Summary
Detta arbete presenterar ett stegvisa protokoll för opartisk beteendetester uppskattning av dopaminerga neuronala cell nummer i mus substantia nigra med standard mikroskopi utrustning (dvs. ett ljusmikroskop, en motoriserad objekttabellen (x, y, z planet), och offentlig domän programvara för digital bildanalys.
Abstract
I prekliniska Parkinsons Sjukdomforskning är analys av nigrostriatala tarmkanalen, inklusive kvantifiering av dopaminerga neuron i substantia nigra, viktigt. För att uppskatta antalet totala dopaminerga neuron, anses opartisk stereology med metoden optisk naftafraktioneringskolonn för närvarande guldmyntfoten. Eftersom teorin bakom metoden optiska naftafraktioneringskolonn är komplex och stereology är svårt att uppnå utan specialutrustning, finns flera kommersiellt tillgängliga komplett stereology system som inkluderar den nödvändiga programvaran, rent för cell räknar skäl. Sedan köpa en specialiserad stereology setup inte är alltid möjligt, av många skäl, denna rapport beskriver en metod för beteendetester uppskattning av dopaminerga neuronala cell räknar med standard mikroskopi utrustning, inklusive ett ljusmikroskop, en motoriserade objekttabellen (x, y, z plan) med programvara för bildåtergivning och en dator för analys. En steg för steg förklaring ges om hur man utför beteendetester kvantifiering med metoden optisk naftafraktioneringskolonn och förprogrammerade filer för beräkning av uppskattade blodkroppar finns. För att bedöma riktigheten av denna metod, utfördes en jämförelse till uppgifter som erhållits från en kommersiellt tillgängliga stereology apparatur. Jämförbara cell nummer hittades med hjälp av detta protokoll och stereology enheten, vilket visar att detta protokoll för opartisk stereology precision.
Introduction
Kvantifiering av antalet neuronala celler är avgörande i prekliniska Parkinsons Sjukdomforskning för att avgöra nivån på neurodegeneration inom det substantia nigra (SN)1,2. Opartisk beteendetester uppskattning av antalet celler i ett område av intresse anses vara den gyllene standard3,4,5.
Före tillkomsten av opartisk stereology uppskattades antalet neuroner i sektioner genom att manipulera räknade cell profiler att korrigera för variabel sannolikheterna att nervceller kommer i sikte i ett avsnitt. En av de vanligaste metoderna var korrigering av kvantifierade blodkroppar som beskrivs av Abercrombie6. Denna metod försökte ta hänsyn till att celler kan kvantifieras mer än en gång om fragment av samma cell finns i intilliggande tunnslip. Därför, Abercrombie och andra författare genereras ekvationer som krävs antaganden om form, storlek och orientering av räknade celler7,8. Dessa antaganden var dock oftast inte insett och därför ledde till systematiska fel och avvikelser från den faktiska mobilnummer (dvs bias). Bias kunde dessutom inte minskas med ytterligare provtagning3.
För beteendetester uppskattning av cell nummer med hjälp av den optiska naftafraktioneringskolonn, tillämpas matematiska principer för att direkt beräkna den cell nummer direkt i en definierad, 3-dimensionell volym. Fördelen med denna metod är att det inte innebär antaganden om form, storlek och orientering av cellerna räknas. Således, de uppskattade cell nummer är närmare sanna värden och komma närmare stickprovsstorleken ökar (dvs opartisk)3. Eftersom många regler måste följas när du använder stereology för att hålla metoden opartisk, klar att använda kommersiella stereology system har utvecklats (för granskning, se Schmitz och Hof, 20054). Specialiserade stereology system implementera design-baserade beteendetester metoder med en priori definierats sonder och provtagning system för beteendetester bedömningar som leder till självständighet från form, storlek, rumslig fördelning och orientering av den celler att vara analyserade4,9. Kommersiellt tillgängliga stereology system är dock dyra; Detta kan begränsa genomförandet i ny forskning.
Syftet med denna studie var att utveckla en användbar teknik för design-baserade beteendetester uppskattning av dopaminerga blodkroppar i musen SN, anställa den optiska naftafraktioneringskolonn metoden och använder standard mikroskopi utrustning (dvs ljus Mikroskop, standard Mikroskop programvara och en motoriserad x, y, z skede). För detta presenteras en steg för steg guide om hur att bearbeta mus hjärnvävnad och uppskatta SN cell nummer med hjälp av design-baserade opartisk stereology. Dessutom finns mallar för beräkningen av det uppskattade cellantal och koefficienter av fel (CE).
Den metod som beskrivs här är inte begränsat till analysen av SN, men kan anpassas för användning i andra anatomiskt definierade regioner av hjärnan som mus eller råtta. Opartisk stereology har exempelvis använts för att uppskatta neuronala cell nummer i hippocampus10 och locus coeruleus11. Dessutom kan celltyper än neuroner, såsom astrocyter12 och mikroglia13, bedömas liksom. Denna metod kan därför användbar till forskare som avser att genomföra opartisk stereology i deras forskning men är inte villig att spendera en massa pengar att köpa ett stereology system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alla tillämpliga internationella, nationella och/eller institutionella riktlinjer för skötsel och användning av djur följdes. Protokollet godkändes av lokala myndigheter på den Regierung von Unterfranken, Würzburg, Tyskland.
1. vävnad behandling och immunohistokemi
- Euthanize möss med CO 2 eller någon annan godkänd metod.
- Perfuse sex 12 veckor gamla C56Bl/6N hanmöss transcardially med 10 mL 0,1 M fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) med en 25-G nål och en infusionspump, följt av 70 mL 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i 0,1 M PBS.
