Biología celular cuantitativa de neurodegeneración en Drosophila mediante análisis imparcial de fluorescencia etiquetas proteínas con ImageJ

Summary

Hemos desarrollado un flujo de trabajo sencillo y adaptable para extraer datos cuantitativos de estudios biológicos celulares basado en la proyección de imagen de la fluorescencia de la agregación de la proteína y autofagia flujo en sistema nervioso central de Drosophila modelos de neurodegeneración.

Abstract

Con la creciente prevalencia de enfermedades neurodegenerativas, es cada vez más importante comprender la fisiopatología subyacente que conduce a la pérdida y disfunción neuronal. Tecnologías y herramientas de imágenes basadas en fluorescencia permiten análisis sin precedentes de los procesos neurobiológicos subcelulares, pero todavía hay una necesidad de enfoques imparciales, reproducibles y accesibles para extraer datos cuantificables de los estudios por imágenes . Hemos desarrollado un flujo de trabajo sencillo y adaptable para extraer datos cuantitativos de estudios por imágenes basados en fluorescencia usando modelos de Drosophila de la neurodegeneración. Específicamente, se describe un enfoque fácil de seguir, semiautomático con Fiji/ImageJ para analizar dos procesos celulares: en primer lugar, cuantificar el contenido total de proteína y perfil en el lóbulo óptico de Drosophila mediante etiquetado fluorescente mutante proteínas huntingtina; y en segundo lugar, evaluar flujo de autofagia-lisosoma en el sistema visual de Drosophila con cuantificación basada en radiométrica de un reportero fluorescente de tándem de la autofagia. Importante, el protocolo descrito aquí incluye un paso de segmentación semiautomática para asegurar que todas las estructuras fluorescentes se analizan para reducir al mínimo el sesgo de selección y para aumentar la resolución de comparaciones sutiles. Este enfoque puede ser extendido para el análisis de otras estructuras biológicas de la célula y procesos implicados en la neurodegeneración, como proteico puncta (gránulos de estrés y complejos sinápticos), compartimentos, así como unida a la membrana (mitocondrias y vesículas tráfico de membrana). Este método proporciona un estándar, pero adaptable punto de referencia para análisis de imagen y cuantificación y podría facilitar la confiabilidad y reproducibilidad a través del campo y en última instancia, mejorar la comprensión mecanicista de la neurodegeneración.

Introduction

Las enfermedades neurodegenerativas afectan a millones de personas cada año y la incidencia está aumentando con un envejecimiento población¹. Mientras que cada enfermedad neurodegenerativa tiene una etiología única, agregación de proteínas mal plegadas y avería de la red proteostasis son características distintivas patológicas común de muchas de estas enfermedades. Dilucidar cómo la interrupción de estos procesos fundamentales e interrelacionados va mal contribuir a la muerte neuronal de la célula y disfunción es fundamental para entender las enfermedades neurodegenerativas, así como orientar las intervenciones terapéuticas. La proyección de imagen basada en la fluorescencia permite la investigación de estos procesos complejos y dinámicos en las neuronas y ha contribuido enormemente a nuestra comprensión de la biología de la célula neuronal. Análisis de fluorescencia de etiquetado proteínas es un reto, sobre todo cuando los experimentos se llevan a cabo en vivo, altamente compacta los tejidos, tipos de células diversas y heterogeneidad morfológica. Cuantificación manual asistida es asequible y sencillo, pero es a menudo desperdiciadora de tiempo y sujeto a sesgo humano. Por lo tanto, hay una necesidad de enfoques imparciales, reproducibles y accesibles para extraer datos cuantificables de los estudios por imágenes.

Hemos esbozado un flujo de trabajo simple y adaptable con Fiji/ImageJ, un software^2,3, de procesamiento de imágenes poderosas y libremente accesibles para extraer datos cuantitativos de estudios por imágenes de fluorescencia en modelos experimentales de neurodegeneración con Drosophila. Siguiendo este protocolo para cuantificar la agregación proteica y autofagia flujo — dos celulares características biológicas que son altamente relevantes para la patología de enfermedades neurodegenerativas, demostró la sensibilidad y la reproducibilidad de este enfoque. Análisis de fluorescencia de etiquetado huntingtina (Htt) de proteínas en el lóbulo óptico de Drosophila revelaron el número, tamaño e intensidad de agregados de proteína. Visualizamos un reportero fluorescente del tándem de autofagia flujo dentro del sistema visual de Drosophila , que muestra señales de emisión diferentes dependiendo de la compartimentación medio ambiente⁴. Análisis del reportero tándem radiométrica permitió una visión cuantitativa y global del flujo de la autofagia-lisosoma de autophagosome formación, maduración y transporte a la degradación en el lisosoma y además destacó vulnerable compartimientos en enfermedades neurodegenerativas. Lo importante, en ambos análisis hemos implementado pasos umbralización y segmentación semiautomáticos en nuestro protocolo para minimizar el sesgo inconsciente, aumentar el poder de toma de muestras y proporcionar un estándar para facilitar las comparaciones entre estudios similares. El flujo de trabajo sencillo pretende hacer poderosos plugins de Fiji/ImageJ (desarrollado por científicos de la computación basados en algoritmos matemáticos) más accesible a los neurobiólogos y la comunidad de Ciencias de la vida en general.

Protocol

1. consideraciones y preparados para diseñar el experimento de análisis de imagen

