Summary
Protein toplama ve merkezi sinir sistemi Drosophila modellerinin autophagic akı floresan-görüntüleme tabanlı cep biyolojik çalışmalar nicel veri ayıklamak için bir basit ve uyarlanabilir iş akışı geliştirdiğimiz ateş.
Abstract
Nörodejeneratif hastalıklar yükselen ve yaygınlığı ile giderek nöronal fonksiyon bozukluğu ve kaybına yol açan temel patofizyolojisi anlamak önemlidir. Henüz hala bir ihtiyaç için çalışmalar Imaging ölçülebilir veri ayıklamak için tarafsız, tekrarlanabilir ve erişilebilir yaklaşımlar floresans tabanlı görüntüleme araçları ve teknolojileri hücre altı nörobiyolojik süreçleri, benzeri görülmemiş analizini etkinleştirmek . Biz ateş Drosophila modelleri kullanarak floresans tabanlı görüntüleme çalışmaları sayısal veri ayıklamak için basit ve uyarlanabilir bir iş akışı geliştirdik. Özellikle, biz iki hücresel süreçler analiz etmek için Fiji/ImageJ kullanarak takip etmek kolay, yarı otomatik bir yaklaşımı açıklamak: ilk olarak, protein toplama içeriği ve profil Drosophila optik mutant floresan öğesini kullanarak lob ölçmek huntingtin proteinleri; ve ikincisi, Drosophila görsel sisteminde autophagy ratiometric tabanlı miktar bir tandem floresan gazeteci ile autophagy-lysosome akı değerlendirmek. Önemlisi, burada özetlenen iletişim kuralı tüm floresan yapıları seçim önyargı en aza indirmek için ve ince karşılaştırma çözünürlüğünü artırmak için analiz edilir emin olmak için bir yarı otomatik bölümleme adım içerir. Bu yaklaşım diğer hücre biyolojik yapıları analiz için uzatılabilir ve süreçleri de gibi membran bağlı bölmeleri içinde ateş, proteinaceous puncta (stres granül ve sinaptik kompleksleri), gibi karıştığı (mitokondri ve membran kaçakçılığı veziküller). Bu yöntem uyarlanabilir görüntü analizi ve miktar ve başvuru noktası ve güvenilirlik ve tekrarlanabilirlik alanın karşısındaki kolaylaştırmak, sonuçta ateş mekanik anlayışı geliştirmek henüz standart, sağlar.
Introduction
Nörodejeneratif hastalıklar her yıl milyonlarca insan etkiler ve bir yaşlanma nüfus1ile görülme sıklığı artmaktadır. Her nörodejeneratif hastalık benzersiz bir etiyoloji olsa da, toplama misfolded proteinlerin ve proteostasis ağ arıza bu hastalıkların çoğunun ortak patolojik işaretlerinden vardır. Nasıl bu temel ve birbiriyle ilişkili işlemler bozulma goes awry elucidating nöronal fonksiyon bozukluğu ve hücre ölümüne katkıda nörodejeneratif hastalıkları anlamak için hem de tedavi müdahaleler rehberlik çok önemlidir. Floresans tabanlı görüntüleme nöronlar karmaşık ve dinamik bu işlemlerde incelenmesi için izin verir ve büyük ölçüde nöronal hücre biyoloji anlayışımız katkıda bulunmuştur. Özellikle deneyler vivo içindeson derece kompakt doku, farklı hücre tipleri ve morfolojik heterojenite nedeniyle dışarı taşırlarken analiz fluorescently tagged proteinlerin zordur. El ile destekli miktar uygun fiyatlı ve basit, ama genellikle zaman alıcı ve tabi insan önyargı. Bu nedenle, çalışmalar Imaging ölçülebilir veri ayıklamak için tarafsız, tekrarlanabilir ve erişilebilir yaklaşımlar için bir ihtiyaç vardır.
Biz Fiji/ImageJ, güçlü ve serbestçe erişilebilir görüntü işleme yazılımı2,3, deneysel modelleri floresans görüntüleme çalışmaları nicel veri ayıklamak için kullanan basit ve uyarlanabilir bir iş akışı belirttiğimiz Drosophilakullanma ateş. Protein toplama ve autophagic akı ölçmek için bu iletişim kurallarını izleyerek — iki nörodejeneratif hastalık patolojiye son derece alakalı biyolojik özellikleri hücre — hassasiyet ve tekrarlanabilirlik bu yaklaşımın gösterdi. Drosophila optik lob fluorescently tagged mutant huntingtin (Htt) proteinlerin çözümleme sayısı, boyutu ve yoğunluğu protein toplamları ortaya. Tandem floresan muhabir autophagic akı compartmental çevre4bağlı olarak farklı emisyon sinyallerini görüntüler Drosophila görsel sistemi içinde görüntülenir. Ratiometric tabanlı analiz tandem muhabir autophagosome oluşumu, olgunlaşma ve taşıma autophagy-lysosome akı lysosome bozulması için nicel ve kapsamlı bir görünümünü için izin ve ayrıca savunmasız vurgulanmış nörodejeneratif koşullarda kesintiye bölmeleri. Önemlisi, biz bilinçsiz önyargı en aza indirmek için bizim protokolünde yarı otomatik eşik ve segmentasyon adımları hayata her iki analizlerde örnekleme gücünü artırmak ve benzer çalışmalar arasında karşılaştırma yapmayı kolaylaştırmak için bir standart sağlamak. Basit iş akışı güçlü Fiji/ImageJ eklentileri (matematik algoritmalarına dayalı bilgisayar mühendisleri tarafından geliştirilen) yapmak için tasarlanmıştır daha neurobiologists ve geniş yaşam bilimleri topluluğu için erişilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. dikkat edilmesi gereken noktalar ve görüntü analiz deney tasarımı için hazırlıklar
- Örneğin 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), membran işaretleri, yerelleştirilmiş floresan kazanmakla uygun anatomik, cep veya farklı örnekler üzerindeki bir bölge (ROI) ilgi standartlaştırılması için simge olarak hizmet için hücre altı işaretleyicileri protein, vb
- Ayrık puncta faiz yapısı için arka plan düzeyleri ötesinde sınırlandırabilirsiniz bir floresan işaretleyiciyi seçin.
Not: Bu protokol proteinaceous yapıları (Örneğin, misfolded protein toplamları) ve membran bağlı organelleri (Örneğin, autophagy muhabir) için optimize edilmiştir. Protein toplama görselleştirmek için kullanılan5insan Htt proteini bir RFP öğesini N-terminal parçası 138 yineler (RFP-hHttQ138) bir patojen polyQ yolu ile yapıldı. Mutant Htt protein elav GAL45,6gibi nöronal belirli sürücüleri altında ifade sitoplazmik toplamları oluşturur. Aktin-GAL4 autophagosome-lysosome akı görselleştirmek için ubiquitously ifade bir tandem mCherry-GFP-Atg8a muhabir sürücü için kullanıldı. mCherry ve GFP pozitif puncta gösterir autophagosomes ve GFP floresans bozulmuş7proteindir kadar nerede asit-duyarlı mCherry kalır lysosome, asidik ortamda söndürülür gibi akı izlenir. Ratiometric analiz için tutarlı bir belirtecidir yapısı tek bir kanal bölümleme için kullanılan, veya yine de açıkça açıklanan bu protokol için uygunsa, iki veya daha fazla kanalı bir projeksiyon yapıları, betimlemek için kullanılabilir. Örneğin, asit-duyarlı ve akı ile yol boyunca yerde kalacaktır gibi mCherry Atg8 pozitif parçacıklar, bölümleme için kullanılır. - Açık kaynak görüntü analiz platformu ImageJ veya Fiji karşıdan yükleyip — eklentileri2,3ImageJ ile tercih edilen dağıtım birlikte.