Varning: PFA är toxiska, allergiframkallande och cancerframkallande. - Dissekera mus hjärnan i koronalt planet med en hjärna matrix slicer på regionen i +0.74 mm från Bregma (Figur 25, Paxinos och Franklin mus hjärnan atlas 14).
- Den dorsala delen av hjärnan, inklusive SN, i 4% PFA i 0,1 M fosfatbuffrad Koksaltlösning för 1 d vid 4 ° C för nedsänkning-fixering.
- Utbyte av PFA till 30% sackaros/0,1 mol PBS infusionsvätska kryo-skydd och inkubera i en annan 2 d vid 4 ° C.
- Put ryggdelen av hjärnan i en cryomold fylld med optimal skärtemperatur (ULT) förening och sakta frysa vävnaden i flytande torr iskylda isopentan.
Varning: Torris är extremt kallt (-78 ° C). Använd personlig skyddsutrustning (PPE), inklusive handskar, medan du arbetar med torris. Torr-is dunstar i CO 2. Därför arbetar under ett dragskåp. - Seriellt skär 30 µm cryo-avsnitten i det koronala planet och samla avsnitten på 2.46 mm från Bregma (Figur 51, Paxinos och Franklin mus hjärnan atlas 14) och slutar på 4,04 mm från Bregma (Figur 64, Paxinos och Franklin mus hjärnan atlas 14).
- Lagra fyra serier i rören som är fyllda med frysskyddmedel (30% glycerol, 30% ethoxyethanol och 40% PBS) vid-20 ° C. Under förfarandet för snittning, markera den högra hjärnhalvan genom att punktera ett litet hål in i övre regionen av hjärnstammen.
- För immunhistokemisk färgning, Välj en rad sektioner per mus. Preincubate friflytande sektioner för 1 h i 10% normala get serum (NGS)/2% BSA/0.5% tvättmedel i 0,1 mol PBS på en shaker. Inkubera i avsnitt med kanin antimus tyrosin hydroxylas (TH; 1:1,000 utspädning) antikropp utspätt i 2% NGS/2% BSA/0.5% tvättmedel i 0,1 mol PBS över natten vid 4 ° C.
- Använd sekundära antikroppar mot kanin Igs (1: 100 utspädning) för 2 h i rumstemperatur, följt av avidinen/biotin reagens (spädning 1: 100). Inkubera och fläckar med 3,3-Diaminobenzidin-tetrahydrochloride (DAB) och H 2 O 2. Montera i avsnitt efter färgning dem på bestruket objekt diabilder.
Obs: TH + dopaminerga SN nervceller visas i figur 1a. Genom färgning en serie, är ett genomsnitt av 13 SN sektioner, sträcker sig från den rostralt till stjärtfenan delar av SN pars compacta (SNpc) och reticulata, färgade per djur ( figur 1b). Avsnitten är åtskilda av 120 µm (1/4-serien) ( figur 1 c).
Varning: DAB är misstänkt cancerframkallande. Det är giftigt vid kontakt och inandning. Använd personlig skyddsutrustning vid arbete med DAB.
2. Förvärv av bilder
- fånga TH immunohistochemically målat SN sektioner digitalt med programvara för bildåtergivning som är kopplat till ett mikroskop. Separat analysera varje avsnitt av en serie.
- Använda alternativet Skanna bild av avbildningsprogrammet. Spara i TIFF-format för bilder med hög kvalitet (figur 2).
Obs: Bildupplösning är 312 pixlar per cm. - Press " förvärva " att öppna fönstret förvärv (figur 2a).
- Ange den binning till " 2 " för gråskalebilder.
Obs: Förvärvet av gråskalebilder istället för färgbilder minskar storleken på den slutgiltiga stack bild arkivera (figur 2a). - Klicka på " Show Live " i fönstret förvärv att öppna ett nytt fönster som visar den levande bilden av avsnittet (figur 2 en och b).
- Klicka på " steg " i fönstret förvärv. Välja " Skanna Skjut " i dropdown-menyn och kontrollera rutan (figur 2 c).
Obs: Detta gör att förvärv och anpassning av starkt förstorad SN bilder (630 X förstoring) i x, y-planet, samt förvärvet av stacken bilder med ett avstånd mellan på varandra följande bilder 1 µm i z-planet, som omfattar en total räckvidd på 13 µ m. - Välj syftet 2,5 X för att söka efter SN.
- Ändra syftet till 63 x.
- Definiera det övre vänstra hörnet (TopLeft) (figur 2 c) och nedre högra hörn (LowRight) (figur 2d) avsnittet genom att klicka på " uppsättningen. "
- Klicka på " Z-serie " och kontrollera den " Z-planet serien " box (figur 2e).
- Bestämma faktiska monterade tjockleken på avsnitten på tre slumpmässigt utvalda räknar platser per sektion med hjälp av avbildningsprogrammet. För detta, klicka på " Visa topp Offset " att definiera upp i avsnittet (figur 2e) och klicka sedan på " sluta Visa topp " (figur 2f). Därefter klicka på " Visa botten Offset " (figur 2f) och klicka sedan på " sluta Visa botten " (figur 2 g). Skriv ner tjockleken på avsnittet.
- Subtrahera 3 µm (säkerhetszon) från toppen offset och skriv resultatet i det övre offset-facket (figur 2 h). Subtrahera 13 µm (höjd av den optiska disector) från den övre offset nummer och skriv resultatet i det nedre offset-facket (figur 2i). Välj följande parametrar: steg, 14; storlek, 1,00 (figur 2i).
