasband		https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html
cell counter plugin	Kurt de Vos		https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html).
optical disector macro	Christopher Ward
C57Bl/6N male mice	Charles River, Germany
SuperFrost Plus coated object slides	Langenbrinck, Germany
25G needle Microlance 3	BD	300400
REGLO Analog Infusion pump	Ismatec	ISM 829
StereoInvestigator system			StereoInvestigator version 11.07
BX53 microscope			BX53 microscope
self-assorted stereology			Visiview
Axiophot2			Axiophot2