Summary
Wir haben einen einfachen und anpassungsfähigen Workflow zur Fluoreszenz-Imaging-basierte zellbiologischen Studien Proteinaggregation und selbstverdauende Fluss in das zentrale Nervensystem der Drosophila -Modelle von quantitativen Daten entlocken entwickelt. Neurodegeneration.
Abstract
Mit der steigenden Verbreitung von neurodegenerativen Erkrankungen ist es zunehmend wichtig, die zugrunde liegende Pathophysiologie zu verstehen, die zu neuronalen Dysfunktion und Verlust führt. Fluoreszenz-imaging-Tools und Technologien ermöglichen beispiellose Analyse der subzellulären neurobiologischen Prozesse, doch gibt es noch eine Notwendigkeit für Objektive, reproduzierbare und zugänglich Ansätze zur Extraktion von quantifizierbaren Daten aus bildgebenden Verfahren . Wir haben einen einfachen und flexiblen Workflow um quantitative Daten von Fluoreszenz basierende bildgebenden Studien mit Drosophila Modelle der Neurodegeneration zu extrahieren entwickelt. Im einzelnen beschreiben wir einen easy-to-Follow, halbautomatischen Ansatz mit Fidschi/ImageJ um zwei zelluläre Prozesse zu analysieren: Erstens quantifizieren wir aggregierte Proteingehalt und Profil in der Drosophila -Optik-Lappen mit Leuchtstoff-Tags Mutant Huntingtin-Proteine; und zweitens bewerten wir Autophagie-Lysosomen Flussmittel in Drosophila visuellen Systems mit ratiometrischen basierende Quantifizierung der fluoreszierenden Tandem Reporter der Autophagie. Wichtig ist, enthält das Protokoll hier skizzierten einen semi-automatischen Segmentierung Schritt um sicherzustellen, dass alle fluoreszierende Strukturen analysiert werden, um Selektionsbias zu minimieren und Auflösung der subtilen Vergleiche zu erhöhen. Dieser Ansatz für die Analyse von anderen biologischen Zellstrukturen erweitert werden kann und Prozesse verwickelt in Neurodegeneration, wie proteinhaltige Puncta (Stress-Granulat und synaptischen komplexe), sowie Membrane-springen Fächer (Mitochondrien und Menschenhandel membranvesikel). Diese Methode bietet eine standardisierte, noch anpassbar Referenz für Bildanalyse und Quantifizierung, und könnte Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit über das Feld erleichtern, und letztlich mechanistisches Verständnis der Neurodegeneration verbessern.
Introduction
Neurodegenerative Erkrankungen betreffen Millionen von Menschen jedes Jahr und die Häufigkeit nimmt mit einer alternden Bevölkerung1. Während jeder Neurodegenerative Erkrankung hat eine einzigartige Ätiologie, zeichnen Aggregation fehlgefaltete Proteine und Aufschlüsselung des proteostase Netzwerks gemeinsame pathologische viele dieser Krankheiten. Erläuterung, wie die Störung dieser grundlegenden und zusammenhängende Prozesse schief geht ist als Beitrag zu neuronalen Dysfunktion und Zelle Tod entscheidend für Verständnis neurodegenerativen Erkrankungen sowie therapeutische Interventionen führen. Fluoreszenz-basierte Bildgebung ermöglicht eine Untersuchung dieser komplexen und dynamischen Prozesse in Neuronen und trug wesentlich zum Verständnis der neuronalen Zelle Biologie. Analyse von eindringmittel tagged Proteinen ist anspruchsvoll, vor allem, wenn Experimente in Vivo, aufgrund der äußerst kompakten Gewebe, verschiedene Zelltypen und morphologischen Heterogenität durchgeführt werden. Manuell assistierte Quantifizierung ist erschwinglich und einfach, aber ist oft zeitaufwändig und unter menschlichen Vorspannung. Daher gibt es eine Notwendigkeit für Objektive, reproduzierbare und zugänglich Ansätze zur Extraktion von quantifizierbaren Daten aus bildgebenden Verfahren.
Wir haben einen einfachen und anpassungsfähigen Workflow mit Fidschi/ImageJ, eine leistungsfähige und frei zugänglichen Bildverarbeitungs-Software2,3, um quantitative Daten aus Fluoreszenz bildgebenden Studien in experimentellen Modellen der skizziert. Neurodegeneration mit Drosophila. Anhand dieses Protokolls Proteinaggregation und selbstverdauende Flussmittel Quantifizierung – zwei Handy-biologischen Funktionen, die für Neurodegenerative Krankheit-Pathologie von großer Bedeutung sind — wir bewiesen die Sensitivität und Reproduzierbarkeit dieses Ansatzes. Analyse der Gewebekulturen tagged mutierte Huntingtin (Htt) Proteine in der Drosophila -Optik-Lappen ergab die Anzahl, Größe und Intensität von proteinaggregaten. Wir visualisieren einen Tandem fluoreszierende Reporter des selbstverdauende Flusses in Drosophila visuellen Systems, die verschiedenen Emission Signale je nach wohnzimmertaugliche Umwelt4anzeigt. Ratiometrischen basierende Analyse des Tandem Reporter für eine quantitative und umfassende Ansicht der Autophagie-Lysosomen Flux von Autophagosome Bildung, Reifung und Transport zu einer Verschlechterung in den Lysosomen zulässig, und zusätzlich hervorgehoben anfällig Fächer in neurodegenerativen Erkrankungen gestört. Wichtig ist, finden Sie in beiden Analysen halbautomatische Schwellwerte und Segmentierung Schritte in unser Protokoll zu minimieren unbewusste Vorurteile, Probenahme-Leistung zu erhöhen, und bieten einen Standard, um Vergleiche zwischen ähnlichen Studien zu erleichtern. Die einfache Workflow soll mächtige Fidschi/ImageJ Plugins (entwickelt von Informatikern, basierend auf mathematischen Algorithmen) zugänglicher Neurobiologen und die Life-Sciences-Gemeinschaft insgesamt.
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Protocol
1. Überlegungen und Vorbereitungen für die Gestaltung von Bild-Analyse-Experiment
- Vorherbestimmen Sie geeignete anatomische, Mobilfunk oder subzellulären Markierungen dienen als Wahrzeichen für die Standardisierung einer Region of Interest (ROI) über verschiedene Proben, z. B. 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI), Membran-Marker, lokalisierte Leuchtstofflampen Protein, etc.
- Wählen Sie einen fluoreszierenden Marker, der diskrete Puncta jenseits Hintergrundkonzentrationen für die Struktur des Interesses abgrenzen kann.
Hinweis: Dieses Protokoll ist für proteinhaltige Strukturen (z.B. fehlgefaltete Protein-Aggregate) und Membrane-springen Organellen (z.B. Autophagie Reporter) optimiert. Um Proteinaggregation zu visualisieren, wurde ein RFP-Tags N-terminale Fragment des menschlichen Htt-Protein mit einer pathogenen PolyQ-Darm-Trakt von 138 Wiederholungen (RFP-hHttQ138) verwendeten5. Das mutierte Htt-Protein bildet zytoplasmatischen Aggregate ausgedrückt unter neuronalen bestimmte Treiber z. B. Ilav-GAL45,6. Um Autophagosome-Lysosomen Flussmittel zu visualisieren, diente der Aktin-GAL4 ubiquitär Ausdruck der Tandem-mCherry-GLP-Atg8a-Reporter fahren. mCherry - und GFP-positiven Puncta zeigen autophagosom, und der Fluss wird überwacht, wie GFP Fluoreszenz in das saure Milieu der Lysosomen wo Säure-unempfindliche mCherry bleibt abgeschreckt ist, bis das Protein abgebaut7. Für ratiometrischen Analyse kann ein einziger Kanal, der eine einheitliche Markierung der Struktur ist für die Segmentierung verwendet oder gegebenenfalls eine Projektion von zwei oder mehr Kanälen kann verwendet werden, um Strukturen, zu umreißen zwar nicht explizit in diesem Protokoll beschrieben. In diesem Beispiel wird mCherry als es Säure-unempfindlich ist und bleibt in dem Fach in der gesamten Fluss durch den Weg für die Segmentierung der Atg8-positiven Teilchen verwendet. - Die open-Source-Bild-Analyse-Plattform ImageJ oder Fidschi herunterladen und installieren – die bevorzugte Distribution von ImageJ mit gebündelt Plugins2,3.