Obs: Detta motsvarar en tjocklek i z-planet på 13 µm, med ett 1 µm avstånd mellan på varandra följande bilder. - Markera katalog för att spara filen (figur 2j).
- Klicka på " sekvens " att starta förvärvet (figur 2j).
- Klicka på " bearbetning " och välj följande parametrar: " alla plan, " från " sekvens; " " Montage; " och " snabb " och " sy " lådor, bild överlappning av 10% (figur 2 k). Börja sy bilderna genom att klicka på " börja ".
Obs: Detta kommer att generera stack bilder för analys (figur 2 l, figur 3a -e).
3. Sekvens av beteendetester bedömning
- utföra analysen av SN stack bilder med hjälp av NIH ImageJ programversion 4.7.
- Hämta de två plugins som behövs från webbplatsen ImageJ.nih.gov: den " Grid Overlay " plugin 15 och den " Cell Counter " plugin 16. Installera båda plugins som beskrivs.
- För opartisk beteendetester bedömning, definiera parametrarna räkna enligt följande: stödrastrets storlek, 130 x 130 µm; counting ram, 50 x 50 µm, och optisk disector höjd, 13 & #181; m.
- Öppna bilden genom att klicka på " fil " → " öppna " (figur 4a) ställa in skalan för bilden med hjälp av den " analysera " → " ange skala " kommando (figur 4b). I detta steg måste ändra definierad storlek från pixlar till µm (figur 4 c).
Obs: För de analyserade bilderna, 425 pixlar motsvarar 100 µm. - Välj de " Plugins " → " nätet " → " Grid typ: linjerna " kommando för att infoga slumpmässigt ett rutnät. Kontrollera den " slumpmässiga Offset " rutan. Definiera storleken på en ruta i rutnätet (rutnät-square) som 130 µm x 130 µm = 16,900 µm 2 ( figur 3b och figur 4 d och e).
- Ändra bild typ från 16-bitars RGB-färg (klicka på " bild " → " typ " → " RGB-färg ") (figur 4f). Leta upp SNpc, som beskrivs av Baquet o.a. 17. omringa SNpc med den " penselverktyget " (borsta bredd: 11) ( figur 3 c och figur 4 g -jag).
- Ångra den " ange skala " kommandot genom att klicka " analysera " → " ange skala " → " Klicka för att ta bort skala " (figur 4j -l) att aktivera prestanda för beräkningar i pixlar snarare än µm.
- Göra en skärmdump (figur 4 m), spara image-filen och öppna den nya filen med ImageJ (figur 4n). Välj " punkt " (figur 4o) och en borste bredd 25 (figur 4 p). Markera varje-ruta som kontaktar SN för placering av en optisk disector (figur 4q). Utför analys av antalet celler i alla optiska disectors som är lokaliserade helt eller delvis inom disponerade SN.
- Välj en-ruta som innehåller delar av SN. Mäta det övre vänstra hörnet av detta torg med markören i ImageJ att definiera x- och y-koordinater för att börja med (figur 4r).
Obs: Koordinater kommer att införas för optisk disector positionering med hjälp av den " optiska disector ställning " (figur 4s), enligt beskrivningen i steg 4. - Beräkna optiska disector positionen med hjälp av kalkylblad mallen rätt, " optisk disector position, " som beskrivs i steg 4.
- Kalibrera den optiska disector (makro skriven av Christopher S. Ward, Kompletterande fil) genom att klicka på " Plugins " → " makron " → " redigera " (figur 4t), öppna den " opt_dis_ Grid.txt " fil (figur 4u) och definiera storleken på den " usergrid " i pixlar som motsvarar med x, y dimension av den optiska disector (figur 4v). Välj en storlek på 50 µm x 50 µm, så att storleken på ena sidan av usergrid definieras som 21,25 pixlar (50 x 4,25 pixlar).
- Bestämma positionen av det optiska disector i stacken bilden genom att infoga de ImageX och ImageY koordinater som definierar mitten av den optiska disector (figur 4v). Kör makrot (" makron " → " Kör makro ") (figur 4w).
Obs: Rutnätet kommer att försvinna från stack bilden ( diagram 3d och diagram 4 x). Den optiska disector kommer att finnas kvar när du flyttar i z-planet ( figur 3e och figur 4 x). - Välj " Plugins " → " Cell Counter " att starta Cell Counter plugin (figur 4 års). Initialisera räknaren Cell och välj en markörtyp (figur 4z). Zooma in på bilden (klicka på " + ") och utföra beteendetester bedömningen av den cell nummer vid 200% förstoring.
- Identifiera dopaminerga neuronal perikarya av deras runda eller ovala form och cell storlek ( figur 1a). Kvantifiera antalet celler med beteendetester regler.
Obs: Eftersom den optiska disector är en 3-dimensionell kub ( figur 5a), definiera utslagning sidor som framsida, vänster, och topp sidor av kuben (röd). Därför, don ' t greve TH + celler som kommer i kontakt med antingen den röda linjen (vänster och) eller ovansida. Lägg till resultaten av blodkroppar till beredda kalkylbladsfilen rätt, " beräkning av celltal " (steg 5). - Enligt SN bilden, beräkna nästa grid-torget där du vill placera den optiska disector för det nästa celltalet, använda x, y steg storleken på överliggande nätet ( Figur 5b) och den " optisk disector ställning " kalkylarksmallen, enligt beskrivningen i steg 4.
- Utföra en uppskattning av den cell nummer med den " beräkning av celltal " kalkylblad (steg 5).
