Biologia cellulare quantitativa della neurodegenerazione in Drosophila attraverso analisi imparziale delle proteine fluorescente contrassegnate usando ImageJ

Summary

Abbiamo sviluppato un flusso di lavoro semplice e adattabile per estrarre dati quantitativi da studi biologici basati su formazione immagine di fluorescenza delle cellule di aggregazione proteica e flusso autofagico nel sistema nervoso centrale di Drosophila modelli di neurodegenerazione.

Abstract

Con la crescente diffusione di malattie neurodegenerative, è sempre più importante capire la patofisiologia di fondo che conduce alla perdita e disfunzione neuronale. Tecnologie e strumenti di imaging basata sulla fluorescenza abilitare analisi senza precedenti dei processi neurobiologici subcellulari, eppure c'è ancora una necessità di approcci imparziale, riproducibile e accessibile per l'estrazione di dati quantificabili da studi di imaging . Abbiamo sviluppato un flusso di lavoro semplice e adattabile per estrarre dati quantitativi dagli studi di formazione immagine di fluorescenza-basata della drosofila in modelli di neurodegenerazione. In particolare, descriviamo un metodo facile da seguire, semi-automatizzato utilizzando Fiji/ImageJ per analizzare i due processi cellulari: in primo luogo, quantifichiamo aggregazione proteica e profilo nel lobo ottico Drosophila utilizzando fluorescenti-etichetta mutante proteine di huntingtin; e in secondo luogo, valutiamo il flusso di autofagia-lisosoma nel sistema visivo della drosofila con quantificazione basata su raziometrici di un reporter fluorescente tandem dell'autofagia. D'importanza, il protocollo descritto qui include un passaggio di segmentazione semi-automatizzata per garantire che tutte le strutture fluorescenti sono analizzate per minimizzare il bias di selezione e per aumentare la risoluzione di sottili confronti. Questo approccio può essere esteso per l'analisi di altre strutture biologiche cellulari e processi implicati nei processi neurodegenerativi, quali proteinico puncta (granuli di stress e complessi sinaptici), anche come membrana-limitano scomparti (mitocondri e vescicole della membrana del traffico). Questo metodo fornisce un standardizzato, ma adattabile riferimento punto per analisi dell'immagine e la quantificazione e potrebbe facilitare affidabilità e riproducibilità attraverso il campo e infine migliorare comprensione meccanicistica della neurodegenerazione.

Introduction

Malattie neurodegenerative colpiscono milioni di persone ogni anno e l'incidenza sta aumentando con l'invecchiamento della popolazione¹. Mentre ogni malattia neurodegenerative ha un'eziologia unica, aggregazione delle proteine misfolded e ripartizione della rete proteostasis sono patologici comuni caratteristiche di molte di queste malattie. Delucidamento come rottura di questi processi fondamentali e interdipendenti va storto per contribuire alla morte delle cellule e la disfunzione neuronale è fondamentale per la comprensione delle malattie neurodegenerative così come guidare gli interventi terapeutici. Acquisizione di immagini basata sulla fluorescenza permette per indagine su questi processi complessi e dinamici nei neuroni e ha notevolmente contribuito alla nostra comprensione della biologia delle cellule neuronali. Analisi di proteine fluorescente è impegnativo, specialmente quando gli esperimenti sono effettuati in vivo, a causa di tessuti altamente compatti, tipi cellulari diversi ed eterogeneità morfologica. Manuale assistita quantificazione è conveniente e semplice, ma è spesso richiede tempo e soggetto a pregiudizi umani. Di conseguenza, c'è una necessità di approcci imparziale, riproducibile e accessibile per l'estrazione di dati quantificabili da studi di imaging.

Abbiamo delineato un flusso di lavoro semplice e adattabile con Fiji/ImageJ, un'immagine potente e liberamente accessibile, elaborazione software^2,3, per estrarre dati quantitativi da studi di formazione immagine di fluorescenza in modelli sperimentali di neurodegenerazione utilizzando Drosophila. Seguendo questo protocollo per quantificare l'aggregazione proteica e flusso autofagico — due cellulari caratteristiche biologiche che sono altamente pertinenti alla patologia di malattia neurodegenerative — abbiamo dimostrato la sensibilità e la riproducibilità di questo approccio. Analisi delle proteine fluorescente contrassegnati huntingtina (Htt) nel lobo ottico di Drosophila ha rivelato il numero, la dimensione e l'intensità degli aggregati della proteina. Abbiamo visualizzato un reporter fluorescente tandem di autophagic flusso all'interno del sistema visivo di Drosophila , che mostra segnali di emissione diversi a seconda l' ambiente compartimentali⁴. Analisi basata su raziometrici del reporter tandem ammessi per una visione quantitativa e globale di cambiamento continuo di autofagia-lisosoma da formazione dell'autofagosoma, maturazione e trasporto alla degradazione nel lisosoma e inoltre evidenziato vulnerabili compartimenti in circostanze neurodegenerative interrotta. Importante, in entrambe le analisi abbiamo implementato passaggi di soglia e segmentazione semi-automatizzati nel nostro protocollo per ridurre al minimo la polarizzazione unconscious, aumentare la potenza di campionamento e fornire uno standard per facilitare i confronti tra studi simili. Il semplice flusso di lavoro è inteso a rendere potente plugin di Fiji/ImageJ (sviluppato da scienziati informatici basati su algoritmi matematici) più accessibile ai neurobiologi e la comunità di Scienze della vita in generale.

