Summary
עבודה זו מציג עבור הערכת stereological לא משוחדת של מספרים דופאמינרגיים וכולינרגיים פרוטוקול צעד אחר צעד העכבר הסובסטנציה ניגרה באמצעות מיקרוסקופ רגיל ציוד (קרי, מיקרוסקופ אור, טבלה אובייקט ממונע (x, y, z המטוס), ותוכנה הציבור לניתוח תמונה דיגיטלית.
Abstract
במחקר פרקינסון ניסויים פרה-קליניים, ניתוח של דרכי nigrostriatal, לרבות כימות של דופאמין אובדן נוירון בתוך הסובסטנציה ניגרה, חיוני. להעריך את מספר נוירון וכולינרגיים הכולל, לא משוחד stereology בשיטת fractionator אופטי הוא נחשב כיום תקן הזהב. בגלל התיאוריה מאחורי השיטה fractionator אופטי מורכבת, וגם בגלל stereology קשה להשגת ללא ציוד מיוחד, מספר מערכות זמינים מסחרית stereology מלאה הכוללים את התוכנה הדרושה קיימות גרידא תא לספור את הסיבות. מאז רכישת מלכודת stereology המקצועית אינה תמיד אפשרית, מסיבות רבות, דו ח זה מתאר שיטה עבור הערכת stereological של תאים עצביים דופאמין שנחשב שימוש בציוד מיקרוסקופ רגיל, כולל מיקרוסקופ אור, מוטורי בטבלת האובייקטים (x, y, z המטוס) עם תוכנת הדמיה, מחשב לצורך ניתוח. הסבר צעד אחר צעד כיצד לבצע כמת stereological בשיטת fractionator אופטי, ונשאר ניתנים הקבצים מחיישנים לחישוב משוער תא ספירת. כדי להעריך את הדיוק של שיטה זו, בוצעה השוואה לנתונים המתקבלים מנגנון stereology זמינים מסחרית. מספרי הטלפון הנייד דומות נמצאו באמצעות פרוטוקול זה המכשיר stereology, ובכך הממחיש את מידת הדיוק של פרוטוקול זה עבור stereology לא משוחדת.
Introduction
כימות של מספר דופאמינרגיים הוא מרכזי במחקר פרקינסון קליניים כדי לקבוע את מידת הקשורים ניוון מוחיים בתוך הסובסטנציה ניגרה (SN)1,2. הערכת stereological מוטים ממספר תאים באזור של הריבית נחשבת4,3,5תקן הזהב.
לפני כניסתו של stereology מוטים, המספר של נוירונים בחלקים הוערך על-ידי מניפולציה תא שנספרו פרופילים לתיקון ההסתברויות משתנה כי נוירונים נכנס מראה במקטע. אחת השיטות הנפוצות ביותר היה התיקון של כימות ספירת מתוארת על ידי אברקרומבי6. שיטה זו ניסה לקחת בחשבון כי התאים ניתן לכמת יותר מפעם אחת אם נמצאו שברי באותו התא בסעיפים דק סמוכים. לכן, אברקרומבי, מחברים אחרים שנוצרו משוואות נדרש הנחות לגבי הצורה, הגודל והכיוון של תאים ספרתי7,8. עם זאת, בהנחות אלו היו בדרך כלל לא הבין והוביל לכן שגיאות שיטתית של התפצלות ממספר התא בפועל (קרי, הטיה). יתר על כן, הטיה לא יופחת ע י דגימה נוספות3.
עבור הערכת stereological של מספרי הטלפון הנייד באמצעות את fractionator אופטי, עקרונות מתמטיים חלות ישירות מעריכים את מספרי הטלפון הנייד ישירות באמצעי אחסון מוגדרים, תלת-ממדי. היתרון של שיטה זו הוא כי זה אינו כרוך הנחות לגבי הצורה, הגודל והכיוון של התאים התפקדות. לפיכך, מספרי הטלפון הנייד המשוער קרובים יותר ערכי אמת, להתקרב ככל גודל המדגם (קרי, לא משוחד)3. כי רבים לציית לכללים בעת שימוש stereology כדי לשמור את השיטה לא משוחד, פותחו מערכות מוכנות לשימוש מסחרי stereology (לסקירה, ראה שמיץ והוף, 20054). Stereology מתמחה במערכות ליישם מבוססי עיצוב stereological שיטות עם אפריורי שהוגדרו הגששים וערכות דגימה עבור הערכות stereological להוביל העצמאות צורה, גודל, התפוצה המרחבית, כיוון תאים להיות שנותחה4,9. עם זאת, מערכות stereology זמינים מסחרית יקרים; זה עלול להגביל יישום במחקר חדש.
מטרת מחקר זה הייתה לפתח טכניקה שמיש עבור הערכת stereological מבוסס על עיצוב של דופאמין תא ספירת העכבר SN, כשנוקטים בשיטה fractionator אופטי והשימוש בציוד מיקרוסקופ רגיל (קרי, אור מיקרוסקופ תוכנה מיקרוסקופ רגיל, ממונע x, y, z הבמה). בשביל זה, מוצג מדריך צעד אחר צעד על כיצד לעבד רקמת מוח העכבר וכיצד להעריך את מספרי הטלפון הנייד SN באמצעות מבוססי עיצוב stereology לא משוחדת. יתר על כן, תבניות עבור חישוב המספרים תא המשוער ואת המקדמים של שגיאה (CE) הינם מסופקים.
השיטה המתוארת כאן אינה מוגבלת לניתוח של SN, אך ניתן להתאים לשימוש באזורים שהוגדרו מבחינה אנטומית אחרים של המוח עכבר או חולדה. למשל, stereology מוטים שימש כדי להעריך את מספרי הטלפון הנייד עצביים בהיפוקמפוס10 , לוקוס coeruleus11. בנוסף, סוגי תאים שאינם הנוירונים, כגון האסטרוציטים12 ו מיקרוגלייה13, יכול להיות מוערך גם כן. לכן שיטה זו יכולה להיות שימושית למדענים מי מתכוון ליישם stereology מוטים במחקר שלהם אבל הם לא מוכנים להשקיע הרבה כסף כדי לרכוש מערכת stereology.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הנחיות הבינלאומי, הלאומי, ו/או מוסדיים החלים על טיפוח ועל השימוש בבעלי חיים היו במעקב. הפרוטוקול שאושר על ידי רשויות מקומיות-Regierung פון Unterfranken, וירצבורג, גרמניה-
1. אימונוהיסטוכימיה ועיבוד רקמה
- Euthanize עכברים עם CO 2 או אחרת אישרה שיטה.