1. Predeterminar conveniente anatómico, celular, subcelulares marcadores o para servir como puntos de referencia para la estandarización de una región de interés (ROI) a través de diferentes muestras, por ejemplo 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), marcadores de membrana, localizada fluorescente proteína, etc.
2. Seleccione un marcador fluorescente que puede delimitar puncta discreta más allá de los niveles de fondo de la estructura de interés.
   Nota: Este protocolo está optimizado para estructuras proteicos (por ejemplo, agregados de proteínas mal plegadas) y membrana-limitan organelles (p. ej., reportero de autofagia). Para visualizar la agregación de la proteína, un fragmento de la etiqueta RFP N-terminal de proteína Htt humana con un tracto de poliQ patógenos de 138 repeticiones (RFP-hHttQ138) fue utilizado⁵. La proteína Htt mutada forma citoplásmicos agregados cuando se expresan bajo controladores neuronales específicos como elav-GAL4^5,6. Para visualizar el flujo de autophagosome-lisosoma, La actinia-GAL4 fue utilizado para conducir ubicuo expresión del reportero tándem mCherry-GFP-Atg8a. puncta mCherry y GFP positivas indican autophagosomes, y el flujo se controla como la fluorescencia de GFP se apaga en el ambiente ácido del lisosoma, donde mCherry resistente al ácido permanece hasta que la proteína es degradada⁷. Radiométrica análisis, un solo canal que es un indicador consistente de la estructura puede ser utilizado para segmentación, o caso que una proyección de dos o más canales puede utilizarse para delinear las estructuras, aunque no explícitamente descrito en el presente Protocolo. En este ejemplo, mCherry se utiliza para la segmentación de las partículas de Atg8 positivo, ya que es resistente al ácido y permanecerá en el compartimiento a través de flujo a través de la vía.
3. Descargar e instalar la plataforma open source de análisis imagen ImageJ o Fiji, la distribución preferida de ImageJ con incluye plugins^2,3.
4. Instalar el plugin para cuenca interactivo h maxima.
   Nota: Este protocolo usa Fiji; plugins adicionales puede ser necesario para ImageJ. El plug-in desarrollado por Benoit Lombardot para SCF-MPI-CBG está disponible en línea (https://imagej.net/Interactive_Watershed).
5. Vaya a "ayuda | Actualización", seleccione"Administrar sitios de actualización"de la"actualización de ImageJ", elegir el sitio de actualizaciones de SCF-MPI-CBG de la lista y luego cerrar y reiniciar Fiji.

2. disección y tinción de inmunofluorescencia del cerebro

1. Hacer silicona platos disección revestimiento de elastómero.
   1. Vierta la silicona componentes de elastómero en un vaso de precipitados según lo indicado por el fabricante y remover bien hasta que se mezcle bien.
   2. Utilice una pipeta para llenar 5 cm llena de platos de cultivo de tejidos un tercio a la mitad (aproximadamente 10 mL de mezcla de elastómeros). Deje que las burbujas ascienden a la superficie y quitar suavemente con papel de seda. Cubrir los platos y colocarlos sobre una superficie plana para curar por 48 – 72 h a temperatura ambiente (RT).
2. Diseccionar el cerebro de la Drosophila y sistema visual si es necesario.
   1. Realizar la disección del cerebro de Drosophila como se describió anteriormente^8,9. Realizar la disección en platos de disección revestimiento de elastómero, con un fondo de elastómero para estabilizar el cerebro para evitar dañar tejidos o fórceps.
   2. Para mantener la lámina intacto durante la disección, Deslice dos pinzas debajo de la retina y rasgar suavemente a través del centro del ojo para eliminar la retina. Tire cualquier tejido retiniano fijado a la lámina con fórceps a cabo paralelo a la superficie de la lámina.
      Nota: Pigmento Residual se lava en los siguientes pasos y generalmente no interfiere con el anticuerpo de la coloración y la proyección de imagen.
   3. Diluir el 37% de formaldehído en solución salina tamponada con fosfato (PBS) para hacer una concentración final de 3,7% fresco antes de usarlo en un tubo de microcentrífuga de 500 μl. Transferir el cerebro disecado a tubo de microcentrífuga con solución fix e incubar durante 15 min a temperatura ambiente con el suave balanceo.
      Nota: El formaldehído tiene una natural tendencia a ser oxidado, produciendo ácido fórmico. Por lo tanto, se sugirió al formaldehído de alícuota del 37% para el almacenamiento y diluir hasta 3,7% recién antes de cada uso. Excesiva fijación o fijación insuficiente afectará la integridad del tejido y la fluorescencia¹⁰.
   4. Lavar 3 veces con PBTx (PBS con 0,4% Tritón X-100) durante 15 minutos.
3. Realizar inmunohistoquímica y montar las muestras.
   1. Si anticuerpos es necesario, quitar PBTx, añadir anticuerpo primario diluido en PBTx con 5% de suero normal de cabra e incube de una alícuota de mezcla durante la noche a 4 ° C.
   2. Anticuerpo primario de quitar y lavar 3 veces con PBTx durante 15 minutos. Añadir el anticuerpo secundario diluido en PBTx con 5% de suero normal de cabra e incubar durante 1 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C. Lavar 3 veces con PBTx durante 15 minutos.
   3. Si se necesita tinción DAPI, quitar PBTx, añadir solución de DAPI (solución de stock: 5 mg/mL, diluir a una concentración de trabajo de 15 μg/mL en PBTx) e incubar 10 min a RT. Wash 3 veces con PBTx durante 15 minutos.
   4. Para eliminar el tejido, coloque una gota de medio de montaje en el centro de un portaobjetos de microscopía con un espaciador de una capa de cinta transparente en ambos lados. Transferir el cerebro en la gota de medio de montaje y esperar 1-2 min hasta que el cerebro se vuelve transparente. Retire con cuidado el medio de montaje con una pipeta.
   5. Para el montaje, aplique una gota fresca de medio de montaje sobre los cerebros en la diapositiva. Cuidadosamente el recubrimiento un cristal evitando burbujas. Sellar los bordes con cemento de goma y deje secar al aire a temperatura ambiente por 20 minutos proceder a la adquisición de la imagen para obtener mejores resultados.

3. adquisición de la imagen

1. Optimizar parámetros de adquisición de microscopio, incluyendo la resolución espacial, objetivo, zoom, velocidad de escaneo y paso de tamaño, para maximizar la resolución de las estructuras de interés para facilitar la segmentación semiautomática durante el análisis de la imagen.
   Nota: Puede ser útil capturar una imagen de muestra y probar segmentación semiautomática (en el paso 5 del presente Protocolo) antes de todas las muestras experimentales de la proyección de imagen. De esta manera el usuario puede ajustar la configuración de imágenes para que herramientas analíticas pueden fácilmente discernir la estructura biológica de interés.
2. Ajuste de controles de imagen detector para captar la más alta relación señal a ruido y rango dinámico más alto de la muestra.
   1. Utilice una LUT (mire para arriba de la mesa) que indica la saturación de píxeles (exposición demasiado alto) o undersaturation (offset demasiado baja) mientras ajustes (figura 3B, rojo indica saturación de pixel por una LUT de Hi/Low).
   2. Verificar ajustes de ganancia y offset son apropiados para todos los grupos experimentales, como las manipulaciones experimentales probablemente alteran la estructura de interés.
      Nota: Es imperativo que se utilizan los mismos ajustes para todos los grupos hacer comparaciones cuantitativas.
3. Imagen a través del tejido para capturar todos los datos.
   Nota: Se recomienda para capturar todos los datos disponibles durante una sesión de imágenes y para definir un área más preciso durante la selección de ROI en el paso 4 si es necesario.
4. Guarda la imagen como el tipo de archivo soportado por el software de imágenes para preservar los metadatos como parámetros de adquisición y calibración espacial. Guardar la imagen con un nombre de archivo incluyendo experimental fecha, antecedentes genéticos y Reporteros fluorescentes, anticuerpos o tintes correspondiente a canales escaneados como [nombre de Grupo Experimental] _ [nombre del espécimen] _ [fecha experimento] _Ch1. [fluoróforo-blanco /Dye]_Ch2.[Fluorophore-Target/Dye], etc.

