Kvantitativ cellebiologi mentalt tilbakestående da i Drosophila gjennom objektiv analyse av Fluorescently merket proteiner med ImageJ

Summary

Vi har utviklet en enkel og tilpasningsdyktig arbeidsflyt for å trekke ut kvantitative data fra fluorescens-imaging-baserte celle biologiske studier av protein aggregering og autophagic forandring i sentralnervesystemet Drosophila modeller av neurodegeneration.

Abstract

Med økende utbredelsen av nevrodegenerative sykdommer er det stadig viktigere å forstå de underliggende patofysiologien som fører til nevronale dysfunksjon og tap. Fluorescens-basert bildebehandling verktøy og teknologier aktiverer enestående analyse av subcellular nevrobiologiske prosesser, men det er fortsatt behov for objektivt reproduserbare og tilgjengelige metoder for utpakking kvantifiserbare data fra imaging studier . Vi har utviklet en enkel og tilpasningsdyktig arbeidsflyt for å trekke ut kvantitative data fra fluorescens-baserte imaging studier med Drosophila modeller av neurodegeneration. Spesielt vi beskrive en lett-å-følge, semi-automatisert tilnærming med Fiji/ImageJ analysere to cellulære prosesser: først, vi kvantifisere samlet proteininnhold og profilen i Drosophila optikk flik med fluorescerende-merket mutant huntingtin proteiner; og andre, vi vurdere autophagy-lysosome forandring i Drosophila visuelle systemet med ratiometric-baserte kvantifisering av tandem fluorescerende reporter for autophagy. Viktigere, inkluderer protokollen skissert her et semi-automatisert segmentering skritt for å sikre alle fluorescerende strukturer analyseres å minimere utvalget bias og å øke oppløsningen til subtile sammenligninger. Denne tilnærmingen kan utvides for analyse av andre cellen biologiske strukturer og prosesser innblandet i neurodegeneration, som proteinaceous puncta (stress granulater og synaptic komplekser), så vel som membran-bundet rom (mitokondrier og membran menneskehandel blemmer). Denne metoden gir et standardisert, men tilpasningsdyktige referanse for bildeanalyse og kvantifisering, og kunne lette pålitelighet og reproduserbarhet over feltet, og til slutt øke mekanistisk forståelse av neurodegeneration.

Introduction

Nevrodegenerative sykdommer påvirker millioner av mennesker hvert år og forekomsten øker med en aldrende befolkning¹. Mens hver nevrodegenerative sykdommer har en unik etiologi, er samling av misfolded proteiner og nedbryting av proteostasis nettverket vanlige patologisk kjennemerkene til mange av disse sykdommene. Klargjørende hvordan forstyrrelse av prosessene grunnleggende og beslektede går galt er å bidra til nevronale dysfunksjon og celle død avgjørende for forstå nevrodegenerative sykdommer, samt guiding terapeutisk intervensjon. Fluorescens-basert bildebehandling tillater undersøkelse av disse komplekse og dynamiske prosesser i nerveceller og har sterkt bidratt til vår forståelse av neuronal cellebiologi. Analyse av fluorescently merket proteiner er utfordrende, spesielt når eksperimenter utføres i vivo, svært kompakt vev, ulike celletyper, og morfologiske heterogenitet. Manuelt assistert kvantifisering er rimelig og enkelt, men er ofte tidkrevende og utsatt for menneskelig bias. Derfor er det behov for objektivt reproduserbare og tilgjengelige metoder for utpakking kvantifiserbare data fra imaging studier.

Vi har skissert en enkel og tilpasningsdyktig arbeidsflyt ved hjelp av Fiji/ImageJ, en kraftig og fritt tilgjengelig bildebehandling programvare^2,3, trekke ut kvantitative data fra fluorescens tenkelig studier i eksperimentelle modeller av neurodegeneration bruker Drosophila. Ved å følge denne protokollen for å kvantifisere protein aggregering og autophagic flux-to celle biologiske egenskaper som er svært relevante for nevrodegenerative sykdommer patologi-vi viste den sensitivitet og reproduserbarhet av denne tilnærmingen. Analyse av fluorescently merket mutant huntingtin (Htt) proteiner i Drosophila optikk flik avdekket antall, størrelse og intensitet av protein aggregater. Vi visualisert tandem fluorescerende reporter av autophagic forandring i Drosophila visuelle systemet, som viser forskjellige utslipp signaler avhengig av avdelingsflytting miljø⁴. Ratiometric-basert analyse av tandem reporteren tillatt for en kvantitativ og omfattende utsikt over autophagy-lysosome flux fra autophagosome formasjon, modning og transport til degradering av lysosome, og i tillegg markert sårbare rom forstyrret i neurodegenerative forhold. Viktigere, i begge analyser vi implementert halvautomatisk terskelverdi og segmentering skritt i våre protokollen å minimere ubevisst bias, øke prøvetaking makt og gir en standard for å forenkle sammenligninger mellom lignende studier. Grei arbeidsflyten er ment å gjøre kraftige Fiji/ImageJ plugins (utviklet ved datamaskinen forskere basert på matematiske algoritmer) mer tilgjengelig for neurobiologists og biovitenskap samfunnet generelt.