- H-maxima etkileşimli dönüm noktası için eklenti.
Not: Fiji bu iletişim kuralını kullanır; ek eklentileri ImageJ için gerekli olabilir. Benoit Lombardot SCF-MPI-CBG için tarafından geliştirilen eklenti kullanılabilir çevrimiçi (https://imagej.net/Interactive_Watershed) olur. - Gidin "yardım | Güncelleştirmek", seçmek"Yönet güncelleştirme siteleri""ImageJ Güncelleyici"dan SCF-MPI-CBG update sitesini listeden seçin ve sonra kapatın ve Fiji yeniden başlatın.
2. beyin diseksiyon ve ayirt boyama
-
Silikon elastomer kaplı diseksiyon yemekleri yapmak.
- Silikon elastomer bileşenleri bir ölçek üretici ve iyice karışık kadar heyecan tarafından belirtildiği şekilde dökün.
- 5 cm doldurmak için bir pipet kullanın doku kültürü yemekleri üçte biri yarısına tam (yaklaşık 10 mL elastomer karışımı). Yüzeye çıkmak ve kağıt mendil ile yavaşça kaldırmak için herhangi bir baloncuklar izin. Bulaşıkları kapak ve 48-72 saat oda sıcaklığında (RT) tedavisi için düzey bir yüzeye koyun.
-
Kopyalayabilmek Drosophila beyin ve gerekirse görsel sistem.
- Drosophila beyin diseksiyon yukarıda açıklanan8,9olarak gerçekleştirin. Diseksiyon elastomer kaplı diseksiyon yemekleri, zarar verici doku veya forseps önlemek için beyin dengelemek için bir elastomer alt kullanarak gerçekleştirin.
- Lamina diseksiyon sırasında korumak için iki forseps retina altında slayt ve yavaşça retina kaldırmak için göz ortasından yırtıyorsun. Lamina yüzeyine paralel düzenlenen forseps ile lamina için bağlı retina herhangi bir doku uzağa çek.
Not: Artık pigment aşağıdaki adımlarda yıkayın ve genellikle boyama ve görüntüleme antikor ile müdahale değil. - Fosfat tamponlu tuz çözeltisi (% 3.7 son bir konsantrasyon içinde 500 µL microcentrifuge tüp kullanmadan önce taze yapmak için PBS) içinde formaldehit % 37 oranında seyreltin. Microcentrifuge tüp düzeltme çözümü ile disseke beyin aktarmak ve hafif sallanan ile 15 dakika RT, kuluçkaya.
Not: Formik asit üreten formaldehit okside doğal bir eğilim vardır. Bu nedenle, aliquot %37 formaldehit depolama için önerilen ve sulu taze her kullanımdan önce % 3.7 için. Aşırı fiksasyon veya altında fiksasyonu doku ve floresan10bütünlüğünü etkileyecektir. - 3 kez ile PBTx yıkama (PBS % 0,4 ile Triton X-100) 15 dakika.
-
İmmünhistokimya gerçekleştirmek ve numuneler monte edin.
- Antikor boyama gerekirse PBTx kaldırmak, birincil antikor PBTx içinde % 5 normal keçi serum ile seyreltilmiş eklemek ve gecede 4 ° C'de aliquot bir karıştırıcı üzerinde kuluçkaya
- Birincil antikor kaldırmak ve 3 kez 15 dk her PBTx ile yıkayın. İkincil antikor PBTx içinde % 5 normal keçi serum ile seyreltilmiş ekleyin ve RT, 1 h için kuluçkaya veya bir gece 4 ° C'de 3 kez 15 dk her PBTx ile yıkayın.
- DAPI boyama gerekirse PBTx kaldırmak, DAPI çözüm eklemek (stok çözüm: 5 mg/mL, seyreltik bir çalışma konsantrasyonu PBTx 15 µg/ml) ve 10 dakika dik yıkama 15 dakika PBTx ile 3 kez kuluçkaya.
- Doku temizlemek için bir damla montaj orta mikroskobu slayt merkezi rondela açık teyp her iki tarafta bir tabaka ile üzerine yerleştirin. Beyin üzerine montaj orta damla aktarmak ve beyin saydam hale gelene kadar için 1-2 dakika bekleyin. Bir pipet ile montaj orta dikkatli bir şekilde çıkarın.
- Takmak için slayt üzerinde taze montaj orta beyin üzerine bir damla uygulanır. Dikkatle kabarcıklar kaçınarak bir cam kaplar. Kenarları kauçuk çimento ile mühür ve 20 dk. devam etmek için resim alma en iyi sonuç için RT kuruması.
3. resim alma
- Dahil olmak üzere uzamsal çözünürlük, amaç, zoom, tarama hızı, mikroskop satın alma parametrelerini optimize etmek ve boyutu görüntü analizi sırasında yarı otomatik bölümleme kolaylaştırmak için çözünürlük ilgi yapıların en üst düzeye çıkarmak için adım.
Not: Bir örnek görüntü yakalama ve yarı otomatik bölümleme (içinde adım 5 Bu protokol) tüm deneysel örnekleri Imaging önce sınamak yararlı olabilir. Böylece analitik araçlar ilgi biyolojik yapısını kolayca ayırt edebilirsiniz bu şekilde Kullanıcı görüntüleme ayarlarını yapın. -
En yüksek sinyal gürültü oranı ve yüksek dinamik Aralık örnek yakalamak için görüntü algılayıcısı kontrolleri ayarlayın.
- Piksel Doygunluk (pozlama çok yüksek) veya (Şekil 3B, kırmızı bir Hi-Low LUT tarafından piksel doygunluk gösterir) ayarlarını yapma sırasında undersaturation (sapma çok düşük) gösterir bir LUT (tablo arama) kullanın.
- Deneysel manipülasyonlar olası faiz yapısı olarak kazanç ve mahsup hesabı ayarları tüm deneysel grupları için uygun olduğunu doğrulayın.
Not: Aynı ayarları tüm gruplar için nicel karşılaştırma yapmak için kullanılır zorunludur.
- Tüm verileri elde etmek için doku görüntü.
Not: Kullanılabilir verilerin tümünü bir görüntüleme oturumu sırasında yakalamak ve gerekirse 4. adımda ROI seçimi sırasında daha kesin bir alanını tanımlamak için önerilir. - Edinme parametreleri ve kayma kalibrasyon gibi meta verileri korumak için düşsel bilgisayar yazılımı tarafından desteklenen dosya türü olarak kaydetmek. Görüntü deneysel Tarih, genetik arka plan ve floresan gazetecilere, antikorlar da dahil olmak üzere bir dosya adıyla kaydedin veya kanallara karşılık gelen boyalar taranan [deneysel grup adı] _ [örnek adı] _ [deneme tarihi] _Ch1. gibi [Fluorophore-hedef /Dye]_Ch2.[fluorophore-Target/dye], vb
4. Fiji/ImageJ görüntü alma ve yatırım getirisi seçimi
- Bir görüntüyü Fiji'de açın. "Bio-formatları içe aktarma seçenekleri" iletişim kutusu, seçmek "görünümü yığınıyla: Hyperstack" ve "renk modu: gri tonlama".
Not: Bu kayma kalibrasyon Fiji okuyabilir gibi meta veriler olarak mikroskop dosya türünü açmak için tavsiye edilir. -
Bir alanı tek bir z uçağı veya standart bir yatırım getirisi örnekler arasında (Şekil 1, yatırım getirisi seçimi) kullanılabilir işaret kanal (lar) temel alan bir projeksiyon tanımlayın.