Protocol

1. Considerazioni e preparati per la progettazione dell'esperimento di analisi di immagine

1. Predeterminare adatto anatomico, cellulare, o subcellulari marcatori per servire come punti di riferimento per la standardizzazione di una regione di interesse (ROI) attraverso diversi campioni, ad esempio 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), marcatori di membrana, localizzati fluorescenti proteine, ecc.
2. Selezionare un marcatore fluorescente che può delimitare discreto puncta oltre i livelli di sfondo per la struttura di interesse.
   Nota: Questo protocollo è ottimizzato per le strutture proteiche (ad es., aggregati di proteine misfolded) e membrana-limitano organelli (ad es., l'autofagia reporter). Per visualizzare l'aggregazione proteica, un frammento di RFP-tag N-terminale della proteina Htt umana con un tratto poliQ patogeni di 138 ripetizioni (RFP-hHttQ138) è stato usato⁵. La proteina Htt mutata forma aggregati citoplasmatici quando espresso in un neurone specifico driver ad esempio elav-GAL4^5,6. Per visualizzare il flusso dell'autofagosoma-lisosoma, Actina-GAL4 è stato utilizzato per guidare ubiquistmente espressione del reporter mCherry-GFP-Atg8a tandem. GFP-positive e di mCherry - puncta indicare autofagosomi, e il flusso viene monitorato come fluorescenza GFP è spenta in ambiente acido del lisosoma, dove mCherry acido-insensibile rimane fino a quando la proteina è degradata⁷. Per analisi raziometrici, un singolo canale che è un indicatore coerenza della struttura può essere utilizzato per segmentazione, o eventualmente che una proiezione di due o più canali possa essere utilizzata per delineare strutture, anche se non esplicitamente descritti nel presente protocollo. In questo esempio, mCherry è utilizzato per la segmentazione delle particelle Atg8-positivi, come è acido-insensibile e rimarrà nel vano in tutto di flusso attraverso la via.
3. Scaricare e installare la piattaforma di open source immagine analisi ImageJ o Fiji — la distribuzione preferita di ImageJ con in bundle plugin^2,3.
4. Installare il plugin per spartiacque interattiva h-maxima.
   Nota: Questo protocollo utilizza Figi; plugin aggiuntivi possono essere richiesti per ImageJ. Il plug-in sviluppato da Benoit Lombardot per SCF-MPI-CBG è disponibile online (https://imagej.net/Interactive_Watershed).
5. Passare a "Guida | Update", selezionare"Gestisci siti di aggiornamento"dal"ImageJ Updater", scegliere il sito di aggiornamento di SCF-MPI-CBG dall'elenco e quindi chiudere e riavviare Fiji.

2. brain dissezione e colorazione di immunofluorescenza

1. Fare in silicone rivestito elastomero dissezione piatti.
   1. Versare in silicone componenti in elastomero in un becher, come indicato dal produttore e mescolare bene fino a quando accuratamente miscelati.
   2. Utilizzare una pipetta per riempire 5 cm completo di piastre di coltura del tessuto un terzo alla metà (circa 10 mL di miscela di elastomero). Consentire tutte le bolle salgono alla superficie e rimuovere delicatamente con carta velina. Coprire i piatti e metterli su una superficie piana per curare per 48-72 h a temperatura ambiente (TA).
2. Sezionare il cervello di Drosophila ed il sistema visivo se necessario.
   1. Eseguire la dissezione del cervello della drosofila come descritto in precedenza^8,9. Eseguire la dissezione in piatti di dissezione elastomero-allineato, utilizzando un fondo di elastomero per stabilizzare il cervello per evitare dannoso tessuto o forcipe.
   2. Per mantenere intatta la lamina durante la dissezione, far scorrere due pinze sotto la retina e strappare delicatamente attraverso il centro dell'occhio per rimuovere la retina. Tirare via qualsiasi tessuto retinico collegato alla lamina con forcipe tenuto parallelo alla superficie della lamina.
      Nota: Pigmento residuo laverà nei passaggi seguenti e solitamente non interferisce con l'anticorpo che macchia e imaging.
   3. Diluire la formaldeide al 37% in tampone fosfato salino (PBS) per rendere una concentrazione finale del 3,7% fresco prima dell'uso in un tubo del microcentrifuge 500 µ l. Trasferire il cervello sezionato a tubo del microcentrifuge con correzione soluzione e incubare per 15 min a RT con dolce dondolio.
      Nota: Formaldeide ha una naturale tendenza ad essere ossidato, producendo acido formico. Di conseguenza, è suggerito per aliquota del 37% formaldeide per deposito e diluire a 3,7% appena prima di ogni utilizzo. Sovra- fissazione di o sotto-fissazione influenzerà l'integrità del tessuto e fluorescenza¹⁰.
   4. Lavare 3 volte con PBTx (PBS con 0,4% Triton X-100) per 15 minuti ciascuno.
3. Eseguire esame immuno-istochimico e montare gli esemplari.
   1. Se è necessaria la macchiatura dell'anticorpo, rimuovere PBTx, aggiungere anticorpo primario diluito in PBTx con 5% di siero di capra normale e incubare su un mixer aliquota durante la notte a 4 ° C.
   2. Rimuovere l'anticorpo primario e lavare 3 volte con PBTx per 15 minuti ciascuno. Aggiungere anticorpo secondario diluito in PBTx con 5% di siero di capra normale e incubare per 1h a RT o durante la notte a 4 ° C. Lavare 3 volte con PBTx per 15 minuti ciascuno.
   3. Se è necessaria la colorazione DAPI, rimuovere PBTx, aggiungere la soluzione DAPI (soluzione: 5 mg/mL, diluire a una concentrazione di lavoro di 15 µ g/mL in PBTx) e incubare per 10 min a RT. Wash 3 volte con PBTx per 15 minuti ciascuno.
   4. Per cancellare il tessuto, posizionare una goccia di mezzo di montaggio al centro di una diapositiva di microscopia con un distanziatore di uno strato di nastro adesivo trasparente su entrambi i lati. Trasferire il cervello sulla goccia di mezzo di montaggio e attendere per 1 – 2 min il cervello diventa trasparente. Rimuovere con attenzione il mezzo di montaggio con una pipetta.
   5. Per montare, applicare una goccia di mezzo di montaggio fresco sul cervello sulla diapositiva. Attentamente e sovrapporre un vetro di copertura evitando bolle. Sigillare i bordi con mastice e asciugare all'aria a temperatura ambiente per 20 minuti procedere all'acquisizione di immagini per ottenere i migliori risultati.

3. acquisizione immagini

1. Ottimizzare i parametri di acquisizione del microscopio, tra cui risoluzione spaziale, obiettivo, zoom, velocità di scansione e dimensione, per massimizzare la risoluzione delle strutture di interesse per facilitare la segmentazione semi-automatizzata durante l'analisi di immagine un passo.
   Nota: Potrebbe essere utile catturare un'immagine di esempio e test di segmentazione semi-automatizzata (nel passaggio 5 del presente protocollo) prima dell'imaging di tutti i campioni sperimentali. In questo modo l'utente può regolare le impostazioni di imaging affinché strumenti analitici possono facilmente discernere la struttura biologica di interesse.
2. Regolare i controlli di rivelatore di immagine per catturare il più alto rapporto segnale-rumore e la massima gamma dinamica dell'esemplare.
   1. Utilizzare una LUT (look up table) che indica la saturazione pixel (esposizione troppo alta) o undersaturation (offset troppo bassa) durante la regolazione delle impostazioni (Figura 3B, rosso indica la saturazione di pixel da una LUT Hi/Low).
   2. Verificare le impostazioni di guadagno e offset siano appropriate per tutti i gruppi sperimentali, come manipolazioni sperimentali probabile alterano la struttura di interesse.
      Nota: È fondamentale che le stesse impostazioni vengono utilizzate per tutti i gruppi per fare confronti quantitativi.
3. Immagine attraverso il tessuto per acquisire tutti i dati.
   Nota: Si consiglia di acquisire tutti i dati disponibili durante una sessione di imaging e di definire una zona più precisa durante la selezione del ROI nel passaggio 4 se necessario.
4. Salvare l'immagine come tipo di file supportato da software di imaging al fine di preservare i metadati quali parametri di acquisizione e calibrazione spaziale. Salvare l'immagine con un nome di file tra cui anticorpi data, background genetico e reporter fluorescenti, sperimentali, o coloranti corrispondenti ai canali scansionati come [nome gruppo sperimentale] _ [nome modello] _ [data di esperimento] _Ch1. [Fluorophore-destinazione /Dye]_Ch2.[fluorophore-target/Dye], ecc.