4. Fiji/ImageJ imagen importación y selección de ROI

1. Abra una imagen en Fiji. Utilice el cuadro de diálogo "Opciones de importación de formatos de Bio", elegir "pila vista con: Hyperstack" y "modo de Color: escala de grises".
   Nota: Se recomienda abrir el tipo de archivo de microscopio, como metadatos tales como calibración espacial puede ser leído por Fiji.
2. Identificar un área de un solo plano z o una proyección basada en el canal de marcador que puede ser utilizado como un ROI estandarizado a través de las muestras (figura 1, selección de retorno de la inversión).
   1. Utilice la barra de desplazamiento de "C" para ver los canales que utiliza para capturar el marcador señalado en el paso 1.1.
   2. Utilice la barra de desplazamiento de "Z" para mover a través de los planos focales. Elegir una sola rebanada o crear una proyección de rebanadas múltiples haciendo clic en "imagen | Pilas | Proyecto Z"y sistema"Start slice"y"Parada de slice"para abarcar el ROI.
      Nota: Ajuste de los ''proyección tipo "a"Máxima intensidad"en el"proyecto Z"cuadro de diálogo es a menudo más adecuado para acentuar las estructuras para la segmentación en la sección 5, aunque esto puede no ser apropiado para todas las aplicaciones. Si otro tipo de proyección es necesaria para el análisis, tenga cuidado de guardar y documentar este archivo como tal para la extracción de la característica en la sección 6 o 7.
   3. Generar una nueva imagen que contiene los canales y plane(s) focal de interés para simplificar los siguientes pasos en el protocolo de análisis de imagen. Seleccione "imagen | Duplicados,"el deseado"canales"(c) y"Rodajas"(z) y cambiar el nombre del archivo para reflejar la selección (por ejemplo, [nombre del Grupo Experimental] _ [nombre del espécimen] _ [date]_[Channel(s)]_[z-plane(s)]) el experimento.
3. Utilice uno de las "herramientas de selección" en la barra de herramientas de Fiji para seleccionar manualmente un ROI estandarizado basado en los criterios de selección determinados en el paso 4.2.
4. Añadir el retorno de la inversión a cargo de ROI haciendo clic en "analizar | Herramientas | ROI Manager "y haga clic en"Agregar"en el menú de ROI Manager. Guarde el ROI en el ROI Manager menú haciendo clic en "más | Guardar"y luego el nombre al archivo para reflejar el retorno de la inversión (por ejemplo, [nombre del Grupo Experimental] _ [nombre del espécimen] _ [fecha experimento] _ [canales] _ [z-plane(s)] _ [Descripción de ROI]).
   Nota: Esto puede ser reabierto en Fiji para posteriores análisis o se puede aplicar a otros canales o imágenes como en la sección 5.3.

5. procesamiento y segmentación con solapas h-maxima

1. Realizar procesamiento previo en el canal utilizado para capturar las estructuras de interés.
   1. Si el archivo de imagen consta de múltiples canales, separar los canales haciendo clic en "imagen | Color | Dividir canales"para aislar el canal de interés.
   2. Aplicar un filtro como el filtro de mediana para reducir el ruido y Desenfoque gaussiano para suavizar haciendo clic en "proceso | Filtros | Filtro tipo"(p. ej.,"Median Filter"o"Desenfoque gaussiano").
      1. Muestra diferentes filtros y filtro de parámetros en las imágenes de cada grupo experimental. Proceda al paso 6.2 con un ejemplo representativo de cada grupo para comprobar el funcionamiento de la segmentación. Seleccione el filtro y ajustes que facilitan la segmentación de las estructuras de interés.
   3. Configuración y registro del filtro. Aplicar estos parámetros a través de grupos experimentales.
   4. Guardar una copia de la imagen como un archivo tiff incluyendo el filtro aplicado para referencia. Utilice un nombre detallado como [nombre de Grupo Experimental] _ [nombre del espécimen] _ [fecha experimento] _ [Channel] _ [z-plane(s)] _ [filtro con parámetros].
2. Realizar segmentación de estructuras de interés con la herramienta de cuencas h-maxima interactiva en la imagen preprocesada generado y guardado en el paso 5.1.
   1. Con la imagen preprocesada en Fiji, iniciar la herramienta de h-maxima cuenca interactivo haciendo clic en "SCF | Etiquetado | H_Watershed interactivo".
      Nota: Este plugin primero calcula la cuenca y luego le permite explorar los efectos de máximos locales y opciones de umbral en la segmentación a través de una imagen de salida actualizados al instante.
   2. Desde el panel de control, ajustar la dinámica de semilla (h), umbral de intensidad (T) y pico de inundación (%) para optimizar la segmentación.
      Nota: Consulte siempre la imagen raw antes de preprocesamiento de sección 4.2 inspeccionar manualmente el rendimiento de la segmentación de las estructuras de interés.
   3. Cuando esté satisfecho con los resultados de la segmentación, seleccione "Exportar máscara de regiones" y elegir "Exportar". Esto genera una imagen binaria de los resultados de la cuenca (figura 1, segmentación).
   4. Registrar los parámetros de segmentación; Estos parámetros deben ser aplicadas a través de grupos experimentales para comparaciones cuantitativas. Guardar la mascarilla de resultados binarios, si lo desea para la referencia con los parámetros de segmentación en el nombre como [nombre de Grupo Experimental] _ [nombre del espécimen] _ [fecha experimento] _ [canales] _ [z-plane(s)] _ [filtro con parámetros] _ [H_Watershed parámetros].
3. Extracto de las estructuras de interés de los resultados de la cuenca.
   1. Abra el ROI guardado de paso 4.4, en el administrador de ROI. Con la máscara de regiones binarias de paso 5.2.4 activo, seleccione el ROI desde el administrador de ROI para aplicar a la imagen para limitar la extracción de la característica para el ROI estandarizado.
   2. Con el retorno de la inversión activa la máscara binaria cuenca, elegir "analizar | Analizar las partículas"con"Añadir al administrador"seleccionado en el cuadro de diálogo extraer características.
      Nota: Esto agregará un identificador de partícula para cada estructura delineado durante la segmentación para el ROI Manager. Opciones están disponibles en este menú excluir características basadas en el tamaño o circularidad si es necesario para refinar estructuras incluidas en el análisis.
   3. Guardar las partículas haciendo clic en "más | Guardar"en el menú de administrador de ROI. Asegúrese de que identificadores son deseleccionados y todas las partículas todo se guardará en un archivo zip. Utilice un nombre detallado como [nombre de Grupo Experimental] _ [nombre del espécimen] _ [fecha experimento] _ [canales] _ [z-plane(s)] _ [filtro con parámetros] _ [H_Watershed parámetros] _ [estructuras].