4. Beräkning av optiska Disector Position med hjälp av den " optiska Disector ställning " Spreadsheet Template
- Beräkna storlek och placering av varje optisk disector placeras in i överliggande nätet inom konturerna av den SN ( Figur 5b) använda den " optisk disector position.xlsx " kalkylbladsfil (Kompletterande fil).
- Infoga omvandlingen av pixel per µm, enligt definitionen i den " ange skala " kommando, i gul markerade positioner av den " optisk disector position.xlsx " fil ( figur 6a och kompletterande fil ).
- In den optiska disector planerade storlek och storleken på grid-torget av överliggande nätet definieras av längden på ena sidan (i µm), orange markerade positionerna.
Obs: Resultaten skildras i röda rutorna bredvid de orange rutorna. - Börja med grid-torget inom SN dispositionen som fastställdes som utgångspunkt (en-ruta valdes till att börja med som i steg 3.9, ovan).
- Infoga koordinaterna x och y, mätt i steg 3.9, in i de gröna rutorna på filen (med hjälp av dessa värden, x, y-koordinaterna för centrera av den optiska disector inom detta första torg beräknas, och resultaten skildras i de blå rutorna). Köra makrot opt_dis_grid.txt (Kompletterande fil).
- Beräkna x, y-koordinaterna för de på varandra följande optiska disectors genom att infoga-ruta avståndet (mätt i antal rutor) i förhållande till den första grid-torget (bruna lådor).
Obs: + x: grid-torget ligger till höger; -x: grid-torget ligger till vänster; + y: grid-torget ligger längst; -y: grid-torget ligger överst. Resultaten visas i de grå rutorna.
5. Uppskattning av Cell nummer använder den " beräkning av celltal " kalkylblad
- Beräkna det uppskattade antalet TH + SN celler per djur (N) med hjälp av formeln Publicerad av västra et al., 1991 3, där ∑ Q – definieras som det totala antalet TH + nervceller som räknas i alla optiska disectors av en hjärna avsnitt.
Obs: Höjden av den optiska disector (h) i förhållande till den uppmätta tjockleken på området (t) ingår i ekvationen. Det område provtagning bråket (asf) definieras som andelen av området (A) av optisk disector (en optisk disector) ramstorlek inom rutnätet (x, y steg) fyrkantig storlek (en optisk disector/A x, y steg) ( figur 3b), och avsnitt provtagning bråkdel (ssf) definieras som andelen av sektioner av hela seriellt skär hjärnan:
att säkerställa högkvalitativa kvantitativa uppskattningar, friktionskoefficienten fel (CE) bör vara lägre än 0,10. Fastställa de CE med hjälp av formeln av Keuker et al., 2001 10:
- för beteendetester uppskattning av antalet cell inom SN av varje mus, infoga anges information om det totala antalet genererade serie per mus, höjden av den optiska disector, x, y område av den optiska disector (en optisk disector, i µm 2), x, y område av grid-torget (x, y steg i µm 2), och medelvärdet mätt tjockleken på området (i µm) i gula rutor med hjälp av den " beräkning av cell count.xlsx " kalkylbladsfil ( figur 6b och kompletterande fil ).
- Analysera varje SN avsnitt från samma djur, som beskrivs i steg 5.
- Infoga cell räknas för varje optisk disector i grå rutor, varje rad hänvisar till ett SN avsnitt, med hjälp av den " beräkning av cell count.xlsx " kalkylbladsfil (Kompletterande fil).
Anmärkning: Antalet beräknade cellen och den beräknade CE skildras i de blå rutorna ( figur 6b).
6. Uppskattning av antalet celler med hjälp av en kommersiellt tillgänglig Stereology System
- Start uppskattning av dopaminerga SNpc cell nummer genom att klicka på " sonder " → " optisk naftafraktioneringskolonn arbetsflöde " att öppna den optiska naftafraktioneringskolonn Arbetsflödet fönster.
Obs: Ett nytt fönster kommer att ta reda på om en ny serie SN kommer att räknas. - Startar en ny serie av TH + SN avsnitt genom att klicka " starta ett nytt ämne " i popup-fönstret.
- Går igenom de olika stegen i arbetsflödet för optisk naftafraktioneringskolonn. Ställa in motivet i det första steget. För detta, infoga prövaren ' s namn, ämnet ' s namn (SN-gruppen), och annan hjälpsam information. Sätt antalet sektioner att räkna för denna SN. Infoga tjockleken på de skurna vävnadssnitt. Infoga avsnittet intervall, som är fyra i detta fall. Infoga slumpmässigt bestäms avsnittsnummer till att börja med.
- i det andra steget, Ställ mikroskopet till låg förstoring (2 X mål) och välj " 2 X Mag linsen " från menyn.
- i steg 3, spåra regionen av intresse med vänster MUSKNAPP, vilket är SNpc, som beskrivs av Baquet et al., 2009 17.
- Ställ in mikroskopet på hög förstoring i steg 4. För detta, ändra målet till 100 X och välj " 100 X Mag lins " från rullgardinsmenyn.
- Mäta tjockleken monterade i steg 5 av fokus längst upp och längst ned i avsnittet.
- i steg 6, definiera counting ramstorleken som 50 x 50 µm, det är storleken på den optiska disector (x, y).
- i steg 7, ange storleken på rutnätet systematisk slumpmässig provtagning (SRS) som 130 x 130 µm.
- Ange en säkerhetszon på 3 µm i steg 8.
- Spara inställningarna i steg 9.
- Räknas slutligen TH + dopaminerga cellerna i varje av de optiska disectors inom rutnätet SRS i steg 10 av optiska naftafraktioneringskolonn arbetsflödet. För detta, starta genom att klicka på den " Counting " knappen.