4. Fiji/ImageJ immagine importazione e selezione ROI

1. Aprire un'immagine in Fiji. Utilizzare la finestra di dialogo "Opzioni di importazione di Bio-Formats", scegliere "Visualizza stack con: Hyperstack" e impostare "modalità colore: scala di grigi".
   Nota: Si consiglia di aprire il tipo di file del microscopio, come metadati, ad esempio calibrazione spaziale può essere letto da Fiji.
2. Identificare un'area da un singolo piano z o una proiezione basata sui canali del marcatore che possono essere utilizzati come un ROI standardizzato attraverso esemplari (Figura 1, selezione di ROI).
   1. Utilizzare la barra di scorrimento "C" per visualizzare i canali utilizzati per catturare il marker(s) indicato al punto 1.1.
   2. Utilizzare la barra di scorrimento "Z" per spostarsi tra i piani focali. Scegliere una sola fetta o creare una proiezione di più sezioni facendo clic su "immagine | Stack | Progetto di Z"e imposta"Start fetta"e" Stop "per comprendere il ROI.
      Nota: Impostando il tipo di "" di proiezione "a"Max intensità"il progetto" Z"nella finestra di dialogo è spesso più adatto per enfatizzare strutture per segmentazione nella sezione 5, anche se questo potrebbe non essere appropriato per tutte le applicazioni. Se un altro tipo di proiezione è necessario per l'analisi, fare attenzione a salvare e documentare questo file come tale per l'estrazione di caratteristica in sezione 6 e/o 7.
   3. Generare una nuova immagine che contiene i canali e focale plane(s) di interesse per semplificare i passaggi seguenti nel protocollo di analisi di immagine. Selezionare "immagine | Duplicati", impostare il desiderato"canali"(c) e"Fette"(z) e cambiare il nome di file per riflettere la selezione (ad es., [nome gruppo sperimentale] _ [nome modello] _ [esperimento date]_[Channel(s)]_[z-plane(s)]).
3. Utilizzare uno degli strumenti di"selezione" sulla barra di Fiji per selezionare manualmente un ROI standardizzato sulla base dei criteri di selezione determinati al punto 4.2.
4. Aggiungere il ROI al manager di ROI facendo clic su "Analyze | Strumenti | ROI Manager "e fare clic su"Aggiungi"dal menu Manager di ROI. Salvare il ROI dal menu ROI Manager facendo clic su "più | Salva"e quindi denominare il file per riflettere il ROI (ad es., [nome gruppo sperimentale] _ [nome modello] _ [data di esperimento] _ [canale] _ [z-plane(s)] _ [Descrizione ROI]).
   Nota: Questo può essere riaperto in Fiji per successive analisi o può essere applicato ad altri canali o immagini come in sezione 5.3.

5. pre-elaborazione e segmentazione con h-maxima Watershedding

1. Eseguire la pre-elaborazione sul canale utilizzato per acquisire le strutture di interesse.
   1. Se il file di immagine è costituito da più canali, i canali separati facendo clic su "immagine | Colore | Dividere i canali"per isolare il canale di interesse.
   2. Applicare un filtro come un filtro mediano per ridurre il rumore o sfocatura gaussiana per lisciatura facendo clic su "processo | Filtri | Tipo di filtro"(ad es.,"Filtro mediano"o"Gaussian Blur").
      1. Diversi filtri di esempio e filtrare i parametri sulle immagini da ogni gruppo sperimentale. Procedere attraverso il passo 6.2 con un esempio rappresentativo di ogni gruppo per controllare le prestazioni di segmentazione. Selezionare il filtro e le impostazioni che facilitano la segmentazione delle strutture di interesse.
   3. Registrare il filtro e le impostazioni. Applicare questi parametri attraverso gruppi sperimentali.
   4. Salvare una copia dell'immagine come file tiff compreso il filtro applicato per riferimento. Utilizzare un nome dettagliato come [nome gruppo sperimentale] _ [nome modello] _ [data di esperimento] _ [canale] _ [z-plane(s)] _ [filtro con parametri].
2. Eseguire segmentazione delle strutture di interesse con lo strumento di spartiacque interattiva h-maxima sull'immagine pre-elaborato generato e salvato nel passaggio 5.1.
   1. Con l'immagine pre-elaborato attivo in Fiji, avviare lo strumento interattivo spartiacque h-maxima cliccando "SCF | Etichettatura | H_Watershed interattiva".
      Nota: Questo plugin calcola prima lo spartiacque e quindi consente all'utente di esplorare gli effetti massimi locali e opzioni di soglia sulla segmentazione attraverso un'immagine di uscita immediatamente aggiornato.
   2. Dal pannello di controllo, regolare seme dinamica (h), soglia di intensità (T) e picco inondazioni (%) per ottimizzare la segmentazione.
      Nota: Consultare sempre l'immagine raw prima di pre-elaborazione da sezione 4.2 per controllare manualmente la prestazioni della segmentazione delle strutture di interesse.
   3. Quando siete soddisfatti con i risultati di segmentazione, selezionare "Esporta la maschera di regioni" e scegliere "Esporta". Questo genererà un'immagine binaria dei risultati spartiacque (Figura 1, segmentazione).
   4. Registrare i parametri di segmentazione; questi parametri devono essere applicati attraverso gruppi sperimentali per confronti quantitativi. Salvare la maschera binaria risultati se desiderato per riferimento con parametri di segmentazione dettagliati nel nome come [nome gruppo sperimentale] _ [nome modello] _ [data di esperimento] _ [canali] _ [z-plane(s)] _ [filtro con parametri] _ [H_Watershed parametri].
3. Estrarre le strutture di interesse dai risultati di spartiacque.
   1. Aprire il ROI salvato da passo 4.4, in gestione ROI. Con la maschera di regioni binario dal punto 5.2.4 attivo, selezionare il ROI dal manager ROI da applicare all'immagine per limitare la funzione di estrazione per il ROI standardizzato.
   2. Con il ROI attivo sulla maschera binaria spartiacque, scegliere "Analyze | Analizzare le particelle"con"Aggiungi a Manager"selezionato nella finestra di dialogo per estrarre caratteristiche.
      Nota: Questo aggiungerà un identificatore di particelle per ogni struttura delineato durante la segmentazione per il gestore di ROI. Opzioni sono disponibili in questo menu per escludere caratteristiche in base alle dimensioni o circolarità se necessario per perfezionare strutture inclusi nell'analisi.
   3. Salvare le particelle facendo clic su "più | Save"dal menu manager di ROI. Assicurarsi che gli identificatori vengono deselezionati e tutte le particelle verranno salvate in un file zip. Utilizzare un nome dettagliato come [nome gruppo sperimentale] _ [nome modello] _ [data di esperimento] _ [canali] _ [z-plane(s)] _ [filtro con parametri] [H_Watershed parametri] _ [strutture].