Protocol

1. hensyn og forberedelser for å utforme bildet analyse eksperimentet

1. Forhåndsbestemme egnet anatomiske, mobilnettet, eller subcellular indikatorer for å tjene som landemerker for standardisering et område av interesse (ROI) i et annet datautvalg, for eksempel 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), membran markører, lokalisert lysstoffrør protein, osv.
2. Velg en fluorescerende markør som kan begrense diskret puncta utover bakgrunn nivå for strukturen av interesse.
   Merk: Denne protokollen er optimalisert for proteinaceous strukturer (f.eks, misfolded protein aggregater) og membran-bundet organeller (f.eks, autophagy reporter). For å visualisere protein aggregering, var en RFP-merket N-terminal fragment av menneskelig Htt protein med en sykdomsfremkallende polyQ eiendom 138 gjentar (RFP-hHttQ138) brukte⁵. Mutant Htt protein danner cytoplasmatiske aggregater da uttrykte under neuronal driverne som elav-GAL4^5,6. For å visualisere autophagosome-lysosome flux, ble Begrepsordbok-GAL4 brukt til å kjøre overalt uttrykk for tandem mCherry-GFP-Atg8a reporter. mCherry - og GFP-positiv puncta indikerer autophagosomes, og fluks er overvåket som GFP fluorescens er slukket i surt miljø av lysosome, hvor syre-ufølsom mCherry forblir til protein er degradert⁷. For ratiometric analyse, kan én kanal som er en konsekvent struktur brukes for segmentering, eller eventuelt en projeksjon av to eller flere kanaler kan brukes til å avgrense strukturer, skjønt ikke uttrykkelig beskrevet i denne protokollen. I dette eksemplet brukes mCherry for segmentering av Atg8-positive partikler, som det er syre-bokstaver og vil forbli i rommet hele flux gjennom sti.
3. Dataoverføre og installere åpen kildekode bildet analyse plattform ImageJ eller Fiji, foretrukket fordeling av ImageJ med medfølgende plugins^2,3.
4. Installere plugin for h-maxima interaktive vannskille.
   Merk: Denne protokollen bruker Fiji; flere plugins kan kreves for ImageJ. Plugin utviklet av Benoit Lombardot for SCF-MPI-CBG er tilgjengelig online (https://imagej.net/Interactive_Watershed).
5. Gå til "hjelp | Oppdatere", velg"Behandle oppdateringen områder"fra"ImageJ Updater", velg Oppdater SCF-MPI-CBG fra listen og deretter lukke og starte Fiji.

2. hjernen disseksjon og Immunofluorescence flekker

1. Gjøre silikon elastomer linjert disseksjon retter.
   1. Hell silikon elastomer komponenter i et beaker som indikert av produsent og rør godt til godt blandet.
   2. Bruke en pipette for å fylle 5 cm vev kultur retter en tredjedel til halvparten full (ca 10 mL av elastomer blanding). Tillate bobler å stige til overflaten og fjerner med papir. Dekke retter og plassere dem på en plan overflate å kurere 48-72 h ved romtemperatur (RT).
2. Dissekere Drosophila hjernen, og visuelle systemet om nødvendig.
   1. Utføre Drosophila hjernen disseksjon som beskrevet tidligere^8,9. Utføre dissection elastomer linjert disseksjon retter, med en elastomer bunnen for å stabilisere hjernen for å unngå skade vev eller tang.
   2. For å holde lamina intakt under disseksjon, skyv to tang under netthinnen og forsiktig rive gjennom midten av øyet å fjerne netthinnen. Trekke bort noen netthinnen vev knyttet til lamina med tang holdt parallelt lamina overflaten.
      Merk: Gjenværende pigment vil vaske i fremgangsmåten og vanligvis påvirke ikke antistoff flekker og tenkelig.
   3. Fortynne 37% formaldehyd i fosfat-bufret saltvann (PBS) å gjøre en siste konsentrasjon av 3,7% frisk før bruk i et 500 µL microcentrifuge rør. Overføre dissekert hjernen til microcentrifuge tube med fastsette løsning og ruge i 15 min på RT med milde rocking.
      Merk: Formaldehyd har en naturlig tendens til å bli oksidert, produsere maursyre. Derfor er det foreslått å aliquot 37% formaldehyd for lagring og fortynnet til 3,7% fersk før bruk. Over fiksering eller under fiksering påvirker integriteten til vev og fluorescens¹⁰.
   4. Vask 3 ganger med PBTx (PBS med 0,4% Triton X-100) i 15 min.
3. Utføre immunohistochemistry og montere prøver.
   1. Hvis antistoff flekker er nødvendig, fjerne PBTx, legger til primære antistoff fortynnet i PBTx med 5% normal geit serum og ruge på en aliquot mikser overnatting på 4 ° C.
   2. Fjern primær antistoff og vask 3 ganger med PBTx i 15 min. Legge til sekundære antistoff fortynnet i PBTx med 5% normal geit serum og ruge 1t på RT eller overnatting på 4 ° C. Vask 3 ganger med PBTx i 15 min.
   3. Hvis DAPI flekker er nødvendig, fjerne PBTx, legger DAPI løsning (lagerløsning: 5 mg/mL, fortynne til en fungerende konsentrasjon av 15 µg/mL i PBTx), og Inkuber i 10 min på RT. Wash 3 ganger med PBTx i 15 min.
   4. Fjerne vevet, plass en dråpe montering medium på midten av et mikroskopi lysbilde av ett lag av klart bånd på begge sider. Overføre hjernen på slipp av montering medium og vente på 1-2 min til hjernen blir gjennomsiktige. Fjern forsiktig montering mediet med en pipette.
   5. For å montere, Påfør en dråpe friskt montering medium på hjernen på lysbildet. Nøye overlappe et cover glass unngå bobler. Forsegle kantene med gummi sement, og air-dry på RT i 20 min. Fortsett å bildeopptak for best resultat.

3. image vinningen

1. Optimalisere mikroskop oppkjøpet parametere, inkludert romlig oppløsning, mål, zoom, skanning fart, og steg størrelse, maksimere oppløsning av strukturer rundt å lette halvautomatisk segmentering under bildeanalyser.
   Merk: Det kan være nyttig å fange et testbilde og teste halvautomatisk segmentering (i trinn 5 i denne protokollen) før imaging alle eksperimentelle prøver. På denne måten kan brukeren justere tenkelig innstillingene slik at analyseverktøy kan lett skjelne biologiske strukturen av interesse.
2. Juster bilde detektor kontrollene for å fange den høyeste signal-til-støy-forhold og høyeste dynamisk område av prøven.
   1. Bruk en LUT (se tabellen) som angir pixel metning (eksponering for høy) eller undersaturation (forskyvning for lav) mens du justerer innstillingene (figur 3B, rød betyr pixel metning av en Hi/Lo LUT).
   2. Kontroller gevinst og forskyvning innstillinger som gjelder for alle eksperimentelle grupper, som eksperimentelle manipulasjoner sannsynlig endrer strukturen på interesse.
      Merk: Det er viktig at de samme innstillingene brukes for alle grupper gjør en kvantitativ sammenligning.
3. Bildet gjennom vev å fange alle data.
   Merk: Det anbefales å fange alle tilgjengelige data i en tenkelig økt og for å definere en mer presis området under ROI utvalg i trinn 4 hvis nødvendig.
4. Lagre bildet som filtype støttes av tenkelig programvare for å bevare metadata som anskaffelse og de romlige kalibrering. Lagre bildet med et filnavn inkludert eksperimentelle dato, genetisk bakgrunn og fluorescerende journalister, antistoffer eller fargestoffer tilsvarer kanaler skannet for eksempel [forsøksgruppen navn] _ [prøven navn] _ [eksperiment dato] _Ch1. [Fluorophore-mål /Dye]_Ch2.[Fluorophore-Target/Dye], osv.