- Installieren Sie das Plugin für h-Maxima interaktive Wasserscheide.
Hinweis: Dieses Protokoll verwendet Fidschi; zusätzliche Plugins sein für ImageJ erforderlich. Das plug-in entwickelt von Benoit Lombardot für SCF-MPI-CBG ist online verfügbar (https://imagej.net/Interactive_Watershed). - Navigieren Sie zu "helfen | Update", wählen Sie"Update-Sites verwalten"aus der"ImageJ-Updater", der SCF-MPI-CBG-Update-Site aus der Liste auswählen und dann schließen und neu starten, Fidschi.
2. Gehirn Sie sezieren und Immunfluoreszenz-Färbung
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Machen Sie Silikon Elastomer gesäumten Dissektion Gerichte.
- Gießen Sie Silikon Elastomer-Komponenten in ein Becherglas, wie durch die Hersteller und unter Rühren gut bis gut vermischt.
- Verwenden Sie eine Pipette, um 5 cm füllen Gewebekultur Gerichte ein Drittel bis die Hälfte voll (ca. 10 mL von Elastomer-Mischung). Lassen Sie Luftblasen an die Oberfläche aufsteigen und entfernen vorsichtig mit Seidenpapier. Decken Sie die Gerichte zu und legen Sie sie auf einer ebenen Fläche für 48-72 h bei Raumtemperatur (RT) zu heilen.
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Sezieren Sie Drosophila Gehirn und visuelle System bei Bedarf.
- Führen Sie Drosophila Gehirn Dissektion als zuvor beschriebenen8,9. Durchführen Sie die Dissektion in Elastomer gesäumten Dissektion Gerichte mit ein Elastomer-Boden, um das Gehirn zur Vermeidung von schädlichen Gewebe oder Zangen zu stabilisieren.
- Der Lamina intakt zu halten, während der Dissektion, schieben Sie zwei Pinzetten unter die Netzhaut und sanft durch die Mitte des Auges, die Netzhaut zu entfernen. Ziehen Sie jede netzhautgewebe an der Lamina mit Zange statt parallel zur Lamina Oberfläche befestigt.
Hinweis: Restliche Pigment wird in den folgenden Schritten abwaschen und in der Regel nicht stört Antikörper Färbung und imaging. - Verdünnen Sie 37 % Formaldehyd in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), eine Endkonzentration von 3,7 % in einem 500 µL Microcentrifuge Schlauch vor Gebrauch frisch zu machen. Übertragen Sie des sezierten Gehirns Microcentrifuge Schlauch mit Fix-Lösung und inkubieren Sie für 15 min bei RT mit sanftes Schaukeln.
Hinweis: Formaldehyd hat eine natürliche Tendenz zu oxidiert werden, produzieren Ameisensäure. Daher ist es vorgeschlagen, um Aliquot der 37 % Formaldehyd für die Lagerung und verdünnte auf 3,7 % frisch vor jedem Gebrauch. Übermäßige Fixierung oder unzureichende Fixierung wird die Integrität des Gewebes und Fluoreszenz10beeinflussen. - 3 Mal mit PBTx waschen (PBS mit 0,4 % Triton x-100) für 15 Minuten.
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Immunohistochemistry durchführen und Proben zu montieren.
- Wenn Antikörper Färbung erforderlich ist, entfernen Sie PBTx zu, fügen Sie Primärantikörper in PBTx mit normalem ziegenserum 5 % verdünnt hinzu und auf einem aliquoten Mixer über Nacht bei 4 ° c inkubieren
- Entfernen Sie Primärantikörper und waschen Sie 3 Mal mit PBTx für 15 min. Hinzufügen Sekundärantikörper in PBTx mit normalem ziegenserum 5 % verdünnt und 1 h bei RT inkubieren oder über Nacht bei 4 ° c Waschen Sie 3 Mal mit PBTx für 15 min.
- Nach Bedarf DAPI-Färbung PBTx zu entfernen, fügen Sie DAPI-Lösung (Lösung auf Lager: 5 mg/mL zu verdünnen, zu einer Arbeit Konzentration von 15 µg/mL in PBTx), und 10 min bei RT. Wash 3 Mal mit PBTx für 15 min inkubieren.
- Um das Gewebe zu löschen, geben Sie einen Tropfen Eindeckmedium auf die Mitte einer Mikroskopie-Folie mit einem Abstandhalter eine Schicht aus durchsichtigem Klebeband auf beiden Seiten. Übertragen Sie das Gehirn auf den Tropfen Eindeckmittel zu, und 1 – 2 min. warten Sie, bis das Gehirn durchsichtig wird. Entfernen Sie vorsichtig das Eindeckmittel mit einer Pipette.
- Zur Montage, geben Sie einen Tropfen frisch Eindeckmedium auf die Köpfe auf der Folie. Überlagern Sie sorgfältig ein Deckglas Luftblasen zu vermeiden. Die Schnittflächen mit Gummilösung versiegeln, und Trocknen bei RT für 20 min. weiter zur Bilderfassung für optimale Ergebnisse zu erzielen.
3. die Bildaufnahme
- Mikroskop Aufnahmeparameter, wie räumliche Auflösung, Ziel, Zoom, Scan-Geschwindigkeit, zu optimieren und Schrittweite, um die Auflösung der Strukturen von Interesse zur semi-automatischen Segmentierung während Bildanalyse Erleichterung zu maximieren.
Hinweis: Es möglicherweise sinnvoll, ein Beispielbild zu erfassen und semi-automatischen Segmentierung (in Schritt 5 dieses Protokolls) zu testen, bevor alle experimentellen Proben imaging. Auf diese Weise kann der Benutzer bildgebende Einstellungen anpassen, so dass Analysewerkzeuge die biologische Struktur der Interesse leicht erkennen können. -
Einstellungen Sie Bild Detektor um die höchsten Signal-Rausch-Verhältnis und höchste Dynamik der Probe zu erfassen.
- Verwenden Sie eine LUT (siehe Tabelle), die angibt, Pixel Sättigung (Exposition zu hoch) oder Undersaturation (Offset zu niedrig) beim einstellen (Abb. 3 b, rote zeigt Pixel Sättigung durch eine LUT Hi/Low).
- Stellen Sie sicher, dass Gain und Offset Einstellungen für alle experimentellen Gruppen geeignet sind, wie experimentelle Manipulationen wahrscheinlich die Struktur von Interesse verändern.
Hinweis: Es ist zwingend notwendig, dass die gleichen Einstellungen für alle Gruppen verwendet werden, um quantitative Vergleiche anzustellen.
- Bild durch das Gewebe, alle Daten zu erfassen.
Hinweis: Es wird empfohlen, alle verfügbaren Daten während einer bildgebenden Sitzung zu erfassen und einen präziseren Bereich bei ROI Auswahl in Schritt 4 zu definieren, bei Bedarf. - Speichern Sie das Bild als Dateityp durch die Software zur Abbilderstellung unterstützt, um Metadaten wie z. B. Aufnahmeparameter und räumlichen Kalibrierung zu bewahren. Speichern Sie das Bild mit einem Dateinamen einschließlich der experimentellen Datum, genetischen Hintergrund und fluoreszierende Reporter, Antikörper oder Farbstoffe, die entsprechenden Kanäle gescannt wie [experimentelle Gruppenname] _ [Muster-Name] _ [Experiment Datum] _Ch1. [Fluorophor-Ziel /Dye]_Ch2.[Fluorophore-Target/Dye], etc.