6. cantidad, área y cuantificación de la intensidad y el análisis

1. Abra la imagen raw generado y guardado en el paso 4.2. Desplácese hasta el canal utilizado para la captura de las estructuras de interés.
   Nota: Es fundamental tomar medidas de intensidad de la imagen raw (antes de preprocesamiento) como aplicación de filtros en los cambios de paso 5.1 los valores de píxel.
2. Abra las partículas obtenidas de la extracción de la característica en el paso 5.3 y seleccionar "Mostrar todo" desde el administrador de ROI.
   Nota: Esta acción superposición de un esquema de cada partícula en el "ROI Manager" en la imagen y debe coincidir con los bordes de las estructuras de interés (figura 1, la extracción de la característica).
3. Establecer las mediciones deseadas haciendo clic en "analizar | Set de mediciones".
   Nota: El área, intensidad y densidad de las partículas pueden medirse eligiendo "área" y "densidad integrada". Cuando se selecciona densidad integrado, Fiji produce dos valores: 'Densidad integrado' calcula como el producto de la zona y valor de gris medio y 'Primas integración densidad' medido como la suma de los valores de píxeles. Densidad de la proteína fluorescente en las partículas se calcula como la suma de los valores de píxeles dividida por el área. El número de las partículas generadas en el paso 5.3 indica la cantidad de partículas dentro del tejido del que retorno de la inversión definido en el paso 4.4.
4. En el menú de ROI Manager elija "Medida". Los resultados se expresan en unidades calibradas como las mediciones de archivos derivados en Fiji desde el software de imágenes. Copiar los resultados de la ventana de resultados y pegue en software de hoja de cálculo para la compilación y cálculos posteriores.

7. radiométrica cuantificación y análisis de datos

1. Siga los pasos 6.1 y 6.2 para abrir identificadores de la partícula en el primer canal prima de interés.
2. Establecer las mediciones deseadas haciendo clic en "analizar | Set de mediciones".
   Nota: La intensidad media por partícula se puede medir por elección "Significa valor de gris".
3. Desde el ROI Manager seleccione "Medida". Copiar datos desde la ventana de resultados y pegue en software de hoja de cálculo.
4. Mover la barra de desplazamiento de "C" para el segundo canal de la materia prima de interés, GFP en este ejemplo (Figura 4A) y repita los pasos 7.2. y 7.3.
   Nota: Las partículas que se guardó en el paso 5.3 por defecto en el canal y la rebanada de la cual se generó. Tenga cuidado para asegurar que las partículas se aplican al canal correcto de interés.
5. Calcular el cociente de la intensidad de la segunda para cada partícula en el software de hoja de cálculo de la intensidad de un canal.
6. Utilice un diagrama de dispersión para visualizar y cuantificar datos radiométrica de fluoróforos que exhiben cambios individuales de los procesos biológicos subyacentes.
   1. Generar un diagrama de dispersión en el software de gráfica.
      Nota: Cada punto de datos representa una estructura de interés donde la intensidad del primer fluoróforo de interés es el valor de"x" y la intensidad del segundo fluoróforo es el "valor y" medido de cada partícula.
   2. Establecer umbrales para cada fluoróforo definir los cuadrantes que bloquean.
7. Usar Perfil de línea para visualizar fluoróforo intensidad a través de una estructura de interés.
   1. Seleccione un ROI generado en el paso 5.3 y utilice la herramienta de línea recta en la barra de herramientas para dibujar una línea recta a través del retorno de la inversión. Agregue la línea de retorno de la inversión para el ROI Manager.
   2. Para cada canal de interés, con la línea de retorno de la inversión activa, seleccione "analizar | Parcela de perfil".
      Nota: La función de Perfil de terreno va a generar una trama de histograma y una tabla de los valores de la intensidad a lo largo de la línea. Copiar resultados medidos de cada canal y pegar en el software de hoja de cálculo para generar un diagrama que muestra ambos canales a lo largo de la línea.

Representative Results

Cuantificación de la intensidad de fluorescencia de etiquetado agregados Htt mutantes en el lóbulo óptico de Drosophila , número y zona

Para investigar la agregación de proteínas mal plegadas en el sistema nervioso central de un modelo de Drosophila de la enfermedad de Huntington, etiquetado RFP mutante humano Htt con expansión patológica ( o no patológico (UAS-RFP-hHttQ15) UAS-RFP-hHttQ138) y membrana GFP (mCD8::GFP UAS)¹¹ Co expresado bajo un controlador de pan-neuronal elav-GAL4. Cerebros de moscas hembra 2 días después de la eclosión (DDE) fueron disecados, fijo y teñidos con DAPI según el artículo 2 del protocolo. Láser confocal de la microscopia de barrido se realizó centrándose en el lóbulo óptico con un 40 X objetivo de inmersión de aceite, 1.30 apertura numérica (NA), con una velocidad de exploración de 8,0 μs por píxel y resolución espacial de 1024 por 1024 píxeles (12 bits por píxel). El tamaño de paso óptimo determinado por el software de imágenes fue de 1.08 μm por rebanada para el objetivo con la siguiente combinación de longitudes de onda de excitación/emisión: canal 1) 488/510 para GFP, canal 2) 543/581 para el RFP y canal 3) 405/461 para DAPI. Configuración del detector de imagen aplicado a todos los grupos para capturar imágenes adecuadas para las comparaciones, se basaron en una muestra de RFP-Htt-Q138, que acumula el RFP-Htt agregados de alta intensidad, en lugar de una muestra de control no patógenos RFP-Htt-Q15, que mantiene niveles bajos de RFP-Htt difusa (figura 2). Si se establecieron ajustes de adquisición de imagen para aprovechar al máximo el rango dinámico de un espécimen de RFP-Htt-Q15, los agregados de RFP-Htt-Q138 saturados. Por ejemplo, una micrografía de la agregación de la proteína en el lóbulo óptico de Drosophila se guardó como HttQ138_Opticlobe.01_01012018_Ch1.RFP-Htt_Ch2.GFP_Ch3.DAPI.