- Perfuse 6 בן שבוע 12 C56Bl/6N עכברים זכרים transcardially עם 10 מ"ל תמיסת 0.1 M באגירה פוספט (PBS) באמצעות מחט 25-G ומשאבת אינפוזיה, ואחריו 70 מ של 4% paraformaldehyde (PFA) ב- PBS 0.1 M.
התראה: כדורגלן הוא רעיל, אלרגניים, מסרטנים. - לנתח את מוח העכבר בתוך המטוס הילתית עם מילות הקסם מטריקס המוח-האזור של +0.74 מ מ Bregma (באיור 25, Paxinos, פרנקלין העכבר מוח אטלס 14).
- לשים את החלק הגבי של המוח, כולל את SN, 4% מחברים ב- PBS 0.1 M עבור 1 י ב 4 ° C עבור טבילה-קיבעון.
- להחליף את כדורגלן לפתרון 30% סוכרוז/0.1 מול PBS להגנה-הקפאה, תקופת דגירה של אחר d 2-4 מעלות צלזיוס
- לשים החלק הגבי של המוח לתוך cryomold מלא עם טמפרטורה אופטימלית חיתוך (אוקטובר) מורכבים, לאט הקפאת הרקמה ב איזופנטאן קרח יבש מקורר נוזל.
התראה: קרח יבש הוא קר מאוד (-78 מעלות צלזיוס); השתמש ציוד מגן אישי (PPE), כולל כפפות, תוך כדי עבודה עם קרח יבש. קרח יבש מתאדה CO 2; לכן, לעבוד תחת ברדס fume. - באופן סדרתי לחתוך 30-מיקרומטר הקפאה-מקטעים בתוך המטוס הילתית ולאסוף את הסעיפים, החל מ- 2.46 מ מ Bregma (איור 51, Paxinos, פרנקלין העכבר מוח אטלס 14) ומסתיים בנקודת 4.04 מ מ Bregma (איור 64, Paxinos, פרנקלין העכבר מוח אטלס 14).
- לאחסן ארבע סדרות צינורות אשר מלאים cryoprotectant (גליצרול 30% ethoxyethanol 30%, 40% PBS) ב-20 ° C. במהלך ההליך אופטים, לסמן את האונה הימנית על-ידי ניקב חור קטן לתוך האזור העליון של גזע המוח.
- עבור נוגדן, בחר סדרה אחת של מקטעים לכל העכבר. Preincubate לתרשים מקטעים עבור h 1 10% עז נורמלית בסרום (דטרגנט NGS)/2% BSA/0.5% ב- 0.1 מול PBS ב מטרף. דגירה הסעיפים עם ארנב אנטי-עכבר טירוזין hydroxylase (TH; 1:1,000 דילול) נוגדן מדולל ותחטא NGS/2% BSA/0.5% 2% ב- 0.1 מול PBS בן לילה ב-4 מעלות צלזיוס
- החל משני נוגדנים נגד הארנב Igs (דילול מטריים) עבור 2 h בטמפרטורת החדר, ואחריו ריאגנט אבידין/ביוטין (דילול מטריים). דגירה, כתם עם 3,3-diaminobenzidine-tetrahydrochloride (DAB) ו- H 2 O 2. הר הסעיפים לאחר צביעת אותם על אובייקט מצופה שקופיות.
הערה: TH + נוירונים דופאמין SN מוצגים איור 1a. על ידי צביעת סדרה אחת, ממוצע של 13 סעיפים SN, המשתרעת rostral לחלקים סימטרית של SN pars compacta (SNpc), reticulata, מוכתמים לכל חיה ( איור 1b). המקטעים מופרדים על-ידי 120 מיקרומטר (1/4 סדרות) ( איור 1 ג).
התראה: DAB הוא קרצינוגן חשד. . זה רעילים על ידי שאיפת והתקשרות. להשתמש עיקרון השוויון הפוליטי בעת עבודה עם DAB.
2. רכישת תמונות
- immunohistochemically TH ללכוד צבעונית מקטעים SN דיגיטלית באמצעות תוכנת הדמיה הוא מצמידים מיקרוסקופ. בנפרד לנתח כל מקטע של סדרה אחת.
- להשתמש באפשרות שקופית סריקה של התוכנה הדמיה. לשמור את הקובץ בתבנית TIFF לתמונות באיכות גבוהה (איור 2).
הערה: רזולוציית התמונה הוא 312 פיקסלים לכל ס מ. - העיתונות " ידרשו " כדי לפתוח את החלון רכישה (איור 2 א).
- להגדיר את binning " 2 " לתמונות בגווני אפור-
הערה: רכישת תמונות בגווני אפור במקום תמונות צבעוניות מקטין את גודל קובץ התמונה הסופית מחסנית (איור 2 א). - לחץ על " להראות חיים " בחלון רכישה כדי לפתוח חלון חדש המציג את התמונה בשידור חי של המקטע (איור 2 ו- b).
- לחץ על " הבמה " בחלון רכישה. בחר " לסרוק שקופיות " התפריט הנפתח ואבדוק תיבת (איור 2 ג).
הערה: פעולה זו מאפשרת רכישה ומכירה היישור של תמונות SN מאוד מוגדלת (630 X הגדלה) ב- x, y-המטוס, כמו גם רכישת תמונות בערימה עם המרחק בין תמונות רצופות של 1 מיקרומטר ב z-המישור, המכסים מגוון הכולל של 13 ממוצע מ - בחר המטרה X 2.5 כדי לחפש SN.
- שינוי המטרה כדי 63 x.
- להגדיר את הפינה השמאלית העליונה (השמאלית-עליונה) (איור 2 c) ואת הפינה הימנית התחתונה (תשמע לי) (איור דו-ממדי) של המקטע על-ידי לחיצה על " סט. "
- לחץ על " Z-סדרת " לבדוק " מסדרת מטוסי ה-Z " תיבת (איור 2e). אתרים
- לקבוע עובי הנטען בפועל של הסעיפים בלספור שנבחרו באקראי שלוש לכל סעיף שימוש בתוכנת הדמיה. לשם כך, לחץ על " תצוגה העליון לקזז " כדי להגדיר את החלק העליון של המקטע (איור 2e) ולאחר מכן לחץ על " להפסיק Top View " (2f איור). לאחר מכן, לחץ על " תצוגה התחתון לקזז " (איור 2f) ולאחר מכן לחץ על " התחתון נוף להפסיק " (איור 2 g). תרשום את העובי של המקטע.