(4) Fidschi/ImageJ Bildimport und ROI-Auswahl
- Öffnen Sie ein Bild in Fidschi. Verwenden Sie das Dialogfeld "Bio-Formate importieren Optionen", wählen Sie "Ansicht-Stack mit: Hyperstack" und "Farbmodus: Graustufen".
Hinweis: Es wird empfohlen, den Dateityp Mikroskop als Metadaten zu öffnen, wie z. B. räumliche Kalibrierung von Fidschi gelesen werden kann. -
Identifizieren Sie einen Bereich aus einer Z-Ebene oder eine Projektion basiert auf die Marker-Kanäle, die als eine standardisierte ROI über Proben (Abbildung 1, ROI-Auswahl) verwendet werden können.
- Verwenden Sie die Bildlaufleiste "C", um die Kanäle verwendet, um die Marker(s) im Schritt 1.1 bezeichneten erfassen anzuzeigen.
- Verwenden Sie die "Z" Scrollbar durch die fokale Flugzeuge bewegen. Wählen Sie ein einzelnes Stück oder eine Projektion von mehreren Scheiben zu erstellen, indem Sie auf "Bild | Stapel | Z-Projekt"und setzen"Start Scheibe"und"Stop Scheibe"um den ROI zu umfassen.
Hinweis: Die " "Projektion Einstellungstyp "bis"Max Intensität"in der"Z-Projekt"Dialogfeld oft eignet sich am besten um Strukturen für die Segmentierung in Abschnitt 5, betonen wenn dies möglicherweise nicht für alle Anwendungen geeignet. Wenn eine andere Art der Projektion für die Analyse erforderlich ist, achten Sie darauf, zu speichern und diese Datei als solche zur Merkmalsextraktion in Abschnitt 6 bzw. 7 zu dokumentieren. - Erzeugen Sie ein neues Bild mit der Kanäle und fokale Maschine(n) von Interesse, die folgenden Schritte in der Bild-Analyse-Protokoll zu vereinfachen. Wählen Sie "Bild | "Duplizieren", legen Sie die gewünschten "Kanäle" (c) und "Scheiben" (Z), und ändern Sie den Namen der Datei entsprechend die Auswahl (z.B., [experimentelle Gruppenname] [Muster-Name] _ _ [date]_[Channel(s)]_[z-plane(s)]) experimentieren.
- Verwenden Sie eine der "Auswahl-Werkzeuge" auf der Fidschi-Symbolleiste einen standardisierte ROI anhand der Auswahlkriterien in Schritt 4.2 ermittelten manuell auswählen.
- Den ROI für den ROI-Manager hinzufügen, indem "Analyze | Werkzeuge | ROI-Manager "und klicken Sie auf"Hinzufügen"im Menü ROI Manager. Speichern Sie den ROI ROI-Manager im Menü, indem Sie auf "mehr | Speichern", und benennen Sie die Datei, um den ROI zu reflektieren (z.B., [experimentelle Gruppenname] [Muster-Name] [Experiment Datum] _ [Kanäle] _ [Z-Maschine(n)] _ [ROI Beschreibung]).
Hinweis: Dies kann in Fidschi für spätere Analysen wieder geöffnet werden oder kann auch auf andere Kanäle oder Bildern wie in Abschnitt 5.3.
5. die Vorverarbeitung und Segmentierung mit h-Maxima wasserfesten
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Führen Sie die Vorverarbeitung auf dem Kanal verwendet, um die Strukturen von Interesse zu erfassen.
- Wenn die Image-Datei aus mehreren Kanälen besteht, trennen Sie die Kanäle durch Klicken auf "Bild | Farbe | Split-Kanäle", der Kanal von Interesse zu isolieren.
- Wenden Sie einen Filter wie z. B. ein Medianfilter reduzieren Lärm oder Gaußsche Unschärfe zum Glätten, indem Sie auf "Prozess | Filter | Filtertyp"(z.B."Median-Filter"oder"Gaußscher Weichzeichner").
- Probieren Sie verschiedene Filter und Filtern Sie Parameter auf Bilder aus jeder experimentellen Gruppe. Fahren Sie durch Schritt 6.2 mit ein repräsentatives Beispiel aus jeder Gruppe Segmentierung Leistung zu überprüfen. Wählen Sie Filter und Einstellungen, die Segmentierung der Strukturen von Interesse zu erleichtern.
- Notieren Sie die Filter und Einstellungen. Wenden Sie diese Parameter auf Versuchsgruppen.
- Speichern Sie eine Kopie des Bildes als Tiff-Datei einschließlich der angewendeten Filters zu Referenzzwecken. Verwenden Sie einen detaillierten Namen wie [experimentelle Gruppenname] [Muster-Name] [Experiment Datum] [Channel] _ _ [Z-Maschine(n)] _ [Filter mit Parameter].
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Durchführen Sie Segmentierung der Strukturen von Interesse mit dem interaktiven h-Maxima-Wasserscheide-Werkzeug auf das vorverarbeitete Bild generiert und gespeichert im Schritt 5.1.
- Das vorverarbeitete Bild aktiv in Fidschi und initiieren die h-Maxima-interaktive Wasserscheide-Tool durch Klicken auf "SCF | Kennzeichnung | Interaktive H_Watershed".
Hinweis: Dieses Plugin berechnet zuerst die Wasserscheide und dann kann der Benutzer die Auswirkungen von lokalen Maxima und Schwelle Optionen auf Segmentierung durch ein Ausgabebild sofort aktualisierte untersuchen. - Passen Sie aus der Systemsteuerung Samen Dynamik (h), Intensität Schwelle (T) und Peak Überschwemmung (%) um Segmentierung zu optimieren an.
Hinweis: Beziehen sich immer auf das raw-Bild vor Vorverarbeitung von Abschnitt 4.2, Leistung der Segmentierung der Strukturen von Interesse manuell zu überprüfen. - Wenn Sie mit Segmentierung Ergebnissen zufrieden sind, wählen Sie "Export Regionen Maske" und "Exportieren". Dadurch wird ein binäres Abbild der Wasserscheide Ergebnisse (Abbildung 1, Segmentierung) generiert.
- Die Segmentierung Parameter zu erfassen; Diese Parameter auf Versuchsgruppen für quantitative Vergleiche angewendet werden müssen. Die binäre Ergebnisse Maske zu speichern, wenn gewünscht als Referenz mit Segmentierung Parameter im Namen wie [experimentelle Gruppenname] [Muster-Name] [Experiment Datum] _ [TV] _ [Z-Maschine(n)] _ [Filter mit Parameter] _ [H_Watershed Parameter].
- Das vorverarbeitete Bild aktiv in Fidschi und initiieren die h-Maxima-interaktive Wasserscheide-Tool durch Klicken auf "SCF | Kennzeichnung | Interaktive H_Watershed".
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Extrahieren Sie die Strukturen von Interesse aus den Ergebnissen der Wasserscheide.
- Öffnen Sie die gespeicherte ROI von Schritt 4.4 im ROI-Manager. Wählen Sie mit der binären Regionen Maske aus Schritt 5.2.4 aktiv den ROI aus der ROI-Manager auf das Bild zur Merkmalsextraktion zum standardisierten ROI Begrenzung angewendet.
- Mit den ROI auf die binäre Wasserscheide Maske aktiv, wählen Sie "Analyze | Analysieren Sie Partikel"mit"Hinzufügen zum Manager"im Dialogfeld ausgewählt werden, um Funktionen zu extrahieren.