El lóbulo óptico entero fue reflejado durante microscopia y consistió en unas 15 rodajas z, pero después de la proyección de imagen se determinó que analizar un solo plano de z era lo mejor resolver estructuras de individuo que de lo contrario aparecerían superpuesta en una proyección debido a la alta densidad en el tejido. Para determinar un ROI estandarizado, los cuerpos celulares C2 y C3, situados entre la médula y lobula la placa del lóbulo óptico¹² fueron usados como un punto de referencia anatómica. En Fiji, la imagen fue duplicada así para reflejar los requisitos de análisis y se guardó como un archivo tiff llamado HttQ138_Opticlobe.01_01012018_Ch1.GFP_Ch2.RFP-Htt_Ch3.DAPI_z8, donde z8 refleja el octavo segmento donde eran mayoría los cuerpos celulares neuronales C2 y C3 prominente por DAPI tinción (figura 1A, adquisición de imágenes). Se utilizó la herramienta de selección de polígono para seleccionar manualmente un ROI en el lóbulo óptico utilizando la coloración de DAPI y neuronal señal GFP como guía (figura 1A, selección de ROI, donde amarillo indica que el ROI y rojo señala la imagen de alta magnificación para claridad en los siguientes paneles del flujo de trabajo). A continuación, se aplicó un filtro de desenfoque gaussiano con el valor σ el valor 1 al canal Htt RFP para suavizar la imagen y facilitar la segmentación (figura 1A, preprocesamiento) y el rendimiento de downstream segmentación y extracción de la característica con y sin este paso de preprocesamiento se ilustra en la figura 1A. H-cuenca interactiva fue realizada en imágenes del canal Htt RFP con los siguientes parámetros: semilla dinámica, 30; umbral de intensidad, 500; pico de inundación (en %), 80; con 'permite dividir' y 'máscara de regiones de exportación' seleccionado (figura 1A, segmentación). La máscara de regiones binario resultante se guarda como HttQ138_Opticlobe. 01_01012018_Ch2.RFP-Htt_z8_GuassianBlur-sigma1_HWatershed-h30_T500_80percent y usados para generar partículas con la herramienta de analizar partículas con una exclusión de tamaño mínimo de 0.4 μm² definir proteína agregados^13,14 . Las partículas resultantes se salvaron del Gerente del ROI como HttQ138_Opticlobe.01_01012018_Ch1.RFP-Htt_z8_GuassianBlur-sigma1_HWatershed-h30_T500_80percent_aggregates y se aplicaron al canal RFP-Htt crudo (antes de preprocesamiento) para extraer datos imagen cuantitativos (figura 1A, extracción de la característica).

Cuantificación del número de agregados de RFP-Htt semiautomática segmentados de planos focales estandarizados a través del lóbulo óptico de Drosophila revela expresión difusa de la expansión de Htt-Q15 no patógena y la acumulación de proteína agregados por la expansión de Q138 Htt enfermedad-que causan (figura 2A-C). La suma de todos los valores de píxel en cada partícula de 'Crudo densidad integrado' fue utilizada para comparar el contenido de la solicitud de propuestas-Htt de cada agregado. Perfiles de tamaño e intensidad de los agregados de un plano focal estándar de cinco lóbulos ópticos diferentes expresando Htt Q138 ilustran la robustez y reproducibilidad de este flujo de trabajo (Figura 2D, E). En particular, cuando agregados fueron sobreexpuestos durante la adquisición de la imagen (Figura 3A, B), cuantificación de tamaño y número de agregados son comparables a los agregados capturados con la exposición ideal (figura 3, D), sin embargo la intensidad de los agregados sobreexpuestos se convierte en función del tamaño como pixeles saturados presentan el valor de intensidad máxima (figura 3E, F). Por lo tanto, establecer parámetros apropiados de exposición exploración es fundamental para extraer toda la gama de composición molecular cuantitativa de agregados proteicos.

Radiométrica basado en la cuantificación de flujo de autofagia en la lámina visual de Drosophila con tándem fluorescente Atg8a reportero

Para evaluar flujo de autofagia-lisosoma en el sistema visual de Drosophila , mCherry-GFP-Atg8a reportero fue ubicuo expresada en control o moscas Drosophila Espermina Sintasa (DSM) mutante homocigótico (DSM^e/e) con controlador de Actina-GAL4 . DSM^e/e vuela neurodegeneración de exposición que se asocia con deterioro del flujo autophagic debido a disfunción lisosomal¹⁵. Cerebros con lámina atado de moscas hembra a 5 DDE fueron disecados, fijo y teñidos con DAPI. La lámina era reflejada por láser, microscopía confocal con un 100 X aceite inmersión objetivo, 1.35 apertura numérica (NA), a una velocidad de muestreo de 8,0 μs por píxel y 12 bits por píxeles de resolución óptica y el tamaño de paso de 1,2 μm.

Este análisis fue realizado en una máximo z-proyección de siete rodajas z a través de la lámina para aumentar el poder de toma de muestras de las escasas estructuras de Atg8 positivo (figura 1B, adquisición de imágenes). El ROI estandarizado fue dibujado manualmente con la herramienta de selección de polígono alrededor de la capa del cuerpo de la célula reveló por DAPI y basado en la anatomía bien caracterizado y organización celular del tejido (figura 1B, selección de ROI, donde amarillo indica la ROI y rojo señala la imagen de alta magnificación para mayor claridad en los siguientes paneles del flujo de trabajo)¹⁶. El reportero de tandem se basa en las propiedades de estabilidad de GFP y mCherry mitades para marcar la progresión a través de la vía de la autofagia-lisosoma, que GFP se apaga por la acidez del lisosoma donde mCherry permanece hasta que es degradada. Por lo tanto, el fluoróforo mCherry perdurable fue utilizado para la segmentación en este protocolo. Al canal mCherry (figura 1B, preprocesamiento) aplicó un filtro de desenfoque gaussiano con el valor σ 1 y H-cuenca interactiva fue realizada con los siguientes parámetros: semilla dinámica, 0; umbral de intensidad, 800; pico de inundación (en %), 90; con 'permite dividir' y 'máscara de regiones de exportación' seleccionado (figura 1B, segmentación). La máscara de regiones binario resultante se utilizó para generar partículas con la herramienta de analizar partículas. Las partículas resultantes se aplican a los canales GFP raws y raw mCherry (antes de preprocesamiento) para extraer datos cuantitativos proporcionales de compartimentos de autofagia-lisosoma (figura 1B, extracción de la característica).