6. quantità, Area e intensità quantificazione e analisi

1. Aprire l'immagine raw generati e salvati al punto 4.2. Scorrere fino al canale utilizzato per l'acquisizione di strutture di interesse.
   Nota: È fondamentale per prendere le misure di intensità dall'immagine raw (prima di pre-elaborazione) come l'applicazione di filtri in cambio di passo 5.1 i valori dei pixel.
2. Aprire le particelle ottenute dall'estrazione di funzionalità nel passaggio 5.3 e selezionare "Mostra tutto" dal gestore del ROI.
   Nota: Questa azione si sovrapporrà un contorno di ogni particella su "ROI Manager" sull'immagine e deve corrispondere i bordi delle strutture di interesse (Figura 1, Feature extraction).
3. Impostare le misure desiderate facendo clic su "Analyze | Impostare misure".
   Nota: L'area, intensità e densità delle particelle può essere misurate scegliendo "zona" e "densità integrata". Quando è selezionata la densità integrata, Fiji produrrà due valori: 'Integrated densità' calcolato come il prodotto della zona e valore di grigio medio e 'Raw integrato densità' misurato come la somma dei valori dei pixel. Densità della proteina fluorescente nelle particelle è calcolato come la somma dei valori dei pixel diviso per l'area. Il numero di particelle generate nel passaggio 5.3 indica la quantità di particelle all'interno del tessuto che Roi definito al punto 4.4.
4. Scegliere dal menu Manager ROI "Misura". I risultati sono espressi in unità calibrata, purché le misurazioni sono effettuate da file derivati in Fiji dal software di imaging. Copiare i risultati dalla finestra risultati e incollare nel software di foglio di calcolo per la compilazione e ulteriori calcoli.

7. raziometrici quantificazione e analisi dei dati

1. Seguire i passaggi 6.1 e 6.2 per aprire gli identificatori delle particelle sul primo canale crudo di interesse.
2. Impostare le misure desiderate facendo clic su "Analyze | Impostare misure".
   Nota: L'intensità media per particella può essere misurato scegliendo "Significa valore di grigio".
3. Da ROI Manager selezionare "Misura". Copiare i dati dalla finestra dei risultati e incollare nel software del foglio elettronico.
4. Spostare la barra di scorrimento "C" sul secondo canale crudo di interesse, GFP in questo esempio (Figura 4A) e ripetere i passaggi da 7.2. e 7.3.
   Nota: Le particelle salvate al passaggio 5.3 imposterà il canale e la fetta da cui è stato generato. Fare attenzione affinché le particelle vengono applicate al corretto canale di interesse.
5. Calcolare il rapporto tra l'intensità da un canale all'intensità del secondo per ogni particella nel software foglio di calcolo.
6. Utilizzare un grafico a dispersione per visualizzare e quantificare raziometrici dati da fluorofori che presentano singole modifiche riflettente dei processi biologici sottostanti.
   1. Generare un grafico a dispersione nel software di grafico.
      Nota: Ogni punto dati rappresenta una struttura di interesse dove l'intensità del fluoroforo primo di interesse è il valore"x" e l'intensità del fluoroforo secondo è il "valore di y" misurato da ogni particella.
   2. Impostare le soglie per ogni fluoroforo definire i quadranti di gating.
7. Utilizzare il profilo di linea per visualizzare fluoroforo intensità attraverso una struttura di interesse.
   1. Selezionare un ROI generato nel passaggio 5.3 e utilizzare lo strumento linea retta sulla barra degli strumenti per disegnare una linea retta attraverso il ROI. Aggiungere la riga ROI al Manager di ROI.
   2. Per ogni canale di interesse, con la linea ROI attivo, selezionare "Analyze | Tracciare il profilo".
      Nota: La funzione del profilo di trama genererà un grafico istogramma e una tabella dei valori di intensità lungo la linea. Copiare i risultati sono misurati da ciascun canale e incolla nel software di foglio di calcolo per generare un grafico che mostra entrambi i canali lungo la linea.

Representative Results

Quantificazione del numero, zona e intensità degli aggregati Htt mutanti fluorescente contrassegnati nel lobo ottico di Drosophila

Per indagare l'aggregazione di proteine misfolded nel sistema nervoso centrale di un modello di Drosophila della malattia di Huntington, RFP-etichetta mutante umano Htt con un non-patologico (UAS-RFP-hHttQ15) o espansione patologica ( UAS-RFP-hHttQ138) e membrana GFP (UAS-mCD8::GFP)¹¹ erano co-espressi sotto una padella-di un neurone driver elav-GAL4. Cervelli di mosche femminile 2 giorni dopo eclosion (DAE) sono stati sezionati, corretti e macchiati con DAPI conformemente al punto 2 del protocollo. Microscopia a scansione laser confocale è stato eseguito la messa a fuoco sul lobo ottico con un 40 X obiettivo obiettivo d'immersione in olio, 1.30 apertura numerica (NA), utilizzando una velocità di scansione di 8,0 µs per pixel e risoluzione spaziale di 1024 x 1024 pixel (12 bit per pixel). La dimensione ottimale passaggio determinata dal software di imaging era 1,08 µm per fetta per l'obiettivo con la seguente combinazione di lunghezze d'onda di eccitazione/emissione: canale 1) 488/510 per GFP, canale 2) 543/581 per RFP e canale 3) 405/461 per DAPI. Impostazioni di rivelatore di immagine applicate a tutti i gruppi per catturare immagini adatte per i confronti, erano basati su un esemplare di RFP-Htt-Q138, che si accumula aggregati RFP-Htt ad alta intensità, piuttosto che un esemplare di controllo RFP-Htt-Q15 non patogeni, che mantiene bassi livelli di diffusa RFP-Htt (Figura 2). Se le impostazioni di acquisizione immagine furono impostate per massimizzare la gamma dinamica di un esemplare di RFP-Htt-Q15, gli aggregati di RFP-Htt-Q138 sarebbero essere saturo. Ad esempio, una microfotografia di aggregazione proteica nel lobo ottico di Drosophila è stato salvato come HttQ138_Opticlobe.01_01012018_Ch1.RFP-Htt_Ch2.GFP_Ch3.DAPI.