Hinweis: Dadurch wird eine Partikel-ID für jede Struktur abgegrenzt, während der Segmentierung zur ROI-Manager hinzugefügt. Optionen sind verfügbar in diesem Menü auszuschließende Features basierend auf Größe oder Zirkularität bei Bedarf zu verfeinern, Strukturen, die in die Analyse einbezogen. - Speichern Sie die Partikel durch Klicken auf "mehr | Speichern Sie"aus dem ROI-Manager-Menü. Sicherstellen Sie, dass Bezeichner deaktiviert sind und alle Partikel in einer Zip-Datei gespeichert werden werden. Verwenden Sie einen detaillierten Namen wie [experimentelle Gruppenname] [Muster-Name] [Experiment Datum] _ [TV] _ [Z-Maschine(n)] [Filter mit Parameter] _ [H_Watershed Parameter] _ [Strukturen].
6. Menge, Bereich und Intensität Quantifizierung und Analyse
- Öffnen Sie die raw-Bild generiert und gespeichert in Schritt 4.2. Scrollen Sie zum Kanal für die Erfassung der Strukturen von Interesse.
Hinweis: Es ist entscheidend für die Intensität Messungen aus den raw-Bild (vor Vorverarbeitung) zu nehmen, als das Anwenden von Filtern im Schritt 5.1 Änderungen die Pixelwerte. - Öffnen Sie die Partikel aus Merkmalsextraktion im Schritt 5.3 gewonnen und wählen Sie "Alle anzeigen" von ROI-Manager.
Hinweis: Diese Aktion wird eine Gliederung der einzelnen Partikel auf der "ROI-Manager" auf das Bild überlagern und sollten die Kanten der Strukturen von Interesse (Abbildung 1, Merkmalsextraktion) übereinstimmen. - Legen Sie die gewünschten Messungen durch Klicken auf "Analyze | Eingestellten Messungen".
Hinweis: Der Bereich, Intensität und Dichte der Partikel können durch Auswahl von "Bereich" und "integrierte Dichte" gemessen werden. Wenn Sie integrierte Dichte ausgewählt ist, wird Fidschi zwei Werte produzieren: "Integrierte Dichte" als das Produkt aus Fläche und mittleren Grauwert und "Raw integrierte Dichte" gemessen als Summe der Pixelwerte berechnet. Dichte des fluoreszierenden Proteins in der Partikel errechnet sich als Summe der Pixelwerte geteilt durch die Fläche. Die Anzahl der Teilchen erzeugt im Schritt 5.3 gibt die Menge der Teilchen innerhalb des Gewebes, den ROI im Schritt 4.4 definiert. - ROI-Manager im Menü wählen Sie "Maßnahme". Die Ergebnisse werden in kalibrierten Einheiten ausgedrückt, solange die Messungen von Dateien, die Software zur Abbilderstellung in Fidschi abgeleitet. Die Ergebnisse aus dem Ergebnisfenster kopieren und Einfügen in Tabellenkalkulations-Software für die Zusammenstellung und weitere Berechnungen.
(7) ratiometrischen Quantifizierung und Analyse der Daten
- Führen Sie die Schritte 6.1 und 6.2, Partikel-IDs auf dem ersten rohen Kanal von Interesse zu öffnen.
- Legen Sie die gewünschten Messungen durch Klicken auf "Analyze | Eingestellten Messungen".
Hinweis: Die durchschnittliche Intensität pro Partikel kann durch die Wahl "Gray Mittelwert" gemessen werden. - Der ROI-Manager wählen Sie "Maßnahme". Daten aus Fenster kopieren und Einfügen in Tabellenkalkulations-Software.
- Verschieben der "C" Bildlaufleiste zum zweiten rohen Kanal von Interesse, GFP in diesem Beispiel (Abb. 4A), und wiederholen Sie die Schritte 7.2. und 7.3.
Hinweis: Die Partikel im Schritt 5.3 gespeichert werden standardmäßig auf den Kanal und die Scheibe aus der es erzeugt wurde. Achten Sie darauf, dass Partikel auf den richtigen Kanal von Interesse angewendet werden. - Berechnen Sie das Verhältnis der Intensität von einem Kanal auf die Intensität des zweiten für jedes Partikel in der Tabellenkalkulations-Software.
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Verwenden Sie ein Punktdiagramm zu visualisieren und zu quantifizieren ratiometrischen Daten aus Fluorophore, die einzelne Änderungen der zugrunde liegenden biologischen Prozesse reflektierende aufweisen.
- Generieren Sie ein Streudiagramm in der Grafik-Software.
Hinweis: Jeder Datenpunkt stellt eine Struktur von Interesse, wo die Intensität der ersten Fluorophor von Interesse ist der "X-Wert" und die Intensität des zweiten Fluorophor ist der "y-Wert" von jedem Teilchen gemessen. - Legen Sie Anspritzung Schwellenwerte für jede Fluorophore, die Quadranten zu definieren.
- Generieren Sie ein Streudiagramm in der Grafik-Software.
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Verwenden Sie Linienprofil Fluorophor Intensität über eine Struktur von Interesse zu visualisieren.
- Wählen Sie einen ROI im Schritt 5.3 erzeugt und mithilfe des geradlinigen Tools auf der Symbolleiste Zeichnen einer geraden Linie durch den ROI. Fügen Sie die Zeile ROI in den ROI-Manager.
- Für jeden Kanal von Interesse, mit der Linie ROI aktiv ist, wählen Sie "Analyze | Plot-Profil".
Hinweis: Der Plot-Profil-Funktion generiert ein Histogramm-Grundstück und eine Tabelle mit den Werten der Intensität entlang der Linie. Kopieren Sie Ergebnisse von jedem Kanal und Paste in Tabellenkalkulations-Software generieren einen Plot zeigt beide Kanäle entlang der Linie gemessen.
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Representative Results
Quantifizierung der Anzahl, Fläche und Intensität der Gewebekulturen tagged mutierten Htt-Aggregate in der Drosophila -Optik-Lappen
Fehlgefaltete Proteinaggregation in das zentrale Nervensystem eine Drosophila -Modell der Huntington-Krankheit, RFP-Tags Mutant untersuchen menschliche Htt mit einem nicht-pathologischen (FH-RFP-hHttQ15) oder pathologische Erweiterung ( UAS-RFP-hHttQ138) und Membran GFP (FH-mCD8::GFP)11 wurden unter einer Pan-neuronale Treiber Ilav-GAL4Co ausgedrückt. Gehirne von weiblichen fliegen 2 Tage nach der bewegungsapparate (DAE) wurden seziert, fixiert und gefärbt mit DAPI gemäß Abschnitt 2 des Protokolls. Konfokale Laser-scanning-Mikroskopie erfolgte mit Schwerpunkt auf der Optik-Lappen mit einem 40 X Objektiv Öl eintauchen, 1,30 numerische Apertur (NA), mit einer Scangeschwindigkeit von 8,0 µs pro Pixel und räumlichen Auflösung von 1024 x 1024 Pixel (12 Bit pro Pixel). Die optimale Schrittweite von imaging-Software bestimmt war 1,08 µm pro Stück für das Ziel mit der folgenden Kombination von Erregung/Emission Wellenlängen: Kanal 1) 488/510 für GLP, Kanal 2) 543/581 für RFP und Kanal 3) 405/461 für DAPI. Detektor Bildeinstellungen angewendet auf alle Gruppen Aufnahmen geeignet für Vergleiche, stützten sich auf ein RFP-Htt-Q138-Probe, die hohe Intensität RFP-Htt Aggregate ansammelt, eher als ein nicht-pathogenen RFP-Htt-F15 Kontrolle Exemplar, unterhält geringe Mengen an diffusen RFP-Htt (Abbildung 2). Wenn Erwerb Bildeinstellungen gesetzt wurden, um den dynamischen Bereich eines RFP-Htt-F15-Probe zu maximieren, würde die RFP-Htt-Q138 Aggregate gesättigt sein. Als Beispiel wurde ein Schliffbild Proteinaggregation in Drosophila Optik Lappen als HttQ138_Opticlobe.01_01012018_Ch1.RFP-Htt_Ch2.GFP_Ch3.DAPI gespeichert.