4. Fiji/ImageJ bilde Import og Avkastningen utvalg

1. Åpne et bilde i Fiji. Bruke dialogboksen "Bio-formater Import Options", velg "Vis stabel med: Hyperstack" og "fargemodus: gråtoner".
   Merk: Det anbefales å åpne hvilken mikroskopet filen som metadata som romlig kalibrering kan leses av Fiji.
2. Identifiser et område fra et enkelt z-fly eller en projeksjon basert på markør kanalen eller som kan brukes som en standardisert avkastning over prøver (figur 1, ROI utvalg).
   1. Bruk "C" rullefeltet til å vise kanalen eller brukes til å fange marker(s) angitt i trinn 1.1.
   2. Bruk "Z" rullefeltet til å flytte gjennom fokal flyene. Velg en enkelt skive eller opprette en projeksjon av flere stykker ved å klikke "bilde | Stabler | Z-prosjektet"og sette"Start del"og"Stop del"å omfatte Avkastningen.
      Merk: Angi hvilken "projeksjon" til "Max intensitet" i "Z prosjektet" dialogboksen er ofte best egnet for å fremheve strukturer for segmentering i § 5 om dette ikke kan være passende for alle programmer. Hvis en annen type projeksjon kreves for analyse, ta vare å bevare og dokumentere denne filen slik egenskapsuttrekking i punkt 6 og/eller 7.
   3. Generere et nytt bilde som inneholder kanalen eller og fokal plane(s) rundt å forenkle fremgangsmåten i bildet analyse protokollen. Velg "bilde | Duplisere", angi ønsket"kanaler"(c) og"Stykker"(z), og endre filnavnet for å gjenspeile utvalget (f.eks, [forsøksgruppen navn] _ [prøven navn] _ [eksperimenter date]_[Channel(s)]_[z-plane(s)]).
3. Bruk en av "utvalg verktøy" på verktøylinjen Fiji manuelt velge en standardisert avkastning basert på utvalgskriterier i trinn 4.2.
4. Legge til Avkastningen Avkastningen manager ved å klikke "analyser | Verktøy | ROI Manager "og klikk"Legg til"på Avkastningen Manager-menyen. Lagre Avkastningen menyen ROI Manager ved å klikke "mer | Lagre", og deretter navnet på filen å reflektere Avkastningen (f.eks, [forsøksgruppen navn] _ [prøven navn] _ [eksperiment dato] _ [kanalen eller] _ [z-plane(s)] _ [ROI beskrivelse]).
   Merk: Dette kan åpnes i Fiji for senere analyser eller kan brukes på andre kanaler eller bilder i del 5.3.

5. forbehandling og segmentering med h-maxima Watershedding

1. Utføre forbehandling på kanalen brukes til å fange strukturer rundt.
   1. Hvis bildefilen består av flere kanaler, skille kanalene ved å klikke "bilde | Farge | Split kanaler"isolere kanalen av interesse.
   2. Bruke et filter som en median filter for å redusere støy eller Gaussuklarhet for utjevning ved å klikke "prosess | Filtre | Filtertype"(f.eks"Median Filter"eller"Gaussian Blur").
      1. Smak forskjellige filtre og filtrere parametere på bilder fra hver forsøksgruppen. Fortsett gjennom trinn 6.2 med et representativt eksempel fra hver gruppe du segmentering ytelse. Velg filter og innstillinger som letter segmentering av strukturer rundt.
   3. Ta opp filteret og innstillinger. Bruk disse parameterne over eksperimentell grupper.
   4. Lagre en kopi av bildet som en tiff-fil inkludert filtrering for referanse. Bruke en detaljert navnet som [forsøksgruppen navn] _ [prøven navn] _ [eksperiment dato] _ [kanal] _ [z-plane(s)] _ [Filter parametere].
2. Utføre segmentering av strukturer rundt med interaktive h-maxima vannskille verktøyet på preprocessed bildet generert og lagret i trinn 5.1.
   1. Med preprocessed bildet i Fiji, starte verktøyet h-maxima interaktive vannskille ved å klikke "SCF | Merking | Interaktive H_Watershed".
      Merk: Denne plugin først beregner vannskillet og deretter tillater brukeren å undersøke effekten av lokale maxima og terskelen alternativer på segmentering gjennom en øyeblikkelig oppdatert utgang for bilde.
   2. Fra kontrollpanelet, justere frø dynamics (h), intensitet terskelen (T) og topp flom (%) for å optimalisere segmentering.
      Merk: Alltid referere til de raw bildet før forbehandling fra delen 4.2 manuelt kontrollere ytelsen til segmentering av strukturer rundt.
   3. Når fornøyd med segmentering resultater, velger "Eksporter regioner maske" og velge "Export". Dette vil generere en binære bilder av vannskille resultater (figur 1, segmentering).
   4. Registrere parameterne segmentering; disse må brukes på eksperimentell grupper for kvantitative sammenligninger. Lagrer binære resultater masken hvis ønskelig for referanse segmentering parametere i navnet for eksempel [forsøksgruppen navn] _ [prøven navn] _ [eksperiment dato] _ [kanaler] _ [z-plane(s)] _ [Filter parametere] _ [H_Watershed parametere].
3. Ekstra strukturer av interesse fra vannskille resultatene.
   1. Åpne lagrede Avkastningen fra trinn 4.4, ROI Manager. Med binære regioner masken fra trinn 5.2.4 aktive, velge Avkastningen fra avkastning manager bruke bildet begrense egenskapsuttrekking til standardiserte Avkastningen.
   2. Med Avkastningen aktiv på binære vannskille masken, velger du «analyser | Analysere partikler"med"Legge til Manager"valgt i dialogboksen å ekstra funksjoner.
      Merk: Denne ville sammenlegge en partikkel-ID for hver struktur avgrenset under segmentering til Avkastningen Manager. Er tilgjengelig på denne menyen til å utelate funksjoner basert på størrelse eller sirkularitet om nødvendig avgrense strukturer inkludert i analysen.
   3. Lagre partikler "mer | Lagre"Avkastningen manager-menyen. Kontroller at identifikatorer er deaktivert og alle partikler blir alle lagret i en zip-fil. Bruke en detaljert navnet som [forsøksgruppen navn] _ [prøven navn] _ [eksperiment dato] _ [kanaler] _ [z-plane(s)] _ [Filter parametere] _ [H_Watershed parametere] _ [strukturer].

