Summary
단백질 집계 및 autophagic 플럭스의 초파리 모델의 중앙 신 경계에서의 형광 이미징-기반 세포 생물학 연구에서 양적 데이터를 추출 하는 간단 하 고 융통성 있는 워크플로 개발 했습니다. neurodegeneration입니다.
Abstract
신경 퇴행 성 질환의 증가 보급, 신경 장애 및 손실 기본 이상 이해 하는 것 점점 더 중요 하다. 형광-기반 이미징 도구 및 기술 사용 subcellular neurobiological 프로세스의 전례 없는 분석 아직 여전히 이미징 연구에서 정량 데이터를 추출, 재현성, 공평 하 고 액세스할 수 있는 방법에 대 한 필요 . 우리 neurodegeneration의 초파리 모델을 사용 하 여 형광 기반 이미징 연구에서 양적 데이터를 추출 하는 간단 하 고 융통성 있는 워크플로 개발 했습니다. 특히, 피지/ImageJ를 사용 하 여 두 개의 세포 프로세스를 분석 하는 따라 하기 쉬운, 반자동 접근 설명: 첫째, 우리가 계량 단백질 집계 내용과 초파리 광 엽 돌연변이 형광 태그를 사용 하 여 프로 파일 huntingtin 단백질; 및 두 번째, 우리 autophagy의 탠덤 형광 기자의 부 량 비율 기반으로 초파리 비주얼 시스템에서 autophagy 리소좀 플럭스 평가. 중요 한 것은, 여기에 설명 된 프로토콜 선택 편견을 최소화 하 고 미묘한 비교의 해상도 높이기 위해 모든 형광 구조 분석 되도록 반자동된 세분화 단계를 포함 합니다. 이 방법은 다른 세포 생물학 구조의 분석을 위해 확장 될 수 있습니다 및 프로세스 연루 neurodegeneration, 배치할 puncta (스트레스과 립 및 시 냅 시스 복합물) 같은 막 도약 뿐만으로 구획 (미토 콘 드리 아와 막 밀매 vesicles)입니다. 아직 적응 참조 이미지 분석 및 정량화를 위한 분야에 걸쳐 안정성과 재현성을 촉진 및 궁극적으로 neurodegeneration의 기계적 이해를 향상 시킬 수이 방법을 표준화 하 고, 제공 한다.
Introduction
신경 퇴행 성 질환에 영향을 미칠 수백만의 사람들이 매년 고 발생률은 노후화 인구1증가 하 고 있다. 각 신경 질환은 독특한 병 인, misfolded 단백질의 집계 및 proteostasis 네트워크의이 질병의 많은 것의 일반적인 병리학 특징입니다. 어떻게 이러한 근본적이 고 상호 프로세스의 중단 awry elucidating 신경 역 기능 및 세포 죽음에 기여 하이 중요 이해 신경 퇴행 성 질환으로 치료 개입을 유도 합니다. 형광 기반 이미징 뉴런에서 이러한 복잡 하 고 동적 프로세스의 조사 가능 하며 신경 세포 생물학의 우리의 이해에 크게 기여 했다. 붙일 태그가 단백질의 분석 실험 실행 된다 vivo에서, 매우 소형 조직, 다양 한 세포 유형 및 형태학이 때에 특히 도전, 이다. 수동으로 보조 정량화 저렴 하 고 간단, 하지만 종종 소모 및 인간의 편견. 따라서, 이미징 연구에서 정량 데이터를 추출, 재현성, 공평 하 고 액세스할 수 있는 방법에 대 한 필요가 있다.
우리의 실험 모델에서 형광 이미징 연구에서 양적 데이터를 추출 피지/ImageJ, 강력 하 고 자유롭게 액세스할 수 있는 이미지 처리 소프트웨어2,3를 사용 하 여 간단 하 고 융통성 있는 워크플로 설명 했습니다. neurodegeneration 초파리를 사용 하 여입니다. 단백질 집계 및 autophagic 유량을 계량 하이 프로토콜에 따라-2 셀 neurodegenerative 질병 병 리 관련성이 높은 생물학 기능-우리 감도 재현성이이 방법의 설명. Drosophila 광 엽에 붙일 태그가 돌연변이 huntingtin (Htt) 단백질의 분석 수, 크기, 및 단백질의 강도 공개 했다. 우리 시각 autophagic 플럭스4compartmental 환경 따라 다른 방출 신호 표시 초파리 비주얼 시스템 내에서 협동 형광 기자. 탠덤 기자 저하는 리소좀에 autophagosome 형성, 성숙, 그리고 전송에서 autophagy 리소좀 플럭스의 양적이 고 포괄적인 보기에 대 한 허용 하 고 또한 취약 한 강조의 비율 기반 분석 신경 퇴행 성 조건에서 중단 하는 구획. 중요 한 것은, 의식이 없는 편견을 최소화 하기 위해 우리의 프로토콜에 반자동된 임계 처리 및 세분화 단계를 구현 우리 모두 분석, 샘플링 파워를 증가 하 고 비슷한 연구 간의 비교를 촉진 하기 위하여 표준을 제공 키를 누릅니다. 간단한 워크플로 강력한 피지/ImageJ 플러그인 (수학 알고리즘에 따라 컴퓨터 과학자에 의해 개발)을 위한 neurobiologists과 생명 과학 지역 사회에 더 접근 가능.
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Protocol
1. 고려 사항 및 이미지 분석 실험 설계에 대 한 준비
- 미리 적당 한 해부학, 세포, 또는 subcellular 마커 다른 샘플에서 관심 (ROI) 영역에 표준화에 대 한 랜드마크로 서 역할을 예를 들어 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), 막 마커, 지역화 된 형광 단백질, 등
- 관심의 구조에 대 한 배경 수준 넘어 개별 puncta 구분 수 형광 마커를 선택 합니다.
참고:이 프로토콜은 최적화 배치할 구조 (예를 들어, misfolded 단백질 집계)와 막 바인딩된 세포 (예를들면, autophagy 기자). 단백질 집계를 시각화 하려면 138 반복 (RFP-hHttQ138)의 병원 성 polyQ로 인간의 Htt 단백질의 N-터미널 RFP 태그 조각이 사용된5이었다. 돌연변이 체 Htt 단백질 세포질 집계 elav GAL45,6등 신경 특정 드라이버에서 표현 하는 때 형성 한다. Autophagosome-리소좀 플럭스를 시각화 하려면 말라 GAL4 편 탠덤 mCherry GFP Atg8a 기자의 식 드라이브 사용 되었다. mCherry-GFP-긍정적인 puncta autophagosomes, 나타내고 GFP 형광 단백질이 저하7때까지 산을 구분 하지 않는 mCherry의 남아 있는 리소좀의 산 성 환경에서 침묵으로 유량 모니터링 합니다. 비율 분석을 위해 구조의 일관 된 표식 인 단일 채널 세분화, 사용 하거나 두 개 이상의 채널의 투영 구조, 윤곽을 그리 다를 사용할 수 있는 적절 한 경우 비록 명시적으로 설명 된이 프로토콜에 될 수 있습니다. 이 예제에서 mCherry는으로 산을 구분 하지 않는 경로 통해 유출 통해 구획에 남아 있을 것 이다 Atg8-긍정적인 입자의 세분화에 대 한 사용 됩니다. - 다운로드 하 고 오픈 소스 이미지 분석 플랫폼 ImageJ 또는 피지 설치-와 ImageJ의 기본 배포 번들 플러그인2,3.