- לחסר 3 מיקרומטר (אזור משמר) מלמעלה לקזז והקלד את התוצאה לתוך החריץ היסט העליונה (איור 2 h). להחסיר 13 מיקרומטר (גובה של disector אופטי) של המספר הנגדי העליונה והקלד את התוצאה לתוך החריץ היסט התחתון (איור 2i). בחר את הפרמטרים הבאים: שלבים, 14; גודל, 1.00 (איור 2i).
הערה: זה תואם את עובי במישור-z של מיקרומטר 13, עם מרחק 1-מיקרומטר בין תמונות רצופות. - בחר את הספריה כדי לשמור את הקובץ (איור 2j).
- לחץ על " רצף " להתחיל הרכישה (איור 2j).
- לחץ על " עיבוד " ובחר את הפרמטרים הבאים: " בכל המישורים, " מן " רצף; " " מונטאז; " ו " מהר " ו " Stitching " תיבות, עם חפיפה תמונה של 10% (איור 2 k). מתחילים לתפור את התמונות על ידי לחיצה על " להתחיל ".
הערה: פעולה זו תיצור תמונות בערימה לניתוח (איור 2 l, איור 3a -e).
3. רצף של הערכה Stereological
- לבצע הניתוח של SN מחסנית תמונות באמצעות ImageJ NIH את גירסת התוכנה 4.7.
- להוריד שני התוספים הנדרשים מאתר האינטרנט ImageJ.nih.gov: " רשת כיסוי " תוסף 15 ו " תא מונה " תוסף 16. להתקין שני תוספים כפי שמתואר.
- להערכת stereological מוטים, להגדיר את הפרמטרים הספירה כדלהלן: גודל רשת, 130 x 130 מיקרומטר; ספירת מסגרת, 50 x 50 מיקרומטר; וגובה אופטי disector, 13 & #181; מ
- פתחו את התמונה על ידי לחיצה על " קובץ " → " פתוח " (איור 4a) להגדיר את קנה המידה של התמונה באמצעות " ניתוח " → " לקבוע קנה מידה " הפקודה (איור 4b). בשלב זה, לשנות את גודל מוגדר מ פיקסלים מיקרומטר (איור 4 ג).
הערה: לתמונות שנותחה, 425 פיקסלים מתאימה 100 מיקרומטר. - בחר " תוספים " → " רשת " → " סוג רשת: קווי " פקודה כדי להוסיף באופן אקראי ברשת. בדוק " לקזז אקראי " התיבה. מגדירים את הגודל של ריבוע אחד בתוך הרשת (רשת-ריבוע) 130 מיקרומטר x 130 מיקרומטר = 16,900 מיקרומטר 2 ( 3b איור , איור 4 d ו- e)-
- שינוי תמונה סוג מ 16-bit צבע RGB (לחץ על " תמונות " → " סוג " → " צבע RGB ") (איור 4f). לאתר של SNpc, כפי שתואר על ידי. Baquet et al. 17. להקיף את SNpc עם " הכלי מברשת צבע " (מברשת רוחב: 11) ( איור 3 c ו- g איור 4 -אני).
- בטל " לקבוע קנה מידה " הפקודה על-ידי לחיצה " ניתוח " → " לקבוע קנה מידה " → " לחץ כדי להסיר מידה " (איור 4j -l) כדי לאפשר את הביצועים של החישובים בפיקסלים אלא מאשר מיקרומטר.
- לעשות צילום מסך (איור 4 מ'), לשמור את קובץ התמונה ולפתוח את הקובץ החדש עם ImageJ (איור 4n). בחר " נקודת " (איור 4o) ורוחב מברשת של 25 (איור 4 p). סמן כל ריבוע הרשת את אנשי הקשר SN עבור מיקום של disector אופטי (4q איור). בצע ניתוח של מספר תאים כל disectors אופטי אשר מותאמים באופן מלא או חלקי בתוך SN מחולקת לרמות את.
- בחר רשת-ריבוע אחד הכולל חלקים SN. מידה לפינה השמאלית העליונה של הכיכר עם הסמן ב- ImageJ להגדרת x ו- y מרכזת להתחיל עם (איור 4r).
הערה: קואורדינטות יתווסף עבור disector אופטי מיצוב באמצעות " disector אופטי עמדה " (איור 4s), כמתואר בשלב 4. - לחשב את המיקום disector אופטי באמצעות תבנית גיליון אלקטרוני רשאית, " אופטי disector המיקום, " כפי שמתואר בשלב 4.
- לכייל את disector אופטי (מאקרו שנכתב על ידי כריסטופר ס וורד, קובץ משלים) על ידי לחיצה על " תוספים " → " מאקרו " → " לערוך " (איור 4t), לפתוח " opt_dis_ grid.txt " קובץ (איור 4u) ולהגדיר את הגודל " usergrid " בפיקסלים שמתאים עם x, y ממד של disector אופטי (איור 4v). בחר בגודל של 50 מיקרומטר x 50 מיקרומטר, כך הגודל של צד אחד של usergrid מוגדר 212.5 פיקסלים (50 x 4.25 פיקסלים).
- לקבוע את המיקום של disector אופטי בתמונה המחסנית על-ידי הוספת הקואורדינטות ImageX ו ImageY המגדירים במרכז disector אופטי (איור 4v). להפעיל את המאקרו (" מאקרו " → " להפעיל מאקרו ") (איור 4w).
הערה: הרשת ייעלמו מהתמונה מחסנית ( איור תלת-ממד ואיור 4 x). Disector אופטי יישמר בעת העברת במישור z-( איור 3e, איור 4 x). - בחר " תוספים " → " תא מונה " כדי להפעיל את התוסף תא מונה (איור 4y). אתחל את המונה התא ובחר סוג סמן (איור 4z). להגדיל התמונה (לחץ על " + ") ולבצע את ההערכה stereological של המספרים תא בהגדלה גדולה של 200%.
- Perikarya עצביים וכולינרגיים זיהוי על ידי מעוגל או אובאלית צורה ותא גודלם ( איור 1 א'). לכמת את מספר התאים באמצעות כללי stereological.
הערה: מאחר disector אופטי קוביה תלת-ממדי ( איור 5a), מגדירים את אי-הכללה של הצדדים כמו הקדמי, שמאל, ואת הצדדים העליון של הקוביה (האדום). לכן, דון ' TH + t ספירת תאים שמגיעים במגע עם הקו האדום (קבלה ושמאלה) או הצד העליון. להוסיף את התוצאות של ספירת קובץ הגיליון האלקטרוני מוכן רשאית, " חישוב בספירת תאי " (שלב 5). - על פי התמונה SN, לחשב את הרשת-הכיכר הבאה שבה ניתן למקם את disector אופטי עבור הרוזן התא הבא, באמצעות x, y צעדים הגודל של הרשת שמעליה ( איור 5b) ו " אופטי disector עמדה " תבנית גיליון אלקטרוני, כפי שמתואר בשלב 4.