- Efter avslutad ett avsnitt, klicka på den " påbörja nästa avsnitt " knappen för att starta arbetsflödet optisk naftafraktioneringskolonn i avsnittet nästa SN i samma SN serie.
- När den sista SN-delen av en SN-serien har kvantifierats, klicka på " jag ' ve färdig Counting. "
- Klicka på den " Visa resultat " knappen för att visa resultaten av provtagningen som stereology.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Använda denna metod, det uppskattade antalet TH + dopaminerga nervceller i rätt SN varierade mellan 7,363 och 7,987 celler och i vänster SN, mellan 7,446 och 7,904 celler. Således var det genomsnittliga antalet dopaminerga neuron (± SEM) 7,647 ± 83 celler för rätt SN och 7,675 ± 66 för vänster SN. Den beräknade CE för varje djur var lägre än 0,08 (intervall: 0,073-0.079) (figur 7). För att säkerställa jämförbarheten av denna metod med kommersiellt tillgängliga och specialiserade stereology system, kvantifierades också SN cell nummer med stereology setup (figur 8). Parametrar som räknar: stödrastrets storlek, 130 x 130 µm; Counting ram, 50 x 50 µm, säkerhetszon, 3 µm. sektioner analyserades med en 100 x / 1.25 numeriska bländaröppningen mål på BX53 Mikroskop. En uppskattad befolkning på TH + SN nervceller med genomsnittlig snittjockleken varierade från 7,067 till 8,105 celler/SN och 7 164 till 8,015 celler/SN på höger och vänster sidor, respektive. Neuronala medeltalet beräknades som 7,535 ± 155 för rätt SN och 7,699 ± 128 celler för vänster SN. Gundersen CE (m = 1) var ≤0.08 i varje SN kvantifieras (figur 7). Statistisk analys använder parat Students t-test visade inte några signifikanta skillnader mellan TH + cell räkningarna av de två metoderna i höger eller vänster SN (menar ± SEM; höger: t (5) = 0.9524, P > 0,05; vänster: t (5) = 0.2928, P > 0,05) (figur 7 ).
Figur 1. Representativa bilder av mus SN färgas för dopaminerga neuron.
(a) en översikt över en representant mus SN visas i den övre panelen. Observera det lilla hålet i den övre delen av rätt hjärnstammen som markerar till höger. Högre förstoring av infällt (svarta lådan) skildrar TH + dopaminerga neuron. (b) en serie av TH-färgade SN avsnitt visas, som täcker hela musen SN från rostralt till stjärtfenan. (c) varje avsnitt avgränsas från avsnittet i följd med 120 µm. skala barer: en, övre panel, 500 µm; nedre panelen, stor bild, 100 µm, nedre panelen, infälld, 50 µm; b, 500 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2. Förvärv av bilder för beteendetester analys med hjälp av avbildningsprogrammet.
(a) röd pil: öppna fönstret förvärv; grön pil: Ange den binning till ”2”. blå pil: Visa live-avbilden. (b) öppnas ett nytt fönster som visar live-avbilden (röd pil). (c) röd pil: Välj menyn ”scenen”; grön pil: Välj alternativet ”Skanna Slide”; blå pil: Markera alternativet ”Skanna Slide”; svart pil: definiera det övre vänstra hörnet. (d) svart pil: definiera det nedre högra hörnet. (e) röd pil: Välj menyn ”Z-serien”; grön pil: Kontrollera ”Z-planet serien”; blå pil: starta den ”Visa topp Offset” att söka efter toppen av avsnittet. (f) röd pil: Klicka på ”sluta Visa Top” att definiera upp i avsnittet; grön pil: starta ”Visa botten Offset” att söka efter den längst ned i avsnittet. (g) röd pil: Klicka på ”sluta Visa botten” att definiera den längst ned i avsnittet. (h) röd pil: subtrahera 3 µm vakten zon från den ”Top Offset” och för in resultatet i ”Top Offset” facket. (i) röd pil: subtrahera 13 µm från numret ”Top Offset” och för in resultatet i ”nedre Offset” facket; grön pil: definiera 14 steg som motsvarar till en z-planet tjocklek 13 µm; blå pil: definiera en storlek på 1.00 µm som motsvarar till en 1 µm avståndet mellan på varandra följande bilder. (j) röd pil: Markera katalog för att spara filen; blå pil: Klicka på ”sekvens” för att starta förvärvet av bilder. (k) röd pil: Klicka på ”behandling”, kontrollera följande parametrar: grön pil: ”alla plan”; blå pil: ”sekvens”; svart pil: ”Montage”; grå pil: ”sömmar”; lila pil: snabb. (l) Klicka på den gula pilen att börja sy bilder. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Figur 3. Bearbeta bilderna för beteendetester analys.
(a) ett exempel stack bild tagen från en mus SN. (b och c) Efter randomiserad införande av ett rutnät som överliggande SN (turkosa linjer, b), beskrivs SN i ett andra steg (blå linje, c). (d) en optisk disector placeras i SN stack bilden. (e) sex på varandra följande fokal plan inom SN stack bilden täcker 13 µm totala i z-planet. Skala barer: a-d, 100 µm, e, 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4. Sekvens av beteendetester bedömning använder ImageJ.