- 1.1. adımda belirlenmiş marker(s) yakalamak için kullanılan kanal (lar) görüntülemek için "C" kaydırma çubuğunu kullanın.
- Odak uçaklar taşımak için "Z" kaydırma çubuğunu kullanın. Tek bir dilim seçin veya birden çok dilim bir projeksiyon tıklatarak oluşturun "görüntü | Yığınlar | Z Projesi"ve set"Başlat dilim"ve"Stop dilim"ROI kapsayacak şekilde.
Not: "projeksiyon türü ayarı" olsa bu tüm uygulamalar için uygun olmayabilir "Max şiddeti" "Z Projesi" iletişim kutusu genellikle en iyi yapıları için bölümleme Bölüm 5 ' daki vurgulamak için uygundur. Başka tür bir projeksiyon analizi için gerekliyse, kaydetmek ve bu nedenle Bölüm 6 ve/veya 7 özellik çıkarma için bu dosya belge için özen gösterin. - Kanal (lar) ve görüntü analizi iletişim kuralı aşağıdaki adımları basitleştirmek ilgi odak plane(s) içeren yeni bir resim oluşturur. Seçin "görüntü | Yinelenen", istenen"Kanallar"(c) ve"Dilim"(z) ayarlayabilir ve değiştirebilirsiniz (Örneğin, [deneysel grup adı] _ [örnek adı] [deneme date]_[Channel(s)]_[z-plane(s)]). seçiminizi yansıtmak için dosya adı
- Bir "seçim araçları" Fiji araç çubuğundaki el ile standart bir yatırım getirisi 4.2. adımda belirlenen seçim ölçütlerine dayanarak seçmek için kullanın.
- ROI ROI Yöneticisi'ne tıklayarak ekleme "Analyze | Araçlar | ROI Yöneticisi "ve"Ekle"ROI Yöneticisi menüsünde'ı tıklatın. ROI ROI Yöneticisi menüsünden tıklatarak kaydedin "daha | Kaydetmek"ve ROI yansıtmak için dosya adı (Örneğin, [deneysel grup adı] _ [örnek adı] _ [deneme tarihi] _ [Kanal] _ [z-plane(s)] _ [ROI Açıklama]).
Not: Bu Fiji'de daha sonraki analizler için açılabilir veya diğer kanalları veya olduğu gibi Bölüm 5.3 görüntü uygulanabilir.
5. ön işleme ve segmentasyon h-maxima Watershedding ile
-
Faiz yapılarının yakalamak için kullanılan kanal ön işleme gerçekleştirin.
- Resim dosyasının birden çok kanal oluşuyorsa, tıklatarak kanalları ayırmak "görüntü | Renk | Kanalları Böl"kanal ilgi izole etmek.
- Gürültü veya tıklatarak düzeltme için Gauss Bulanıklığı azaltmak için bir Medyan filtresi gibi bir filtre uygula "süreci | Filtreler | "Filtre türü" (Örneğin, "Medyan filtresi" veya "Gaussian Blur").
- Farklı filtre tadın ve parametreleri imge--dan her deney grubu üzerinde filtre uygulayabilirsiniz. Adımda 6.2 bölümleme performansını kontrol etmek için her grup temsil edici bir örnek ile devam edin. Filtre ve segmentasyon ilgi yapıların kolaylaştırmak ayarlarını seçin.
- Filtre ve ayarları kaydedin. Bu parametreler deneysel grupları arasında geçerlidir.
- Başvuru için uygulanan filtre kapsayan bir TIFF dosyası olarak görüntünün bir kopyasını kaydedin. [Deneysel grup adı] _ [örnek adı] _ [deneme tarihi] _ [Kanal] _ gibi detaylı bir ad kullanın [z-plane(s)] _ [süzgeç parametreleri ile].
-
Segmentasyon yapıları etkileşimli h-maxima dönüm noktası aracı ile ilgi oluşturulan ve 5.1. adımda kaydettiğiniz Önişlenmiş görüntü üzerinde gerçekleştirin.
- Fiji'de etkin Önişlenmiş görüntü ile h-maxima etkileşimli havza aracı tıklatarak başlatmak "SCF | Etiketleme | Etkileşimli H_Watershed".
Not: Bu eklenti ilk dönüm noktası hesaplar ve yerel maxima ve segmentasyon bir anında Güncellenme Zamanı çıkış görüntü yoluyla eşik seçenekleri etkilerini araştırmak kullanıcının izin verir. - Denetim Masası'ndan, tohum dinamikleri (s), yoğunluğu eşik (T) ve en yüksek (%) bölümleme optimize etmek için sel ayarlayın.
Not: Her zaman raw resim bölümü el ile ilgi yapıların bölümleme performansını incelemek için 4.2 ön işleme önce bakın. - Segmentasyon sonuçlardan memnun, "bölgeler maske ver"'i seçin ve "Dışa aktar" ı seçin. Bu dönüm noktası sonuçları (Şekil 1, bölümleme) ikili bir görüntüsünü oluşturur.
- Segmentasyon parametreleri kayıt; Bu parametreler nicel karşılaştırmalar için deneysel grupları genelinde uygulanması gereken. İkili sonuçlar maskesi için başvuru adı [deneysel grup adı] _ [örnek adı] _ [deneme tarihi] _ [Kanallar] _ gibi ayrıntılı segmentasyon parametrelerle istenirse kaydeder [z-plane(s)] [süzgeç parametreleri ile] _ [H_Watershed parametreleri].
- Fiji'de etkin Önişlenmiş görüntü ile h-maxima etkileşimli havza aracı tıklatarak başlatmak "SCF | Etiketleme | Etkileşimli H_Watershed".
-
Faiz yapılarının havza sonuçlarından ayıklayın.
- Kaydedilmiş ROI adım 4.4, ROI Yöneticisi'nde açın. Adım 5.2.4'ten aktif ikili bölgeleri maskeyle ROI ROI Yöneticisi özellik çıkarma Standart yatırım getirisi için sınırlamak için resme uygulamak için seçin.
- Yatırım getirisi üzerinde ikili dönüm noktası maskesi etkin ile seçin "Analyze | Parçacıklar "Eklemek için Yöneticisi ile" özellikleri ayıklamak için iletişim kutusunda seçilen analiz".
Not: Bu segment için yatırım getirisi Yöneticisi sırasında belirlenen her yapısı için bir parçacık tanımlayıcı ekler. Boyutu veya Analize dahil yapıları iyileştirmek için gerekirse Döngüsellik temel özellikleri dışlamak için bu menüdeki seçenekler kullanılabilir. - Parçacıklar tıklayarak kaydetmek "daha | «««Kaydet"ROI Yöneticisi menüsünden. Tanımlayıcıları seçili ve tüm parçacıklar tek bir zip dosyasında kaydedilir sağlamak. [Deneysel grup adı] _ [örnek adı] _ [deneme tarihi] _ [Kanallar] _ gibi detaylı bir ad kullanın [z-plane(s)] _ [süzgeç parametreleri ile] _ [H_Watershed parametreleri] _ [yapıları].
6. miktarı, alan ve yoğunluk miktar ve analiz
- Oluşturulan ve 4.2. adımda kaydettiğiniz raw resim açın. Faiz yapılarının yakalamak için kullanılan kanala ilerleyebilir.
Not: Yoğunluk ölçümleri Ham görüntü (ön işleme önce) piksel değerlerini filtre adım 5.1 değişiklikleri uygulama olarak almak için önemlidir. - Özellik çıkarma 5.3. adımda elde edilen parçacıklar açın ve "Tümünü göster" ROI Yöneticisi'nden seçin.