Die gesamte Optik Lappen war während Mikroskopie abgebildet und bestand aus etwa 15 Z-Scheiben, aber nach dem Imaging wurde festgestellt, dass die Analyse einer Z-Ebene am besten lösen individuelle Strukturen, die sonst scheint in einer Projektion durch überlappende die hohe Dichte des Gewebes. Um einen standardisierten ROI zu ermitteln, wurden die C2 und C3 Zellkörpern befindet sich zwischen der Medulla und Lobula Platte der Optik Lappen12 als eine anatomische Landmarke verwendet. In Fidschi das Bild war so dupliziert die Anforderungen angepasst und als Tiff-Datei namens HttQ138_Opticlobe.01_01012018_Ch1.GFP_Ch2.RFP-Htt_Ch3.DAPI_z8, wo z8 achten Scheibe reflektiert C2 und C3 neuronalen Zellkörpern die meisten waren gespeichert wurde Prominente mit DAPI-Färbung (Abbildung 1A, Bildaufnahme). Das Auswahl-Werkzeug "Polygon" wurde verwendet, um manuell auswählen einen ROI in der Optik-Lappen mit DAPI-Färbung und neuronale GFP Signal als Leitfaden (Abbildung 1A, ROI-Auswahl, wo gelb zeigt den ROI und rot bezeichnet die hohe Vergrößerung Bild gezeigt für Klarheit in den folgenden Feldern des Workflows). Als nächstes war ein Gaußscher Weichzeichner Filter mit σ-Wert auf 1 festgelegt angewendet auf die RFP-Htt-Kanal glatt das Bild und Segmentierung (Abbildung 1A, Vorverarbeitung) und die Leistung der nachgelagerten Segmentierung und Merkmalsextraktion mit und ohne dies zu erleichtern Vorverarbeitung Schritt ist in Figur 1Adargestellt. Interaktive H-Wasserscheide erfolgte auf Bilder des RFP-Htt-Kanals mit den folgenden Parametern: seed Dynamik, 30; Intensität Schwelle, 500; Peak Überschwemmungen (in %), 80; mit "zulassen Spaltung" und "Regionen Maske" Exportieren"ausgewählt (Abbildung 1A, Segmentierung). Die daraus resultierenden binären Regionen Maske wurde als HttQ138_Opticlobe gespeichert. 01_01012018_Ch2.RFP-Htt_z8_GuassianBlur-sigma1_HWatershed-h30_T500_80percent und gebrauchte Partikel mit dem analysieren-Partikel-Werkzeug mit einer Mindestgröße Ausschluss von 0,4 µm2 Protein Aggregate13,14 definieren erzeugt . Die entstehenden Partikel wurden von den ROI-Manager als HttQ138_Opticlobe.01_01012018_Ch1.RFP-Htt_z8_GuassianBlur-sigma1_HWatershed-h30_T500_80percent_aggregates gerettet und wurden auf den rohen RFP-Htt-Kanal (vor Vorverarbeitung) eingesetzt, um zu extrahieren quantitative Bilddaten (Abbildung 1A, Merkmalsextraktion).
Quantifizierung der Anzahl von halbautomatisch segmentiert RFP-Htt-Aggregate aus standardisierten fokale Flugzeuge durch die Optik Lappen des Drosophila offenbart diffusen Ausdruck der nicht-pathogenen Htt-F15-Erweiterung und die Anhäufung von protein Aggregate der krankheitsverursachenden Htt-Q138 Ausbau (Abbildung 2A-C). Die Summe aller Pixel-Werte in jedem Teilchen von "Integrierten Rohdichte" gegeben wurde für den Vergleich des RFP-Htt Inhalts jedes Aggregat verwendet. Größe und Intensität Profile aller Aggregate von einer standardisierten Fokalebene von fünf verschiedenen Sehlappen mit dem Ausdruck Htt-Q138 illustrieren die Robustheit und Reproduzierbarkeit dieser Workflow (Abb. 2D, E). Vor allem, wenn Aggregate während der Bildaufnahme (Abb. 3A, B) überbelichtet waren, Quantifizierung der Größe und Anzahl der Aggregate sind vergleichbar mit Aggregaten mit idealer Belichtung (Abbildung 3, D), erfasst aber die Intensität der überbelichteten Aggregate wird eine Funktion der Größe gesättigten Pixel den maximalen Intensitätswert (Abbildung 3E, F) aufweisen. Einrichtung von entsprechenden Scan Belichtungsparameter ist demzufolge entscheidend für das gesamte Spektrum der quantitativen Molekulare Zusammensetzung von proteinaggregaten extrahieren.
Ratiometrischen basierende Quantifizierung der Autophagie Flussmittel in der Drosophila visuelle Lamina mit einem Tandem fluoreszierende Atg8a reporter
Autophagie-Lysosomen Flussmittel im visuellen System von Drosophila zu bewerten, mCherry GFP Atg8a Reporter äußerte ubiquitär in der Steuerung oder fliegt Drosophila Spermin Synthase (dSms) homozygoten Mutante (dSmse/e) mit Actin-GAL4 -Treiber. Oberflächenmodellee/e fliegt Ausstellung Neurodegeneration, der mit eingeschränkter selbstverdauende Flux durch lysosomale Dysfunktion15verbunden ist. Gehirne mit angehängten Lamina von weiblichen fliegen am 5 DAE wurden seziert, fixiert und gefärbt mit DAPI. Der Lamina wurde durch Laser-scanning-konfokalen Mikroskopie mit einem 100 X Öl Immersion Objektiv, 1,35 numerische Apertur (NA), eine Abtastgeschwindigkeit von 8,0 µs pro Pixel und 12 Bit pro Pixel optische Auflösung und Schrittweite von 1,2 µm abgebildet.
Diese Analyse wurde auf eine max Z-Projektion von sieben Z-Scheiben durch der Lamina zur Erhöhung der Leistung der Probenahme der spärlichen Atg8-Positive Strukturen (Abbildung 1 b, Bildaufnahme) durchgeführt. Die standardisierte ROI wurde manuell mit dem Polygon-Auswahl-Werkzeug um den Zellkörper Layer von DAPI offenbart und anhand der gut-gekennzeichneten Anatomie und zelluläre Organisation des Gewebes gezogen (Abb. 1 b, ROI-Auswahl, wo gelbe zeigt die ROI und rot bezeichnet die hohe Vergrößerung Bild gezeigt aus Gründen der Übersichtlichkeit in den folgenden Feldern des Workflows)16. Die Tandem Reporter stützt sich auf Stabilitätseigenschaften der GFP und mCherry Moieties anlässlich der Progression durch die Autophagie-Lysosomen Weg, so dass GFP durch die Säure der Lysosomen gestillt ist wo mCherry bleibt, bis es abgebaut ist. Daher wurde die langlebigeren mCherry Fluorophor für die Segmentierung in diesem Protokoll verwendet. Ein Filter Gaußscher Weichzeichner mit σ Wert 1 auf den mCherry-Kanal (Abbildung 1 b, Vorverarbeitung) angewendet wurde, und interaktive H-Wasserscheide wurde mit den folgenden Parametern durchgeführt: seed Dynamik, 0; Intensität Schwelle, 800; Peak Überschwemmungen (in %), 90; mit "zulassen Spaltung" und "Regionen Maske" Exportieren"ausgewählt (Abbildung 1 b, Segmentierung). Die daraus resultierenden binären Regionen Maske wurde verwendet, um Partikel mit dem Tool analysieren Partikel erzeugen. Die entstehenden Partikel wurden auf die rohe mCherry und rohe GFP-Kanäle (vor Vorverarbeitung) angewendet, um quantitative ratiometrischen Daten von Autophagie-Lysosomen Fächer (Abbildung 1 b, Merkmalsextraktion) zu extrahieren.