L'intero lobo ottico era imaged durante la microscopia e consisteva di circa 15 z-fette, ma dopo formazione immagine è stato determinato che l'analisi di un singolo piano z era migliore risolvere individuo strutture che altrimenti apparirebbe sovrapposto in una proiezione a causa della ad alta densità all'interno del tessuto. Per determinare un ROI standardizzato, situati tra la piastra di midollo e lobula del lobo ottico¹² i corpi di cella C2 e C3 sono stati utilizzati come punto di riferimento anatomico. Nelle Isole Figi, l'immagine è stato duplicato così per riflettere le esigenze di analisi ed è stato salvato come file tiff denominato HttQ138_Opticlobe.01_01012018_Ch1.GFP_Ch2.RFP-Htt_Ch3.DAPI_z8, dove z8 riflette la fetta ottava dove erano più corpi delle cellule neuronali, C2 e C3 prominente di DAPI macchiatura (Figura 1A, acquisizione di immagini). È stato utilizzato lo strumento di selezione poligono per selezionare manualmente un ROI intorno al lobo ottico utilizzando DAPI macchiatura e segnale neuronale GFP come guida (Figura 1A, selezione ROI, dove il giallo indica il ROI e rosso indica l'immagine di alto ingrandimento indicato per chiarezza nei seguenti pannelli del flusso di lavoro). Successivamente, è stato applicato un filtro di sfocatura gaussiana con σ valore impostato su 1 per il canale di RFP-Htt per lisciare l'immagine e facilitare la segmentazione (Figura 1A, pre-elaborazione) e le prestazioni di segmentazione a valle e funzione di estrazione con e senza che questo passaggio di pre-elaborazione è illustrato in Figura 1A. H-spartiacque interattivo è stato effettuato sulle immagini del canale RFP-Htt con i seguenti parametri: seme dinamiche, 30; soglia di intensità, 500; picco di inondazioni (in %), 80; con ' spaccare ' selezionata Consenti e 'Esporta maschera regioni' (Figura 1A, segmentazione). La maschera di regioni binario risultante è stata salvata come HttQ138_Opticlobe. 01_01012018_Ch2.RFP-Htt_z8_GuassianBlur-sigma1_HWatershed-h30_T500_80percent e usati per generare particelle con lo strumento di analisi particelle con un'esclusione di dimensione minima di 0,4 µm² per definire proteina aggregati^13,14 . Le particelle risultanti sono state salvate dal manager ROI come HttQ138_Opticlobe.01_01012018_Ch1.RFP-Htt_z8_GuassianBlur-sigma1_HWatershed-h30_T500_80percent_aggregates e sono state applicate al canale RFP-Htt crudo (prima di pre-elaborazione) per estrarre dati di imaging quantitativi (Figura 1A, Feature extraction).

Quantificazione del numero di semi-automaticamente segmentato RFP-Htt aggregati da piani focali standardizzati attraverso il lobo ottico di Drosophila ha rivelato diffuso espressione dell'espansione Htt-Q15 non patogeni ed accumulo di proteine aggregati dalla malattia-causanti Htt-Q138 espansione (Figura 2A-C). La somma di tutti i valori di pixel in ogni particella dato da 'Raw densità integrata' è stata utilizzata per confrontare il contenuto di RFP-Htt di ogni aggregato. Profili di dimensioni e intensità di tutti gli aggregati da un piano focale standardizzato di cinque diversi lobi ottica esprimendo Htt-Q138 illustrano la robustezza e la riproducibilità del flusso di lavoro (Figura 2D, E). In particolare, quando gli aggregati sono sovraesposte durante acquisizione immagine (Figura 3A, B), quantificazione delle dimensioni e del numero degli aggregati sono paragonabili agli aggregati catturati con l'esposizione ideale (Figura 3, D), tuttavia la intensità degli aggregati sovraesposti diventa una funzione della dimensione come saturi pixel mostrano il valore di massima intensità (Figura 3E, F). Pertanto, impostazione parametri di esposizione scansione appropriati è fondamentale per estrarre l'intera gamma di composizione molecolare quantitativa di aggregati proteici.

Basato su raziometrici quantificazione del flusso di autofagia nella Drosophila visual lamina utilizzando un tandem fluorescente Atg8a reporter

Per valutare il flusso di autofagia-lisosoma nel sistema visivo della drosofila , mCherry-GFP-Atg8a reporter è stato espresso ubiquitariamente in controllo o mosche di Drosophila spermina sintasi (DSM) omozigote mutante (DSM^e/e) con L'actina-GAL4 driver. DSM^e/e Vola neurodegeneration espositivo che è associato con flusso autofagico alterata a causa di disfunzione lysosomal¹⁵. Cervelli con annesso lamina di mosche femminile a 5 DAE sono stati sezionati, corretti e macchiati con DAPI. La lamina è stato ripreso da microscopia confocale con un 100 X olio immersione lente obiettiva, 1,35 apertura numerica (NA), ad una velocità di campionamento di 8,0 µs per pixel e 12 bit per pixel di risoluzione ottica e dimensione del passaggio di 1,2 µm di scansione laser.

Questa analisi è stata eseguita una massima della z-proiezione di sette z-fette attraverso la lamina per aumentare la potenza di campionamento delle strutture sparse Atg8-positivi (Figura 1B, acquisizione di immagini). Il ROI standardizzato manualmente è stato disegnato con lo strumento di selezione poligono intorno allo strato di corpo cellulare ha rivelato di DAPI e basato sull'anatomia ben caratterizzato e organizzazione cellulare del tessuto (Figura 1B, selezione di ROI, dove il giallo indica la ROI e rosso indica l'immagine di alto ingrandimento indicato per chiarezza nei seguenti pannelli del flusso di lavoro)¹⁶. Il reporter di tandem si basa sulle proprietà di stabilità di GFP e mCherry moiety per contrassegnare la progressione attraverso il pathway di autofagia-lisosoma, tale che GFP è placata dall'acidità del lisosoma dove mCherry rimane finché non è degradato. Di conseguenza, il più longevo mCherry fluoroforo è stato utilizzato per la segmentazione in questo protocollo. È stato applicato un filtro di sfocatura gaussiana con valore σ 1 al canale mCherry (Figura 1B, pre-elaborazione), e H-spartiacque interattivo è stato effettuato con i seguenti parametri: seme dinamiche, 0; soglia di intensità, 800; picco di inondazioni (in %), 90; con ' spaccare ' selezionata Consenti e 'Esporta maschera regioni' (Figura 1B, segmentazione). La maschera di regioni binario risultante è stata utilizzata per generare particelle con lo strumento di analisi particelle. Le particelle risultanti sono state applicate sia al mCherry raw e raw canali GFP (prima di pre-elaborazione) per estrarre dati quantitativi raziometrici dai compartimenti autofagia-lisosoma (Figura 1B, Feature extraction).