Not: Bu eylem her parçacık "ROI Yöneticisi hakkında" görüntü üzerine bir taslağını yerleşimi ve ilgi (Şekil 1, özellik çıkarma) yapıları kenarları aynı olmalıdır. - Tıklatarak istediğiniz ölçüleri ayarlayın "Analyze | Ölçümleri kümesi?".
Not: Alan, yoğunluk ve parçacık yoğunluğu "alan" ve "entegre yoğunluk" seçerek ölçülebilir. Entegre yoğunluk seçildiğinde, Fiji iki değer üretecek: 'yoğunluğu entegre' hesaplanan alan ve ortalama gri değeri ve 'Ham yoğunluk piksel değerlerinin toplamı olarak ölçülen entegre' ürün olarak. Parçacıklar floresan protein yoğunluğu alanına göre bölünmüş piksel değerlerinin toplamı olarak hesaplanır. 5.3. adımda oluşturulan parçacıklar ROI 4.4. adımda tanımlanan doku içinde parçacıkların miktarı gösterir. - "Ölçü" ROI Yöneticisi menüsünden seçin. Fiji'de görüntüleme yazılımdan türetilen dosya ölçümler alınır sürece sonuçları kalibre birimler cinsinden ifade edilir. Sonuçları sonuçları penceresinden kopyalayın ve derleme ve daha fazla hesaplamalar için elektronik tablo yazılımı içine yapıştırın.
7. Ratiometric miktar ve veri analizi
- 6.1 ve 6.2 parçacık tanımlayıcıları ilgi ilk ham kanal açmak için adımları izleyin.
- Tıklatarak istediğiniz ölçüleri ayarlayın "Analyze | Ölçümleri kümesi?".
Not: Parçacık başına ortalama yoğunluğu "Demek gri değeri" seçerek ölçülebilir. - ROI Yöneticisi'nden "Ölçü birimi" seçin. Sonuçları penceresinden veri kopyalama ve elektronik tablo yazılımı yapıştırın.
- "C" kaydırma çubuğu ilgi, GFP (Şekil 4A), bu örnekte ham ikinci kanala geçin ve adımları 7.2. ve 7.3.
Not: 5.3. adımda kaydettiğiniz parçacıklar kanal ve dilim oluşturulan varsayılan olacaktır. Parçacıklar faiz doğru kanala uygulanır sağlamak için özen gösterin. - Bir kanaldan yoğunluğu içinde elektronik tablo yazılımı her parçacık saniyeliğine yoğunluğu için oranını hesaplamak.
-
Bir dağılım çizim görselleştirmek ve kişisel değişiklikler temel biyolojik süreçleri yansıtıcı sergi fluorophores ratiometric verileri ölçmek için kullanın.
- Bir dağılım çizim grafik yazılımı oluşturmak.
Not: Her bir veri noktası burada ilk fluorophore ilgi yoğunluğunu "x değeri", ikinci fluorophore yoğunluğunu "her parçacık ölçülen y değeri" faiz yapısını temsil eder. - Çeyrek dairelerin tanımlamak her fluorophore için eşikler çoğunluğuna ayarlayın.
- Bir dağılım çizim grafik yazılımı oluşturmak.
-
Fluorophore yoğunluğu faiz yapısı arasında görselleştirmek için satır profili kullanın.
- 5.3. adımda oluşturulan bir yatırım getirisi seçin ve yatırım getirisi ile düz bir çizgi çizmek için araç çubuğunda düz çizgi aracını kullanın. Hat yatırım getirisi yatırım getirisi Yöneticisi'ne ekleyin.
- Her kanal hattı aktif, yatırım getirisi ile ilgi için seçin "Analyze | «««Çıkart"profili.
Not: Arsa profil işlev bir çubuk grafik arsa ve hat boyunca yoğunluk değerlerinin bir tablosu üretir. Her kanal ve hamur içine her iki kanal hattı boyunca gösterilen bir çizim oluşturmak için elektronik tablo yazılımı üzerinden ölçülen sonuçlar kopyalayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Miktar sayısını, alan ve fluorescently tagged mutant yoğunluğunu Htt Drosophila optik lobunda toplar.
Merkezi sinir sistemi misfolded protein toplamada Huntington hastalığı, RFP öğesini mutant bir Drosophila modeli araştırmak için bir patolojik olmayan (UAS-RFP-hHttQ15) ya da patolojik genişletme ( ile insan Htt UAS-RFP-hHttQ138) ve membran GFP (UAS-mCD8::GFP)11 altında bir pan-nöronal sürücüsü elav-GAL4ortak ifade edildi. Dişi sinek 2 gün sonra eclosion (DAE) beyinlerinin disseke, sabit ve DAPI ile protokol Bölüm 2 göre lekeli. Confocal lazer mikroskobu tarama ile 40 X yağı daldırma objektif lens, piksel başına 8.0 µs tarama hızını ve Uzaysal Çözünürlük 1024 x 1024 piksel (12 bit / piksel) kullanarak 1.30 sayısal diyafram (NA), optik lob odaklanan gerçekleştirildi. Disk görüntüsü oluşturma yazılımı tarafından belirlenen en uygun adım boyutu 1.08 µm uyarma/emisyon dalga boylarında aşağıdaki kombinasyonu ile amaç için dilim başına oldu: Kanal 1) 488/510 GFP için kanal 2) 543/581 RFP için ve Kanal 3) 405/461 DAPI için. Herkese uygulanan görüntü Dedektör ayarları karşılaştırmalar için uygun çekim için gruplar, tutar patojenik olmayan bir RFP-Htt-S15 denetim numune yerine yüksek yoğunluklu RFP-Htt toplamları birikir, bir RFP-Htt-Q138 numune dayalı idi diffüz RFP-Htt (Şekil 2) seviyesinin düşük. Görüntü alma ayarları bir RFP-Htt-S15 numune dinamik alanı en üst düzeye çıkarmak için ayarlandıysa, RFP-Htt-Q138 toplamları doymuş. Örneğin, bir test protein toplayıcı Drosophila optik lob HttQ138_Opticlobe.01_01012018_Ch1.RFP-Htt_Ch2.GFP_Ch3.DAPI kaydedildi.
Tüm optik lob sırasında mikroskobu görüntüsü ve yaklaşık 15 z-dilim oluşuyordu, ama o kararlı görüntüleme sonra tek bir z uçağı analiz bireysel yapıları gidermek en iyi Aksi takdirde bir projeksiyon nedeniyle örtüşen görünür yüksek yoğunluklu doku içinde. Standart bir yatırım getirisi belirlemek için C2 ve C3 cep cesetleri optik lob12 medulla ve lobula plaka arasında bulunan anatomik bir dönüm noktası kullanılmıştır. Fiji, görüntü analiz gereksinimlerini yansıtacak şekilde böylece çoğaltıldı ve HttQ138_Opticlobe.01_01012018_Ch1.GFP_Ch2.RFP-Htt_Ch3.DAPI_z8, burada z8 C2 ve C3 nöronal hücre organları çoğu neredeydin sekizinci dilim yansıtır adlı bir TIFF dosyası olarak kaydedilmiş (Şekil 1A, resim alma) boyama DAPI tarafından önemli. Çokgen seçim aracını bir yatırım getirisi optik DAPI boyama ve nöronal GFP sinyal (Şekil 1A, yatırım getirisi seçimi, nerede sarı yatırım getirisini gösterir ve kırmızı yüksek büyütme görüntü için gösterilen belirtir bir kılavuz olarak kullanarak lob çevresinde el ile seçmek için kullanılan iş akışı aşağıdaki panelleri olarak netlik). Ardından, görüntü düzgün ve bölümleme (Şekil 1A, önişleme) ve aşağı akım segmentasyon ve özellik çıkarma ile ve bu olmadan performansını kolaylaştırmak RFP-Htt kanal σ değeri 1 olarak ayarlanmış bir Gaussian Blur filtresi uygulandı önişleme adım Şekil 1A' gösterilmektedir. Etkileşimli H-havza görüntüleri aşağıdaki parametrelerle RFP-Htt kanalının performansı: tohum dinamikleri, 30; Yoğunluk eşik, 500; sel (% olarak), 80 zirve; ile 'bölme izin ver' ve 'bölgelerinde maske ver' (Şekil 1A, bölümleme) seçili. Elde edilen ikili bölgeleri maskesi HttQ138_Opticlobe kaydedildi. 01_01012018_Ch2.RFP-Htt_z8_GuassianBlur-sigma1_HWatershed-h30_T500_80percent ve protein toplamları13,14 tanımlamak için 0.4 µm2 en küçük boyut dışlanma ile analiz parçacıklar aracıyla parçacıklar oluşturmak için kullanılan . Sonuçta ortaya çıkan partiküller HttQ138_Opticlobe.01_01012018_Ch1.RFP-Htt_z8_GuassianBlur-sigma1_HWatershed-h30_T500_80percent_aggregates olarak yatırım getirisi yöneticisinden kaydedildi ve ham RFP-Htt kanala (ön işleme önce) ayıklamak için uygulanmış olan nicel veri görüntüleme (Şekil 1A, özellik çıkarma).