- H-맥시 마 대화형 유역에 대 한 플러그인을 설치 합니다.
참고:이 프로토콜 사용 하 여 피지; 추가 플러그인 ImageJ에 대 한 필요할 수 있습니다. Benoit Lombardot SCF-MPI-CBG에 의해 개발 된 플러그인은 사용할 수 온라인 (https://imagej.net/Interactive_Watershed)입니다. - 로 이동 "도움말 | 업데이트","관리 업데이트 사이트"선택" ImageJ 업데이트 "에서 목록에서 SCF-MPI-CBG 업데이트 사이트를 선택 하 고 다음 닫고 다시 시작 피지.
2. 뇌의 해 부와 면역 형광 염색
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실리콘 고무 줄 절 개 요리를 합니다.
- 실리콘 엘라 스토 머 부품에 붓고 비 커 및 철저 하 게 혼합 때까지 잘 저 어에 표시 된 대로.
- 5 cm을 채우기 위해 한 피 펫을 사용 하 여 조직 문화 요리 1-3 반에 전체 (고무 혼합물의 약 10 mL). 어떤 거품 표면에 승천 하 고 티슈로 제거를 허용 합니다. 요리를 커버 하 고 실내 온도 (RT)에서 48-72 h에 대 한 치료를 레벨 표면에 그들을 배치.
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초파리 뇌, 그리고 필요한 경우 비주얼 시스템을 해 부.
- 앞에서 설명한8,9 초파리 뇌 해 부를 수행 합니다. 파괴적인 조직 또는 집게를 피하기 위해 두뇌를 안정 시키기 위해 고무 바닥을 사용 하 여 고무 줄 절 개 요리를 해 부를 수행 합니다.
- 해 부 동안에 lamina 그대로 유지, 망막 아래 두 개의 집게를 슬라이드 하 고 부드럽게 제거 망막을 눈의 중간을 통해 눈물. Lamina 표면에 평행 하 게 개최 하는 집게와는 lamina에 연결 된 어떤 망막 조직을 멀리 당겨.
참고: 잔여 안료 다음 단계에서 씻어 것입니다 그리고 일반적으로 항 체 얼룩이 지 고 이미징 방해 하지 않습니다. - 인산 염 버퍼 식 염 수 500 µ L microcentrifuge 튜브에 3.7%의 최종 농도 사용 하기 전에 신선한 게를 (PBS)에 37% 포름알데히드를 희석. 수정 솔루션 microcentrifuge 관에 해 부 두뇌를 전송 하 고 부드러운 락와 RT에 15 분 동안 품 어.
참고: 포름알데히드 포 름 산을 생산 자연 산화 될 경향이 있다. 따라서, 그것은 스토리지에 대 한 약 수는 37% 포름알데히드를 제안 및 각 사용 전에 갓 3.7%에 희석입니다. -고정 또는 아래 고정 조직 및 형광10의 무결성에 영향을 것입니다. - PBTx로 3 회 세척 (PBS 0.4% 트라이 톤 X-100) 15 분.
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Immunohistochemistry 수행 하 고 표본 탑재.
- 항 체는 얼룩이 지는 필요한 경우, PBTx를 제거, PBTx에서 5% 정상 염소 혈 청 희석 주 항 체를 추가 하 고 하룻밤 4 ° c.에 aliquot 믹서에 품 어
- 1 차적인 항 체를 제거 하 고 15 분 동안 PBTx와 3 번 세척. 추가 5% 정상 염소 혈 청 희석 PBTx에서 이차 항 체와 RT에 1 시간에 대 한 품 어 또는 4 ° c.에서 하룻밤 PBTx 3 시간 15 분 동안 씻어.
- DAPI 얼룩은 필요한 경우, PBTx 제거, DAPI 솔루션 추가 (재고 솔루션: 5 mg/mL, 희석 작업 PBTx에 15 µ g/mL의 농도에), 및 실시간 씻어 3 시간 15 분 동안 PBTx에서 10 분 동안 품 어.
- 취소는 조직, 양쪽에 명확한 테이프의 1 개의 층의 스페이서와 현미경 슬라이드의 중심에 장착 매체의 한 방울을 배치 합니다. 전송 설치 매체의 드롭에 두뇌와 두뇌 투명 하 게 될 때까지 1-2 분 기다립니다. 조심 스럽게 제거를 피 펫을 장착 매체.
- 탑재, 슬라이드에 두뇌에 신선한 설치 매체의 방울을 적용 합니다. 조심 스럽게 거품을 피하고 커버 유리 오버레이. 고무 시멘트, 가장자리를 밀봉 하 고 20 분 최상의 결과 얻으려면 이미지 수집을 진행에 대 한 실시간에 건조.
3. 이미지 수집
- 공간 해상도, 목표, 스캐닝 속도, 줌 현미경 수집 매개 변수를 최적화 하 고 단계 크기, 이미지 분석 중 반자동된 세분화를 촉진 하기 위하여 관심의 구조의 해상도 최대화 하기 위해.
참고: 그것은 샘플 이미지를 캡처하고 모든 실험 샘플을 이미징 하기 전에 (이 프로토콜의 5 단계)에서 반자동된 세분화를 테스트에 유용할 수 있습니다. 이 방법으로 사용자 분석 도구 쉽게 관심의 생물학 구조를 분별 수 있도록 이미지 설정을 조정할 수 있습니다. -
높은 신호 대 잡음 비율 및 표본의 높은 동적 범위를 캡처 이미지 검출기 컨트롤을 조정 합니다.
- 사용 하 여 픽셀의 채도 (너무 높은 노출) 또는 undersaturation (너무 낮은 오프셋) 설정 (그림 3B, 빨간색 나타냅니다 안녕/낮은 LUT에 의해 픽셀 채도) 조정 하는 동안 나타내는 LUT (조회 테이블).
- 이득 및 오프셋 설정은 모든 실험적인 그룹에 대 한 적절 한 실험 조작 가능성이 관심의 구조 변경으로 확인 합니다.
참고: 그것은 절대적 양적 비교에 같은 설정이 모든 그룹에 대해 사용 됩니다.
- 모든 데이터를 캡처하려면 조직을 통해 이미지입니다.