Sichtkontrolle des mCherry-GLP-Atg8-positiven Strukturen angegeben Anreicherung im Großraum Zellkörper von der Lamina, konsistent mit früheren Berichten von Retrograder Transport von selbstverdauende Vesikeln zum Zellkörper in Neuronen17. Grundstück-Profil wurde verwendet, um mCherry und GFP Intensität über mehrere Atg8-Positive Strukturen (siehe Zeile ROIs in Abb. 4A und daraus resultierende Intensität profile entlang der Linie in Abbildung 4 b), Unterschiede in der Reporter enthüllen, wo hohe visualisieren Intensität der beiden Fluorophore zeigt an, dass autophagosom (Abbildung 4B3), hohe mCherry und niedrige GFP Fusion mit den Lysosomen zeigt, wie GFP wird in diesem sauren Fach (Abbildung 4B1) abgeschreckt, und schließlich spiegelt die niedrigen mCherry Abbau innerhalb die Lysosomen (Abbildung 4B2). Ein Streudiagramm generiert aus der mittleren Fluorophor Intensität jedes halbautomatisch segmentierte mCherry-Atg8-positiven Teilchen veranschaulicht Fluss durch die Autophagie-Lysosomen-Weg, der dann in diskreten Schritten durch Quadrant Analyse ( getrennt wurde Abbildung 4). Die Handlung gliederte sich in vier Quadranten mit gating Schwellenwerten der GFP = 570, mCherry = 1.800. Die Grenzwerte wurden in der Kontrollgruppe, die mit den folgenden Prinzipien basierend gesetzt: (1) das Design der fluoreszierenden Tandem Reporter und die Eigenschaften der beiden Fluorophore, so dass theoretisch GFP sollte nicht fluoreszieren wo es keine mCherry Signal (Quadrant (IV) und (2) die Verteilung der Atg8-positiven Teilchen reflektiert die Verteilung der Autophagie-Lysosomen Weg-bezogene Fächer in Wildtyp Neuronen basale Autophagie hocheffiziente18,19 ist. In die Lamellen der Steuerung fliegen rund 25 % der Atg8-positiven Teilchen als autophagosom klassifiziert wurden (Quadrant ich), und die Hälfte der Puncta verarbeitet über Autophagosome-Lysosomen Fusion (Quadrant II und III); Oberflächenmodellee/e Lamellen hatte deutlich erhöht, autophagosom oder dysfunktionalen Lysosomen (Quadrant ich) und verringerte Autolysosomes (Quadrant II und III), suggestive Autophagosome Akkumulation durch die Mängel in Autophagosome-Lysosomen Fusion und/oder lysosomalen Abbau (Abbildung 4 C, D). Quantitative Daten unterstützt auch offensichtliche Ansammlung von Atg8-Positive Strukturen in Lamina von dSmse/e fliegen (Abb. 4E). Ratiometrischen Analyse der mittleren mCherry und GFP Signal markiert einen Unterschied zwischen Steuerung und dSmse/e -Gruppe (Abb. 4F) aber könnte nicht ausführlich behandelt werden den allgemeine Einfluss auf den Weg noch die spezifischen Schritte von offenbart die Quadrant-Analyse.
Abbildung 1: Workflow durch Vorspannung minimiert, semi-automatische Segmentierung der subzellulären Strukturen in Drosophila Gehirn Beispiele Fidschi mit. (A) repräsentative konfokale mikrographen von einzelnen Fokalebene durch die Optik-Lappen eine Drosophila erwachsenen Gehirn zum Ausdruck zu bringen pan neuronalen RFP-Tags mutierte Htt und Membran-gezielte GFP (ilav-GAL4 > FH-mCD8:GFP, UAS-RFP-hHttQ138) mit DAPI-Färbung (Bildaufnahme). DAPI und GFP wurden verwendet, um einen ROI (gelb) um die Optik-Lappen zu wählen; rotes Feld zeigt Region über einen Workflow aus Gründen der Übersichtlichkeit (ROI Auswahl) vergrößert. Vorverarbeitung Panel zeigt hohen Vergrößerung der raw-Bild des RFP-HttQ138-Kanals (oben) und nach Anwendung des Gaußschen Weichzeichner Filter, σ1 (unten). Segmentierung von interaktiven h-Maxima Watershed mithilfe der angegebenen Parametereinstellungen für Saatgut Dynamik durch h-Maxima (h), globale Wasserscheide Stop durch Intensität Schwelle (T), festgelegten Kriterien bestimmt und regionalen Stop festgelegten Kriterien peak Überschwemmungen) %) auf die RFP-HttQ138 roh (oben) und "glockenförmig" unscharf (unten) Bilder und Wasserscheide Ergebnisse aus Regionen Maske von Wasserscheide Plugin exportiert und aus Gründen der Übersichtlichkeit invertiert durchgeführt. Durch die erzeugten Partikel analysieren Partikel (Magenta) überlagert, die RFP-HttQ138-raw-Bilder (Merkmalsextraktion). Pfeile zeigen Aggregate, die stark segmentierten ohne Vorverarbeitung und Pfeilspitzen zeigen Strukturen, die nicht nach der Filterung zu trennen. (B) repräsentative konfokale mikrographen maximale Z-Projektion eines 7 fokale Flugzeuge über den horizontalen Bereich der Lamina eine Kontroll-und Mutant (dSmse/e) Drosophila Erwachsenen mit dem allgegenwärtigen GLP-mCherry-Atg8a (Ausdruck Aktin-GAL4 > FH-GLP-mCherry-Atg8) mit DAPI-Färbung (Bildaufnahme). DAPI wurde verwendet, um einen ROI (gelb) um den Zellkörper Layer von der Lamina auszuwählen; rotes Feld zeigt Region über einen Workflow aus Gründen der Übersichtlichkeit (ROI Auswahl) vergrößert. Vorverarbeitung Panel zeigt hohen Vergrößerung des mCherry Kanals mit Gaußscher Weichzeichner-Filter angewendet σ1, Kontrolle und mutierten Lamina. Segmentierung durch interaktive h-Maxima Wasserscheide auf die gefilterte mCherry Bilder mit den angegebenen Parametereinstellungen durchgeführt und Wasserscheide führt als binäre Regionen Maske aus Gründen der Übersichtlichkeit invertiert dargestellt. Durch die erzeugten Partikel analysieren Partikel (Magenta) überlagert, die rohe mCherry und GFP Bilder (Merkmalsextraktion). Skalieren von Balken = 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Quantifizierung der Größe und Intensität der mutierten RFP-Htt-Aggregate ist robust und reproduzierbare. (A-B) Drosophila Gehirne mit RFP-hHttQ15 (A) oder RFP-hHttQ138 Ausdruck (B) unter einer Pan-neuronale Treiber Ilav-GAL4 seziert und behoben wurden und die Sehlappen wurden durch Laser-scanning-konfokalen Mikroskopie abgebildet. Maßstabsleiste = 50 µm. (C) die durchschnittliche Anzahl der Aggregate in jeder Gruppe von einer manuell ausgewählten ROI in der Optik-Lappen quantifiziert und konzentrierte sich auf eine standardisierte Z-Scheibe (n = 5). (D-E) Die Größe (D) und die Gesamtintensität (E) der RFP-hHttQ138 Aggregate aus quantifiziert standardisiert ROIs in Sehlappen von 5 verschiedenen Tieren. Aggregieren von Daten ist im logarithmischen Skala aufgetragen. Aggregate wurden als Objekte größer als 0,4 µm2 (gestrichelte Linie in D) definiert. Statistische Analysen, One-Way ANOVA, NS: nicht signifikant; AE: willkürliche Einheit Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Bild Überbelichtung führt zu ungenauen Intensität Messungen. (A-B) Repräsentative konfokale Schliffbild der gleichen Optic lobe mit idealer Belichtung (A) und Überbelichtung (B) Pseudocolored mit der HiLo-LUT in Fidschi. Rot b zeigt überbelichtet Aggregate. Maßstabsleiste = 50 µm. (C) Quantifizierung der aggregierten Größe nach der Implementierung von h-Maxima Wasserscheide Parameter ähnlich Segmentierung Ergebnisse zu generieren. Statistische Analysen, unabhängige Stichproben t -Test, NS: nicht signifikant. (D) Häufigkeitsverteilung der aggregierten Größe ideal und überbelichtete Bilder. Aggregate mit einer Größe von 5 bis 25 µm2 wurden weiter in 4 kategorische Gruppen klassifiziert. (E -F) Korrelationsanalyse der Intensität der Aggregate als Funktion der aggregierten Größe (E). Eine Bezugslinie ist gezeichnet (schwarz), wenn alle Pixel eine maximale Helligkeitswert von 4095 haben. Green-Box zeigt Aggregate unter 10 µm-2 -Gebiet in Fgezeigt. b: Regressionskoeffizienten, R2: Bestimmungskoeffizient; AE: willkürliche Einheit Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Quantifizierung der Tandem fluoreszierende mCherry-GLP-Atg8a genetische Reporter zeigt deutliche Merkmale des selbstverdauende Flusses in Drosophila. (A) repräsentative konfokale mikrographen von Drosophila Lamina von Kontrolle und dSmse/e mutierte fliegen mit dem ubiquitär Ausdruck mCherry-GLP-Atg8a (Aktin-GAL4 > mCherry-GLP-Atg8a) und für DAPI gefärbt . Gestrichelte Box Bereiche der Lamina Zellkörper Ebene erscheinen in hoher Vergrößerung (rechts). Zahlen Atg8a-positiven Vertretungsstrukturen geplottet in B und in Cquantifiziert. (B) Histogramm plot von der Fluoreszenzintensität in willkürlichen Einheiten (AE) entlang der Linie ROIs in starker Vergrößerung Bilder in A. (C) mCherry-GLP-Atg8 Strukturen gezeichnet durch mittlere GFP Intensität als Funktion der mittleren mCherry Intensität angegeben gemessen von Kontrolle und dSmse/e Lamina (Partikel gemessen von 3 Schichten aus jeder Gruppe). Die Handlung gliederte sich in vier Quadranten mit gating Schwellenwerten der GFP = 570 und mCherry = 1800 mit dem Anteil an Strukturen in jedem Quadranten vom Genotyp angegeben. ()D) Quantifizierung der mittlere Prozentsätze des mCherry-GLP-Atg8 kategorisiert in jedem Quadranten in C (n = 3 Lamina). ()E) Quantifizierung der Zahlen des mCherry-GLP-Atg8 Puncta pro Lamina (Mittelwert ± S.D., n = 3 Lamina). (F) ratiometrischen Analyse mCherry-GLP-Atg8 Strukturen in Kontrolle und mutierte Fliege Lamina beobachtet (meine mit 95 % CI, n = 3 Lamina). Student t-test. P < 0,05, **P < 0,01. Sscale Balken = 2 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Die hier beschriebene Protokoll lässt sich vehement und reproduzierbar quantitate Zelle biologische Prozesse visualisiert durch Fluoreszenz-basierte Bildgebung. Zusammenhang mit biologischen und technischen Einschränkungen müssen sorgfältig geprüft werden, um das experimentelle Design führen. Fluoreszierenden Marker der subzellulären Strukturen von Interesse, ob immunhistochemische, farbstoffbasierte oder genetisch ausgedrückt, müssen über Hintergrund von Morphologie und Intensität unterscheiden. FH/GAL4 -System ist weit verbreitet, gezielte Genexpression in Drosophilazu fahren. Die hier vorgestellten Beispiele verwendet transgene Linien tragen GAL4-Treiber zur Aktivierung der Transkription von eindringmittel tagged Proteinen unter der Kontrolle von UAS Enhancer Proteinaggregation und Autophagie im Nervensystem zu untersuchen. Wenn gleichzeitige Expression von einer experimentellen UAS-Transgen zusammen mit einem fluoreszierenden Reporter Transgen erforderlich ist, sollte dann die Kontrollgruppe auch co-Überexpression des eine belanglose Transgen Steuern für GAL4 Dosierung, z. B. enthalten FH-GFP oder FH-LacZ. Standardisierte Probenvorbereitung ist wie hier beschrieben für Drosophila Zentralnervensystem und visuelles System, Dissektion, Fixierung, Antikörper Färbung, durch Montage für optimale Bildgebung und Quantifizierung von entscheidender Bedeutung.
Gute bildgebende Verfahren, die Signal-Rausch-Verhältnis und Dynamikumfang zu maximieren sind notwendig zur semi-automatischen Analyse und für genaue Vergleiche zwischen experimentellen Gruppen an erster Stelle. Bildparameter Erwerb sollte festgelegt werden, so dass die Reporter nicht übersättigt ist, so dass das gesamte Spektrum der Protein-Intensität extrahiert werden kann und (Abbildung 3 quantifiziert). Für quantitative Vergleiche sollten Bildgebung mit der gleichen Aufnahmeparameter und vorzugsweise am selben Tag durchgeführt werden.
ROI-Auswahl, Bildverarbeitung, Feature-Segmentierung und Merkmalsextraktion mit dem Open-Source-Plattform ImageJ/Fidschi sind abhängig von der Anwendung; während Ausgangsparameter vom Benutzer definiert werden müssen, wird ihre Anwendung über Proben Voreingenommenheit minimieren, bei gleichzeitiger Maximierung der quantitativen Datenausgabe. Es ist wichtig, sorgfältig Dokumenten-Workflow und empfohlen, ein Bild als Tiff-Datei speichern, nachdem jeder Schritt mit Datei-Name Details Verarbeitung angewendet. Dies kann besonders hilfreich sein bei der Erarbeitung von Protokoll, die Parameter für das erste Mal und wird als Bezugspunkt zur Sicherstellung der Konsistenz zwischen experimentellen Gruppen bei jedem Schritt in der Bildverarbeitung und Analyse dienen. ROI-Auswahlkriterien mit Marker oder anatomischen Landmarken sollte aus einer Kontrollgruppe definiert werden, jedoch sollte darauf geachtet werden, um sicherzustellen, dass experimentelle Manipulationen nicht verändern die Marker oder Sehenswürdigkeiten in einer Weise, die zuverlässige Angabe der verhindern würde eine ROI zu standardisieren. Ein einzelnes Stück oder eine Z-Projektion von mehreren Scheiben kann ausgewählt werden, am besten die Ziele der Analyse, anzugehen, wo eine einzelne Brennebene kann nützlich sein, Trennung der benachbarten Strukturen zu verbessern, und eine Z-Projektion ist hilfreich für die Analyse von Strukturen lokalisiert im gesamten Gewebe Volumen. Die Art der Z-Projektion für Segmentierung und Bildanalyse sollte sorgfältig und unabhängig voneinander bestimmt werden. Eine maximale Intensität Projektion wird ein scharfes Bild produzieren, da Strukturen hellsten in den Ebenen sind, wo sie stehen im Mittelpunkt, und sind in der Regel gut geeignet für die Segmentierung. Bildanalyse kann auf eine maximale Projektion, wie im Beispiel der Autophagie-Lysosomen Analyse zulässig; Atg8-Positive Strukturen sind kleiner als die Schrittweite für die Probenahme verwendet, so sind am genauesten vertreten durch die maximale Intensität von der alleinigen Fokalebene, von der sie erfasst wurden. Jedoch kann eine Summe-Projektion, die alle Pixel mit dem gleichen Xy-Koordinaten hinzufügt für Analyse der Strukturen, die größer als die Schrittgröße, genauer die Intensität Informationen jeder Struktur dar. Während dieses Protokoll zur Analyse ein einzelnes Stück oder eine Z-Projektion von mehreren Scheiben in 2D dient, könnte der Workflow an 3D-Strukturen in einer Z-Serie mit mehreren dieselben Werkzeuge analysieren leicht angepasst werden. 3D-Analyse wäre wünschenswert, dass einer kleinen Stichprobe von unregelmäßig geformten Strukturen, wo eine Z-Scheibe, die schräg die Struktur schneidet die Analyse verzerren würde.