Miktar yarı otomatik olarak parçalı RFP-Htt toplamları standart odak uçak Drosophila optik lob aracılığıyla sayıda patojen Htt-S15 büyümenin diffüz ifade ve protein birikimi ortaya hastalığa neden olan Htt-Q138 genişleme (Şekil 2A-C) göre toplamları. Her parçacık 'Tarafından ham entegre yoğunluk' verilen tüm piksel değerleri toplamı her toplamak RFP-Htt içeriğini karşılaştırmak için kullanıldı. Boyutu ve yoğunluğu profilleri beş farklı optik loblar Htt-Q138 ifade bir standart odak düzlem üzerinden tüm toplamları sağlamlık ve tekrarlanabilirlik bu iş akışının (Şekil 2B, E) göstermektedir. Özellikle, toplamları (Şekil 3A, B) resim alma sırasında pozlanmış edildi zaman miktar boyutu ve toplamları sayısı toplamları (Şekil 3 c, D), ideal maruz kalma ile yakalanan karşılaştırılabilir ancak doymuş piksel maksimum yoğunluk değeri (Şekil 3E, F) sergilemek gibi pozlanmış toplamları yoğunluğunu boyutu bir fonksiyonu olur. Bu nedenle, uygun tarama pozlama parametreleri ayarlama eksiksiz olarak protein toplamları nicel moleküler kompozisyonu ayıklamak için önemlidir.
Ratiometric tabanlı miktar tandem floresan Atg8a muhabir kullanarak Drosophila görsel lamina autophagy akı
Drosophila visual sisteminde Autophagy-lysosome akı değerlendirmek için mCherry-GFP-Atg8a muhabir ubiquitously denetiminde ifade edildi ya da Drosophila spermine synthase (DSM) homozigoz mutant (DSMe/e) uçar Aktin-GAL4 sürücü ile. DSMe/e lizozomal disfonksiyon15nedeniyle bozulmuş autophagic akı ile ilişkili sergi ateş uçar. Beyin ekli lamina 5 DAE, kadın Sineklerin Tanrısı ile disseke, sabit ve DAPI ile lekeli. Lamina lazer bir 100 X yağı daldırma objektif lens, 1,35 sayısal diyafram (NA), 8.0 µs / piksel ve 12 bit / piksel optik çözünürlük örnekleme hızını ve 1.2 µm adım boyutu ile confocal mikroskobu tarama görüntüsü.
Bu analiz en fazla bir z-projeksiyon dilim yedi z-seyrek Atg8 pozitif yapıları (Şekil 1B, resim alma) örnekleme gücünü artırmak için lamina aracılığıyla gerçekleştirildi. Standart ROI DAPI tarafından ortaya ve iyi karakterize anatomi ve hücresel doku organizasyonu göre hücre vücut katman çevresinde çokgen seçim aracıyla el ile çizilmiş (Şekil 1B, yatırım getirisi seçimi, burada sarı gösterir Yatırım getirisi ve kırmızı atar iş akışı aşağıdaki panelleri netlik için gösterilen yüksek büyütme resim)16. Öyle ki GFP bayağı bozulmuş kadar nerede mCherry kalır lysosome asit tarafından giderdikten tandem muhabir GFP ve mCherry moieties ilerleme autophagy-lysosome yolu ile işaretlemek için istikrar özelliklerini kullanır. Bu nedenle, longer-lived mCherry fluorophore segmentasyon bu iletişim kuralı için kullanıldı. Gauss Bulanıklığı filtresi σ değeri 1 ile mCherry kanala (Şekil 1B, önişleme) uygulandı ve etkileşimli H-havza aşağıdaki parametrelerle gerçekleştirilen: tohum dinamikleri, 0; Yoğunluk eşik, 800; sel (% olarak), 90 zirve; ile 'bölme izin ver' ve 'bölgelerinde maske ver' (1B rakam, bölümleme) seçili. Elde edilen ikili bölgeleri maskesi parçacıklar analiz parçacıklar aracıyla oluşturmak için kullanılmıştır. Sonuçta ortaya çıkan partiküller ham mCherry ve ham GFP kanallar için (ön işleme önce) autophagy-lysosome bölmeleri (Şekil 1B, özellik çıkarma) kantitatif ratiometric veri ayıklamak için uygulandı.
Görsel muayene mCherry GFP Atg8 pozitif yapıların hücre vücut bölgesinde zenginlik lamina autophagic veziküller nöronlar17hücre vücutta retrograd taşıma önceki raporlar ile tutarlı belirtti. Arsa profil mCherry ve yüksek muhabir farklılıkları ortaya GFP yoğunluğu (satır ROIs Şekil 4A ve 4B şekiliçinde çizgi boyunca elde edilen yoğunluk profilleri Bkz:) birkaç Atg8 pozitif yapıları arasında görselleştirmek için kullanılan Her iki fluorophores yoğunluğunu GFP asidik bu bölümünde (Şekil 4B1) su ve son olarak düşük mCherry yıkımı içinde yansıtır füzyon lysosome ile autophagosomes (Şekil 4B3), yüksek mCherry ve düşük GFP gösterir gösterir lysosome (Şekil 4B2). Her yarı otomatik olarak kesimli mCherry Atg8 pozitif parçacık ortalama fluorophore yoğunluğunu oluşturulan bir dağılım çizim akı ayrı adımları çeyrek Analizi ( sonra ayrıldı autophagy-lysosome yolu ile gösterir Şekil 4 c). Arsa GFP gating eşikleri kullanarak dört çeyrek daire bölünmüş 570, mCherry = 1800 =. Eşikleri aşağıdaki ilkeleri kullanarak kontrol grubuna göre ayarlanmış: (1) Yani bu teorik olarak GFP tekrar tandem floresan muhabir tasarımını ve iki fluorophores özelliklerini, olduğunu değil bulabilsem olduğu yerde mCherry sinyal (çeyreği IV) ve (2) dağıtım Atg8 pozitif parçacıkların bazal autophagy yüksek verimli18,19nerede autophagy-lysosome yolu ile ilgili bölümler-vahşi-tip nöronlar içinde dağılımını yansıtır. Denetim sinekler laminas içinde yaklaşık autophagosomes Atg8 pozitif parçacıkların % 25 binned (çeyreği ben), ve puncta yarısı autophagosome-lysosome füzyon işlenir (çeyreği II ve III); DSMe/e laminas anlamlı bir artış autophagosomes ya da işlevsel olmayan organellerin (çeyreği ben) ve autolysosomes azalma (çeyreği II ve III), autophagosome birikimi ile ekranlarda bulunan düşündüren autophagosome-lysosome füzyon ve/veya lizozomal bozulması (Şekil 4 C, D). Nicel veri Atg8 pozitif yapıları açık birikimi lamina DSMe/e uçar (Şekil 4E) dan da desteklenmekte. Demek mCherry ve GFP sinyal Ratiometric analizi kontrol ve DSMe/e grubu (Şekil 4F) arasında bir fark vurgulanan ama yol ne de tarafından ortaya belirli adımlar genel etkisi ayrıntılı değil Dörtgen Bölümlü analizi.