(a) röd pil: Klicka på ”Arkiv” → ”öppna” för att öppna en stack bild. (b) röd pil: Klicka på ”analysera” → ”ange skala”. (c) röda pilar: definiera parametrar för ”avståndet i pixlar”, ”kända avstånd” och ”enhet av längden”. (d) röd pil: Välj ”Plugins” → ”Grid”. (e) röd pil: Välj ”linjer”; grön pil: Kontrollera ”Random Offset”; blå pil: Infoga storlek på rutnätet i µm2. (f) röd pil: Klicka på ”bild” → ”typ” → ”RGB färg”. (g) röd pil: Välj ”penselverktyget”; grön pil: definiera ”borste bredden” som 11. (h) röd pil: börja att omringa den SNpc. (i) röda pilarna skildra den inringade SNpc (j) röd pil: Klicka på ”analysera” → ”ange skala” och ta bort den skala (k) genom att klicka på ”Klicka på att ta bort skala”, skildras av röda pilen. Observera ändringen från µm (k, grön pil) till pixlar (l, röd pil). (m) ta en skärmdump (röd pil pekar mot skärmdumpen) och (n) öppna filen Skärmdump bild med ImageJ. (o) röd pil: Klicka på ”Point”. (p) röd pil: infoga en borste bredd 25. (q) den röda pilen visar de markerade-rutor som kontaktar SNpc. (r) den röda pilen pekar på det övre vänstra hörnet av en-ruta som innehåller en del av SN. Genom att sätta markören vid denna punkt, x, y-koordinater för ”optiska disector position” (steg 4) mäts och infogas i mallen ”optiska disector position.xlsx” (s, röd pil). (t) röd pil: Välj ”Plugins” →”Makron” → ”redigera”. (u) röd pil: Välj filen ”opt_dis_grid.txt”. Ett nytt fönster öppnas (v). Infoga den ”usergrid”, storlek i pixlar (v, röd pil) och x, y-koordinater (v, grön pil). (w) köra makrot ”opt_dis_grid.txt” (röd pil). En optisk disector visas i mitten av tidigare definierade grid-torget (röd pil), (x) . (y) röd pil: Klicka på ”Plugins” → ”Cell disk”. (z) initialisera räknaren Cell (röd pil) och välj en markörtyp (grön pil). Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Figur 5. Placering av den optiska disector.
(a) Illustration av den optiska disector som används för opartisk stereology. Den optiska disector är en 3-dimensionell kub. Tre schematiska celler är synliga inom den optiska disector. Beteendetester reglerna för kvantifiering av celler indikerar att celler att röra röd märkt sidorna av den optiska disector är uteslutna (röda blodkroppar), medan celler som kontaktar den gröna märkta sidor ingår i cell räknar (gröna celler). (b) en optisk disector placeras i varje rutnät-torget som kommer i kontakt med SN. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Beräkning av optiska disector position och uppskattning av antalet celler.
(a) ett exempel beräkningen utförs för positionering av den optiska disector. (b) ett exempel på beräkning av totala cell nummer. Numrerar av kvantifierade celler infogas i den grå rutor, medan parametrarna för beteendetester kvantifiering infogas i de gula rutorna. Den uppskattade mobilnummer och CE-visas i de blå rutorna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7. Jämförelse av cell räknar parameter.
(a) jämföra beräknat TH + cellantal till höger och vänster musknapp SN erhålls från den beskrivna beteendetester metoden med de uppgifter som erhållits från analys med hjälp av kommersiellt tillgängliga stereology systemet visade inte några signifikanta skillnader. En detaljerad lista över de erhållna uppgifterna rätt (b) och vänstra (c) SN ges med uppskattade cell nummer per djur, antalet celler som faktiskt räknas, antalet sektioner räknas och antalet provtagningsställen (dvs. antalet rutor räknas) för båda metoderna. Värdena i stapeldiagram är det medelvärde ± SEM data från 6 möss. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8. Kvantifiering av celler med kommersiellt tillgängliga stereology systemet.
(a-b) Skissera av SN dras och (c) placerar av den optiska disectors är automatiskt fastställas. (d-e) Varje optisk disector analyseras för antalet celler genom att fokusera längs z-planet. Sex på varandra följande fokal plan inom SN visas. De röda och gröna linjerna motsvarar den optiska disector. Skala barer: a-d, 100 µm, e, 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Kompletterande fil 1. opt_dis_grid.txt Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Kompletterande fil 2. Optiska disector position.xlsx vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Kompletterande fil 3. Beräkning av cell count.xlsx vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Stereology börjar med vävnad behandling. Seriell styckning av SN vävnad måste utföras noga för att förhindra förlust av sektioner under beteendetester analys. Dessutom är ett viktigt steg att markera en halvklotet för att skilja höger från vänster SN när du utför stereology. Att placera ett litet hål på den övre delen av hjärnstammen genereras de bästa resultaten i studien presenteras. Dessutom sedan arbetar med optisk naftafraktioneringskolonn metod krav att vävnaden är skuren i tjocka delar av ca 30-40 µm, i stället för de 5-10 µm oftare används i immunohistokemi, antikroppar och andra inkubation flytande vävnad penetration under immunhistokemisk färgning måste säkerställas, sådan som genom att använda ett rengöringsmedel.
Immunhistokemisk färgning för dopaminerga nervceller med såväl TH antikropp etiketter SN nervceller, som nervceller inom ventral tegmental området (VTA), som ligger medialt från SN, och nervceller i fältet retrorubral. En annan kritisk punkt när du utför stereology i SN är alltså kunskap om musen SN anatomi, eftersom SN nervceller inte kan visualiseras uteslutande av standard immunhistokemisk eller histologiska färgning. Istället erkännande av anatomiska landmärken, subthalamic kärnan, fältet retrorubral och VTA, är viktigt att fastställa hela omfattningen av SN17,18,19.