Ispezione visiva delle strutture mCherry-GFP-Atg8-positive indicate arricchimento della regione del corpo delle cellule della lamina, coerenza con i rapporti precedenti di trasporto retrogrado delle vescicole autofagiche al corpo delle cellule in neuroni¹⁷. Profilo di trama è stato utilizzato per visualizzare mCherry e intensità GFP attraverso diverse strutture Atg8-positive (vedi linea ROIs in Figura 4A e profili di intensità risultante lungo la linea in Figura 4B), rivelando le differenze nel reporter dove l'alta intensità dei due fluorofori indica autofagosomi (Figura 4B3), mCherry ad alta e bassa GFP indica la fusione con i lisosomi come GFP è spenta in questo comparto acido (Figura 4B1), e infine mCherry basso riflette degradazione all'interno il lisosoma (Figura 4B2). Un grafico a dispersione generato dall'intensità media fluoroforo di ogni particella mCherry-Atg8-positivi semiautomatico segmentato illustra il flusso attraverso la via di autofagia-lisosoma che poi è stato separato in passi discreti di analisi quadrante ( Figura 4). La trama è stato diviso in quattro quadranti usando Gate soglie di GFP = 570, mCherry = 1.800. Le soglie sono state impostate in base al gruppo di controllo utilizzando le seguenti entità: (1) il design del reporter fluorescente tandem e le proprietà dei due fluorophores, così che teoricamente GFP dovrebbe non essere flourescente dove non c'è nessun segnale di mCherry (quadrante IV) e (2) la distribuzione delle particelle Atg8-positivo riflette la distribuzione dei comparti di correlate a via autofagia-lisosoma, nei neuroni di tipo selvatico, dove l'autofagia basale è altamente efficiente^18,19. Nelle lamine di controllo mosche, circa 25% delle particelle Atg8-positivi sono state cestinate come autofagosomi (quadrante io), e metà dei puncta vengono elaborate oltre fusione autofagosoma-lisosoma (quadrante II e III); DSM^e/e lamine avevano aumentato significativamente autofagosomi o disfunzionali lisosomi (quadrante ho) ed è diminuito di autolysosomes (quadrante II e III), indicativi di accumulo autofagosoma attraverso i difetti in fusione dell'autofagosoma-lisosoma e/o degradazione lisosomiale (Figura 4 C, D). Dati quantitativi supportato anche evidente accumulo di strutture Atg8-positive nella lamina da DSM^e/e mosche (Figura 4E). Raziometrici analisi del segnale GFP e media mCherry ha evidenziato una differenza tra controllo e DSM^e/e gruppo (Figura 4F) ma non è in grado di dettaglio l'influenza globale sul pathway né i passaggi specifici ha rivelati dal analisi di quadrante.