Resim 1: İş akışı önyargı simge durumuna küçültülmüş, yarı otomatik bölümleme Fiji örneklerle kullanarak Drosophila beyinde hücre altı yapıları aracılığıyla. (A)temsilcisi confocal filmler optik Drosophila ifade yetişkin beyin lobu ile tek odak düzlem üzerinden pan nöronal RFP öğesini mutant Htt ve membran hedefli GFP (elav-GAL4 > UAS-mCD8:GFP, UAS-RFP-hHttQ138) (resim alma) boyama DAPI ile. DAPI ve GFP bir yatırım getirisi (sarı) optik lob çevresinde seçmek için kullanılmıştır; kırmızı kutu netlik (ROI seçimi) için iş akışı aracılığıyla bölge büyütülmüş gösterir. Önişleme paneli gösterir raw görüntü RFP-HttQ138 kanal (üst) ve sonra Gaussian Blur filtresi, σ1 uygulanması yüksek büyütme (altta). H-(h), maxima yoğunluğu eşik (T), tarafından belirlenen genel havza dur ölçüt tarafından bölümleme tohum dynamics için belirtilen parametre ayarlarını kullanarak etkileşimli h-maxima dönüm noktası tarafından belirlenen ve bölgesel durdurma ölçütleri tarafından belirlenen zirve sel) RFP HttQ138 ham (üst) ve Gauss bulanık (alt) görüntü ve havza havza eklentiden ihraç ve netlik için ters bölgeleri maskesi sonuçlarından %) gerçekleştirilen. Tarafından üretilen parçacıklar RFP HttQ138 ham görüntüleri (özellik çıkarma) overlaid parçacıklar (macenta) analiz. Oklar, ön işleme olmadan aşırı kesimli toplamları gösterir ve ok uçları süzme sonra ayırmak için başarısız yapıları gösterir. (B) temsilcisi confocal filmler üzerinden kontrol ve mutant (DSMe/e) Drosophila ifade her yerde GFP-mCherry-Atg8a (yetişkin lamina yatay bölümüne 7 odak uçakların maksimum z-projeksiyon aktin-GAL4 > UAS-GFP-mCherry-Atg8) (resim alma) boyama DAPI ile. DAPI lamina hücre vücut tabakası çevresinde bir ROI (sarı) seçmek için kullanılan; kırmızı kutu netlik (ROI seçimi) için iş akışı aracılığıyla bölge büyütülmüş gösterir. Önişleme paneli mCherry kanal yüksek büyütme Gaussian Blur filtresi ile gösterir σ1 denetim ve mutant lamina için uygulanan. Belirtilen parametre ayarları ile filtre uygulanmış mCherry görüntülerde segmentasyon etkileşimli h-maxima dönüm noktası tarafından gerçekleştirilen ve havza netlik için ters ikili bölgeleri maske olarak gösterilen sonuçlar. Parçacıklar tarafından üretilen ham mCherry ve GFP görüntüleri (özellik çıkarma) üzerinde overlaid parçacıklar (macenta) analiz. Ölçek çubukları 50 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: miktar boyutu ve yoğunluğu mutant RFP-Htt toplamları sağlam ve tekrarlanabilir. (A-B) Drosophila beyin RFP-hHttQ15(a)veya bir pan-nöronal sürücüsü elav-GAL4 altında RFP-hHttQ138 deyimi (B) ile disseke ve düzeltildi ve optik loblar confocal mikroskobu tarama lazerle görüntüsü. Ölçek çubuğu 50 µm her Grup toplamları ortalama sayısı üzerinden el ile seçilen bir yatırım getirisi optik lob çevresinde sayısal ve bir standart z-dilim üzerinde duruldu. (C) = (n = 5). (D-E) Boyutu (D) ve toplam RFP hHttQ138 toplamları üzerinden sayısal yoğunluğu (E) ROIs 5 farklı hayvanlar optik lobları standart. Veri toplama günlük ölçeğinde çizilir. Toplamları nesneleri 0.4 µm2 (kesikli çizgi olarak D) daha büyük olarak tanımlanmış. İstatistiksel analiz, tek yönlü ANOVA, NS: önemli değil; yapıyordum: rasgele birim Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: görüntü dozun neden yanlış yoğunluk ölçümleri için. (A-B) İdeal pozlama(a)ile aynı optic lobe ve dozun (B) pseudocolored Fiji'de HiLo LUT ile temsilcisi confocal test. B kırmızı pozlanmış toplamları gösterir. Ölçek çubuğu 50 µm. = Benzer segmentasyon sonuçlar üretmek için h-maxima dönüm noktası parametreleri uygulama sonra (C) miktar toplam boyutu. İstatistiksel analiz, bağımsız örnekler t -testi, NS: önemli değil. (D) frekans dağılımı ideal ve pozlanmış görüntülerde toplam boyutu. Toplamları 25 µm2 5 boyutta daha fazla 4 kategorik gruplarında binned. (E -F) Agrega yoğunluğunu toplam boyutu (E) bir fonksiyonu olarak korelasyon analizi. Tüm pikseller 4095 maksimum yoğunluk değeri varsa başvuru satırı çizilmiş (siyah) olur. Yeşil kutu toplamları Fiçinde gösterilen 10 µm2 alanı altında gösterir. b: regresyon katsayısı, R2: katsayısı; yapıyordum: rasgele birim Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 4: Bir tandem floresan mCherry-GFP-Atg8a genetik gazeteci Quantification Drosophilaautophagic akı ayrı özellikleri ortaya koymaktadır. (A)temsilcisi confocal Filmler, Drosophila lamina ubiquitously ifade mCherry-GFP-Atg8a denetim ve DSMe/e mutant sinekler üzerinden (aktin-GAL4 > mCherry-GFP-Atg8a) ve DAPI için lekeli . Lamina hücre vücut katman kesikli kutulu alanlarında yüksek büyütme (doğru) gösterilir. Sayılar Atg8a pozitif yapıları çizilen B ve Csayısal gösterir. (B) çubuk grafik çizmek rasgele birimlerinde (AU) Floresan yoğunluğunun yüksek büyütme görüntüleri ortalama mCherry yoğunluk fonksiyonu olarak ortalama GFP yoğunluğu tarafından çizilen A. (C) mCherry-GFP-Atg8 yapılarda belirtilen satır ROIs boyunca Denetim ve DSMe/e lamina (İlgeçler 3 lamina her gruptan gelen ölçülen) üzerinden ölçülür. Arsa GFP gating eşikleri kullanarak dört çeyrek daire bölünmüş = 570 ve mCherry yapıları her çeyrekte genotip tarafından belirtilen yüzdesi ile 1800 =. ()D) mCherry-GFP-Atg8 C her çeyreğinde halinde kategorize ortalama oranlarda miktar (n = 3 lamina). ()E) miktar başına lamina mCherry-GFP-Atg8 puncta sayıda (ortalama ± S.D., n = 3 lamina). (F) mCherry-GFP-Atg8 yapıları Ratiometric Analizi gözlenen kontrol ve mutasyona uğramış sinek lamina (% 95 GA ile yani n = 3 lamina). Öğrenci t-test. P < 0,05, **P < 0,01. Sscale barlar 2 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada özetlenen Protokolü sağlam ve tekrarlanarak hücre biyolojik süreçlerin floresans tabanlı görüntüleme tarafından görüntülenmiştir quantitate için kullanılabilir. Biyolojik bağlam ve teknik sınırlamalar deneysel tasarım kılavuzunu dikkatle dikkate alınması gerekir. İlgi, hücre altı yapıları floresan işaretleri immunohistokimyasal, boya tabanlı veya genetik olarak ifade edilen, Morfoloji ve yoğunluğu tarafından arka plan üzerinde ayırt olmak gerekmediğini. UAS/GAL4 sistem hedeflenen gen ekspresyonu Drosophilaiçinde sürücü için yaygın olarak kullanılır. Burada sunulan örnekler transgenik satırları GAL4 sürücüleri taşıyan transkripsiyon protein toplama ve sinir sisteminde autophagy araştırmak için UAS artırıcı kontrol altında fluorescently tagged proteinlerin etkinleştirmek için kullanılır. Bir floresan muhabir transgene ile birlikte aynı anda ifade bir deneysel UAS transgene gerekiyorsa, o zaman kontrol grubu de co-overexpression, örneğin GAL4 dozaj için denetime önemsiz bir transgene içermelidir UAS GFP veya UAS-lacZ. Standart numune hazırlama, Drosophila merkezi sinir sistemi ve diseksiyon, fiksasyon, boyama, montaj yoluyla antikor görsel sistem için burada belirtildiği gibi en uygun görüntüleme ve miktar için önemlidir.