6. antall, området og intensitet kvantifisering og analyse

1. Åpne rå bildet generert og lagret i trinn 4.2. Rull til kanalen brukes for å fange strukturer rundt.
   Merk: Det er viktig å ta intensiteten målinger fra rå bildet (før forbehandling) som bruker filtre i trinn 5.1 endringer pikselverdiene.
2. Åpne partikler fra egenskapsuttrekking i trinn 5.3 og velg "Vis alle" fra avkastning Manager.
   Merk: Denne handlingen vil overlappe en oversikt over hver partikkel på "Avkastningen Manager" på bildet og samsvare kantene av strukturer rundt (figur 1, egenskapsuttrekking).
3. Angi ønskede målene ved å klikke "analyser | Angi mål".
   Merk: Området, intensitet, og tetthet av partikler kan måles ved å velge "området" og "integrerte tetthet". Når integrert tetthet er valgt, Fiji vil produsere to verdier: 'Integrerte tetthet' beregnet som produktet av området og grå middelverdien og 'Raw integrerte tetthet' målt som summen av bildepunktverdiene. Tettheten av fluorescerende proteinet i partikler beregnes som summen av bildepunktverdiene delt på området. Antall partikler generert i trinn 5.3 angir antall partikler i vevet ROI definert under punkt 4.4.
4. Velg "Tiltak" Avkastningen Manager-menyen. Resultatene er uttrykt i kalibrerte enheter som målingene hentes fra filer avledet Fiji fra tenkelig programvare. Kopiere resultatene fra resultatvinduet og lim inn regnearkprogram for sammenstilling og ytterligere beregninger.

7. Ratiometric kvantifisering og dataanalyse

1. Fremgangsmåten 6.1 og 6.2 åpne partikkel identifikatorer på første rå kanalen av interesse.
2. Angi ønskede målene ved å klikke "analyser | Angi mål".
   Merk: Gjennomsnittlig intensiteten per partikkel kan måles ved å velge "Mener grå verdi".
3. Fra avkastning Manager Velg "Tiltak". Kopiere data fra resultatvinduet og lim inn regneark.
4. Flytte "C" rullefeltet til den andre rå kanalen av interesse, GFP i dette eksemplet (figur 4A), og gjenta trinn 7.2. og 7.3.
   Merk: Partikler lagret i trinn 5.3 standard kanalen og skive som det ble generert. Ta vare for å sikre partikler brukes til riktig kanal rundt.
5. Beregne forholdet mellom intensiteten kanal til intensiteten av andre for hver partikkel i regneark programvaren.
6. Bruk et spredningsdiagram å visualisere og kvantifisere ratiometric data fra fluorophores som viser individuelle endringer fra underliggende biologiske prosesser.
   1. Generere et spredningsdiagram i grafisk programvare.
      Merk: Hvert datapunkt representerer en interesse hvor intensiteten av den første fluorophore av interesse er "x-verdien" og intensiteten av den andre fluorophore er "y value" målt fra hver partikkel.
   2. Angi gating terskler for hver fluorophore definere kvadrantene.
7. Bruk linje-profilen for å visualisere fluorophore intensitet over en struktur av interesse.
   1. Velg en avkastning generert i trinn 5.3 og bruke verktøyet lineær på verktøylinjen til å tegne en rett linje gjennom Avkastningen. Legge til linjen avkastning til Avkastningen Manager.
   2. For hver kanal av interesse, med linjen ROI aktiv, velger du «analyser | Plott profil".
      Merk: Tomten profilen funksjonen vil generere et histogram plott og en tabell med verdiene i intensiteten langs linjen. Kopiere resultatene målt fra hver kanal og lime inn regnearkprogram generere et plott viser begge kanaler langs linjen.

Representative Results

Kvantifisering av antall, område og intensitet av fluorescently merket mutant Htt samler i Drosophila optikk flik

Undersøke misfolded protein kontonumre i sentralnervesystemet Drosophila modell av Huntingtons sykdom, RFP-merket mutant menneskelige Htt med ikke-patologisk (UAS-RFP-hHttQ15) eller patologisk utvidelse ( UAS-RFP-hHttQ138) og membran GFP (UAS-mCD8::GFP)¹¹ var co uttrykte under en pan-nevrale driveren elav-GAL4. Hjernen til kvinnelige fluer 2 dager etter eclosion (DAE) ble dissekert, fast og farget med DAPI i henhold til § 2 i protokollen. AC confocal mikroskopi for laserskanning ble utført med optikk lobe med en 40 X olje nedsenking linsen, 1,30 numeriske blenderåpning (NA), bruke en skanning fart av 8.0 µs per piksel og romlig oppløsning på 1024 x 1024 piksler (12 bits per piksel). Den optimale trinn størrelsen etter bildebehandlingsprogramvare var 1,08 µm per stykke for målsettingen med følgende kombinasjon av eksitasjon/utslipp bølgelengder: kanal 1) 488/510 for GFP og kanal 2) 543/581 for RFP kanal 3) 405/461 for DAPI. Bilde detektor innstillingene gjelder for alle grupper til å ta bilder egnet for sammenligninger, var basert på en RFP-Htt-Q138 prøven, som akkumuleres høy intensitet RFP-Htt aggregater, i stedet for en ikke-patogene RFP-Htt-Q15 kontroll prøven, som opprettholder lave nivåer av diffus RFP-Htt (figur 2). Hvis Bildeinnstillinger oppkjøpet var maksimere det dynamiske spekteret av en RFP-Htt-Q15, ville deretter RFP-Htt-Q138-aggregater være mettet. Som et eksempel, ble et mikroskop-bilde av protein aggregering i Drosophila optikk flik lagret som HttQ138_Opticlobe.01_01012018_Ch1.RFP-Htt_Ch2.GFP_Ch3.DAPI.