Inspección visual de estructuras mCherry-GFP-positivas de Atg8 indica enriquecimiento en la región del cuerpo celular de la lámina, consistente con informes anteriores de transporte retrógrado de vesículas autofágicas al cuerpo de la célula en neuronas¹⁷. Perfil de terreno fue utilizado para visualizar mCherry y la intensidad de la GFP, a través de varias estructuras de Atg8 positivo (ver línea ROIs en Figura 4A y perfiles de intensidad resultante a lo largo de la línea en la Figura 4B), revelando las diferencias en el reportero de alto intensidad de ambos fluoróforos indica autophagosomes (figura 4B3), mCherry alta y GFP bajo indica fusión con lisosoma como GFP se apaga en este compartimiento ácido (figura 4B1), y finalmente mCherry baja refleja la degradación dentro de el lisosoma (figura 4B2). Un diagrama de dispersión generado a partir de la intensidad del fluoróforo media de cada partícula mCherry Atg8 de positivo semiautomática segmentada ilustra el flujo a través de la vía de la autofagia-lisosoma que luego fue separada en pasos discretos por análisis del cuadrante ( Figura 4). La parcela se dividió en cuatro cuadrantes mediante umbrales bloquea de GFP = 570, mCherry = 1.800. Los umbrales se establecieron basándose en el grupo de control con los siguientes principios: (1) el diseño del reportero fluorescente de tandem y las propiedades de los dos fluoróforos, así que teóricamente GFP debe no es fluorescente cuando no hay ninguna señal de mCherry (cuadrante IV) y (2) la distribución de partículas de Atg8 positivo refleja la distribución de autofagia-lisosoma vía relacionados con compartimentos en las neuronas de tipo salvaje donde autofagia basal es altamente eficiente^18,19. En la lámina de control de moscas, alrededor 25% de las partículas positivas de Atg8 se clasifica como autophagosomes (cuadrante I), y la mitad de la puncta se procesan más allá de la fusión autophagosome-lisosoma (cuadrante II y III); DSM^e/e laminas habían aumentado significativamente autophagosomes o lisosomas disfuncionales (cuadrante I) y autolysosomes (cuadrante II y III), sugestivo de autophagosome acumulación a través de los defectos en fusión de autophagosome-lisosoma y degradación lisosomal (figura 4 C, D). Datos cuantitativos también apoyaron la evidente acumulación de estructuras positivas de Atg8 en lámina de moscas DSM^e/e (figura 4E). Análisis radiométrica de GFP señal y media mCherry destacó una diferencia entre grupo control y DSM^e/e (figura 4F) pero no podría detallar la influencia general en el camino ni los pasos específicos que se reveló por la Análisis del cuadrante.

Figura 1: Flujo de trabajo a través de la segmentación minimizar sesgos, semi-automatizado de estructuras subcelulares en el cerebro de la Drosophila con Fiji ejemplos. (A) representante micrografías confocales del solo plano focal a través del lóbulo óptico de un cerebro adulto de Drosophila expresar pan neuronal mutante etiqueta RFP Htt y orientada a la membrana de la GFP (elav-GAL4 > UAS-mCD8:GFP, UAS-RFP-hHttQ138) con DAPI que se manchaba (adquisición de la imagen). DAPI y GFP se utilizan para seleccionar un ROI (amarillo) en el lóbulo óptico; cuadro rojo indica región magnificada a través de flujo de trabajo para mayor claridad (selección de retorno de la inversión). Preprocesamiento del panel muestra alta magnificación de imagen raw del canal de RFP-HttQ138 (arriba) y después de la aplicación de un filtro de desenfoque gaussiano, σ1 (abajo). Segmentación por cuenca interactivo h-maxima utilizando la configuración de los parámetros indicados para la dinámica de semillas determinado por h-maxima (h), criterios de parada cuenca global determinados por el umbral de intensidad (T), y criterios de parada regional determinados por pico (inundaciones %) realizados en la RFP HttQ138 cruda (parte superior) y gaussiano borrosa (parte inferior) imágenes y resultados de cuencas de regiones máscara procedente de cuenca plugin e invertida para mayor claridad. Las partículas generadas por analizan partículas (magenta) superpuestas en las imágenes raws de RFP-HttQ138 (extracción de la característica). Las flechas indican agregados que son demasiado segmentados sin proceso previo y puntas de flecha indican las estructuras que no separe después de filtrar. (B) micrografías confocales representativa de máxima proyección z de 7 planos focales a través de la sección horizontal de la lámina de un control y mutante (DSM^e/e) Drosophila adulto expresando ubicua (GFP-mCherry-Atg8a actinia-GAL4 > UAS-GFP-mCherry-Atg8) con DAPI (adquisición de la imagen) la coloración. DAPI se utilizó para seleccionar un ROI (amarillo) alrededor de la capa del cuerpo celular de la lámina; cuadro rojo indica región magnificada a través de flujo de trabajo para mayor claridad (selección de retorno de la inversión). Panel de preprocesamiento muestra alta magnificación de mCherry canal con filtro de desenfoque gaussiano, σ1 aplicado a control y lámina mutante. Segmentación por cuenca h-maxima interactivo realizado en las imágenes filtradas mCherry con la configuración de los parámetros indicados, y cuenca resultados se muestra como regiones binarias máscara invertida para mayor claridad. Las partículas generadas por analizan partículas (magenta) superpuestas en el mCherry raw e imágenes GFP (extracción de la característica). Barras de escala = 50 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: cuantificación del tamaño y la intensidad de agregados de RFP-Htt mutantes son robusta y reproducible. (A-B) Cerebro de la Drosophila con RFP-hHttQ15 (A) o RFP-hHttQ138 expresión (B) en un controlador de pan-neuronal elav-GAL4 fueron disecado y fija y los lóbulos ópticos fueron reflejados por microscopía confocal de barrido láser. Barra de escala = 50 μm. (C) el número promedio de agregados en cada grupo cuantificado de un ROI manualmente seleccionado alrededor del lóbulo óptico y se centró en una rodaja z estandarizada (n = 5). (D-E) El tamaño (D) y la intensidad total (E) de agregados de RFP hHttQ138 cuantificado de estandardizan ROIs en los lóbulos ópticos de 5 diferentes animales. Datos agregados se grafica en escala logarítmica. Agregados fueron definidos como objetos de más de 0,4 μm² (línea discontinua en D). Análisis estadístico ANOVA unidireccional, NS: no significativo; a.u.: unidad arbitraria haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: la sobreexposición de la imagen conduce a mediciones de intensidad incorrecta. (A-B) Micrografía confocal representante de la misma optic lobe con la exposición ideal (A) y pseudocolored (B) la sobreexposición con el LUT de HiLo en Fiji. Rojo en B indica agregados sobreexpuestas. Barra de escala = 50 μm. (C) cuantificación de tamaño agregado después de la implementación de parámetros de la cuenca h maxima para generar resultados similares de segmentación. Análisis estadístico, prueba de tmuestras independientes, NS: no significativo. (D) distribución de frecuencia del tamaño del agregado en imágenes ideales y sobreexpuestas. Agregados con un tamaño de 5 a 25 μm² más fueron agrupadas en 4 grupos categóricos. (E -F) Análisis de correlación de la intensidad de los agregados en función de tamaño agregado (E). Una línea de referencia es dibujado (negro) cuando todos los píxeles tienen un valor de intensidad máxima de 4095. La casilla verde indica agregados debajo de 10 μm² zona se muestra en la F. b: coeficiente de regresión, R²: coeficiente de determinación; a.u.: unidad arbitraria haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Cuantificación de un reportero tándem fluorescente mCherry-GFP-Atg8a genético revela características de flujo autofagia en Drosophila. (A) representante micrografías confocales de Drosophila lámina de moscas mutantes DSM^e/e y control ubicuo expresando mCherry-GFP-Atg8a (actinia-GAL4 > mCherry-GFP-Atg8a) y se tiñen para DAPI . Áreas punteadas en caja de la capa del cuerpo de la célula de lámina se muestran en alta magnificación (derecha). Números indican estructuras representativas de la positivas de Atg8a trazan en B y cuantificaron en C. (B) histograma diagrama de la intensidad de fluorescencia en unidades arbitrarias (UA) a lo largo de la línea ROIs indicados en imágenes de gran aumento en las estructuras de mCherry-GFP-Atg8 A. (C) trazadas la intensidad media del GFP en función de la intensidad de la medias mCherry medida de lámina control y DSM^e/e (partículas que miden de 3 láminas de cada grupo). La parcela se dividió en cuatro cuadrantes mediante umbrales bloquea de GFP = 570 y mCherry = 1800 con el porcentaje de estructuras en cada cuadrante indicado por genotipo. (D) cuantificación de los porcentajes promedios de mCherry-GFP-Atg8 clasificados en cada cuadrante en C (n = lámina 3). ()E) cuantificación de las cantidades de puncta mCherry-GFP-Atg8 por lámina (media ± D.S., n = lámina 3). (F) análisis radiométrica de mCherry-GFP-Atg8 estructuras observan en control y lámina mosca mutante (significa con IC del 95%, n = lámina 3). Estudiante t-pruebas. P < 0.05, **P < 0.01. Sscale barras = 2 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