참고: 한 이미징 세션 동안 사용할 수 있는 데이터의 모든을 포착 하 고 필요한 경우 4 단계에서에서 ROI 선택 동안 더 정확한 영역을 정의 하 것이 좋습니다. - 인수 매개 변수 및 공간 교정 같은 메타 데이터를 보존 하기 위해 이미징 소프트웨어에서 지 원하는 파일 형식으로 이미지를 저장 합니다. 실험 날짜, 유전적 배경, 그리고 형광 성 취재 원, 항 체를 포함 한 파일 이름으로 이미지를 저장 또는 채널에 해당 하는 염료 같은 [실험 그룹 이름] _ [견본 이름] _ [실험 날짜] _Ch1. 스캔 [Fluorophore-표적 /Dye]_Ch2.[Fluorophore-target/Dye], 등
4. 피지/ImageJ 이미지 가져오기 및 ROI 선택
- 피지에서 이미지를 엽니다. "바이오 형식 가져오기 옵션" 대화 상자를 사용 하 여, 선택 "으로 보기 스택: Hyperstack" 설정 "색상 모드: 회색 음영".
참고: 공간 교정 피지에 의해 읽을 수 수와 같은 메타 데이터로 현미경 파일 형식을 열려면 추천 된다. -
하나의 z-비행기 또는 표본 (그림 1, ROI 선택)에 걸쳐 표준화 된 투자 수익으로 사용 될 수 있는 마커 채널에 따라 투영에서 영역을 식별 합니다.
- "C" 스크롤 막대를 사용 하 여 단계 1.1에서에서 지정 하는 marker(s)을 캡처하는 데 사용 하는 채널을 볼 수 있습니다.
- "Z" 스크롤 막대를 사용 하 여 초점 비행기를 통해 이동. 단일 슬라이스를 선택 하거나 클릭 하 여 여러 조각의 투영을 만듭니다 "이미지 | 스택 | Z 프로젝트"및 설정" 시작 "조각과"Stop 슬라이스"투자 수익을 포괄 하는.
참고: "투영 유형 설정" "Z 프로젝트"에서 "최대 강도" 대화 상자는 자주 가장 적합 섹션 5에 세분화에 대 한 구조를 강조 하기 위해이 모든 응용 프로그램에 적합 하지 않을 수 있습니다 비록. 다른 유형의 투영 분석을 위해 필요한 경우, 저장 하 고 따라서 섹션 6 또는 7 기능 추출에 대 한이 파일을 문서 처리. - 채널 및 이미지 분석 프로토콜에서 다음 단계를 단순화 하는 관심의 초점 plane(s)를 포함 하는 새로운 이미지를 생성 합니다. 선택 "이미지 | 중복 "을 원하는"채널"(c)와"분할 영역"(z), 설정 하 고 (예를 들어, [실험 그룹 이름] _ [견본 이름] _ [date]_[Channel(s)]_[z-plane(s)]) 실험 선택에 맞게 파일 이름을 변경할.
- 4.2 단계에서 결정 하는 선택 기준에 따라 표준화 된 ROI를 수동으로 선택 하 피지 도구 모음에서 "선택 도구" 중 하나를 사용 합니다.
- 클릭 하 여 투자 수익 ROI 관리자에 추가 "분석 | 도구 | 투자 수익 관리자 "및 ROI 관리자 메뉴에서"추가 "를 클릭 합니다. 클릭 하 여 투자 수익 ROI 관리자 메뉴에서 저장 "더 | 저장"하 고 투자 수익을 반영 하기 위해 파일 이름을 (예를 들어, [실험 그룹 이름] _ [견본 이름] _ [실험 날짜] _ [채널] _ [z-plane(s)] _ [투자 수익 설명]).
참고:이 나중 분석에 대 한 피지에 재개 될 수 있다 또는 다른 채널 또는 5.3 단원에서 이미지에 적용할 수 있습니다.
5. 전처리 및 h-맥시 마 Watershedding와 시장 세분화
-
관심의 구조를 캡처하는 데 사용 하는 채널에 전처리를 수행 합니다.
- 이미지 파일 여러 채널의 경우, 클릭 하 여 채널을 분리 "이미지 | 컬러 | 채널 분할"관심의 채널을.
- 소음이 나 클릭 하 여 스무 딩 가우스 흐림 효과 줄이기 위해 중간 필터 같은 필터를 적용 "과정 | 필터 | 필터 유형"(예를 들어," 중간값 필터 "또는" 가우스 흐려 ").
- 다른 필터를 샘플 하 고 각 실험 그룹에서 이미지 매개 변수를 필터링 합니다. 단계 6.2 세분화 성능 확인 각 그룹에서 대표적인 예를 계속 수행 합니다. 필터 및 관심의 구조의 세분화를 촉진 하는 설정을 선택 합니다.
- 필터 및 설정을 기록 합니다. 실험 그룹에서 이러한 매개 변수를 적용 합니다.
- Tiff 파일 참조에 대 한 적용 된 필터를 포함 하 여 이미지의 복사본을 저장. [실험 그룹 이름] _ [견본 이름] _ [실험 날짜] _ [채널] _ 같은 상세한 이름을 사용 [z-plane(s)] _ [매개 변수 필터].
-
전처리 된 이미지 생성 및 단계 5.1에서에서 저장에 대화형 h-최대 분수령 도구에 대 한 관심의 구조의 세분화를 수행 합니다.
- 피지에서 활성 전처리 이미지 클릭 하 여 h-맥시 마 대화형 분수령 도구 시작 "SCF | 라벨 | 인터랙티브 H_Watershed "입니다.
참고:이 플러그인 분수령와 먼저 다음 사용자에 게 로컬 맥시 마와 즉시 업데이트 출력 이미지를 통해 세분화에 임계값 옵션의 효과 탐험. - 컨트롤 패널에서 씨앗 역학 (h), 강도 임계값 (T), 및 세분화를 최적화 하기 위해 (%)을 초과 하는 피크를 조정 합니다.
참고: 항상 섹션 4.2 수동으로 관심의 구조의 세분화의 성능 검사에에서 전처리 하기 전에 raw 이미지를 참조. - 세분화 결과 만족 하는 경우 "내보내기 영역 마스크"를 선택 하 고 "내보내기"를 선택 하십시오. 이 분수령 결과 (그림 1, 분할)의 이진 이미지를 생성 합니다.
- 기록 세그먼트 매개 변수; 이 매개 변수는 양적 비교에 대 한 실험적인 그룹에 적용할 필요가 있다. [실험 그룹 이름] _ [견본 이름] _ [실험 날짜] _ [채널] _ 같은 이름에 대 한 자세한 세그먼트 매개 변수 참조에 대 한 원하는 경우 이진 결과 마스크를 저장 [z-plane(s)] _ [매개 변수가 있는 필터] _ [H_Watershed 매개 변수].
- 피지에서 활성 전처리 이미지 클릭 하 여 h-맥시 마 대화형 분수령 도구 시작 "SCF | 라벨 | 인터랙티브 H_Watershed "입니다.
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분수령 결과에서 관심의 구조를 추출 합니다.
- 투자 수익 관리자에 단계 4.4에서 저장 된 ROI를 엽니다. 5.2.4 활성 단계에서 이진 영역 마스크 기능 추출 표준화 된 투자 수익을 제한 하려면 이미지에 적용할 ROI 관리자에서 투자 수익을 선택 합니다.