Det hele optikk lobe ble fotografert under mikroskopi og besto av rundt 15 z-skiver, men etter bildebehandling ble det fastslått at analysere et enkelt z-fly var best å oppløse individuelle strukturer som ellers synes overlappende i en projeksjon grunn den høy tetthet i vevet. For å bestemme en standardisert avkastning, ble C2 og C3 celle likene ligger mellom margen og lobula platen av optikk lobe¹² brukt som en anatomisk landemerke. Fiji, bildet ble dermed duplisert for å gjenspeile kravene analyse og ble lagret som en tiff-fil kalt HttQ138_Opticlobe.01_01012018_Ch1.GFP_Ch2.RFP-Htt_Ch3.DAPI_z8, der z8 gjenspeiler den åttende del der C2 og C3 neuronal cellen legemer var mest fremtredende ved DAPI flekker (figur 1A, bildeopptak). Utvalg polygonverktøyet ble brukt til å velge manuelt en avkastning rundt optikk lobe med DAPI flekker og neuronal GFP signalet som en guide (figur 1A, ROI utvalg, der gult angir Avkastningen og rødt angir forstørring bildet vises for klarhet i følgende paneler av arbeidsflyten). Deretter ble en Gaussian Blur filter med σ salgsverdi sette å 1 brukt på RFP-Htt kanal å glatte bildet og lette segmentering (figur 1A, forbehandling) og nedstrøms segmentering og egenskapsuttrekking med og uten dette forbehandling trinn er illustrert i figur 1A. Interaktiv H-vannskille ble utført på bilder av RFP-Htt kanalen med følgende parametere: frø dynamikk, 30; intensitet terskel, 500; topp flom (i %), 80, med 'tillate deling' og 'eksportere regioner maske' valgt (figur 1A, segmentering). Resulterende binære regioner masken ble lagret som HttQ138_Opticlobe. 01_01012018_Ch2.RFP-Htt_z8_GuassianBlur-sigma1_HWatershed-h30_T500_80percent og brukes til å generere partikler med verktøyet analyser partikler med en minimum størrelse utelukkelse av 0,4 µm² å definere protein aggregater^13,14 . Den resulterende partikler ble lagret fra avkastning manager som HttQ138_Opticlobe.01_01012018_Ch1.RFP-Htt_z8_GuassianBlur-sigma1_HWatershed-h30_T500_80percent_aggregates og ble brukt på rå RFP-Htt kanalen (før forbehandling) for å pakke ut kvantitative bildebehandling data (figur 1A, egenskapsuttrekking).

Kvantifisering av antall halvautomatisk segmentert RFP-Htt aggregater fra standardiserte focal fly gjennom optikk flik av Drosophila avslørte diffus uttrykk av ikke-patogene Htt-Q15 og akkumulering av protein aggregater av sykdomsfremkallende Htt-Q138 (figur 2A-C). Summen av alle bildepunktverdiene i hver partikkel gitt av "Rå integrert tetthet" ble brukt for å sammenligne RFP-Htt innholdet i hver samlet. Størrelse og intensitet profiler av alle aggregater fra en standardisert fokalplanet av fem forskjellige optikk lobes uttrykke Htt-Q138 illustrerer robusthet og reproduserbarhet av arbeidsflyten (figur 2D, E). Spesielt når aggregater ble overeksponert under bildeopptak (figur 3A, B), kvantifisering av størrelse og antall aggregater er sammenlignbare med aggregater tatt med perfekt eksponering (Figur 3 c, D), men intensiteten av de overeksponerte aggregatene blir en funksjon av størrelsen som mettet piksler viser maksimal intensitetsverdien (figur 3E, F). Sette opp aktuelle skanning eksponering parametere er derfor viktig å trekke ut hele spekteret av kvantitative molekylær sammensetningen av protein aggregater.

Ratiometric-baserte kvantifisering av autophagy forandring i Drosophila visuelle lamina bruker tandem fluorescerende Atg8a reporter

For å vurdere autophagy-lysosome forandring i Drosophila visuelle systemet, mCherry-GFP-Atg8a reporter ble overalt uttrykt kontroll eller Drosophila spermine syntase (dSms) homozygous mutant (dSms^e/e) flyr med Utgangen-GAL4 -driver. dSms^e/e flyr utstillingen neurodegeneration som er forbundet med nedsatt autophagic forandring på grunn av lysosomale dysfunksjon¹⁵. Hjerner med vedlagte lamina kvinnelige fluer på 5 DAE ble dissekert, fast og farget med DAPI. Lamina ble avbildet av laserskanning AC confocal mikroskopi med en 100 X olje nedsenking linsen, 1.35 numeriske blenderåpning (NA), på en sampling hastighet på 8.0 µs per piksel og 12 biter per piksel optisk oppløsning og steg størrelse på 1,2 µm.

Denne analysen ble utført på en maks z-projeksjon av syv z-skiver gjennom lamina å øke prøvetaking makt av sparsommelig Atg8-positive strukturer (figur 1B, bildeopptak). Standardisert Avkastningen ble manuelt trukket med polygon markeringsverktøyet rundt celle kroppen laget avslørt av DAPI og basert på godt karakterisert anatomi og mobilnettet organisasjon av vev (figur 1B, ROI utvalg, der gult angir den Avkastning og rødt angir forstørring bildet vises for klarhet i følgende paneler av arbeidsflyten)¹⁶. Tandem reporteren avhengig stabilitet egenskapene for GFP og mCherry moieties merke progresjon gjennom autophagy-lysosome veien, slik at GFP er slukket av surheten i lysosome der mCherry forblir inntil det er degradert. Den longer-lived mCherry fluorophore ble derfor brukt segmentering i denne protokollen. En Gaussian Blur filter med σ verdien 1 ble brukt til mCherry kanal (figur 1B, forbehandling), og interaktive H-vannskille ble utført med følgende parametere: frø dynamikk, 0; intensitet terskel, 800; topp flom (i %), 90; med 'tillate deling' og 'eksportere regioner maske' valgt (figur 1B, segmentering). Resulterende binære regioner masken ble brukt til å generere partikler med verktøyet analyser partikler. Den resulterende partikler ble brukt til både rå mCherry og rå GFP kanaler (før forbehandling) for å trekke ut kvantitative ratiometric data fra autophagy-lysosome rom (figur 1B, egenskapsuttrekking).