- לבצע הערכה של מספר תאים באמצעות " חישוב בספירת תאי " גיליון אלקטרוני (שלב 5).
4. חישוב מיקום אופטי באמצעות Disector " עמדה Disector אופטי " תבנית גיליון אלקטרוני
- לחשב את הגודל והמיקום של כל disector אופטי למקם לתוך הרשת שמעליה במבנה החלוקה לרמות של (SN איור 5b) באמצעות " אופטי disector position.xlsx " קובץ גיליון אלקטרוני (קובץ משלים).
- להוסיף את ההמרה של פיקסל לכל מיקרומטר, כפי שהוגדרו על ידי " לקבוע קנה מידה " הפקודה, לעמדות צהוב מסומנים " אופטי disector position.xlsx " קובץ ( איור 6a, קובץ משלים ).
- הכנס המתוכנן לגודל disector אופטי והגודל של הכיכר-הרשת של הרשת שמעליה, שהוגדרו על-ידי האורך של צד אחד (במיקרומטר), לעמדות המסומן כתום.
הערה: תוצאות מתוארים בתיבות אדום ליד תיבות תפוזים. - להתחיל עם הרשת-כיכר במבנה החלוקה לרמות SN זה נקבע כנקודת ההתחלה (רשת-ריבוע אחד נבחר מלכתחילה, כמו שלב 3.9, לעיל).
- הוספה x ו- y מרכזת, כפי שנמדד בשלב 3.9, לתוך הקופסאות הירוקות של הקובץ (באמצעות ערכים אלה, x, y קואורדינטות עבור מרכז disector אופטי בתוך הכיכר הראשונה הזאת מחושבים, התוצאות מתוארים בתיבות כחול). להפעיל את המאקרו opt_dis_grid.txt (קובץ משלים).
- לחשב x, y הקואורדינטות של disectors אופטי ברציפות על-ידי הוספת המרחק מקודדים (נמדד במספר ריבועי) ביחס הרשת-הכיכר הראשונה (תיבות חום).
הערה: + x: רשת-סקוור הינו ממוקם ימינה; -x: רשת-סקוור הינו ממוקם משמאל; + y: רשת-ריבוע ממוקם בתחתית; -יום: רשת-כיכר ממוקם לפסגה. התוצאות מוצגות בתיבות אפורה.
5. אומדן תא מספר משתמש " חישוב של ספירת התאים " גיליון אלקטרוני
- חישוב המספר המשוער של תאי TH + SN לכל חיה (N) תוך שימוש בנוסחה לאור מאת המערבית et al., 1991 3, איפה ∑ Q – מוגדרת בתור המספר הכולל של תאנון + נוירונים במניין disectors אופטי כל סעיף מח אחד.
הערה: הגובה של disector אופטי (h) ביחס העובי מדודה של הסעיף (t) הינו כלול את המשוואה. השבר אזור הדגימה (asf) מוגדר את הפרופורציה של האזור (א) של גודל מסגרת אופטי disector (disector אופטי) בתוך ריבוע בגודל של הרשת (x, y שלב) (אופטי disector/A x, y שלב) ( איור 3b), ו שבר דגימה סעיף (ssf) מוגדר היחס בחלקים של המוח לחתוך כל באופן סדרתי:
כדי להבטיח איכותי וכמותי הערכות, המקדם של שגיאה (CE) צריך להיות נמוך מ 0.10. לקבוע את לסה נ באמצעות הנוסחה מאת Keuker et al., 2001 10:
- עבור הערכת stereological של מספר תאים בתוך SN של כל אחד עכבר, הכנס את המידע המצוין לגבי המספר הכולל של סדרת שנוצר לכל עכבר, הגובה את disector אופטי, x, y באזור של disector אופטי (אופטי disector, מיקרומטר 2), x, y שטח של הרשת-מרובע (x, y שלב מיקרומטר 2), הממוצע נמדד עובי של המקטע (במיקרומטר) בתיבות צהוב באמצעות " חישוב של התא count.xlsx " קובץ הגיליון האלקטרוני ( איור 6b וקובץ משלימה ).
- לנתח כל מקטע SN מן החיה אותו, כפי שמתואר בשלב 5. תא
- הוספה לא שווה כל disector אופטי בתיבות אפורות, כל שורה בהתייחס לסעיף SN אחד, משתמש " חישוב של התא count.xlsx " קובץ גיליון אלקטרוני (קובץ משלים).
הערה: המספר המשוער תא ו- CE מחושב את מתוארים בתיבות כחול ( איור 6b).
6. הערכה של מספר הטלפון הנייד באמצעות מסחרית זמינים Stereology מערכת
- התחל ההערכה של דופאמין SNpc את המספר על ידי לחיצה על " רגשים " → " אופטי זרימת Fractionator " כדי לפתוח את Fractionator אופטי זרימת העבודה חלון.
הערה: חלון חדש יהיה המוקפץ כדי לקבוע אם סדרה חדשה של SN הולך לספור. - להתחיל סדרה חדשה של תאנון + SN סעיפים על ידי לחיצה " התחל נושא חדש " בחלון המוקפץ.
- לעבור את השלבים השונים של זרימת העבודה Fractionator אופטי. להגדיר את הנושא בשלב הראשון. בשביל זה, הוסף את החוקר ' s שם, הנושא ' s (SN קבוצה), ושם ועוד מידע מועיל. הכנס את המספרים של מקטעים שווה זה SN. הכנס את העובי של הסעיפים רקמות לחתוך. הכנס את מרווח הזמן סעיף, אשר הוא ארבעה במקרה זה. הכנס את מספר הסעיף נקבע באופן אקראי כדי להתחיל עם.
- בשלב השני, להגדיר המיקרוסקופ נמוכה הגדלה (המטרה X 2) ובחר " 2 X עדשה Mag " ' מתפריט '.
- בשלב 3, לאתר את האזור של עניין עם לחצן העכבר השמאלי, המהווה SNpc, כפי שתואר על ידי Baquet et al., 2009 17.
- מוגדר המיקרוסקופ הגדלה גבוהה בשלב 4. בשביל זה, שינוי המטרה עד 100 X ובחר " 100 מג X עדשה " מתוך התפריט הנפתח.
- למדידת העובי הנטען בשלב 5 על ידי התמקדות לראש, לתחתית של המקטע.