- 이진 분수령 마스크에 활성 ROI 선택 "분석 | 분석 입자 ""관리자 추가"기능을 추출 하는 대화 상자에서 선택 합니다.
참고:이 세분화 ROI 관리자에 동안 delineated 각 구조에 대 한 입자 식별자를 추가 합니다. 옵션 크기 또는 순환 분석에 포함 하는 구조를 수정 하는 데 필요한 경우에 따라 기능을 제외 하려면이 메뉴에서 사용할 수 있습니다. - 클릭 하 여 입자를 저장 "더 | 투자 수익 관리자 메뉴에서 "저장 합니다. 식별자를 선택 하 고 모든 입자 모두 zip 파일에 저장 됩니다 확인 하십시오. [실험 그룹 이름] _ [견본 이름] _ [실험 날짜] _ [채널] _ 같은 상세한 이름을 사용 [z-plane(s)] _ [매개 변수가 있는 필터] _ [H_Watershed 매개 변수] _ [구조].
6. 수량, 지역, 그리고 강도 정량화 및 분석
- 생성 및 저장 단계 4.2에서에서 raw 이미지를 엽니다. 관심의 구조를 캡처하기 위해 사용 되는 채널을 스크롤하십시오.
참고: 적용 단계 5.1 변경에서 필터 픽셀 값으로 (전처리) 전에 raw 이미지에서 강도 측정 하는 중요 한 이다. - 5.3 단계에서 기능 추출에서 얻은 입자 열고 ROI 관리자에서 "모두 보기"를 선택 합니다.
참고:이 작업 각 입자에는 "ROI 관리자" 이미지에 대 한 개요를 오버레이 및 관심 (그림 1, 기능 추출)의 구조의 가장자리를 일치 해야 합니다. - 클릭 하 여 원하는 측정을 설정 "분석 | 설정 측정 ".
참고: 영역, 강도, 그리고 입자의 밀도 "지역" 및 "통합된 밀도"를 선택 하 여 측정할 수 있습니다. 통합된 밀도 옵션을 선택 하면 피지 두 값을 생산할 예정 이다: 지역 및 평균 회색 값과 '원시 통합 밀도' 픽셀 값의 합으로 측정으로 계산 '밀도 통합'. 입자에 형광 단백질의 밀도 지역으로 나눈 픽셀 값의 합으로 계산 됩니다. 5.3 단계에서 생성 된 입자의 수 ROI 4.4 단계에서 정의 하는 조직 내의 입자의 수량을 나타냅니다. - 투자 수익 관리자 메뉴에서 "측정"을 선택 합니다. 결과 측정 이미징 소프트웨어에서 피지에서 파생 된 파일에서 가져옵니다으로 보정 단위로 표현 됩니다. 결과 창에서 결과 복사 하 고 컴파일 및 추가 계산 스프레드시트 소프트웨어에 붙여 넣습니다.
7. 비율 정량화 및 데이터 분석
- 단계 6.1 및 6.2 입자 식별자의 첫 번째 원시 채널에 여.
- 클릭 하 여 원하는 측정을 설정 "분석 | 설정 측정 ".
참고: 입자 당 평균 강도 "의미 회색 값"을 선택 하 여 측정할 수 있습니다. - 투자 수익 관리자에서 "측정"을 선택 합니다. 결과 창에서 데이터를 복사 및 붙여넣기 스프레드시트 소프트웨어에.
- 관심,이 예 (그림 4A), GFP의 두 번째 원시 채널에 "C" 스크롤 막대를 이동 하 고 반복 하는 단계 7.2. 그리고 7.3입니다.
참고: 입자 저장 단계 5.3에서에서 기본적으로 됩니다 채널 및 생성 된 조각. 주의 입자의 올바른 채널에 적용 됩니다. - 스프레드시트 소프트웨어에서 각 입자에 대 한 두 번째의 강도를 하나의 채널에서 휘도의 비율을 계산 합니다.
-
산 점도 사용 하 여 시각화 하 고 개별 변경 기본 생물학 과정의 반사를 전시 fluorophores에서 비율 계량 데이터를 계량.
- 그래프 소프트웨어에서 산 점도 생성 합니다.
참고: 각 데이터 요소는 관심의 첫 번째 fluorophore의 강도 "x"값 및 두 번째 fluorophore의 강도 각 입자를 측정 하는 "y 값"의 구조를 나타냅니다. - 게이팅 사분면을 정의 하기 위해 각 fluorophore에 대 한 임계값을 설정 합니다.
- 그래프 소프트웨어에서 산 점도 생성 합니다.
-
선 프로 파일을 사용 하 여 관심의 구조에 걸쳐 fluorophore 강도 시각화.
- 5.3 단계에서 생성 된 ROI를 선택 하 고 도구 모음에서 직선 도구를 사용 하 여 투자 수익을 통해 직선을 그립니다. 라인 투자 수익 ROI 관리자에 추가 합니다.
- 관심, 투자 수익, 라인의 각 채널에 대 한 선택 "분석 | 플롯 프로필 ".
참고: 플롯 프로필 기능 히스토그램 플롯 및 라인을 따라 강도 값의 테이블을 생성 합니다. 각 채널 및 붙여넣기 스프레드시트 소프트웨어 라인을 따라 두 채널을 보여주는 플롯을 생성 하에 측정 결과 복사 합니다.
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Representative Results
번호, 지역, 및 초파리 광 엽에 붙일 태그가 돌연변이 체 Htt 집계의 강렬의 정량화
Huntington의 질병, RFP 태그 돌연변이 초파리 모델의 중앙 신 경계에 misfolded 단백질 집단을 조사 하는 병 적인 비 (UAS-RFP-hHttQ15) 또는 병 적인 확장 ( 인간의 Htt UAS-RFP-hHttQ138) 막 GFP (UAS-mCD8::GFP)11 팬 신경 드라이버 elav GAL4아래 공동 표현 했다. 여성 파리 일수로 (대) 후 2 일의 머리 해 부, 고정, 고 DAPI 프로토콜의 섹션 2에 따라 물. Confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법 기름 침수 렌즈, 1.30 수 가늠 구멍 (NA), 픽셀 당 8.0 µs의 스캔 속도 해상도 1024 x 1024 픽셀 (픽셀 당 12 비트) 사용 하 여 X 40 광 엽에 초점을 맞추고 수행 되었다. 이미징 소프트웨어에 의해 결정 하는 최적의 단계 크기는 여기/방출 파장의 다음 조합으로 목표에 대 한 조각 당 1.08 µ m: 채널 1) 488/510 GFP, 채널 2) 543/581 RFP, 그리고 채널 3) 405/461 DAPI. 이미지 검출기 설정 모두에 적용 그룹 이미지 비교에 적합 하, 유지 하는 비 병원 성 RFP Htt Q15 제어 표본 보다 강도 높은 RFP Htt 집계, 축적 하는 RFP-Htt-Q138 견본에 확산 RFP-Htt (그림 2)의 낮은 수준. 이미지 수집 설정 RFP Htt Q15 견본의 동적 범위를 극대화 하기 위해 설정 된, RFP-Htt-Q138 집계 포화 될 것 이다. 예를 들어, 초파리 광 엽에 단백질 집단의 현미경 사진 HttQ138_Opticlobe.01_01012018_Ch1.RFP Htt_Ch2.GFP_Ch3.DAPI로 저장 되었습니다.