Visuell inspeksjon av mCherry-GFP-Atg8-positiv strukturer angitt berikelse i regionen celle kroppen av lamina, samsvar med tidligere rapporter av retrograd transport av autophagic blemmer til selve cellen i neurons¹⁷. Tomten profilen ble brukt til å visualisere mCherry og GFP intensitet på tvers av flere Atg8-positive strukturer (se linjen ROIs i figur 4A og resulterende intensitet profiler langs linjen i figur 4B), avslørende forskjeller i reporteren hvor høy intensiteten i begge fluorophores angir autophagosomes (figur 4B3), høy mCherry og lav GFP angir sammensmelting med lysosome GFP er slukket i denne Sure rom (figur 4B1), og til slutt lav mCherry gjenspeiler fornedrelse i lysosome (figur 4B2). Et spredningsdiagram generert fra mener fluorophore intensiteten av hver halvautomatisk segmentert mCherry-Atg8-positiv partikkel illustrerer flux gjennom autophagy-lysosome sti som ble deretter delt inn i separate trinn av kvadrant analyse ( Figur 4C). Handlingen ble delt i fire quadrants bruker gating terskler av GFP = 570, mCherry = 1800. Grensene ble sett basert på kontrollgruppen bruker de følgende prinsippene: (1) utformingen av tandem fluorescerende reporteren og egenskapene til de to fluorophores, så som teoretisk GFP bør ikke fluoresce der det er ingen mCherry signal (kvadrant IV), og (2) fordelingen av Atg8-positive partikler gjenspeiler distribusjon av autophagy-lysosome sti-relaterte rom i vill-type neurons der basale autophagy er svært effektiv^18,19. I laminas av kontroll fluer, rundt 25% av Atg8-positive partikler binned som autophagosomes (kvadrant jeg), og halvparten av puncta behandles utover autophagosome-lysosome fusion (kvadrant II og III); dSms^e/e laminas hadde betydelig økt autophagosomes eller dysfunksjonelle lysosomer (kvadrant jeg) og redusert autolysosomes (kvadrant II og III), suggestiv av autophagosome akkumulering gjennom mangler i autophagosome-lysosome fusion og/eller lysosomale degradering (Figur 4 C, D). Kvantitative data støttes også åpenbare opphopning av Atg8-positive strukturer i lamina fra dSms^e/e fluer (figur 4E). Ratiometric analyse av gjennomsnittlig mCherry og GFP signal markert forskjell kontroll og dSms^e/e gruppe (figur 4F) men kunne ikke detalj total påvirkning på veien eller fremgangsmåten avslørt av den kvadrant analyse.