- בשלב 6, מגדירים את גודל המסגרת ספירת 50 x 50 מיקרומטר; זה גודל disector אופטי (x, y)-
- בשלב 7, הגדר את גודל הרשת דגימה אקראית שיטתית (SRS) 130 x 130 מיקרומטר.
- להזין אזור משמר 3-מיקרומטר בשלב 8.
- לשמור את ההגדרות בשלב 9.
- בסופו של דבר, לספור את ה + וכולינרגיים התאים בכל אחד disectors אופטי בתוך הרשת SRS בשלב 10 של זרימת העבודה Fractionator אופטי. בשביל זה, להתחיל על-ידי לחיצה על " ספירת " כפתור.
- מסיים מקטע אחד, לחץ על " בסעיף הבא להתחיל " כפתור כדי להתחיל את זרימת העבודה Fractionator אופטי של המקטע SN הבאה של הסדרה SN אותו.
- כאשר יש כבר לכמת את המקטע האחרון SN סדרה SN אחת, לחץ על " אני ' ve סיום ספירת. "
- לחץ על " הצג תוצאות " לחצן כדי להציג את התוצאות של דגימה stereology.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות שיטת שהוצגו, המספר המשוער של תאנון + וכולינרגיים נוירונים הזכות SN נע בין תאים 7,363 ו- 7,987 ו, ב שמאל SN, בין תאים 7,446 ו 7,904. לפיכך, המספר הממוצע של נוירונים דופאמין (± SEM) היה ± 7,647 83 תאים עבור הזכות SN ± 7,675 66 בעד השמאל SN. לסה נ מחושבת עבור כל חיה שנמוך מ 0.08 (טווח: 0.073-0.079) (איור 7). כדי לברר את comparability של שיטה זו עם מערכות stereology מסחרית זמינים ממוקצעות, מספרי הטלפון הנייד SN היו גם לכמת באמצעות הגדרת stereology (איור 8). הפרמטרים הספירה היו: גודל רשת, מיקרומטר 130 x 130; ספירת מסגרת, 50 x 50 מיקרומטר; אזור משמר, 3 מיקרומטר. סעיפים נותחו עם 100 x / 1.25 מפתח נומרי המטרה של מיקרוסקופ BX53. האוכלוסייה המוערכת של נוירונים TH + SN באמצעות העובי סעיף רשע נע בין 7,067 תאים 8,105/SN, 7,164 עד 8,015 תאים/SN בצדדים ימינה ושמאלה, בהתאמה. המספר עצביים רשע מחושב כמו 7,535 ± 155 תאים על הזכות SN ותאים 7,699 ± 128 בעד השמאל SN. לסה נ Gundersen (m = 1) היה ≤0.08 בתוך כל SN לכמת (איור 7). ניתוח סטטיסטי באמצעות מבחן t של סטודנט לזווג. לא נמצאו כל הבדלים משמעותיים בין תאנון + תא הסעיפים של שתי השיטות ב הזכות או ב- SN השמאלי את (זאת אומרת ± SEM; נכון: t (5) = 0.9524, P > 0.05; השמאלי: t (5) = 0.2928, P > 0.05) (איור 7 ).
איור 1. להחליפן בתמונות של העכבר SN מוכתם נוירונים דופאמין.
(א) סקירה של כדור שלג העכבר נציג מוצג בחלונית העליונה. הערה החור קטן בחלק העליון של גזע המוח נכון המסמן את הצד הימני. הגדלה גבוהה יותר של שיבוץ (קופסה שחורה) מתארת TH + נוירונים דופאמין. (b) סדרה אחת של SN שהוכתמו TH מקטעים מוצג, המכסים את העכבר כל SN מ rostral כדי סימטרית. (ג) כל מקטע מופרדים מהמקטע רצופות ברים 120 מיקרומטר. קנה מידה:, העליון פאנל, מיקרומטר 500; בחלונית התחתונה, תמונה גדולה, 100 מיקרומטר; בחלונית התחתונה, שיבוץ, 50 מיקרומטר; b, 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 2. רכישת תמונות לניתוח stereological שימוש בתוכנת הדמיה.
(א) חץ אדום: לפתוח את החלון רכישה; החץ הירוק: להגדיר את binning ל- "2"; חץ כחול: להראות את התמונה בשידור חי. (b) ייפתח חלון חדש המציג את התמונה בשידור חי (חץ אדום). חץ אדום (c) : בחר בתפריט "הבמה"; החץ הירוק: בחר באפשרות "לסרוק שקופיות"; החץ הכחול: לבדוק את האפשרות "לסרוק שקופיות"; חץ שחור: להגדיר את הפינה השמאלית העליונה. חץ שחור (d) : הגדרת בפינה הימנית התחתונה. חץ אדום (e) : בחר בתפריט "Z-סדרה"; החץ הירוק: לבדוק את "סדרות מטוס ה-Z"; חץ כחול: להתחיל את "נוף העליון לקזז" כדי לחפש העליון של המקטע. חץ אדום (נ) : לחץ על "תפסיק למעלה תצוגה" כדי להגדיר את החלק העליון של המקטע; החץ הירוק: להתחיל "נוף התחתון לקזז" כדי לחפש התחתון של המקטע. חץ אדום (g) : לחץ על "תפסיק התחתון נוף" כדי להגדיר את החלק התחתון של המקטע. חץ אדום (h) : לחסר השומר 3-מיקרומטר אזור מ "העליון לקזז" והכנס את התוצאה לתוך החריץ "העליון לקזז". (i) חץ אדום: לחסר מיקרומטר 13 ממספר "העליון לקזז" והוסף את התוצאה לתוך החריץ "התחתון לקזז"; החץ הירוק: הגדרת השלבים 14 שמתאים מטוס ה-z לעובי מיקרומטר 13; החץ הכחול: להגדיר גודל של 1.00 מיקרומטר המתאים למרחק 1-מיקרומטר בין תמונות רצופות. חץ אדום (j) : בחר את הספריה כדי לשמור את הקובץ; החץ הכחול: לחץ על "רצף" להתחיל הרכישה של תמונות. חץ אדום (k) : לחץ על "עיבוד;" בדוק את הפרמטרים הבאים: החץ הירוק: "כל המטוסים;" חץ כחול: "רצף"; חץ שחור: "מונטאז;" חץ אפור: "תפרים"; סגול חץ: מהר. (l) לחצו על החץ הצהוב כדי להתחיל תפרים את התמונות. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
איור 3. עיבוד התמונות לניתוח stereological.