Figura 1: Flusso di lavoro attraverso la segmentazione bias-ridotti al minimo, semi-automatica di strutture subcellulari del cervello di Drosophila utilizzando Fiji con esempi. (A) rappresentante confocale micrografie dal singolo piano focale attraverso il lobo ottico di un cervello adulto di Drosophila che esprimono pan neuronale RFP-etichetta mutante Htt e membrana-mirati GFP (elav-GAL4 > UAS-mCD8:GFP, UAS-RFP-hHttQ138) con DAPI macchiatura (acquisizione immagine). DAPI e GFP sono stati usati per selezionare un ROI (giallo) intorno al lobo ottico; scatola rossa indica regione amplificato attraverso il flusso di lavoro per chiarezza (selezione ROI). Pannello di pre-elaborazione Mostra ad alto ingrandimento di immagine raw del canale RFP-HttQ138 (in alto) e dopo l'applicazione di un filtro di sfocatura gaussiana, σ1 (in basso). Segmentazione da spartiacque h-maxima interattiva utilizzando le impostazioni dei parametri indicati per dynamics seme determinato da h-maxima (h), i criteri di arresto globale spartiacque determinati dalla soglia di intensità (T), e fermata regionale criteri determinati dal picco (allagamento RFP-HttQ138 crudo (in alto) e immagini sfocate gaussiana (in basso) e risultati di spartiacque da regioni maschera esportati da spartiacque plugin e invertita per chiarezza sottoposti %). Le particelle generate da analizzano particelle (magenta) sovrapposte le immagini raw di RFP-HttQ138 (Feature extraction). Le frecce indicano gli aggregati che sono troppo segmentati senza pre-elaborazione e punte di freccia indicano le strutture che non riescono a separare dopo il filtraggio. (B) rappresentante confocale micrografie da z-sporgenza massima di 7 piani focali attraverso la sezione orizzontale della lamina di un controllo e mutante (DSM^e/e), della drosofila adulti esprimendo onnipresente (GFP-mCherry-Atg8a actina-GAL4 > UAS-GFP-mCherry-Atg8) con DAPI macchiatura (acquisizione immagine). DAPI è stato utilizzato per selezionare un ROI (giallo) intorno allo strato di corpo delle cellule della lamina; scatola rossa indica regione amplificato attraverso il flusso di lavoro per chiarezza (selezione ROI). Pannello di pre-elaborazione Mostra ad alto ingrandimento del canale mCherry con filtro di sfocatura gaussiana, σ1 applicato sia il controllo che il mutante della lamina. Segmentazione di spartiacque interattiva h-maxima eseguita sulle immagini mCherry filtrata con le impostazioni dei parametri indicati e spartiacque risultati mostrato come binario regioni maschera invertita per chiarezza. Le particelle generate da analizzano particelle (magenta) sovrapposte sul crudo mCherry e immagini GFP (Feature extraction). Scala bar = 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: quantificazione delle dimensioni e intensità di mutante RFP-Htt aggregati è robusto e riproducibile. (A-B) Cervello di Drosophila con RFP-hHttQ15 (A) o espressione RFP-hHttQ138 (B) sotto una padella-di un neurone driver elav-GAL4 era dissecato e fissa e i lobi ottici erano imaged di microscopia confocale a scansione laser. Barra della scala = 50 µm. (C) il numero medio degli aggregati in ogni gruppo quantificato da un ROI selezionato manualmente intorno al lobo ottico e focalizzata su una fetta di z standardizzata (n = 5). (D-E) La dimensione (D) e l'intensità totale (E) degli aggregati di RFP-hHttQ138 quantificato da standardizzata ROIs nei lobi in ottica di 5 diversi animali. Aggregazione dei dati è rappresentato graficamente in scala logaritmica. Gli aggregati sono stati definiti come oggetti superiori a 0,4 µm² (linea tratteggiata in D). Analisi statistica, One-way ANOVA, NS: non significativo; a.u.: unità arbitrarie Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: sovraesposizione immagine porta a misurazioni imprecise intensità. (A-B) Micrografo confocale rappresentanza della stessa optic lobe con l'esposizione ideale (A) e pseudocolored di sovraesposizione (B) con la LUT HiLo in Fiji. Rosso in B indica aggregati sovraesposti. Barra della scala = 50 µm. (C) quantificazione delle dimensioni di aggregazione dopo applicare h-maxima spartiacque parametri per generare risultati simili di segmentazione. Analisi statistica, campioni indipendenti t -test, NS: non significativo. Distribuzione di frequenza (D) della dimensione aggregata in immagini sovraesposte e ideale. Aggregati di dimensioni da 5 a 25 µm² sono stati ulteriormente cestinati in 4 gruppi categoriali. (E -F) Analisi di correlazione dell'intensità degli aggregati in funzione della pezzatura (E). Una linea di riferimento è disegnato (nero), quando tutti i pixel hanno un valore di intensità massima pari a 4095. Casella verde indica aggregati sotto 10 µm² zona indicata in F. b: coefficiente di regressione, R²: coefficiente di determinazione; a.u.: unità arbitrarie Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Quantificazione di un reporter tandem fluorescente mCherry-GFP-Atg8a genetica rivela caratteristiche distinte del flusso autofagico di Drosophila. (A) rappresentante confocale micrografie della drosofila lamina da controllo e DSM^e/e mosche mutanti ubiquistmente esprimendo mCherry-GFP-Atg8a (actina-GAL4 > mCherry-GFP-Atg8a) e macchiato per DAPI . Aree tratteggiate boxed del livello di corpo delle cellule della lamina sono mostrati in alto ingrandimento (a destra). I numeri indicano strutture rappresentative Atg8a-positivi tracciati in B e quantificato in C. Istogramma (B) tracciare l'intensità di fluorescenza in unità arbitrarie (AU) lungo linea ROIs indicato nelle immagini di alto ingrandimento in strutture mCherry-GFP-Atg8 A. (C) tracciati di intensità media di GFP in funzione dell'intensità media mCherry misurato dal controllo e DSM^e/e della lamina (particelle misurate da 3 lamine da ogni gruppo). La trama è stato diviso in quattro quadranti usando Gate soglie di GFP = 570 e mCherry = 1800 con la percentuale di strutture in ogni quadrante indicato dal genotipo. (D) quantificazione delle percentuali medie di mCherry-GFP-Atg8 classificati in ogni quadrante in C (n = 3 della lamina). (E) quantificazione dei numeri dei puncta mCherry-GFP-Atg8 a lamina (media ± S.D., n = 3 della lamina). (F) raziometrici analisi delle strutture mCherry-GFP-Atg8 osservata in controllo e mutante della lamina Vola (dire con IC al 95%, n = 3 della lamina). Di Student t-test. P < 0,05, * *P < 0.01. Sscale bar = 2 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Il protocollo descritto qui può essere utilizzato per robustamente e riproducibile quantitate processi biologici delle cellule visualizzati da formazione immagine di fluorescenza-basata. Contesto biologico e limiti tecnici devono essere attentamente considerati per guidare il disegno sperimentale. Marcatori fluorescenti di strutture subcellulari di interesse, se immunohistochemical, dye-based o geneticamente espresse, devono essere distinguibili sopra priorità bassa di morfologia e intensità. Il sistema GAL4/UAS è ampiamente usato per guidare l'espressione genica mirata in Drosophila. Gli esempi presentati qui utilizzato linee transgeniche che trasportano GAL4 driver per attivare la trascrizione di proteine fluorescente etichettate sotto il controllo del rinforzatore UAS per indagare l'aggregazione proteica e autofagia nel sistema nervoso. Se espressione simultanea di un transgene UAS sperimentale è necessario insieme a un transgene reporter fluorescente, il gruppo di controllo dovrebbe includere anche co-sovraespressione di un transgene irrilevante al controllo per il dosaggio di GAL4, ad esempio UAS-GFP o UAS-lacZ. Preparazione del campione standardizzato, come descritto qui per Drosophila del sistema nervoso centrale ed il sistema visivo, da dissezione, fissazione, anticorpo che macchia, grazie al montaggio, è fondamentale per la quantificazione e la formazione immagine ottima.

Buone pratiche che massimizzare il rapporto segnale-rumore e gamma dinamica di formazione immagine sono necessari per l'analisi semi-automatica e sono di fondamentale importanza per operare un confronto tra i gruppi sperimentali. Parametri di acquisizione di immagine devono essere impostati in modo che il reporter non è troppo saturi affinché l'intera gamma di intensità di proteina possa essere estratti e quantificati (Figura 3). Per confronti quantitativi, imaging deve essere eseguita con gli stessi parametri di acquisizione e preferibilmente lo stesso giorno.

Selezione di ROI, elaborazione delle immagini, caratteristica segmentazione e funzione di estrazione utilizzando la piattaforma open-source ImageJ/Fiji sono dipendenti dall'applicazione; mentre i parametri iniziali devono essere definiti dall'utente, loro applicazione attraverso esemplari ridurrà al bias massimizzando l'output di dati quantitativi. È fondamentale per attentamente workflow documentale e consigliato per salvare un'immagine come file tiff dopo ogni passaggio con dettagli di file nome applicato elaborazione. Questo può essere particolarmente utile quando si lavora fuori protocollo i parametri per la prima volta e la volontà di servire come punto di riferimento per garantire la coerenza tra gruppi sperimentali in ogni fase di elaborazione e analisi. Criteri di selezione ROI utilizzando marcatori o reperi anatomici dovrebbero essere definiti da un gruppo di controllo, ma deve prestare attenzione per assicurare che le manipolazioni sperimentali non alterano i marcatori o punti di riferimento in un modo che impedirebbe l'indicazione affidabile di un standardizzare il ROI. Una sola fetta o z-proiezione di più sezioni possa essere selezionata per affrontare meglio gli obiettivi dell'analisi, dove un singolo piano focale può essere utile per migliorare la separazione delle vicine strutture e una z-proiezione può essere utile per analizzare strutture localizzate in tutto il volume del tessuto. Il tipo di z-proiezione utilizzata per segmentazione e analisi delle immagini dovrebbe essere determinato accuratamente e in modo indipendente. Una proiezione di massima intensità produrrà un'immagine nitida, poiché le strutture sono più brillanti nei piani dove sono a fuoco e di solito sono adatti per la segmentazione. Analisi delle immagini può essere accettabile su una sporgenza massima, come nell'esempio di analisi di autofagia-lisosoma; Strutture Atg8-positive sono più piccole rispetto alle dimensioni di passaggio utilizzata per il campionamento, così più accuratamente sono rappresentati dall'intensità massima dal piano focale unico da cui furono catturati. Tuttavia, per l'analisi delle strutture più grandi rispetto alle dimensioni di passaggio, una somma-proiezione che aggiunge tutti i pixel con le stesse coordinate xy può rappresentare con maggiore precisione le informazioni di intensità di ogni struttura. Mentre questo protocollo è progettato per analizzare una singola fetta o z-proiezione di più sezioni in 2D, il flusso di lavoro potrebbe essere facilmente adattato per analizzare strutture 3D in un z-serie utilizzando molti degli stessi strumenti. Analisi 3D sarebbero auspicabile per una piccola dimensione del campione di strutture di forma irregolare, dove una fetta z che obliquamente interseca la struttura sarebbe inclinare l'analisi.