Figur 1: Arbeidsflyten gjennom bias-minimert, semi-automatisert segmentering av subcellular strukturer i Drosophila hjernen Fiji med eksempler. (A) representant AC confocal micrographs fra enkelt fokalplanet gjennom optikk flik av en Drosophila voksen hjernen uttrykke panorere neuronal RFP-merket mutant Htt og membran målrettede GFP (elav-GAL4 > UAS-mCD8:GFP, UAS-RFP-hHttQ138) med DAPI flekker (Image acquisition). DAPI og GFP ble brukt til å velge en avkastning (gul) rundt optikk lobe; rød boks angir regionen forstørret arbeidsflyten for klarhet (ROI utvalg). Forbehandling panelet viser forstørring av ømt punkt image RFP-HttQ138 kanalen (øverst) og etter en Gaussian Blur filter, σ1 (nederst). Segmentering av interaktive h-maxima vannskille bruker angitt parameterinnstillingene for frø dynamics bestemmes av h-maxima (h), globale vannskille stopp kriterier fastsatt av intensitet terskelen (T), og regionale stopp kriterier fastsatt av peak flom ( %) utført på RFP-HttQ138 rå (øverst) og variabelt uskarpt (nederst) bilder og vannskille resultater fra regionene maske eksportert fra vannskille plugin og invertert klarhet. Partikler generert av analysere partikler (rosa) over RFP-HttQ138 raw-bilder (egenskapsuttrekking). Pilene angir Sammendrag som er over segmentert uten forbehandling og pilspisser angir strukturer som ikke klarer å skille etter filtrering. (B) representant AC confocal micrographs fra maksimal z-projeksjon av 7 fokal fly gjennom lamina kontroll og mutant (dSms^e/e) Drosophila voksen uttrykke allestedsnærværende GFP-mCherry-Atg8a (horisontal under utgangen-GAL4 > UAS-GFP-mCherry-Atg8) med DAPI flekker (Image acquisition). DAPI ble brukt til å velge en avkastning (gul) rundt celle kroppen laget av lamina; rød boks angir regionen forstørret arbeidsflyten for klarhet (ROI utvalg). Forbehandling panelet viser forstørring av mCherry kanal Gaussian Blur-filteret, brukes σ1 på både kontrollen og mutant lamina. Segmentering av interaktive h-maxima vannskille utføres på filtrerte mCherry bildene med angitte parameterinnstillingene, og vannskille resultatene vises som binære regioner maske invertert klarhet. Partikler generert av analysere partikler (rosa) over den rå mCherry og GFP bilder (egenskapsuttrekking). Skalere barer = 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2: kvantifisering av størrelse og intensitet av mutant RFP-Htt aggregater er robust og reproduserbar. (A-B) Drosophila hjerne med RFP-hHttQ15 (A) eller RFP-hHttQ138 uttrykk (B) under en pan-nevrale driveren elav-GAL4 ble dissekert og fast og optikk lobes ble fotografert av laserskanning AC confocal mikroskopi. Skala bar = 50 µm. (C) gjennomsnittlig antall mengdefunksjoner i hver gruppe kvantifisert fra en manuelt valgt avkastning rundt optikk lobe og fokusert på en standardisert z-SKIVE (n = 5). (D-E) Størrelse (D) og total intensitet (E) av RFP-hHttQ138-aggregater kvantifisert fra standardisert ROIs i optikk lobes av 5 forskjellige dyr. Samle data tegnes inn i logaritmisk skala. Aggregater ble definert som objekter som er større enn 0.4 µm² (stiplet linje i D). Statistisk analyse, enveis ANOVA, NS: ikke signifikant; a.u.: tilfeldig enhet Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3: Image overeksponering fører til unøyaktig intensitet målinger. (A-B) Representant AC confocal mikroskop-bilde av den samme optic lobe med perfekt eksponering (A) og overeksponering (B) pseudocolored med HiLo LUT i Fiji. Rødt i B angir overeksponert aggregat. Skala bar = 50 µm. (C) kvantifisering av samlede størrelsen etter implementering h-maxima vannskille parametere til å generere lignende segmentering resultater. Statistisk analyse, uavhengige utvalg t -test, NS: ubetydelig. (D) fordelingen av den samlede størrelsen i ideelle og overeksponerte bilder. Aggregater størrelse fra 5 til 25 µm² ble ytterligere binned i 4 kategoriske grupper. (E -F) Korrelasjon analyse av intensiteten av aggregatene som en funksjon av samlede størrelsen (E). Referanselinje som er tegnet (svart) når alle bildepunktene har maksimale intensitetsverdien 4095. Grønne boksen angir aggregater under 10 µm² området vises i F. b: regression koeffisient, R²: bestemmelseskoeffisient; a.u.: tilfeldig enhet Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4: Kvantifisering av tandem fluorescerende mCherry-GFP-Atg8a genetisk reporter avslører distinkte egenskaper av autophagic forandring i Drosophila. (A) representant AC confocal micrographs av Drosophila lamina fra kontroll og dSms^e/e mutant flyr overalt uttrykke mCherry-GFP-Atg8a (utgangen-GAL4 > mCherry-GFP-Atg8a) og farget for DAPI . Stiplet boksområdene på lamina celle kroppen laget vises i forstørring (høyre). Tall angir representant Atg8a-positive strukturer tegnet inn i B og kvantifisert i C. (B) histogrammet tegne fluorescens intensitet i vilkårlig enheter (AU) langs linjen ROIs i høy forstørrelse bilder i A. (C) mCherry-GFP-Atg8 strukturer plottet av mener GFP intensitet som en funksjon av gjennomsnittlig mCherry intensitet målt fra kontroll og dSms^e/e lamina (partikler målt fra 3 laminae fra hver gruppe). Handlingen ble delt i fire quadrants bruker gating terskler av GFP = 570 og mCherry = 1800 der strukturer i hver kvadrant angitt av genotype. ((D)) kvantifisering av mener prosenter av mCherry-GFP-Atg8 kategorisert i hver kvadrant i C (n = 3 lamina). ()E) kvantifisering av antall mCherry-GFP-Atg8 puncta per lamina (gjennomsnittlig ± SD, n = 3 lamina). (F) Ratiometric analyse av mCherry-GFP-Atg8 strukturer observert i kontroll og mutant fly lamina (mener med 95% CI, n = 3 lamina). Student t-test. P < 0,05, **P < 0,01. Sscale barer = 2 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Protokollen skissert her kan brukes å robust og reproduserbar quantitate celle biologiske prosesser visualisert ved fluorescens-basert bildebehandling. Biologisk sammenheng og tekniske begrensninger må nøye vurderes å veilede eksperimentell design. Fluorescerende markører av subcellular strukturer rundt, om immunohistochemical, fargebasert eller genetisk uttrykt, må være gjenkjennelig over bakgrunnen av morfologi og intensitet. UAS/GAL4 systemet er mye brukt til å drive målrettet genuttrykk i Drosophila. Eksemplene presenteres her brukt transgene linjer bærer GAL4 sjåførene for å aktivere transkripsjon av fluorescently merket proteiner under kontroll av UAS enhancer undersøke protein aggregering og autophagy i nervesystemet. Hvis samtidige uttrykket av en eksperimentell UAS transgene sammen med et fluorescerende reporter transgene, bør deretter kontrollgruppen også inkludere co-overuttrykte en inconsequential transgene kontroll for GAL4 dosering, for eksempel UAS-GFP eller UAS-lacZ. Standardisert utvalg forberedelse, er som skissert her for Drosophila sentralnervesystemet og visuelle systemet, fra disseksjon, fiksering, antistoff flekker, gjennom montering, avgjørende for optimal bildebehandling og kvantifisering.

God imaging praksis som maksimerer signal-til-støy-forhold og dynamisk område er nødvendig for semi-automatisert analyse og er avgjørende for nøyaktige sammenligninger mellom eksperimentelle grupper. Oppkjøpet bildeparametere bør angis slik at reporteren ikke er overeksponert slik at hele spekteret av protein intensitet kan hentes og kvantifisert (Figur 3). For kvantitative sammenligninger, skal imaging utføres med samme oppkjøpet parametere og helst på samme dag.

ROI utvalg, bildebehandling, funksjonen segmentering og egenskapsuttrekking ved hjelp av åpen kildekode-plattformen ImageJ/Fiji er program-avhengige; mens innledende parametere må defineres av brukeren, vil programmet over prøver minimere bias samtidig maksimere kvantitative data utgang. Det er viktig å nøye dokumentarbeidsflyt og anbefalt å lagre et bilde som en tiff-fil etter hvert trinn med filen navnet detaljering behandling. Dette kan være spesielt nyttig når du arbeider ut protokollen parametere for første gang og vil tjene som et referansepunkt for å sikre konsekvens mellom eksperimentelle grupper på hvert trinn i bildebehandling og analyse. ROI utvalgskriterier markører eller anatomiske landemerker bør defineres fra en kontrollgruppe, men bekymre burde være tatt å sikre at eksperimentelle manipulasjoner ikke endre markører eller landemerker på en måte som ville hindre pålitelig indikasjon på en standardisere avkastning. Et enkelt stykke eller en z-projeksjon av flere stykker kan velges beste ta målene for analysen, der en enkelt fokalplanet kan være nyttig å forbedre separasjon av nærliggende strukturer, og en z-projeksjon kan være nyttig for å analysere strukturer lokalisert over hele vev volumet. Z-projeksjon brukes for segmentering og bildeanalyse bør være forsiktig og uavhengig bestemmes. En maksimale intensitet projeksjon vil produsere et skarpt bilde, siden strukturer er smarteste i flyene der de er i fokus, og er vanligvis godt egnet for segmentering. Bildeanalyse kan være akseptabelt på en maksimal projeksjon, eksemplet autophagy-lysosome analyse; Atg8-positive strukturer er mindre enn trinn brukes for prøvetaking, dermed mest nøyaktig representert ved den maksimale intensiteten fra eneste fokalplanet som de ble tatt. Men for analyse av strukturer større enn trinn, kan en sum-projeksjon som legger alle pikslene med samme xy-koordinater mer nøyaktig representere intensitet informasjon om hver struktur. Mens denne protokollen er designet for å analysere et enkelt stykke eller en z-projeksjon av flere sektorer i 2D, kan arbeidsflyten tilpasses lett å analysere 3D strukturer i en z-serien ved hjelp av flere av de samme verktøyene. 3D Analyser ville være ønskelig for en liten utvalgsstørrelsen av uregelmessig formet strukturer, der en z-sektoren som skjærer skrått strukturen ville skew analysen.