전체 광 엽 현미경 중 몇 군데 되었고 약 15 z-조각, 이루어져 보이지만 이미징 결정 했다 후 하나의 z-비행기 분석 최고의 개인 구조를 해결 하는 것 그렇지 않으면 중복으로 인해 프로젝션에는 조직 내의 높은 밀도. 표준화 된 ROI를 결정 하기 위해 광 엽12 의 정도 및 lobula 플레이트 사이 위치한 C2 및 C3 셀 시체 해부학 적 랜드마크로 사용 되었다. 피지, 이미지 분석 요구 사항에 맞게 복제 되었습니다 따라서 고 라는 HttQ138_Opticlobe.01_01012018_Ch1.GFP_Ch2.RFP-Htt_Ch3.DAPI_z8, z8 C2 및 C3 신경 셀 시체 했다 대부분 8 분할을 반영 하는 tiff 파일로 저장 (그림 1A, 이미지 수집) 얼룩 DAPI에서 저명한. 다각형 선택 도구 DAPI 얼룩이 지 고 신경 GFP 신호를 사용 하 여 (그림 1A, ROI 선택, 노란색 투자 수익을 나타냅니다 및 높은 확대 이미지에 대 한 표시를 지정 하는 레드 가이드로 시 엽 주위 ROI를 수동으로 선택 하는 데 사용 했다 선명도 워크플로의 다음 패널에서). Σ 값이 1로 설정 된 가우시안 흐림 필터 RFP Htt 채널 이미지를 부드럽게 하 여 세분화 (그림 1A, 전처리), 및 다운스트림 세분화 및 특징 추출이 없이의 성능에 적용 된 다음, 전처리 단계 그림 1A에서 보여 줍니다. 인터랙티브 H-유역 매개 변수가 RFP Htt 채널의 이미지에서 수행 되었다: 역학, 30; 씨앗 강도 임계값, 500; 피크 (%에서), 홍수 80;와 ' 분할 ' 고 (그림 1A, 세분화) 선정 '내보내기 영역 마스크'. 결과 이진 영역 마스크는 HttQ138_Opticlobe로 저장 되었습니다. 01_01012018_Ch2.RFP-Htt_z8_GuassianBlur-sigma1_HWatershed-h30_T500_80percent 및 단백질 집계13,14 정의 하 0.4 µ m2 의 최소 크기 배제 된 분석 입자 도구로 입자를 생성 하는 데 사용 . 결과 입자 HttQ138_Opticlobe.01_01012018_Ch1.RFP-Htt_z8_GuassianBlur-sigma1_HWatershed-h30_T500_80percent_aggregates로 ROI 관리자에서 저장 하 고 추출 (전처리) 전에 원시 RFP Htt 채널에 적용 된 양적 이미징 데이터 (그림 1A, 기능 추출).
초파리 의 광 엽을 통해 표준화 된 초점 비행기에서 반자동으로 세그먼트 RFP Htt의 수의 정량화 공개 비 병원 성 Htt Q15 확장의 확산 식 및 단백질의 축적 질병을 일으키는 Htt Q138 확장 (그림 2A-C)에 의해 집계. '원시 통합된 밀도'에 의해 주어진 각 입자의 모든 픽셀 값 들의 합 각 집계의 RFP Htt 콘텐츠 비교를 위해 사용 되었다. Htt Q138을 표현 하는 5 다른 시 돌출부의 표준화 된 초점면에서 모든 집계의 크기와 강도 프로필에는 견고성과 재현성이이 워크플로 (그림 2D, E)의 보여 줍니다. 특히, 집계 (그림 3A, B) 이미지 중 설쳐 했다 때 집계의 크기와 수의 정량화 비교할 수 있습니다 집계 (그림 3C, D), 이상적인 노출으로 캡처한 그러나 설쳐 집계의 강도 포화 픽셀 전시 최대 강도 값 (그림 3E, F)로 크기의 함수가 된다. 따라서, 적절 한 검색 노출 매개 변수 설정이 단백질의 양적 분자 구성의 전체 범위를 추출 중요 합니다.
탠덤 형광 Atg8a 기자를 사용 하 여 초파리 시각적 lamina에서 autophagy 유량의 비율에 기초를 둔 정량화
초파리 시각 시스템에서 autophagy 리소좀 플럭스를 평가, mCherry-GFP-Atg8a 기자 했다 편 컨트롤에서 또는 초파리 spermine synthase (dSms) homozygous 돌연변이 (dSmse/e) 파리 함께 걸 GAL4 드라이버. dSmse/e lysosomal 부전15인해 장애인된 autophagic 플럭스와 관련 된 전시 neurodegeneration 파리. 연결 된 lamina 5 대에서 여성 파리의 머리 해 부, 고정, 고 DAPI 스테인드. lamina는 레이저 스캐닝는 100 X 기름 침수 렌즈, 1.35 수 가늠 구멍 (NA), 픽셀 당 8.0 µs의 광학 해상도 픽셀 당 12 비트 샘플링 속도와 단계 1.2 µ m의 크기와 confocal 현미경 검사 법에 의해 몇 군데.
이 분석은 조각의 7 z-lamina 스파스 Atg8 양성 구조 (그림 1B, 이미지 수집)의 샘플링을 증가를 통해 최대 z 프로젝션에서 수행 되었다. 표준화 된 ROI 수동으로 DAPI에서 공개 하 고 잘 특징이 해부학 및 조직 세포 조직에 따라 셀 바디 레이어 주위 다각형 선택 도구로 그린 (그림 1B, ROI 선택, 노란색 표시는 수익과 레드 워크플로의 다음 패널에서 선명도 대 한 표시 높은 확대 이미지 지정)16. 직렬 식 기자는 GFP mCherry 저하 됩니다 때까지 남아 있는 리소좀의 산도 의해 침묵 이다 GFP와 mCherry moieties autophagy 리소좀 통로 통해 진행 표시의 안정성 속성에 의존 합니다. 따라서, 최소로 mCherry fluorophore 세분화가이 프로토콜에 사용 되었다. Σ 값 1 가우스 블러 필터 (그림 1B, 전처리), mCherry 채널에 적용 된 및 다음 매개 변수 대화형 H-유역 수행: 역학, 0; 씨앗 강도 임계값, 800; 피크 (%에서), 홍수 90;와 ' 분할 ' 고 (그림 1B, 세분화) 선정 '내보내기 영역 마스크'. 결과 이진 영역 마스크 분석 입자 도구로 입자를 생성 하기 위해 사용 되었다. 결과 입자 autophagy 리소좀 구획 (그림 1B, 기능 추출)에서 양적 비율 데이터를 추출 (전처리) 전에 원시 mCherry 원시 GFP 채널에 적용 했다.