Vorverarbeitung mit einem Filter, wie in diesem Protokoll vorgeschlagen reduzieren Lärm unter Beibehaltung der Kanten, um die Erkennung von Strukturen des Interesses während der Segmentierung zu unterstützen; Hintergrund-Rauschen und fluoreszierende Marker Inhomogenität ohne ausreichende Glättung führt über Segmentierung, während Einstellungen, die zu viel Unschärfe führen Details entfernen und verhindern, präzise Kantenerkennung dass werden. Segmentierung von Watershed betrachtet das Bild als eine topografische Oberfläche mit einer Wasserquelle auf lokale Maxima – hohe Intensität Pixel in einem fluoreszierenden Bild —, die überflutet bis es trifft benachbarten überschwemmte Gebieten, wo ein Damm oder Segment-Grenze,20gebaut ist. Die h-Maxima-Wasserscheide verwendet eine benutzerdefinierte Schwelle (h-Maxima Dynamik im SCF-MPI-CBG-Plugin), sinnvolle lokale Maxima zur Vermeidung übermäßiger Segmentierung der Strukturen, die nicht über eine einzigartige lokale maximal21zu unterscheiden. Das interaktive h-Maxima Wasserscheide Plugin implementiert in diesem Protokoll ermöglicht dem Benutzer, h-Maxima Dynamik (h), globale Wasserscheide Stop Kriterien Intensität Schwelle (T) und regionalen Stop Kriterien, die durch Überschwemmung (%), Spitze einstellen während sofort anzeigen Wasserscheide Ergebnisse auf ein Ausgabebild Segmentierung Leistung qualitativ zu bewerten. Segmentierung Ergebnisse stimmen genau mit den meisten Struktur Grenzen, obwohl übermäßige Segmentierung und unvollständige Trennung (Abbildung 1A, rote Pfeile in Merkmalsextraktion) auftreten, wo fluoreszierende Kennzeichnung inhomogen ist oder das Gewebe ist dicht besiedelt. Die Effizienz der semi-automatischen Segmentierung und Analyse Schritte kann genutzt werden, um Stichproben Leistung zu erhöhen und Segmentierung Fallstricke zu mildern.
Nach der Segmentierung und Merkmalsextraktion ist es einfach, morphologische Informationen wie Fläche, Abmessungen und Rundheit zu extrahieren. Darüber hinaus Wenn Bilder entsprechend erhoben werden, um Überbelichtungen zu vermeiden, kann molekularer Informationen auch aus dieser Bildanalyse durch Intensität Messungen abgeleitet werden. Sobald Maßnahmen der Neurodegenerative Krankheit Pathologie extrahiert und durch diesen Ansatz quantifiziert, können diese Maßnahmen verwendet werden, eine Reihe von wichtigen Fragen angehen. Insbesondere hat das Protokoll demonstriert das Potenzial, Bildanalyse und Quantifizierung von proteinaggregaten, um Faktoren zu identifizieren, die beeinflussen Proteinaggregation und korrelieren, Verteilung, Anzahl, Größe und Dichte Protein der Aggregate zu verwenden mit neuronalen Dysfunktion und organismal Gesundheit. Ratiometrischen basierende Quantifizierung kann verwendet werden, um aggregierte Interaktion mit subzelluläre Komponenten oder Verfahren beim Fortschreiten der Erkrankung zu informieren. Während Biochemische und Durchflusszytometrie wurden angewandt, um das Zusammenspiel von Aggregaten und mit anderen subzellulären Strukturen zu analysieren, Zelle Lysis zu Proteinverlust führen, zusammengefasste Eigenschaften ändern und Proteinprotein Interaktionen22zu stören. mCherry-GLP-Atg8 ist weit verbreitet, Autophagie durch Fluoreszenz-Mikroskopie, vor allem in kultivierten Zellen23, zu überwachen, aber neutrale und quantitative Analysemethoden fehlen. Darüber hinaus in Vivo Analyse mit der genetisch codierten Tandem Reporter ist anspruchsvoll und erfordert eine streng kontrollierte genetischen Hintergrund und Gewebe Vorbereitung. Dieses Protokoll beschreibt verifizierte Methodik von Gewebe Vorbereitung auf bildgebende Verfahren kritisch, Autophagie-Lysosomen Fächer zu quantifizieren. Mit guten genetischen Praktiken können die Bild-Analyse Ansätze einschließlich Atg-positiven Teilchen Intensität Profile und Quadrant Analyse mit Anspritzung von fluoreszierenden Einzelsignale leisten leistungsfähige Erkennung und Vergleich der normalen und pathologischen selbstverdauende Flussmittel in Vivo in vielfältigen Krankheitsmodelle.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wird unterstützt durch die Sheila und David Fuente neuropathischen Schmerzen Forschung Programm Graduate Fellowship (zu J.M.B.), Lois Pope LIFE Fellows Programm (, C.L., Y.Z und J.M.B.), die Snyder-Robinson Foundation Predoctoral Fellowship (zu cl), Dr. John T . Macdonald Foundation (CL), Verträge, Bewilligungen von der National Institutes of Health (NIH) HHSN268201300038C, R21GM119018 und R56NS095893 (zu R.G.Z.), und von Taishan Gelehrter Project (Provinz Shandong, Volksrepublik China) (R.G.Z.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SYLGARD(R) 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | PF184250 | Dissection dish |
| Falcon 35 mm Not TC-Treated Easy-Grip Style Bacteriological Petri Dish | Corning | 351008 | Dissection dish |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dissection tool |
| Sodium Chloride | Sigma | S3014 | PBS solution |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | S5136 | PBS solution |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma | P5655 | PBS solution |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | Washing and antibody incubaton solution. |
| 37% Formaldehyde | VWR | 10790-710 | Fixation |
| Disposable Microcentrifuge Tubes (0.5mL, blue) | VWR | 89000-022 | Fixation, washing, and antibody incubaton. |
| Plain and Frosted Micro Slides (25×75mm) | VWR | 48312-004 | Slides for confocal imaging |
| Micro Cover Glasses, rectangular (22×40mm) | VWR | 48393-172 | Slides for confocal imaging |
| Rubber Cement | Slime | 1051-A | Mounting |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | Mounting |
| Scotch Magic 810 Invisible Tape (19mm×25.4m) | 3M Company | 810 | Mounting |
| Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | Antibody incubaton |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | Nucleic acid staining. Dissolve in deionized water to make a 5 mg/mL stock solution and store at -80°C. Dilute to a working concentration of 10-20 μg/mL in PBTx. |
| 3.5X-90X Stereo Zoom Inspection Industrial Microscope | AmScope | SM-1BNZ | Dissection scope. Equipped with 6W LED Dual Gooseneck Illuminator |
| ImageJ/Fiji | NIH | v1.51u | With SCF_MPI_CBG plugins (version 1.1.2) |
| FV1000-IX81 Confocal-laser Scanning Microscope | Olympus | ||
| Recombinant Construct | Bloomington Drosophila Stock Center | BL37749 |
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