Forbehandling med et filter, som foreslått i denne protokollen, kan redusere støy mens kanter for å hjelpe oppdagelsen av strukturer rundt under segmentering, beholdes bakgrunn støy og fluorescerende markør inhomogeneity uten tilstrekkelig utjevning vil føre over segmentering, mens innstillinger som mye uskarphet fjerner detaljer og hindre nøyaktig kantregistrering. Segmentering av vannskille vurderer bildet som en topografiske overflate med en vannkilde på lokale maxima, høy intensitet bildepunkter i et fluorescerende bilde-som flommer til den møter nabolandet oversvømte områder der en dam, eller segmentet grensen er bygget²⁰. H-maxima vannskillet bruker en brukerdefinert grense (h-maxima dynamikken i SCF-MPI-CBG plugin) å skille meningsfull lokale maxima for å unngå over segmentering av strukturer som ikke har en unik lokal maksimal²¹. Interaktiv h-maxima vannskille plugin implementert i denne protokollen lar brukeren justere h-maxima dynamics (h), globale vannskille stopp kriterier fastsatt av intensitet terskelen (T) og regionale stopp kriterier fastsatt av topp flom (%), mens umiddelbart viser vannskille resultater på en utgang for bilde kvalitativt evaluere segmentering ytelse. Segmentering resultater vil nøye enig med de fleste struktur grenser, selv om både over segmentering og ufullstendig separasjon (figur 1A, røde piler i egenskapsuttrekking) kan oppstå hvor fluorescerende merking er ikke-homogen eller vev er forurenset. Effektiviteten av semi-automatisert segmentering og analyse trinnene kan utnyttes til å øke prøvetaking makt og redusere segmentering fallgruvene.

Etter segmentering og egenskapsuttrekking er det enkelt å trekke ut morfologiske informasjon som området, dimensjoner og sirkularitet. Videre, hvis bilder er samlet riktig for å unngå overeksponering, molekylære informasjonen kan også være avledet fra denne bildeanalyser av intensitet målinger. Når tiltak av nevrodegenerative sykdommer patologi er pakket ut og kvantifisert ved denne tilnærmingen, kan disse tiltakene brukes til en rekke viktige spørsmål. Spesielt har protokollen vist potensial til å bruke bildeanalyse og måling av protein aggregater for å identifisere faktorene som påvirker protein aggregering og koordinere fordelingen, antall, størrelse og protein tetthet av aggregater med neuronal dysfunksjon og organismebiologi helse. Ratiometric-baserte kvantifisering kan brukes å informere samlet interaksjon med subcellular komponenter eller prosesser under sykdomsprogresjon. Mens biokjemiske og flowcytometri er brukt for å analysere samspillet av aggregater og andre subcellular strukturer, celle lysis kan føre til tap av protein, endre samlet egenskaper og forstyrre protein-protein interaksjoner²². mCherry-GFP-Atg8 har vært mye brukt til å overvåke autophagy gjennom fluorescens mikroskopi, spesielt i kulturperler celler²³, men upartisk og kvantitative analytiske metoder er mangler. Videre i vivo analyse bruker genetisk kodet tandem reporteren er utfordrende og krever kontrollerte genetisk bakgrunn og vev forberedelse. Denne protokollen skisserer bekreftet methodology fra vev forberedelse i imaging praksis kritisk å kvantifisere autophagy-lysosome rom. Med god genetisk praksis, bildet analyse tilnærminger inkludert Atg-positive partikkel intensitet profiler og kvadrant analyse med gating av personlige fluorescerende signaler, har råd til kraftig gjenkjenning og sammenligning av normal og patologiske autophagic forandring i vivo i variert sykdom modeller.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SYLGARD(R) 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning Corporation	PF184250	Dissection dish
Falcon 35 mm Not TC-Treated Easy-Grip Style Bacteriological Petri Dish	Corning	351008	Dissection dish
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-20	Dissection tool
Sodium Chloride	Sigma	S3014	PBS solution
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma	S5136	PBS solution
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma	P5655	PBS solution
Triton X-100	Sigma	T9284	Washing and antibody incubaton solution.
37% Formaldehyde	VWR	10790-710	Fixation
Disposable Microcentrifuge Tubes (0.5mL, blue)	VWR	89000-022	Fixation, washing, and antibody incubaton.
Plain and Frosted Micro Slides (25×75mm)	VWR	48312-004	Slides for confocal imaging
Micro Cover Glasses, rectangular (22×40mm)	VWR	48393-172	Slides for confocal imaging
Rubber Cement	Slime	1051-A	Mounting
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories, Inc.	H-1000	Mounting
Scotch Magic 810 Invisible Tape (19mm×25.4m)	3M Company	810	Mounting
Normal Goat Serum	Thermo Fisher Scientific	PCN5000	Antibody incubaton
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Thermo Fisher Scientific	D1306	Nucleic acid staining. Dissolve in deionized water to make a 5 mg/mL stock solution and store at -80°C. Dilute to a working concentration of 10-20 μg/mL in PBTx.
3.5X-90X Stereo Zoom Inspection Industrial Microscope	AmScope	SM-1BNZ	Dissection scope. Equipped with 6W LED Dual Gooseneck Illuminator
ImageJ/Fiji	NIH	v1.51u	With SCF_MPI_CBG plugins (version 1.1.2)
FV1000-IX81 Confocal-laser Scanning Microscope	Olympus
Recombinant Construct	Bloomington Drosophila Stock Center	BL37749