İyi sinyal-gürültü oranı ve dinamik alanı en üst düzeye çıkarmak uygulamaları görüntüleme yarı otomatik analiz için gerekli olan ve deneysel grupları arasında doğru karşılaştırmalar için olağanüstü vardır. Böylece böylece eksiksiz olarak protein yoğunluk elde edilebilir ve (Şekil 3) sayısal muhabir doygun değil görüntü edinme parametreleri ayarlamanız gerekir. Nicel karşılaştırmalar için görüntüleme ile aynı edinme parametreleri ve tercihen aynı gün yapılmalıdır.
Yatırım getirisi seçimi, görüntü işleme, özellik segmentasyon ve açık kaynak kodlu platformu kullanarak özellik çıkarma ImageJ/Fiji uygulama bağımlı; Başlangıç parametreleri Kullanıcı tarafından tanımlanan gerekir iken, onların uygulama örnekleri genelinde önyargı nicel veri çıkışı en üst düzeye en aza indirmek olacaktır. Dikkatle belge iş akışı için kritik ve önerilen dosya adı ayrıntılı her adım işleme uygulayıp sonra resim TIFF dosyası olarak kaydetmek için. Bu ilk kez ve için parametreler deneysel grupları her adımda görüntü işleme ve analiz arasında tutarlılığı sağlamak için bir referans noktası olarak hizmet Protokolü dışarı çalışırken özellikle yararlı olabilir. Yatırım getirisi seçim ölçütü işaretleri veya anatomik işaretlerini kullanarak kontrol grubundan tanımlanmış ancak deneysel manipülasyonlar işaretçileri veya simge güvenilir göstergesi önleyecek bir şekilde değiştirmeyin emin olmak için bakım alınmalıdır bir yatırım getirisi standartlaştırmak. Tek bir dilim veya birden çok dilim bir z-projeksiyon en iyi analiz, nerede bir tek odak düzlem ayırma yapıları komşu geliştirmek için yararlı olabilir ve bir z-projeksiyon yapıları analiz etmek için yararlı olabilir amaçlarını yönelik olarak seçilebilir doku cilt yerelleştirilmiş. Z-projeksiyon görüntü analizi ve bölümleme için kullanılan türü dikkatle ve bağımsız olarak tespit edilmelidir. Yapıları uçaklarda nerede odak ve genellikle de bölümleme için uygundur en parlak olduğundan maksimum yoğunluk projeksiyon net bir görüntü üretecek. Görüntü analizi autophagy-lysosome analiz örnekte olduğu gibi en fazla bir projeksiyon üzerinde kabul edilebilir olabilir; Atg8-pozitif yapıları örnekleme için kullanılan adım boyutun altındaki, böylece en doğru en fazla yoğunluk tarafından hangi yakalandılar tek odak düzlem gösterilir. Ancak, yapıları adım boyutundan daha büyük bir analiz için aynı xy koordinatları ile tüm pikseller ekler bir toplamı-projeksiyon daha doğru bir şekilde her yapısının yoğunluk bilgi temsil edebilir. Bu iletişim kuralı tek bir dilim veya birden çok dilim 2D bir z-projeksiyon çözümlemek için tasarlandığından, iş akışı bir z-serisi aynı araçları birkaç kullanarak 3D yapılar analiz etmek için kolayca adapte olabilir. 3D analiz nerede konuşabilerek yapısı kesişiyor bir z dilimli Analizi çarpık düzensiz şekilli yapılar, küçük örnek boyutu için arzu olurdu.
Ajanlara bu protokol için gibi bir filtre ile ön işleme gürültü yapılar ilgi algılama sırasında bölümleme yardımcı olmak için kenarları koruyarak azaltabilir; çok fazla bulanık sonuç ayarları ayrıntı kaldırmak ve doğru kenar algılama önlemek yeterli düzeltme olmadan arka plan gürültü ve floresan işaret inhomogeneity aşırı segmentasyon içinde sonuçlanır. Bölümleme tarafından bir dönüm noktası olarak bir su kaynağı itibariyle yerel maxima topografik bir yüzeyle görüntü dikkate alır — bir floresan görüntü piksellerindeki yüksek yoğunluklu — bu sel sular altında alanlarda nerede bir baraj veya segment sınır, inşa edilmiştir20komşu olduğunu kadar. H-maxima bir dönüm noktası benzersiz bir yerel en fazla21var mı yapıları aşırı ayrılmasını önlemek için anlamlı yerel maxima ayırt etmek için bir Kullanıcı tanımlı eşik (h-maxima dynamics SCF-MPI-CBG eklentisi) kullanır. Bu protokol için uygulanan etkileşimli h-maxima havza eklenti h-maxima dinamikleri (s), küresel havza durdurma ölçütleri yoğunluğu eşik (T) tarafından belirlenen ve sel (%), tepe tarafından belirlenen bölgesel dur ölçüt ayarlamak kullanıcı sağlar iken anında havza sonuçları niteliksel bölümleme performansını değerlendirmek için bir çıkış görüntü görüntüleme. Aşırı segmentasyon ve eksik ayrılık (Şekil 1A, özellik çıkarma içinde kırmızı oklar) Floresan etiketleme inhomogeneous nerede veya doku oluşabilir olsa da segmentasyon sonuçları yakından çoğu yapısı sınırları ile kabul edecektir yoğun nüfuslu. Yarı otomatik bölümleme ve çözümleme adımları verimliliğini örnekleme gücünü artırmak ve segmentasyon tuzaklar azaltmak için kullanılacak olabilir.