El protocolo descrito aquí puede utilizarse para robusta y reproducible cuantificar procesos biológicos celulares visualizados por la proyección de imagen basada en fluorescencia. Contexto biológico y limitaciones técnicas necesitan ser cuidadosamente considerados para orientar el diseño experimental. Marcadores fluorescentes de estructuras subcelulares de interés, si immunohistochemical, teñir-basada, o genético expresado deben ser distinguibles sobre fondo de morfología e intensidad. El sistema de GAL4/UAS es ampliamente utilizado para impulsar la expresión de genes específicos en Drosophila. Los ejemplos presentados aquí utilizan líneas transgénicas que GAL4 Controladores para activar la transcripción de proteínas fluorescencia etiquetas bajo el control del potenciador de la UAS para investigar la agregación de proteína mal plegada y autofagia en el sistema nervioso. Si simultánea expresión de un transgen experimental de la UAS se requiere junto con un reportero fluorescente transgenes, entonces el grupo de control debe también incluir co-la sobreexpresión de un transgén inconsecuente a control para dosificación de GAL4, por ejemplo UAS-GFP o UAS-lacZ. Preparación de la muestra estandarizada, como se indica aquí para el sistema nervioso central de Drosophila y sistema visual, de disección, fijación, anticuerpo de la coloración, a través del montaje, es fundamental para la cuantificación y proyección de imagen óptima.

Buenas prácticas que maximizan la relación señal a ruido y rango dinámico de la proyección de imagen son necesarios para el análisis semi-automatizado y son primordiales para las comparaciones exactas entre grupos experimentales. Parámetros de adquisición de la imagen deben ajustarse para que el reportero no es sobresaturado para que toda la gama de intensidad de proteína puede ser extraída y cuantificada (figura 3). Para las comparaciones cuantitativas, la proyección de imagen debe realizarse con los mismos parámetros de adquisición y preferiblemente el mismo día.

Selección de ROI, procesamiento de imágenes, segmentación característica y extracción de la característica usando la plataforma de código abierto ImageJ/Fiji son dependientes de las aplicaciones; mientras que los parámetros iniciales deben ser definidos por el usuario, su aplicación a través de muestras minimizará el sesgo maximizando la salida de datos cuantitativos. Es crítico para flujo de trabajo de documento cuidadosamente y se recomienda para guardar una imagen como un archivo tiff después de cada paso con detalle de nombre de archivo procesamiento. Esto puede ser especialmente útil cuando los parámetros para la primera vez y sirven como punto de referencia para asegurar la consistencia entre grupos experimentales en cada paso de procesamiento de imágenes y análisis de protocolo. Deberían definirse los criterios de selección de ROI usando marcadores o puntos anatómicos de un grupo de control, pero debe tenerse cuidado para asegurarse de que las manipulaciones experimentales no altera los marcadores o puntos de interés de manera que impidan una indicación confiable de un estandarizar el retorno de la inversión. Puede seleccionarse una sola rebanada o una proyección z de varias rebanadas atender mejor los objetivos del análisis, donde un solo plano focal puede ser útil para mejorar la separación de estructuras de vecinos, y una proyección de z puede ser útil para el análisis de las estructuras localizados en todo el volumen de tejido. El tipo de proyección z utilizada segmentación y análisis de la imagen debe ser determinado cuidadosamente y de manera independiente. Una proyección de máxima intensidad producirá una imagen nítida, ya que las estructuras son más brillantes en los planos donde están en foco y generalmente están bien adaptadas para la segmentación. Análisis de la imagen pueden ser aceptable en una proyección máxima, como en el ejemplo de análisis de la autofagia-lisosoma; Estructuras de Atg8-positivo son más pequeñas que el tamaño de paso utilizado para muestreo, así más exactamente son representados por la intensidad máxima del plano focal único desde el que fueron capturados. Sin embargo, para el análisis de las estructuras más grandes que el tamaño de paso, una proyección de suma que agrega todos los píxeles con las mismas coordenadas xy puede representar más exactamente la información de intensidad de cada estructura. Aunque este protocolo está diseñado para analizar una sola rebanada o una z-proyección de múltiples cortes en 2D, el flujo de trabajo podría ser fácilmente adaptado para analizar estructuras 3D en una serie z con varios de las mismas herramientas. Análisis 3D sería deseable un tamaño de muestra pequeño de estructuras de forma irregular, donde una rodaja z que cruza oblicuamente la estructura sería sesgar el análisis.