(א) תמונה מחסנית דוגמה שנלקחו עכבר SN. (b ו- c) לאחר ההוספה אקראי של רשת המכסים את SN (קווים בצבע טורקיז, b), מחולקת לרמות את SN בשלב השני (קו כחול, ג). (ד) disector אופטי ימוקם התמונה מחסנית SN. (ה) שישה מטוסים מוקד ברציפות בתוך התמונה מחסנית SN לכסות הכולל ב z-המישור 13 מיקרומטר. גודל ברים:-d, 100 מיקרומטר; e, 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 4. רצף של הערכה stereological באמצעות ImageJ.
(א) חץ אדום: לחץ על "קובץ" ← "פתח" כדי לפתוח תמונה מחסנית. חץ אדום (b) : לחץ על "לנתח" ← "לקבוע סולם". (ג) חצים אדומים: להגדיר את הפרמטרים עבור "מרחק בפיקסלים," "מרחק ידוע", "יחידת אורך". חץ אדום (d) : בחר "תוספים" ← "רשת". חץ אדום (e) : בחר ". קווי;" החץ הירוק: לבדוק "היסט מקרי"; חץ כחול: הכנס את הגודל של הרשת מיקרומטר2. חץ אדום (נ) : לחץ על "תמונה" ← "סוג" ← "RGB צבע." חץ אדום (g) : בחר "הכלי מברשת צבע;" החץ הירוק: מגדירים את "רוחב המברשת" 11. חץ אדום (h) : מתחילים להקיף את SNpc. (א) אדום חצים מתארים את שהינכם מטיילים SNpc. (j) חץ אדום: לחץ על "לנתח" ← "סולם להגדיר" ולהסיר את קנה המידה (k) על ידי לחיצה על "לחץ על כדי להסיר מידה," מתואר על ידי האדום חץ. שימו לב לשינוי מ מיקרומטר (חץk, ירוק) פיקסלים (חץl, אדום). (ז) לקחת צילום מסך (חץ אדום נקודות לקראת צילום מסך), (n) לפתוח את קובץ התמונה צילום מסך עם ImageJ. חץ אדום (o) : לחץ על "נקודת." חץ אדום (p) : הוספת מברשת ברוחב של 25. (q) החץ האדום מתאר את המסומן הרשת ריבועים לפנות את SNpc. (r) מצביע החץ האדום שבפינה השמאלית העליונה של הרשת-מרובע הכולל חלק SN. על ידי הצבת הסמן בנקודה זו, ה-x, y מרכזת עבור "תנוחת disector אופטי" (שלב 4) נמדד, מוכנס לתוך התבנית "disector אופטי position.xlsx" (s, האדום חץ). חץ אדום (t) : בחר "תוספים" ←"מאקרו" ← "Edit." חץ אדום (u) : בחר את הקובץ "opt_dis_grid.txt". חלון חדש ייפתח (v). הכנס את הגודל של "usergrid", פיקסלים (v, חץ אדום), וה ה-x, y (v, החץ הירוק). (w) להפעיל את המאקרו "opt_dis_grid.txt" (חץ אדום). (x) disector אופטי יופיע באמצע שהוגדרו בעבר-מקודדים (חץ אדום). חץ אדום (y) : לחץ על "תוספים" ← "מונה תא." (z) לאתחל את הדלפק תא (חץ אדום) ובחר סוג סמן (חץ ירוק). אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
איור 5. השמה של disector אופטי.
(א) שמדגים disector אופטי המשמש stereology לא משוחדת. Disector אופטי הוא קוביית תלת-ממדי. שלושה תאים סכמטית גלויים בתוך disector אופטי. החוקים stereological עבור כימות של תאים מציינים כי תאים לגעת בצדדים שכותרתו אדום של disector אופטי הם נשלל (תא אדום), תוך תאי קשר הירוק הצדדים שכותרתו כלולים בתא ספירה (תאים ירוק). (b) disector אופטי ממוקם בכיכר כל הרשת-שבא במגע עם SN. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6. החישוב של disector אופטי עמדה, הערכה של מספר הטלפון הנייד.
(א) חישוב דוגמה לבצע עבור המיקום של disector אופטי. (b) דוגמה של הערכת מספר התאים הכולל. המספרים של כימות תאים מוכנסים בתיבות אפורות, ואילו הפרמטרים של כימות stereological מוכנסים בתוך הקופסאות צהוב. המספר המשוער תא ו- CE של מוצגים את הקופסאות הכחולות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 7. השוואה של תא ספירת פרמטר.
(א) השוואת מוערך TH + תא מספר העכבר ימינה ושמאלה SN המתקבל בשיטת stereological המתואר עם הנתונים רכשה מניתוח באמצעות מערכת stereology זמינים מסחרית לא הראה הבדלים משמעותיים כלשהם. רשימה מפורטת של נתונים המתקבלים נכון (b) , שמאל (ג) SN ניתנת עם המספר המשוער תא לכל בעל חיים, מספר התאים ממש ספרה, מספר קטעים שנספרו ולאחר מספר האתרים דגימה (קרי, מספר חלקות נספרים) עבור שתי שיטות. הערכים בגרפים בר הם זאת אומרת ± SEM של נתונים מ 6 עכברים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 8. כימות של תאים עם מערכת stereology זמינים מסחרית.
(-b) קווי המתאר של SN נמשך והם (ג) העמדות של disectors אופטי באופן אוטומטי נחוש. (d-e) כל disector אופטי ניתוח עבור מספר הטלפון הנייד על ידי התמקדות לאורך מטוס ה-z. שישה מטוסים מוקד ברציפות בתוך SN מוצגים. הקווים האדומים והירוקים תואמות disector אופטי. גודל ברים:-d, 100 מיקרומטר; e, 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
משלימה קובץ 1. opt_dis_grid.txt אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
קובץ משלים 2. Disector אופטי position.xlsx אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
קובץ משלים 3. חישוב של תא count.xlsx אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Stereology מתחיל עם עיבוד רקמות. חיתוך סדרתי של SN רקמה יש לבצע בזהירות כדי למנוע האובדן של מקטעים במהלך ניתוח stereological. בנוסף, הוא צעד חיוני כדי לסמן והזיז חצי אחד על מנת לבדל את הזכות מן השמאל SN בעת ביצוע stereology. הצבת לחור קטן בחלק העליון של גזע המוח להפיק את התוצאות הטובות ביותר במחקר הציג. יתר על כן, מאז עובד עם הדרישות שיטת fractionator אופטי הרקמה היא לחתוך בסעיפים בעובי של בערך 30-40 µm, יותר מאשר של 5-10 מיקרומטר יותר נפוץ אימונוהיסטוכימיה, נוגדנים, אחרים חדירה של נוזלים ברקמות הדגירה במהלך נוגדן והקפדה, כזה כמו באמצעות חומר ניקוי.