Pre-elaborazione con un filtro, ad esempio quelli suggeriti in questo protocollo, può ridurre il rumore preservando i bordi per facilitare la rilevazione delle strutture di interesse durante la segmentazione; disomogeneità di sfondo rumore e fluorescenti marcatore senza anti-aliasing sufficiente si tradurrà in eccessiva segmentazione, mentre le impostazioni che si traducono in troppa sfocatura rimuoverà dettaglio e impedire il rilevamento dei bordi precisi. Segmentazione di spartiacque considera l'immagine come una superficie topografica con una fonte di acqua a massimi locali — pixel ad alta intensità in un'immagine fluorescente — che inonda fino a quando incontra vicine aree inondate dove una diga o un limite di segmento, è costruito²⁰. Lo spartiacque di h-maxima utilizza una soglia definita dall'utente (dinamiche di h-maxima in SCF-MPI-CBG plugin) per distinguere significativi massimi locali per evitare eccessiva segmentazione delle strutture che non dispongono di un unico locale massimo²¹. Il plugin di spartiacque interattiva h-maxima implementato in questo protocollo permette all'utente di regolare il h-maxima dinamica (h), criteri di arresto globale spartiacque determinati dalla soglia di intensità (T) e regionale arresto criteri determinati dal picco inondazioni (%), mentre istantaneamente e visualizzazione dei risultati di spartiacque su un'immagine di uscita per valutare qualitativamente la prestazione di segmentazione. Risultati di segmentazione saranno strettamente d'accordo con la maggior parte dei confini di struttura, anche se sia eccessiva segmentazione e separazione incompleta (Figura 1A, frecce rosse in Feature extraction) possono verificarsi dove Contrassegno fluorescente è disomogenea o il tessuto è densamente popolata. L'efficienza delle operazioni di segmentazione e analisi semi-automatizzate può essere sfruttato per aumentare la potenza di campionamento e mitigare le insidie di segmentazione.

Dopo la segmentazione e la funzione di estrazione, è semplice per estrarre informazioni morfologiche come zona, dimensioni e circolarità. Inoltre, se le immagini sono raccolte in modo appropriato per evitare la sovraesposizione, informazioni molecolari possono anche essere dedotte da questa analisi di immagine mediante misure di intensità. Una volta che misure di patologia di malattia neurodegenerative sono estratti e quantificati mediante questo approccio, queste misure possono essere utilizzate per affrontare una serie di domande importanti. In particolare, il protocollo ha dimostrato il potenziale di utilizzare immagine analisi e quantificazione degli aggregati proteici per identificare i fattori che influenzano l'aggregazione proteica e correlano distribuzione, numero, dimensione e densità della proteina degli aggregati con disfunzione neuronale e salute organismal. Basato su raziometrici quantificazione può essere utilizzato per informare aggregata interazione con componenti sottocellulari o processi durante la progressione di malattia. Mentre biochimici e citometria a flusso sono stati applicati per analizzare l'interazione degli aggregati e con altre strutture subcellulari, lisi cellulare possono portare alla perdita della proteina, modificare le proprietà di aggregazione e perturbare di interazioni proteina-proteina²². mCherry-GFP-Atg8 è stato ampiamente utilizzato per monitorare l'autofagia attraverso microscopia di fluorescenza, soprattutto in cellule coltivate²³, ma mancano metodi di analisi quantitative e imparziale. Inoltre, analisi in vivo utilizzando il reporter codificato geneticamente tandem è impegnativo e richiede una preparazione di sfondo e del tessuto genetica altamente controllata. Questo protocollo delinea metodologia verificato dalla preparazione del tessuto di imaging a pratiche critiche di quantificare scomparti di autofagia-lisosoma. Con le buone pratiche genetiche, gli approcci di analisi di immagine inclusi Atg-positivi particella intensità profili e analisi di quadrante con gating di singoli segnali fluorescenti, possono permettersi potente rilevamento e confronto tra normale e patologico flusso autofagico in vivo in modelli di malattie diverse.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SYLGARD(R) 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning Corporation	PF184250	Dissection dish
Falcon 35 mm Not TC-Treated Easy-Grip Style Bacteriological Petri Dish	Corning	351008	Dissection dish
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-20	Dissection tool
Sodium Chloride	Sigma	S3014	PBS solution
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma	S5136	PBS solution
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma	P5655	PBS solution
Triton X-100	Sigma	T9284	Washing and antibody incubaton solution.
37% Formaldehyde	VWR	10790-710	Fixation
Disposable Microcentrifuge Tubes (0.5mL, blue)	VWR	89000-022	Fixation, washing, and antibody incubaton.
Plain and Frosted Micro Slides (25×75mm)	VWR	48312-004	Slides for confocal imaging
Micro Cover Glasses, rectangular (22×40mm)	VWR	48393-172	Slides for confocal imaging
Rubber Cement	Slime	1051-A	Mounting
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories, Inc.	H-1000	Mounting
Scotch Magic 810 Invisible Tape (19mm×25.4m)	3M Company	810	Mounting
Normal Goat Serum	Thermo Fisher Scientific	PCN5000	Antibody incubaton
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Thermo Fisher Scientific	D1306	Nucleic acid staining. Dissolve in deionized water to make a 5 mg/mL stock solution and store at -80°C. Dilute to a working concentration of 10-20 μg/mL in PBTx.
3.5X-90X Stereo Zoom Inspection Industrial Microscope	AmScope	SM-1BNZ	Dissection scope. Equipped with 6W LED Dual Gooseneck Illuminator
ImageJ/Fiji	NIH	v1.51u	With SCF_MPI_CBG plugins (version 1.1.2)
FV1000-IX81 Confocal-laser Scanning Microscope	Olympus
Recombinant Construct	Bloomington Drosophila Stock Center	BL37749