MCherry-GFP-Atg8-양성 구조 검사 표시 lamina, 뉴런17셀 시체 autophagic vesicles의 역행 수송의 이전 보고서와 일치의 세포 농도에 농축. 플롯 프로필 mCherry 및 높은 어디 기자에 차이 드러내는 여러 Atg8 양성 구조 (라인 ROIs 그림 4A 와 4B 그림에 선 따라 결과 강도 프로필 참조), 걸쳐 GFP 강도 시각화 하는 데 사용 되었다 두 fluorophores의 강도가 나타냅니다 GFP에이 산 성 (그림 4B1), 침묵 하 고 낮은 mCherry 내 저하를 반영 하는 마지막으로 autophagosomes (그림 4B3), 높은 mCherry 및 낮은 GFP 융해는 리소좀을 나타냅니다. 리소좀 (그림 4B2)입니다. 각 세미 자동으로 분할 된 mCherry-Atg8-긍정적인 입자의 평균 fluorophore 강도에서 생성 된 점도 설명 다음으로 구분 했 고 개별 단계 사분면 분석 ( 에 의해 autophagy 리소좀 통로 통해 유출 그림 4C). 줄거리는 GFP의 제어 임계값을 사용 하 여 4 개의 사분면으로 분할 되었다 570, mCherry = = 1800. 다음 보안 주체를 사용 하 여 컨트롤 그룹 기반으로 임계값 설정 했다: (1) 협동 형광 기자의 디자인 및 두 fluorophores의 속성, 그래서 그 이론적으로 GFP 해야 하지 형광 어디에 mCherry 신호 (사분면 4) 및 (2) Atg8-긍정적인 입자의 분포 반영 autophagy 리소좀 통로 관련 구획 야생-타입 신경 기저 autophagy가 고효율18,19의 분포. 제어 파리의 laminas에서 약 25 %Atg8-긍정적인 입자의 autophagosomes로 범주화 되었다 (사분면 나), 그리고 autophagosome 리소좀 퓨전 넘어 처리 되는 puncta의 절반 (사분면 II 및 III); dSmse/e laminas autophagosomes 또는 역 기능 리소좀에 크게 증가 했다 (사분면 나) autolysosomes를 감소 (사분면 II 및 III)에서 결함을 통해 autophagosome 축적의 암시, autophagosome-리소좀 퓨전 또는 lysosomal 저하 (그림 4 C, D). 양적 데이터 또한 lamina dSmse/e 파리 (그림 4E)에서 Atg8 양성 구조의 분명 한 축적을 지원. 평균 mCherry의 GFP 신호 비율 분석 제어 및 dSmse/e 그룹 (그림 4 층) 사이의 차이 강조 하지만 통로 공개 하는 특정 단계에 전반적인 영향을 자세하게 하지 수는 사분면 분석입니다.
그림 1: 워크플로 예제와 함께 피지를 사용 하 여 초파리 뇌의 subcellular 구조의 바이어스 최소화, 반자동 세분화 통해. 초파리 뇌 표현 시 엽을 통해 단일 초점 비행기에서 (A) 대표 confocal 현미경 팬 신경 RFP 태그 돌연변이 체 Htt와 막 대상 GFP (elav GAL4 > UAS-mCD8:GFP, UAS-RFP-hHttQ138) DAPI 얼룩 (이미지 수집)와 함께. DAPI GFP 광 엽; 주위 ROI (노란색)을 선택 하는 데 사용 빨간색 상자가 지역 확대 선명도 (ROI 선택)에 대 한 워크플로 통해 나타냅니다. 전처리 패널 σ1 가우시안 흐림 필터의 적용 후 RFP HttQ138 채널 (맨 위)의 원시 이미지의 높은 확대 표시 (아래). 인터랙티브 h-최대 분수령 씨앗 역학에 대 한 표시 매개 변수 설정을 사용 하 여 세분화 h-맥시 마 (h), 글로벌 분수령 정지 기준 강도 임계값 (T)에 의해 결정에 의해 결정 되며 지역 정지 기준에 의해 결정 피크 홍수 ( %)은 RFP HttQ138 원시 (위)와 가우스 흐리게 (아래) 이미지 및 분수령 지역 마스크 분수령 플러그인에서 내보낸 및 선명도 대 한 반전 결과에서 수행. 입자에 의해 생성 된 입자 (마젠타) RFP HttQ138 raw 이미지 (기능 추출)에 중첩 분석. 화살표 집계 전처리 없이-세그먼트를 나타내고 화살촉 필터링 후 분리에 실패 하는 구조를 표시 합니다. (B) 제어 및 유비 쿼터 스 GFP-mCherry-Atg8a (표현 성인 돌연변이 (dSmse/e) 초파리 의 lamina의 수평 섹션을 통해 7 초점 비행기의 최대 z-프로젝션에서 대표적인 confocal 현미경 걸 GAL4 > UAS-GFP-mCherry-Atg8) 와 DAPI 얼룩 (이미지 수집). DAPI; lamina의 셀 시체 레이어 주위 ROI (노란색)을 선택 하는 데 사용 되었다 빨간색 상자가 지역 확대 선명도 (ROI 선택)에 대 한 워크플로 통해 나타냅니다. Σ1 제어 및 돌연변이 lamina 적용 전처리 패널 가우스 흐림 필터, mCherry 채널의 높은 확대를 보여줍니다. 표시 매개 변수 설정 사용 하 여 필터링 된 mCherry 이미지에 대화형 h-최대 분수령 세분화 수행 그리고 분수령 결과 이진 영역 마스크 선명도 대 한 반전으로 표시. 입자에 의해 생성 된 입자 (마젠타) 원시 mCherry에 GFP 이미지 (기능 추출) 중첩을 분석 합니다. 스케일 바 = 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 크기의 정량화와 돌연변이 RFP Htt의 강도 강력 하 고 재현할 수. (A-B) RFP-hHttQ15 (A) 또는 팬-신경 드라이버 elav GAL4 아래 RFP hHttQ138 식 (B) 초파리 두뇌 했다 해 부 및 고정 시 돌출부 레이저 confocal 현미경 검사 법을 검사 하 여 촬영 했다. 눈금 막대 = 50 µ m. (C) 각 그룹에서의 평균 수 시 엽 주위 수동으로 선택한 투자 수익에서 계량 및 표준화 된 z-조각에 초점을 맞춘 (n = 5). (D-E) 크기 (D)와 RFP hHttQ138 집계에서 계량의 총 강도 (E) 5 다른 동물의 시 돌출부에 ROIs를 표준화. 집계 데이터는 로그 눈금에 플롯 됩니다. 집계는 개체 보다 큰 0.4 µ m2 ( D에서 파선)으로 정의 되었다. 통계 분석, 일방통행 ANOVA, NS: 중요 하지; 거리: 임의 단위 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 이미지 노출 과도 부정확 한 강도 측정 리드. (A-B) 이상적인 노출 (A)와 같은 optic lobe 그리고 피지에 힐로 LUT와 과도 (B) pseudocolored의 대표 confocal 현미경 사진. B에서 레드 설쳐 집계를 나타냅니다. 눈금 막대 50 µ m. = (C) 부 량 집계 크기의 h-맥시 마 유역 매개 변수 구현 후 비슷한 세분화 결과를 생성. 