Abbiamo sviluppato un flusso di lavoro semplice e adattabile per estrarre dati quantitativi da studi biologici basati su formazione immagine di fluorescenza delle cellule di aggregazione proteica e flusso autofagico nel sistema nervoso centrale di Drosophila modelli di neurodegenerazione.
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Articolo metodologico
Biologia cellulare quantitativa della neurodegenerazione in Drosophila attraverso analisi imparziale delle proteine fluorescente contrassegnate usando ImageJ
In questo articolo
Sommario
Abstract
Con la crescente diffusione di malattie neurodegenerative, è sempre più importante capire la patofisiologia di fondo che conduce alla perdita e disfunzione neuronale. Tecnologie e strumenti di imaging basata sulla fluorescenza abilitare analisi senza precedenti dei processi neurobiologici subcellulari, eppure c'è ancora una necessità di approcci imparziale, riproducibile e accessibile per l'estrazione di dati quantificabili da studi di imaging . Abbiamo sviluppato un flusso di lavoro semplice e adattabile per estrarre dati quantitativi dagli studi di formazione immagine di fluorescenza-basata della drosofila in modelli di neurodegenerazione. In particolare, descriviamo un metodo facile da seguire, semi-automatizzato utilizzando Fiji/ImageJ per analizzare i due processi cellulari: in primo luogo, quantifichiamo aggregazione proteica e profilo nel lobo ottico Drosophila utilizzando fluorescenti-etichetta mutante proteine di huntingtin; e in secondo luogo, valutiamo il flusso di autofagia-lisosoma nel sistema visivo della drosofila con quantificazione basata su raziometrici di un reporter fluorescente tandem dell'autofagia. D'importanza, il protocollo descritto qui include un passaggio di segmentazione semi-automatizzata per garantire che tutte le strutture fluorescenti sono analizzate per minimizzare il bias di selezione e per aumentare la risoluzione di sottili confronti. Questo approccio può essere esteso per l'analisi di altre strutture biologiche cellulari e processi implicati nei processi neurodegenerativi, quali proteinico puncta (granuli di stress e complessi sinaptici), anche come membrana-limitano scomparti (mitocondri e vescicole della membrana del traffico). Questo metodo fornisce un standardizzato, ma adattabile riferimento punto per analisi dell'immagine e la quantificazione e potrebbe facilitare affidabilità e riproducibilità attraverso il campo e infine migliorare comprensione meccanicistica della neurodegenerazione.
Introduzione
Malattie neurodegenerative colpiscono milioni di persone ogni anno e l'incidenza sta aumentando con l'invecchiamento della popolazione1. Mentre ogni malattia neurodegenerative ha un'eziologia unica, aggregazione delle proteine misfolded e ripartizione della rete proteostasis sono patologici comuni caratteristiche di molte di queste malattie. Delucidamento come rottura di questi processi fondamentali e interdipendenti va storto per contribuire alla morte delle cellule e la disfunzione neuronale è fondamentale per la comprensione delle malattie neurodegenerative così come guidare gli interventi terapeutici. Acquisizione di immagini basata sulla f....
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Protocollo
1. Considerazioni e preparati per la progettazione dell'esperimento di analisi di immagine
- Predeterminare adatto anatomico, cellulare, o subcellulari marcatori per servire come punti di riferimento per la standardizzazione di una regione di interesse (ROI) attraverso diversi campioni, ad esempio 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), marcatori di membrana, localizzati fluorescenti proteine, ecc.
- Selezionare un marcatore fluorescente che può delimitare discreto puncta oltre i livelli di sfondo per la struttura di interesse.
Nota: Questo protocollo è ottimizzato per le strutture proteiche (ad es., aggregati di proteine misfolded....