Immunohistochemical מכתים נוירונים דופאמין באמצעות תוויות נוגדן TH SN נוירונים, כמו גם נוירונים בתוך אזור הטגמנטום הגחוני (מע' ' מ), הנמצא medially מ SN, ו נוירונים בשטח retrorubral. לכן, עוד נקודה קריטית בעת ביצוע stereology של SN הוא הידע של העכבר SN אנטומיה, מאז SN נוירונים, לא ניתן לאבחן באופן בלעדי על ידי תקן immunohistochemical או צביעת היסטולוגית. במקום זאת, ההכרה של ציוני דרך אנטומיים, כמו לגרעין subthalamic, השדה retrorubral את מע' ' מ, חשובים לקבוע את היקף שלם SN17,18,19.
הערכה של מספר עצביים צריך להיות לשחזור ואמין. למרות קבוצות שונות משתמשות stereology זמינים מסחרית כיוונונים, מספרי של תאנון + נוירונים דופאמין SN בעכברים wt, שנלקחו פרסומים שונים, משתנים בעוד17,מספר20. ב- Baquet et al., ניתוח stereological מבוססי עיצוב בעכברים 3 כדי 4-בן חודש זכר ונקבה C57BL/6J wt באמצעות מערכת stereology זמינים מסחרית גילה משוער 8,716 ± 338 TH + וכולינרגיים SN נוירונים (טווח: 7,546-9,869)17 . לעומת זאת, Smeyne et al. נמצאו תאים TH + SN פחות ב- 9 - עד השבוע ה-16 זכר C57BL/6J עכברים שקיבלו i.p. saline 0.9%, החל 6,302 ± 262 תאים לתאים 6,861 ± 338, באמצעות גירסה חדשה יותר של אותה מערכת stereology20. עם זאת, המחבר הראשון היה גם המחבר האחרון Baquet et al. נייר, ולכן למעט בדרגות שונות של ניסיון כסיבה לקבלת תוצאות שונות. נתונים אלה סותר משקפים את הצורך שיטה כמת stereological המציגה את השתנות פחות. כדי לוודא את הטכניקה של כימות, הנוסחה המשמשת, בוצעה השוואה של התוצאות של ספירת התאים SN מספר באמצעות השיטה המתוארת כימות באמצעות הגדרת stereology זמינים מסחרית. ניתוח סטטיסטי לא הראה הבדלים משמעותיים כלשהם בעת השוואת המספרים של תאנון + נוירונים דופאמין הנכון והשאיר SN של עכברים wt באמצעות שתי טכניקות של כימות התא, ובכך הוכחת כי בשיטה זו הוא ריאלי עבור הערכה stereological של SN הנוירונים בעכברים.
היתרון העיקרי של השיטה המתוארת היא כי זה מפחית את העלויות הקשורות בדרך כלל היישום של טכניקות stereology לספירת תאים. יתרון נוסף הוא כי, עבור השיטה המתוארת, תמונות בערימה של SN נשמרים, ניתן לנתח בכל זמן (אפילו בו זמנית) על ידי חוקר אחר. יתר על כן, רכישה ומכירה ניתוחים של קרינה פלואורסצנטית תמונות אפשריים באמצעות שיטה זו, מכיוון שניתן לצבוע בגווני אפור עם "טבלאות בדיקת מידע" ב- ImageJ. עם זאת, קיימות מגבלות על מחקר זה. ראשית, כימות של מספר הטלפון הנייד הוא זמן רב יותר (בסביבות 50%) מאשר כמת עם מערכת stereology זמינים מסחרית. זה בעיקר בגלל שתי סיבות: 1. מחסנית תמונות של SN חייב להילקח ו- 2. חישוב של המיקום disector אופטי בתוך כל SN וחישוב של המספר המשוער ו- CE חייב להתבצע באופן ידני באמצעות תבניות חישוב. שנית, לפחות עם מערכת זמין במעבדה שלנו, הניתוח ניתן לבצע אך ורק תמונות בגווני אפור בשל גודל קובץ גדול של תמונות צבע, אשר לא יכול להיות מעובד על ידי ImageJ. זה עלול להוות בעיה אם יש צורך לכמת שתי אוכלוסיות תאים שונים באותו זמן בכתם כפול. זה יכול להיות קשה יותר להבחין בין שתי האוכלוסיות תא מוכתם באופן שונה בתמונות בגווני אפור. לכן, על אף שלב ממונע (x, y, z המטוס), התוכנה המתאימים זמינים במעבדות רבים עובדים עם דגימות היסטולוגית, ניהול ואיכות תמונות בערימה תלויות התוכנה מיקרוסקופ, הביצועים של המחשב המצורפת.
ישנם דרכים אפשריות כדי להתגבר על המגבלות. באמצעות תבניות חישוב שפיתחנו, התכנות של פקודות מאקרו להפיכת חלק מהתהליכים שבוצעו באופן ידני כעת יכול להפחית שגיאות או אי דיוקים בעת הערכת stereological ולהאיץ את מהירות העבודה. בנוסף, עם הפיתוח המתמשך של ImageJ ושל תוכנות הדמיה אחרות, כמו גם עם הגדלת כוח העיבוד של המחשב, גדלי קבצים גדולים יותר של התמונה צריך לא להוות בעיה בעתיד הקרוב. לכן, ניתוחים של תמונות צבע בהיר-שדה יהיה לניהול עם הטכניקה המתוארת.
בטכניקה המתוארת אינה מוגבלת ניתוחים של תאי TH + SN, אך ניתן להרחיב לנתח תא סוגים אחרים של אזורים במוח של מכרסמים. בשביל זה, גבולות האנטומי של האזור עניין להיקבע, ההכתמה בהתאמה חייב להתבצע. בנוסף, טכניקה זו ניתן להתאים להקשיה. בשביל זה, רכישת תמונות בערימה חייב להיות מותאם כדי לספק יותר תמונות בערימה. לדוגמה, אם סעיף מיקרומטר בעובי 40 נדרשות, בפועל רכוב עובי של המקטע לאחר צביעת רקמות חייבת להידרש כדי לקבוע את גובה הכרחי disector אופטי. מהמסיכה 6 מיקרומטר (מיקרומטר 3 אזור משמר בחלק העליון והתחתון) עובי רקמת רשע ולקחת את התוצאה כמו גובה disector אופטי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
וו. מודיע שימש על לוחות מדעי Merz תרופות, LLC, טבע; קיבל מימון עבור נסיעות Ipsen, Merz תרופות, LLC, Allergan, inc.; קיבלה רמקול honoraria Merz, טבע, Allergan, inc. מחוץ העבודות שהוגשו. הספר שימש כיועץ עבור בוסטון סיינטיפיק, מדטרוניק AbbVie, קיבלה honoraria של מדטרוניק בוסטון סיינטיפיק, AbbVie, Bial, Allergan, GlobalKinetics מחוץ העבודות שהוגשו.