통계 분석, 독립 샘플 t-테스트, NS: 중요 하지. (D) 고 설쳐 이미지에 전체 크기의 주파수 분포. 5에서 25 µ m2 의 크기와 집계 4 범주 그룹에서 범주화 추가 했다. (E -F) 상관 관계 분석 집계 크기 (E)의 기능으로는 집계의 강도. 모든 픽셀 4095의 최대 강도 값이 없을 때 참조 선이 그려진된 (블랙)입니다. 녹색 상자 아래 10 µ m2 지역 F에 표시 된 집계를 나타냅니다. b: 회귀 계수, R2: 계수 결정; 거리: 임의 단위 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 협동 형광 mCherry-GFP-Atg8a 유전 기자의 정량화 초파리에 있는 autophagic 플럭스의 뚜렷한 특징을 보여준다. (A) 제어 및 dSmse/e 편 mCherry-GFP-Atg8a 표현 된 돌연변이 파리에서 초파리 lamina의 대표적인 confocal 현미경 (걸 GAL4 > mCherry GFP Atg8a) DAPI 위한 스테인드 . Lamina 세포 체 층의 점선된 박스 영역 (오른쪽) 높은 확대에 표시 됩니다. 숫자는 대표 Atg8a 긍정적인 구조 플롯 b에서 와 C에서 계량을 나타냅니다. (B) 히스토그램 라인 ROIs A. (C) mCherry-GFP-Atg8 구조 의미 mCherry 농도의 기능으로 평균 GFP 강도 의해 플롯에 높은 확대 이미지에 표시 된 따라 임의의 단위 (AU) 형광 강도 플롯 제어 및 dSmse/e lamina (각 그룹에서 3 하기에서 측정 하는 입자)에서 측정 됩니다. 줄거리는 GFP의 제어 임계값을 사용 하 여 4 개의 사분면으로 분할 되었다 = 570 및 mCherry = 1800 구조 유전자 형에 의해 표시 된 각 사분면에서의 비율. (D) mCherry-GFP-Atg8 C에서 각 사분면으로 분류의 평균 비율의 정량화 (n = 3 lamina). (E) lamina 당 mCherry-GFP-Atg8 puncta의 숫자의 정량화 (평균 ± 사 우 스 다코타, n = 3 lamina). (F) mCherry-GFP-Atg8 구조의 비율 분석 제어 및 돌연변이 비행 lamina에서 관찰 (95 %ci, 의미 n = 3 lamina). 학생 t-테스트. P < 0.05, * *P < 0.01. Sscale 바 = 2 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
튼튼하게 그리고 reproducibly quantitate 형광 기반 이미징에 의해 시각 세포 생물학 과정을 여기에 설명 된 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 생물 학적 컨텍스트 및 기술적 한계 실험 설계 가이드를 신중 하 게 고려 될 필요가 있다. 관심의 subcellular 구조의 형광 마커 immunohistochemical, 염료 기반, 또는 유전자 표현 배경 형태와 강도 의해 위에 구별 될 필요가 있는지. UAS/GAL4 시스템 널리 초파리에 타겟된 유전자 발현을 운전 하는 데 사용 됩니다. 여기에 제시 된 예제 단백질 집계 및 신 경계에서 autophagy 조사 UAS 증강의 통제 붙일 태그가 단백질의 전사를 활성화 하기 위해 유전자 변형 라인 GAL4 드라이버를 들고 사용. 실험적인 UAS transgene의 동시 식 형광 리포터 transgene 함께 필요한 경우, 다음 컨트롤 그룹 또한 포함 해야 한다 예 GAL4 복용량에 대 한 제어를 하 찮은 transgene의 공동 overexpression UAS-GFP 또는 UAS lacZ. 표준화 된 샘플 준비, 초파리 중앙 신 경계 해 부, 고정, 얼룩, 장착을 통해 항 체에서 시각 시스템에 대 한 여기에 설명 된 대로 최적의 이미징 및 정량화에 대 한 중요 합니다.
좋은 신호 대 잡음 비율 및 동적 범위를 극대화 하는 관행을 이미징 반자동된 분석에 필요한 하 고 실험적인 그룹 간의 정확한 비교를 위해 파라마운트. 그래서 그 기자를 단백질 농도의 전체 범위 추출 될 수 있다 (그림 3) 계량 oversaturated 하지는 이미지 수집 매개 변수를 설정 해야 합니다. 동일한 매개 변수를 수집 하 고 선호 같은 날에 양적 비교에 대 한 이미징 수행 되어야 한다.
투자 수익 선택, 이미지 프로세싱, 기능 세분화 및 오픈 소스 플랫폼을 사용 하 여 기능 추출 ImageJ/피지는 응용 프로그램에 따라 다릅니다; 초기 매개 변수는 사용자가 정의 해야 합니다, 하는 동안 표본에서 그들의 응용 프로그램 양적 데이터 출력을 극대화 하면서 편견을 최소화 합니다. 그것은 신중 하 게 문서 워크플로에 중요 하 고 각 단계 파일 이름을 적 처리를 적용 한 후 이미지를 tiff 파일로 저장을 권장. 처음으로 고 지에 대 한 매개 변수는 이미지 처리의 각 단계에서 실험적인 그룹 및 분석 간의 일관성을 보장 하기 위해 기준점으로 봉사 하는 프로토콜에 밖으로 일 때이 특히 유용할 수 있습니다. 투자 수익 선택 기준 표식 또는 해부학 적 랜드마크를 사용 하 여 컨트롤 그룹에서 정의 해야 하지만 주의 마커 또는 신뢰할 수 있는 표시 방지 하는 방법에 있는 실험적인 조작 변경 하지 할 수 있도록 해야 한 ROI를 표준화할 수 있습니다. 단일 슬라이스 또는 여러 조각의 z 프로젝션 최고의 단일 초점 비행기 구조, 이웃의 분리를 향상 시킬 수 및 z-투영 구조를 분석 하는 데 유용할 수 있습니다. 분석의 목표를 해결 하기 위해 선택할 수 있습니다. 조직 볼륨에 걸쳐 지역화. Z-프로젝션 세분화 및 이미지 분석 사용의 종류 결정 되어야 합니다 신중 하 게 그리고 독립적으로. 최대 강도 프로젝션 때문에 구조는 어디 그들이에 초점, 있고는 일반적으로 세분화 비행기에 밝은 날카로운 이미지를 생산할 예정 이다. 이미지 분석 autophagy 리소좀 분석;의 예와 최대 투영에 허용 될 수 있습니다. Atg8-양성 구조 샘플링에 사용 되는 단계 크기 보다 작은, 따라서 가장 정확 하 게 표시 됩니다 최대 강도는 그들은 캡처된 유일한 초점 비행기에서. 그러나, 단계 크기 보다 큰 구조의 분석, 같은 xy 좌표와 모든 픽셀을 추가 하는 sum 프로젝션 수 있습니다 더 정확 하 게 나타낼 각 구조의 강도 정보. 이 프로토콜은 단일 슬라이스 또는 차원에서 여러 조각의 z 투영을 분석 하기 위한 설계, 워크플로가 동일한 도구 중 몇 가지를 사용 하 여 z 시리즈에서 3 차원 구조 분석에 쉽게 적응 수 있습니다. 3D 분석 불규칙 모양의 구조의 작은 샘플 크기에 대 한 바람직한 구조를 비스듬히 교차 하는 z-슬라이스 분석을 왜곡 것 이다 있을 것 이다.