Segmentasyon ve özellik çıkarma sonra alan, boyutları ve döngü gibi morfolojik bilgileri ayıklamak basittir. Görüntüleri uygun dozun önlemek için toplanan varsa, Ayrıca, moleküler bilgi de bu görüntü analiz yoğunluk ölçümleri tarafından anlaşılmaktadır olabilir. Bir kez önlemler nörodejeneratif hastalık patoloji çıkarılan ve bu yaklaşım tarafından sayılabilir, bu önlemlerin önemli sorular bir dizi adresi için kullanılabilir. Özellikle, protokol görüntü analizi ve miktar protein toplamları faktörler etkisi protein toplama ve dağıtım, sayısı, boyutu ve agrega yoğunluğu protein aralarındaki ilişkileri belirlemektir tanımlamada kullanmak için potansiyel göstermiştir nöronal fonksiyon bozukluğu ve organizmalar sağlık ile. Ratiometric tabanlı miktar hücre altı bileşenleri veya işlemleri toplu etkileşim sırasında hastalık ilerleme bilgilendirmek için kullanılabilir. Biyokimyasal iken ve toplamları ve diğer hücre altı yapıları ile etkileşimi analiz etmek için uygulanan akış sitometresi, hücre lizis protein kaybına neden, toplama özelliklerini değiştirmek ve protein-protein etkileşimleri22bozabilir. mCherry-GFP-Atg8 yaygın autophagy kültürlü hücreleri23, başta floresans mikroskobu aracılığıyla izlemek için kullanılmıştır ama tarafsız ve niceliksel analitik yöntemleri eksik. Ayrıca, in vivo Analizi genetik olarak kodlanmış tandem muhabir meydan okuyor ve son derece kontrollü genetik arka plan ve doku hazırlık gerektirir. Bu protokol uygulamaları autophagy-lysosome bölmeleri ölçmek için kritik görüntüleme için doğrulanmış metodoloji doku hazırlık üzerinden özetliyor. İyi genetik uygulamaları ile Atg-pozitif parçacık yoğunluğu profilleri ve bireysel floresan sinyalleri tarafından geçişi ile çeyrek analizi de dahil olmak üzere görüntü analiz yaklaşımlar güçlü algılama ve normal ve patolojik karşılaştırılması Ödeyebileceğinizden autophagic akı vivo içinde çeşitli hastalık modelleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser Sheila ve David Fuente Nöropatik ağrı araştırma programı yüksek lisans bursu (için J.M.B.) tarafından desteklenmektedir, Lois Pope LIFE Fellows programı (CL, Y.Z. ve J.M.B. için) Snyder-Robinson Vakfı HGUGM Bursu (için CL), Dr. John T . Macdonald Vakfı (na CL), (için R.G.Z.), Ulusal Enstitüleri (NIH) sağlık HHSN268201300038C, R21GM119018 ve R56NS095893 gelen hibe sözleşmeleri ve Taishan bilim adamı projeye (Shandong Eyaleti, Çin Halk Cumhuriyeti) (R.G.Z.) tarafından.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SYLGARD(R) 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | PF184250 | Dissection dish |
| Falcon 35 mm Not TC-Treated Easy-Grip Style Bacteriological Petri Dish | Corning | 351008 | Dissection dish |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dissection tool |
| Sodium Chloride | Sigma | S3014 | PBS solution |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | S5136 | PBS solution |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma | P5655 | PBS solution |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | Washing and antibody incubaton solution. |
| 37% Formaldehyde | VWR | 10790-710 | Fixation |
| Disposable Microcentrifuge Tubes (0.5mL, blue) | VWR | 89000-022 | Fixation, washing, and antibody incubaton. |
| Plain and Frosted Micro Slides (25×75mm) | VWR | 48312-004 | Slides for confocal imaging |
| Micro Cover Glasses, rectangular (22×40mm) | VWR | 48393-172 | Slides for confocal imaging |
| Rubber Cement | Slime | 1051-A | Mounting |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | Mounting |
| Scotch Magic 810 Invisible Tape (19mm×25.4m) | 3M Company | 810 | Mounting |
| Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | Antibody incubaton |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | Nucleic acid staining. Dissolve in deionized water to make a 5 mg/mL stock solution and store at -80°C. Dilute to a working concentration of 10-20 μg/mL in PBTx. |
| 3.5X-90X Stereo Zoom Inspection Industrial Microscope | AmScope | SM-1BNZ | Dissection scope. Equipped with 6W LED Dual Gooseneck Illuminator |
| ImageJ/Fiji | NIH | v1.51u | With SCF_MPI_CBG plugins (version 1.1.2) |
| FV1000-IX81 Confocal-laser Scanning Microscope | Olympus | ||
| Recombinant Construct | Bloomington Drosophila Stock Center | BL37749 |
References
- Erkkinen, M. G., Kim, M. -O., Geschwind, M. D. Clinical Neurology and Epidemiology of the Major Neurodegenerative Diseases. Cold Spring Harbor perspectives in biology. , a033118 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature methods. 9 (7), 671 (2012).
- Mauvezin, C., Ayala, C., Braden, C. R., Kim, J., Neufeld, T. P. Assays to monitor autophagy in Drosophila. Methods. 68 (1), 134-139 (2014).
- Weiss, K. R., Kimura, Y., Lee, W. -C. M., Littleton, J. T. Huntingtin aggregation kinetics and their pathological role in a Drosophila Huntington's disease model. Genetics. 190 (2), 581-600 (2012).
- Babcock, D. T., Ganetzky, B. Transcellular spreading of huntingtin aggregates in the Drosophila brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (39), E5427-E5433 (2015).
- DeVorkin, L., Gorski, S. M. Monitoring autophagy in Drosophila using fluorescent reporters in the UAS-GAL4 system. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (9), (2014).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. Journal of visualized experiments: JoVE. (37), (2010).
- Sweeney, S. T., Hidalgo, A., de Belle, J. S., Keshishian, H. Dissection of adult Drosophila brains. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2011).
- Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde fixation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 845-853 (1985).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends in neurosciences. 24 (5), 251-254 (2001).
- Fischbach, K. -F., Dittrich, A. The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure. Cell and tissue research. 258 (3), 441-475 (1989).
- Ruan, K., Zhu, Y., Li, C., Brazill, J. M., Zhai, R. G. Alternative splicing of Drosophila Nmnat functions as a switch to enhance neuroprotection under stress. Nature Communications. 6, 10057 (2015).
- Zhai, R. G., et al. NAD synthase NMNAT acts as a chaperone to protect against neurodegeneration. Nature. 452 (7189), 887 (2008).
- Li, C., et al. Spermine synthase deficiency causes lysosomal dysfunction and oxidative stress in models of Snyder-Robinson syndrome. Nat Commun. 8 (1), 1257 (2017).
- Prokop, A., Meinertzhagen, I. A. Development and structure of synaptic contacts in Drosophila. Semin Cell Dev Biol. 17 (1), 20-30 (2006).
- Maday, S., Holzbaur, E. L. Autophagosome biogenesis in primary neurons follows an ordered and spatially regulated pathway. Dev Cell. 30 (1), 71-85 (2014).
- Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker. Molecular biology of the cell. 15 (3), 1101-1111 (2004).
- Lee, S., Sato, Y., Nixon, R. A. Primary lysosomal dysfunction causes cargo-specific deficits of axonal transport leading to Alzheimer-like neuritic dystrophy. Autophagy. 7 (12), 1562-1563 (2011).
- Vincent, L., Soille, P. Watersheds in digital spaces: an efficient algorithm based on immersion simulations. IEEE Transactions on Pattern Analysis & Machine Intelligence. (6), 583-598 (1991).
- Najman, L., Schmitt, M. Geodesic saliency of watershed contours and hierarchical segmentation. IEEE Transactions on pattern analysis and machine intelligence. 18 (12), 1163-1173 (1996).
- Shiber, A., Breuer, W., Ravid, T. Flow cytometric quantification and characterization of intracellular protein aggregates in yeast. Prion. 8 (3), 276-284 (2014).
- Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. Methods in mammalian autophagy research. Cell. 140 (3), 313-326 (2010).