Bedömning av neuronala numret måste vara tillförlitliga och reproducerbara. Även om olika grupper använder kommersiellt tillgängliga stereology uppställningar, varierar av TH + dopaminerga SN nervceller i wt möss, tagna från olika publikationer, i nummer17,20. I Baquet et al., design-baserade beteendetester analys i 3 - 4 månad-gamla manliga och kvinnliga C57BL/6J wt möss använder en kommersiellt tillgänglig stereology system visade en uppskattad 8,716 ± 338 TH + dopaminerga SN nervceller (intervall: 7,546-9,869)17 . Däremot Smeyne et al. hittade färre TH + SN celler hos 9 - till 16-vecka-gammal C57BL/6J hanmöss som fått 0,9% saltlösning i.p., alltifrån 6 302 ± 262 celler till 6.861 ± 338 celler, använder en nyare version av samma stereology system20. Dock var den första författaren också sista författare i Baquet et al. papper, därför exklusive varierande erfarenhet som orsak till de olika resultaten. Dessa motstridiga uppgifter återspeglar behovet av en beteendetester kvantifiering metod som visar mindre variabilitet. Kontrollera tekniken för kvantifiering och den formel som används genom utfördes en jämförelse av resultaten av SN nummer celltal med den beskrivna metoden med en kvantifiering med hjälp av kommersiellt tillgängliga stereology setup. Statistisk analys visade inte några signifikanta skillnader när man jämför antalet dopaminerga neuron TH + till höger och vänster SN av wt möss fastställs med hjälp av båda teknikerna av cell kvantifieringen, vilket visar att denna metod är möjlig för den beteendetester uppskattning av SN nervceller i möss.
Den största fördelen med den beskrivna metoden är att det minskar de kostnader som vanligtvis förknippas med genomförandet av stereology tekniker för cell inventering. En andra fördel är att, för den beskrivna metoden, stack bilder av SN sparas och kan analyseras som helst (även samtidigt) med en annan utredare. Dessutom, förvärv och analyser av fluorescens bilder är möjligt med den här metoden eftersom gråskalebilder kan färgas med ”uppslagstabeller” i ImageJ. Det finns dock begränsningar för denna studie. Först, kvantifiering av antalet celler är mer tidskrävande (ca 50%) än kvantifiering med kommersiellt tillgängliga stereology systemet. Detta är främst på grund av två skäl: 1. stack bilder av SN måste tas och 2. beräkning av den optiska disector placeringen inom varje SN och beräkning av antalet beräknade celler och CE måste utföras manuellt med beräkningsmallar. Andra, åtminstone med systemet som är tillgängliga i vårt laboratorium, analys kan endast utföras på gråskalebilder på grund av stor arkivera storleken av färgbilder, som inte kunde behandlas av ImageJ. Detta kan utgöra ett problem om det finns ett behov av att kvantifiera två olika cellpopulationer samtidigt i en dubbel fläck. Det kan vara svårare att skilja två olikt färgade cellpopulationer i gråskalebilder. Därför, även om en motoriserad scenen (x, y, z plan) och motsvarande programvara finns i många laboratorier som arbetar med histologiska prover, förvaltning och kvaliteten på stacken bilder beror på Mikroskop mjukvaran och prestanda den anslutna datorn.
Det finns olika sätt att övervinna begränsningarna. Med hjälp av de beräkningsmallar vi utvecklat, kan programmering av makron för att automatisera några av de för närvarande manuellt utförda processerna minska fel eller felaktigheter under beteendetester bedömning och påskynda hastigheten av arbete. Dessutom bör med den pågående utvecklingen av ImageJ och andra bildhanteringsprogram, samt med ökande dator processorkraft, större bild filstorlekar inte utgöra ett problem i en nära framtid. Därför, analyser av ljusa fält färgbilder blir hanterbara med den beskrivna tekniken.
Den teknik som beskrivs är inte begränsad till analyser av TH + SN celler, men kan utökas för att analysera andra celltyper och hjärnregioner gnagare. Regionen av intresse anatomiska gränser måste fastställas för detta, och respektive färgningen måste utföras. Denna teknik kan dessutom anpassas till tjockare sektioner. För detta, måste förvärvet av stacken bilder anpassas till ger mer stack bilder. Till exempel om 40 µm tjock avsnitt krävs, monterad den faktiska tjocklek i avsnittet efter vävnad färgning måste bedömas för att fastställa nödvändiga höjden av den optiska disector. Subtrahera 6 µm (3 µm säkerhetszon på toppen och botten) från medelvärdet vävnad tjocklek och ta resultatet som höjden av den optiska disector.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
C. W. I. har suttit vetenskapliga styrelserna för Merz Pharmaceuticals, LLC och TEVA; har fått finansiering för resor från Ipsen, Merz Pharmaceuticals, LLC och Allergan, Inc.; och har fått talare arvoden från Merz, TEVA och Allergan, Inc. utanför det inlämnade arbetet. J. V. har fungerat som konsult i Boston Scientific, Medtronic och AbbVie och erhållit arvode från Medtronic, Boston Scientific, AbbVie, Bial, Allergan och GlobalKinetics utanför det inlämnade arbetet.