전처리 필터,이 프로토콜에 제안 된 그들과 같은 세분화; 동안 관심의 구조의 탐지를 원조 하기 위하여 가장자리를 유지 하면서 소음을 줄일 수 있습니다. 않고 충분 한 배경 잡음과 형광 마커 이질성-세분화, 너무 모호 하 게 발생 하는 설정 정보를 제거 하 고 정확한 가장자리 탐지를 방지 발생 합니다. 로컬 맥시 마에서 물 소스와 지형 표면으로 이미지를 고려 하는 분수령 세분화-형광 이미지의 강도 높은 픽셀-그 밖으로 홍수 범람된 지역 댐, 또는 세그먼트 경계20내장은 이웃 충족 될 때까지. H-최대 분수령 사용자 정의 임계값 (SCF-MPI-CBG 플러그인의 역학 h-맥시 마)을 사용 하 여 독특한 지역 최대21가 없는 구조의 이상 세분화를 피하기 위해 의미 있는 로컬 맥시 마를 구별. 인터랙티브 h-최대 분수령 플러그인이이 프로토콜에서 구현 하면 h-맥시 마 역학 (h), 글로벌 분수령 정지 기준 강도 임계값 (T)에 의해 결정 및 지역 정지 기준 (%)을 초과 하는 피크에 의해 결정을 하는 동안 출력 이미지 품질로 세분화 성능을 평가 하기 위해 유역 결과 보고 즉시. 형광 라벨은 휘도가 또는 조직 이상 세분화와 불완전 한 분리 (그림 1A, 특징 추출에 빨간색 화살표)가 발생할 수 있지만 세분화 결과 대부분의 구조 경계와 밀접 하 게 동의 합니다. 밀도가 채워집니다. 반자동 세분화 및 분석 단계의 효율성 세분화 함정을 완화 하 고 샘플링을 증가 활용 될 수 있습니다.
세그먼트화 기능 추출 후에, 그것은 지역, 차원, 및 순환 같은 형태학 정보를 추출 간단 합니다. 또한, 노출 과도 피하기 위해 이미지를 적절 하 게 수집 하는 경우 분자 정보 유추 수 있습니다 또한 수이 이미지 분석에서 강도 측정에 의해. 일단 신경 퇴행 성 질병 병 리의 추출 하 고이 접근 방식에 의해 정량, 다양 한 중요 한 질문을 해결 하기 위해 이러한 조치를 사용할 수 있습니다. 특히, 프로토콜 이미지 분석 및 단백질의 정량화를 사용 하 여 요소 단백질 집계에 영향을 배포, 번호, 크기, 및 단백질 밀도 집계의 상관 관계 식별을 보여주었다합니다 신경 장애 및 organismal 건강. 부 량 비율 기준에 기초를 둔 질병의 진행 하는 동안 집계 상호 subcellular 구성 요소 또는 프로세스를 사용할 수 있습니다. 생 화 확 적인 동안 cytometry 다른 subcellular 구조와의 상호 작용을 분석에 적용 된, 세포 세포의 용 해 수 있습니다 단백질 손실 집계 속성을 변경 하 고 단백질-단백질 상호 작용22중단. mCherry-GFP-Atg8 형광 현미경 검사 법, 배양된 세포23에서 특히 통해 autophagy를 모니터링 하는 데 널리 이용 되는 그러나 공평 하 고 양적 분석 방법 부족. 또한, 분석 vivo에서 유전자 인코딩된 직렬 식 기자를 사용 하 여 도전 하며 높은 제어 유전 배경 및 조직 준비. 이 프로토콜 이미징 autophagy 리소좀 구획을 계량 하는 중요 한 사례를 조직 준비에서 검증 된 방법론을 설명 합니다. 좋은 유전자 관행, Atg 긍정적인 입자 강도 프로필 등 개별 형광 신호에 의해 게이팅 사분면 분석 이미지 분석 접근 강력한 탐지 및 정상 및 병 적인 비교를 감당할 수 있는 autophagic 플럭스에서 vivo에서 다양 한 질병 모델에서.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 쉴라와 데이비드 Fuente Neuropathic 고통을 연구 프로그램 대학원 친교 (J.M.B.)에 의해 지원, 로이스 교황 생활 휄 로우 프로그램 (카스 티 야, Y.Z., 및 J.M.B.)는 스나이더-로빈슨 재단 Predoctoral 친목 (카스 티 야), 닥터 존 T . 맥도날드 재단 (에 카스 티 야), 계약서, 부여에서 건강 (NIH) HHSN268201300038C, R21GM119018, 및 R56NS095893의 국가 학회 (R.G.Z.), 고 대 산 학자 프로젝트 (산둥 성, 중화 인민 공화국) (R.G.Z.)에 의해.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SYLGARD(R) 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | PF184250 | Dissection dish |
| Falcon 35 mm Not TC-Treated Easy-Grip Style Bacteriological Petri Dish | Corning | 351008 | Dissection dish |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dissection tool |
| Sodium Chloride | Sigma | S3014 | PBS solution |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | S5136 | PBS solution |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma | P5655 | PBS solution |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | Washing and antibody incubaton solution. |
| 37% Formaldehyde | VWR | 10790-710 | Fixation |
| Disposable Microcentrifuge Tubes (0.5mL, blue) | VWR | 89000-022 | Fixation, washing, and antibody incubaton. |
| Plain and Frosted Micro Slides (25×75mm) | VWR | 48312-004 | Slides for confocal imaging |
| Micro Cover Glasses, rectangular (22×40mm) | VWR | 48393-172 | Slides for confocal imaging |
| Rubber Cement | Slime | 1051-A | Mounting |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | Mounting |
| Scotch Magic 810 Invisible Tape (19mm×25.4m) | 3M Company | 810 | Mounting |
| Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | Antibody incubaton |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | Nucleic acid staining. Dissolve in deionized water to make a 5 mg/mL stock solution and store at -80°C. Dilute to a working concentration of 10-20 μg/mL in PBTx. |
| 3.5X-90X Stereo Zoom Inspection Industrial Microscope | AmScope | SM-1BNZ | Dissection scope. Equipped with 6W LED Dual Gooseneck Illuminator |
| ImageJ/Fiji | NIH | v1.51u | With SCF_MPI_CBG plugins (version 1.1.2) |
| FV1000-IX81 Confocal-laser Scanning Microscope | Olympus | ||
| Recombinant Construct | Bloomington Drosophila Stock Center | BL37749 |
References
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