Procesamiento previo con un filtro, como los sugeridos en este protocolo, puede reducir el ruido mientras que preserva los bordes para ayudar a la detección de estructuras de interés durante la segmentación; homogeneidad de fondo ruido y fluorescente de marcador sin suavizado suficiente resultará en segmentación excesiva, mientras que ajustes que demasiado desenfoque serán quitar detalle y evitar la detección de bordes precisos. Segmentación por cuenca considera la imagen como una superficie topográfica con una fuente de agua en el local maxima — píxeles de alta intensidad en una imagen fluorescente, que inunda hasta topar con las vecinas áreas inundadas donde una presa, o límite de segmento, se construye²⁰. La cuenca h maxima utiliza un umbral definido por el usuario (dinámica h maxima en plugin SCF-MPI-CBG) para distinguir significativos máximos locales para evitar la excesiva segmentación de estructuras que no tienen un único máximo local²¹. El plugin de cuenca interactivo h-maxima en este protocolo permite al usuario ajustar la dinámica de h-maxima (h) criterios de parada cuenca global determinados por el umbral de intensidad (T) y criterios de parada regional determinados por pico de inundación (%), mientras que al instante viendo los resultados de la cuenca en una imagen de salida para evaluar cualitativamente el desempeño de la segmentación. Resultados segmentación cerca estarán de acuerdo con límites de la estructura de la mayoría, aunque excesiva segmentación y separación incompleta (figura 1A, flechas rojas en la extracción de la característica) pueden ocurrir donde el etiquetado fluorescente es no homogéneo o el tejido es densamente pobladas. La eficiencia de las etapas de segmentación y análisis semiautomáticos se puede aprovechar para aumentar el poder de toma de muestras y mitigar riesgos de segmentación.

Segmentación y extracción de la característica, es sencillo extraer información morfológica como área, dimensiones y circularidad. Además, si las imágenes se recogen apropiadamente para evitar sobreexposiciones, información molecular también se infiere de este análisis de la imagen por las medidas de intensidad. Una vez las medidas de la patología de enfermedades neurodegenerativas son extraídas y cuantificadas por este enfoque, estas medidas se pueden utilizar para abordar una serie de preguntas importantes. Específicamente, el protocolo ha demostrado el potencial de uso de análisis de imagen y cuantificación de agregados de proteína para identificar los factores que influyen en la agregación de la proteína y correlacionan la distribución, número, tamaño y densidad de los agregados de proteína con disfunción neuronal y la salud. Cuantificación basada en radiométrica puede utilizarse para informar a total interacción con componentes subcelulares o procesos durante la progresión de la enfermedad. Mientras que la bioquímica citometría de flujo han sido aplicados para analizar la interacción de agregados y con otras estructuras subcelulares y lisis celular pueden conducir a pérdida de la proteína, cambiar propiedades del agregado y perturbar de interacciones proteína-proteína²². mCherry-GFP-Atg8 ha sido ampliamente utilizado para monitorear autofagia mediante microscopía de fluorescencia, sobre todo en las células cultivadas²³, pero carecen de métodos analíticos cuantitativos e imparciales. Además, en vivo el análisis usando el reportero tándem genéticamente codificados es un reto y requiere preparación de tejido y fondo genética altamente controlada. Este protocolo describe comprobada metodología de preparación de tejido para imágenes prácticas fundamentales para cuantificar los compartimientos de la autofagia-lisosoma. Con buenas prácticas genéticas, los enfoques de análisis de imagen incluyendo Atg positivas partículas intensidad perfiles y análisis de cuadrante con gating de señales fluorescentes individuales, puede permitirse potente detección y comparación de normal y patológico autofagia flujo en vivo en modelos de enfermedades diversas.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SYLGARD(R) 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning Corporation	PF184250	Dissection dish
Falcon 35 mm Not TC-Treated Easy-Grip Style Bacteriological Petri Dish	Corning	351008	Dissection dish
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-20	Dissection tool
Sodium Chloride	Sigma	S3014	PBS solution
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma	S5136	PBS solution
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma	P5655	PBS solution
Triton X-100	Sigma	T9284	Washing and antibody incubaton solution.
37% Formaldehyde	VWR	10790-710	Fixation
Disposable Microcentrifuge Tubes (0.5mL, blue)	VWR	89000-022	Fixation, washing, and antibody incubaton.
Plain and Frosted Micro Slides (25×75mm)	VWR	48312-004	Slides for confocal imaging
Micro Cover Glasses, rectangular (22×40mm)	VWR	48393-172	Slides for confocal imaging
Rubber Cement	Slime	1051-A	Mounting
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories, Inc.	H-1000	Mounting
Scotch Magic 810 Invisible Tape (19mm×25.4m)	3M Company	810	Mounting
Normal Goat Serum	Thermo Fisher Scientific	PCN5000	Antibody incubaton
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Thermo Fisher Scientific	D1306	Nucleic acid staining. Dissolve in deionized water to make a 5 mg/mL stock solution and store at -80°C. Dilute to a working concentration of 10-20 μg/mL in PBTx.
3.5X-90X Stereo Zoom Inspection Industrial Microscope	AmScope	SM-1BNZ	Dissection scope. Equipped with 6W LED Dual Gooseneck Illuminator
ImageJ/Fiji	NIH	v1.51u	With SCF_MPI_CBG plugins (version 1.1.2)
FV1000-IX81 Confocal-laser Scanning Microscope	Olympus
Recombinant Construct	Bloomington Drosophila Stock Center	BL37749