Acknowledgments
Författarna är tacksamma mot Keali Röhm, Louisa Frieß och Heike Menzel för deras teknisk experthjälp; att Helga Brünner för djurens vård; och att Chistopher S. Ward för generering och distribution av den optiska disector rutnät plugin för programmet ImageJ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paxinos mouse atlas | The Mouse Brain George Paxinos Keith B.J.FranklinCopyright @2001 by Academic Press CD Rom designet & created by Paul Halasz | ||
| brain matrix slicer mouse | Zivic Instruments | BSMAS 001-1 | |
| paraformaldehyde | Merck | 1040051000 | |
| sucrose /D(+) Saccharose | Roth | 4621.1 | |
| isopentane | Roth | 3927.1 | |
| glycerol | Merck | 1040931000 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 32205-1L | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| phosphate buffered saline ingredients: | |||
| sodium chloride | Sigma Aldrich | 31434-1KG-R | |
| potassium dihydrogen phosphate | Merck | 1048731000 | |
| di-sodium hydrogen phosphate dihydrate | Merck | 1065801000 | |
| potassium chloride | Merck | 1049360500 | |
| normal goat serum | Dako | X0907 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A4503-100G | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ml | detergent |
| 3,3-Diaminobenzidine-tetrahydrochlorid/DAB tablets 10mg pH 7.0 | Kem En Tec | 4170 | |
| H2O2/ Hydrogen peroxide 30% | Merck | 1072090250 | |
| avidin/biotin reagent | Thermo Scientific | 32050 | Standard Ultra Sensitive ABC Staining Kit, 1:100 |
| rabbit anti mouse tyrosine hydroxylase antibody | abcam | Ab112 | 1:1000 |
| biotinylated goat-anti-rabbit IgG H+L | vector laboratories | BA-1000 | 1:100 |
| StereoInvestigator version 11.07 | MBF | ||
| BX53 microscope | Olympus | ||
| Visiview | Visitron Systems GmbH | 3.3.0.2 | |
| Axiophot2 | Zeiss | ||
| ImageJ software | NIH | Version 4.7 | |
| Tissue-TEK OCT | Sakura | 4583 | |
| dry ice | |||
| grid overlay plugin | Wayne Rasband | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html | |
| cell counter plugin | Kurt de Vos | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html). | |
| optical disector macro | Christopher Ward | ||
| C57Bl/6N male mice | Charles River, Germany | ||
| SuperFrost Plus coated object slides | Langenbrinck, Germany | ||
| 25G needle Microlance 3 | BD | 300400 | |
| REGLO Analog Infusion pump | Ismatec | ISM 829 | |
| StereoInvestigator system | StereoInvestigator version 11.07 | ||
| BX53 microscope | BX53 microscope | ||
| self-assorted stereology | Visiview | ||
| Axiophot2 | Axiophot2 |
References
- Ip, C. W., et al. AAV1/2-induced overexpression of A53T-alpha-synuclein in the substantia nigra results in degeneration of the nigrostriatal system with Lewy-like pathology and motor impairment: a new mouse model for Parkinson's disease. Acta Neuropathol Commun. 5 (1), 11 (2017).
- Ip, C. W., Beck, S. K., Volkmann, J. Lymphocytes reduce nigrostriatal deficits in the 6-hydroxydopamine mouse model of Parkinson's disease. J Neural Transm (Vienna). 122 (12), 1633-1643 (2015).
- West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Anat Rec. 231 (4), 482-497 (1991).
- Schmitz, C., Hof, P. R. Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience. 130 (4), 813-831 (2005).
- Tieu, K. A guide to neurotoxic animal models of Parkinson's disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 1 (1), e009316 (2011).
- Abercrombie, M. Estimation of nuclear population from microtome sections. Anat Rec. 94, 239-247 (1946).
- Rose, R. D., Rohrlich, D. Counting sectioned cells via mathematical reconstruction. J Comp Neurol. 263 (3), 365-386 (1987).
- Weibel, E. R., Gomez, D. M. A principle for counting tissue structures on random sections. J Appl Physiol. 17, 343-348 (1962).
- West, M. J. Design-based stereological methods for counting neurons. Prog Brain Res. 135, 43-51 (2002).
- Keuker, J. I., Vollmann-Honsdorf, G. K., Fuchs, E. How to use the optical fractionator: an example based on the estimation of neurons in the hippocampal CA1 and CA3 regions of tree shrews. Brain Res Brain Res Protoc. 7 (3), 211-221 (2001).
- Mouton, P. R., et al. The effects of age and lipopolysaccharide (LPS)-mediated peripheral inflammation on numbers of central catecholaminergic neurons. Neurobiol Aging. 33 (2), e427-e436 (2012).
- Barreto, G. E., Sun, X., Xu, L., Giffard, R. G. Astrocyte proliferation following stroke in the mouse depends on distance from the infarct. PLoS One. 6 (11), e27881 (2011).
- Robinson, S., et al. Microstructural and microglial changes after repetitive mild traumatic brain injury in mice. J Neurosci Res. 95 (4), 1025-1035 (2017).
- Paxinos, G., Franklin, K. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (2001).
- Rasband, W. Grid_Overlay.java. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html (2010).
- De Vos, K. cell_counter.jar. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html (2010).
- Baquet, Z. C., Williams, D., Brody, J., Smeyne, R. J. A comparison of model-based (2D) and design-based (3D) stereological methods for estimating cell number in the substantia nigra pars compacta (SNpc) of the C57BL/6J mouse. Neuroscience. 161 (4), 1082-1090 (2009).
- Fu, Y., et al. A cytoarchitectonic and chemoarchitectonic analysis of the dopamine cell groups in the substantia nigra, ventral tegmental area, and retrorubral field in the mouse. Brain Struct Funct. 217 (2), 591-612 (2012).
- German, D. C., Manaye, K. F. Midbrain dopaminergic neurons (nuclei A8, A9, and A10): three-dimensional reconstruction in the rat. J Comp Neurol. 331 (3), 297-309 (1993).
- Smeyne, R. J., et al. Assessment of the Effects of MPTP and Paraquat on Dopaminergic Neurons and Microglia in the Substantia Nigra Pars Compacta of C57BL/6 Mice. PLoS One. 11 (10), e0164094 (2016).