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Risultati
Quantificazione del numero, zona e intensità degli aggregati Htt mutanti fluorescente contrassegnati nel lobo ottico di Drosophila
Per indagare l'aggregazione di proteine misfolded nel sistema nervoso centrale di un modello di Drosophila della malattia di Huntington, RFP-etichetta mutante umano Htt con un non-patologico (UAS-RFP-hHttQ15) o espansione patologica ( UAS-RFP-hHttQ138) e membrana GFP .......
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Discussione
Il protocollo descritto qui può essere utilizzato per robustamente e riproducibile quantitate processi biologici delle cellule visualizzati da formazione immagine di fluorescenza-basata. Contesto biologico e limiti tecnici devono essere attentamente considerati per guidare il disegno sperimentale. Marcatori fluorescenti di strutture subcellulari di interesse, se immunohistochemical, dye-based o geneticamente espresse, devono essere distinguibili sopra priorità bassa di morfologia e intensità. Il sistema GAL4/UAS.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è supportato da Sheila e David Fuente neuropatico dolore ricerca programma Istituto europeo di Oncologia (a J.M.B.), il Lois Pope LIFE Fellows Program (di C.L., Y.Z. e J.M.B.), la Snyder-Robinson Foundation Fellowship Predoctoral (a C.L.), il Dr. John T . Fondazione di Macdonald (a C.L.), contratti, borse di studio dal National Institutes of Health (NIH) HHSN268201300038C, R21GM119018 e R56NS095893 (per R.G.Z.) e dal progetto di studioso di Taishan (Provincia di Shandong, Repubblica popolare cinese) (per R.G.Z.).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Kit di elastomeri siliconici SYLGARD(R) 184 | Dow Corning Corporation | PF184250 | Piatto di dissezione |
| Falcon 35 mm Non trattato con TC Piastra di Petri batteriologica Easy-Grip | Corning | 351008 | Piatto di dissezione |
| Dumont #5 Pinze | Fine Science Tools | 11251-20 | Strumento di dissezione |
| Cloruro di sodio | Sigma | S3014 | Soluzione |
| PBSFosfato di sodio bibasico | Sigma | S5136 | PBS soluzione |
| Potassio Fosfato Monobasico | Sigma | P5655 | PBS soluzione |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | Soluzione di lavaggio e incubazione di anticorpi. |
| fissazione | VWR | 10790-710 | 37% di formaldeide |
| (0,5 ml, blu) | VWR | 89000-022 | Fissaggio, lavaggio e incubazione di anticorpi. |
| Micro vetrini lisci e smerigliati (25&volte; 75mm) | VWR | 48312-004 | Vetrini per imaging confocale |
| Micro Cover Glasses, rettangolari (22× 40mm) | VWR | 48393-172 | Vetrini per imaging confocale |
| Gomma Cemento | Slime | 1051-A | Montaggio |
| VECTASHIELD Antifade Montaggio Medio | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | Nastro |
| invisibile Scotch Magic 810 (19mm&volte; 25,4 m) | 3M Company | 810 | Montaggio |
| capra normale | Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | Incubazione di anticorpi |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindolo, Dicloridrato) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | Colorazione con acido nucleico. Sciogliere in acqua deionizzata per ottenere una soluzione madre da 5 mg/mL e conservare a -80 °C. Diluire a una concentrazione di lavoro di 10-20 °C; g/mL in PBTx. |
| 3.5X-90X Stereo Zoom Ispezione Microscopio industriale | AmScope | SM-1BNZ | Ambito di dissezione. Dotato di illuminatore a doppio collo d'oca a LED da 6 W |
| ImageJ/Fiji | NIH | v1.51u | Con plug-in SCF_MPI_CBG (versione 1.1.2) |
| FV1000-IX81 Microscopio a scansione laser confocale | Olympus | ||
| Costrutto ricombinante | Bloomington Drosophila Stock Center | BL37749 |
Riferimenti
- Erkkinen, M. G., Kim, M. -O., Geschwind, M. D. Clinical Neurology and Epidemiology of the Major Neurodegenerative Diseases. Cold Spring Harbor perspectives in biology. , a033118(2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-imag....
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Ristampe e permessi