Acknowledgments
המחברים מודים Keali רוהם, לואיזה Frieß של הייקה מנזל לסיוע טכני מומחה שלהם; כדי הלגה Brünner על הטיפול בבעלי חיים; וכדי Chistopher וורד ס הדור והפצה של התוסף רשת disector אופטי עבור התוכנה ImageJ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paxinos mouse atlas | The Mouse Brain George Paxinos Keith B.J.FranklinCopyright @2001 by Academic Press CD Rom designet & created by Paul Halasz | ||
| brain matrix slicer mouse | Zivic Instruments | BSMAS 001-1 | |
| paraformaldehyde | Merck | 1040051000 | |
| sucrose /D(+) Saccharose | Roth | 4621.1 | |
| isopentane | Roth | 3927.1 | |
| glycerol | Merck | 1040931000 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 32205-1L | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| phosphate buffered saline ingredients: | |||
| sodium chloride | Sigma Aldrich | 31434-1KG-R | |
| potassium dihydrogen phosphate | Merck | 1048731000 | |
| di-sodium hydrogen phosphate dihydrate | Merck | 1065801000 | |
| potassium chloride | Merck | 1049360500 | |
| normal goat serum | Dako | X0907 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A4503-100G | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ml | detergent |
| 3,3-Diaminobenzidine-tetrahydrochlorid/DAB tablets 10mg pH 7.0 | Kem En Tec | 4170 | |
| H2O2/ Hydrogen peroxide 30% | Merck | 1072090250 | |
| avidin/biotin reagent | Thermo Scientific | 32050 | Standard Ultra Sensitive ABC Staining Kit, 1:100 |
| rabbit anti mouse tyrosine hydroxylase antibody | abcam | Ab112 | 1:1000 |
| biotinylated goat-anti-rabbit IgG H+L | vector laboratories | BA-1000 | 1:100 |
| StereoInvestigator version 11.07 | MBF | ||
| BX53 microscope | Olympus | ||
| Visiview | Visitron Systems GmbH | 3.3.0.2 | |
| Axiophot2 | Zeiss | ||
| ImageJ software | NIH | Version 4.7 | |
| Tissue-TEK OCT | Sakura | 4583 | |
| dry ice | |||
| grid overlay plugin | Wayne Rasband | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html | |
| cell counter plugin | Kurt de Vos | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html). | |
| optical disector macro | Christopher Ward | ||
| C57Bl/6N male mice | Charles River, Germany | ||
| SuperFrost Plus coated object slides | Langenbrinck, Germany | ||
| 25G needle Microlance 3 | BD | 300400 | |
| REGLO Analog Infusion pump | Ismatec | ISM 829 | |
| StereoInvestigator system | StereoInvestigator version 11.07 | ||
| BX53 microscope | BX53 microscope | ||
| self-assorted stereology | Visiview | ||
| Axiophot2 | Axiophot2 |
References
- Ip, C. W., et al. AAV1/2-induced overexpression of A53T-alpha-synuclein in the substantia nigra results in degeneration of the nigrostriatal system with Lewy-like pathology and motor impairment: a new mouse model for Parkinson's disease. Acta Neuropathol Commun. 5 (1), 11 (2017).
- Ip, C. W., Beck, S. K., Volkmann, J. Lymphocytes reduce nigrostriatal deficits in the 6-hydroxydopamine mouse model of Parkinson's disease. J Neural Transm (Vienna). 122 (12), 1633-1643 (2015).
- West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Anat Rec. 231 (4), 482-497 (1991).
- Schmitz, C., Hof, P. R. Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience. 130 (4), 813-831 (2005).
- Tieu, K. A guide to neurotoxic animal models of Parkinson's disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 1 (1), e009316 (2011).
- Abercrombie, M. Estimation of nuclear population from microtome sections. Anat Rec. 94, 239-247 (1946).
- Rose, R. D., Rohrlich, D. Counting sectioned cells via mathematical reconstruction. J Comp Neurol. 263 (3), 365-386 (1987).
- Weibel, E. R., Gomez, D. M. A principle for counting tissue structures on random sections. J Appl Physiol. 17, 343-348 (1962).
- West, M. J. Design-based stereological methods for counting neurons. Prog Brain Res. 135, 43-51 (2002).
- Keuker, J. I., Vollmann-Honsdorf, G. K., Fuchs, E. How to use the optical fractionator: an example based on the estimation of neurons in the hippocampal CA1 and CA3 regions of tree shrews. Brain Res Brain Res Protoc. 7 (3), 211-221 (2001).
- Mouton, P. R., et al. The effects of age and lipopolysaccharide (LPS)-mediated peripheral inflammation on numbers of central catecholaminergic neurons. Neurobiol Aging. 33 (2), e427-e436 (2012).
- Barreto, G. E., Sun, X., Xu, L., Giffard, R. G. Astrocyte proliferation following stroke in the mouse depends on distance from the infarct. PLoS One. 6 (11), e27881 (2011).
- Robinson, S., et al. Microstructural and microglial changes after repetitive mild traumatic brain injury in mice. J Neurosci Res. 95 (4), 1025-1035 (2017).
- Paxinos, G., Franklin, K. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (2001).
- Rasband, W. Grid_Overlay.java. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html (2010).
- De Vos, K. cell_counter.jar. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html (2010).
- Baquet, Z. C., Williams, D., Brody, J., Smeyne, R. J. A comparison of model-based (2D) and design-based (3D) stereological methods for estimating cell number in the substantia nigra pars compacta (SNpc) of the C57BL/6J mouse. Neuroscience. 161 (4), 1082-1090 (2009).
- Fu, Y., et al. A cytoarchitectonic and chemoarchitectonic analysis of the dopamine cell groups in the substantia nigra, ventral tegmental area, and retrorubral field in the mouse. Brain Struct Funct. 217 (2), 591-612 (2012).
- German, D. C., Manaye, K. F. Midbrain dopaminergic neurons (nuclei A8, A9, and A10): three-dimensional reconstruction in the rat. J Comp Neurol. 331 (3), 297-309 (1993).
- Smeyne, R. J., et al. Assessment of the Effects of MPTP and Paraquat on Dopaminergic Neurons and Microglia in the Substantia Nigra Pars Compacta of C57BL/6 Mice. PLoS One. 11 (10), e0164094 (2016).
