Summary
我们开发了一个简单且适应性强的工作流, 从荧光成像的细胞生物学研究中提取定量数据自噬性果蝇模型中中枢神经系统蛋白质聚集和通量变性.
Abstract
随着神经退行性疾病患病率的上升, 了解导致神经元功能障碍和丧失的潜在病理生理学越来越重要。基于荧光的成像工具和技术能够对亚细胞神经生物学过程进行空前的分析, 但仍然需要有无偏见、可重现和易于获取的方法来从成像研究中提取量化数据。.我们开发了一个简单而适应的工作流程, 从荧光成像研究中提取定量数据, 利用果蝇模型变性。具体来说, 我们描述了一个易于跟踪, 半自动化的方法, 使用斐济/ImageJ 分析两个细胞过程: 首先, 我们用荧光标记突变体量化果蝇光学叶中蛋白质的总含量和剖面。杭丁顿蛋白蛋白;第二, 我们评估果蝇视觉系统的自噬溶酶通量, 并以比例为基础, 对一个串联荧光报告器进行定量化。重要的是, 这里概述的协议包括一个半自动的分割步骤, 以确保所有的荧光结构进行分析, 以尽量减少选择偏差, 并增加微妙比较的分辨率。这种方法可以推广到分析其他细胞生物学结构和过程中涉及变性, 如蛋白质 puncta (应力颗粒和突触复合物), 以及膜约束的车厢 (线粒体和膜贩运囊泡)。该方法为图像分析和量化提供了一个标准化的、可适应的参考点, 并能促进整个领域的可靠性和重现性, 最终增强了对变性的机械理解。
Introduction
神经退行性疾病每年影响上百万人, 发病率随着人口老龄化1而增加。尽管每种神经退行性疾病都有一个独特的病因, 错误折叠蛋白的聚集和 proteostasis 网络的崩溃是许多这些疾病的常见病理特征。阐明这些基本和相互关联的过程的中断如何导致神经元功能障碍, 细胞死亡对于理解神经退行性疾病以及指导治疗干预是至关重要的。荧光成像技术允许对神经元的这些复杂和动态过程进行调查, 并极大地促进了我们对神经细胞生物学的理解。荧光标记蛋白的分析具有挑战性, 尤其是在体内进行实验时, 由于组织高度紧凑, 细胞类型多样, 形态学异质性。人工辅助量化是负担得起和直接的, 但往往是费时的, 并受人的偏见。因此, 需要有无偏见的、可重复的和易于获取的方法来从成像研究中提取量化数据。
我们概述了一个简单和适应性的工作流程使用斐济/ImageJ, 一个强大的和自由访问的图像处理软件2,3, 从荧光成像研究中提取定量数据的实验模型变性使用果蝇。通过遵循这一协议来量化蛋白质聚集和自噬性通量-两个细胞生物学特征, 这是高度相关的神经退行性疾病病理学-我们展示了敏感性和再现这种方法。荧光标记突变体杭丁顿蛋白 (Htt) 蛋白在果蝇视神经叶中的分析揭示了蛋白质聚集的数量、大小和强度。我们在果蝇视觉系统中可视化了自噬性通量的串联荧光记者, 它根据区划环境4显示不同的发射信号。比例分析的串联记者允许从 autophagosome 的形成, 成熟和运输到降解溶酶体的自噬溶酶通量的定量和全面的看法, 并进一步强调脆弱神经退行性疾病的车厢中断。重要的是, 在这两种分析中, 我们在协议中实现了半自动阈值和分割步骤, 以最大限度地减少无意识偏差, 增加采样功率, 并提供一个标准来促进类似研究之间的比较。简单的工作流旨在使强大的斐济/ImageJ 插件 (由计算机科学家根据数学算法开发) 更容易被 neurobiologists 和生命科学社区访问。
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Protocol
1. 图像分析实验设计的思考与准备
- 预先确定合适的解剖, 细胞, 或亚型标记, 以作为标志, 以标准化的兴趣区域 (ROI) 横跨不同的样本, 例如 4 ', 6-diamidino 2-苯基吲哚 (DAPI), 膜标记, 局部荧光蛋白等.
- 选择一个荧光标记, 它可以将离散 puncta 划分为兴趣结构以外的背景层。
注: 本协议是为蛋白质结构 (如错误折叠蛋白聚集) 和膜结合器 (如自噬记者) 进行优化的。为了可视化蛋白质聚集, 使用了一个 RFP 标记的 n-末端片段的人 Htt 蛋白与致病 polyQ 道138重复 (RFP-hHttQ138)5。突变 Htt 蛋白在神经元特异驱动物 (如elav-GAL45、6) 下表达时形成细胞质团聚体。为了形象化 autophagosome 溶酶体的通量, actin-GAL4被用来无所不在串联 mCherry-GFP-Atg8a 记者的驱动表达。mCherry 和 GFP 阳性 puncta 表明自噬体, 当 GFP 荧光在溶酶体酸性环境中被淬火时, 通量被监测, 酸不敏感的 mCherry 一直保持到蛋白质降解7。对于比例分析, 作为结构的一致标记的单个通道可以用于分割, 或者如果适当, 可以使用两个或多个通道的投影来描绘结构, 尽管本协议没有明确描述。在这个例子中, mCherry 是用于 Atg8-positive 粒子的分割, 因为它是酸不敏感的, 并将保持在车厢贯穿整个通路通量。 - 下载并安装开放源码图像分析平台 ImageJ 或斐济-ImageJ 的首选分布与捆绑的插件2,3。
- 为 h 极大交互分水岭安装插件。
注: 本议定书使用斐济;ImageJ 可能需要额外的插件。Benoit Lombardot 为超临界-MPI-CBG 开发的插件可在线提供 (https://imagej.net/Interactive_Watershed)。 - 导航到 "帮助 |更新 ", 选择" 管理更新站点 "从" ImageJ 更新程序 ", 从列表中选择" 超临界-MPI-CBG 更新站点 ", 然后关闭并重新启动斐济。
2. 脑解剖和免疫荧光染色
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做硅胶衬里的解剖碟。
- 将硅胶元件倒入烧杯中, 由制造商指示, 搅拌良好, 直至彻底混合。
- 用吸管填充5厘米组织培养皿1/3 至半满 (大约10毫升的弹性体混合物)。允许任何气泡上升到表面, 并用纸巾轻轻地移除。把盘子盖好, 放在一层表面, 在室温下 48–72 h。
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解剖果蝇的大脑和视觉系统, 如果需要的话。
- 执行果蝇大脑解剖, 如前所述8,9。在弹性衬里的解剖皿中进行解剖, 使用弹性体底部稳定大脑以避免损伤组织或镊子。
- 为了在解剖过程中保持叶片完好无损, 在视网膜下滑动两个钳, 轻轻地撕裂眼睛的中间, 以去除视网膜。用与椎板表面平行的镊子拔出附着在叶片上的任何视网膜组织。
注: 残留色素将在以下步骤洗涤, 通常不会干扰抗体染色和成像。 - 稀释37% 甲醛在磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 使最后的集中3.7% 新鲜之前使用在500µL 离心管。用固定溶液将解剖过的大脑转移到离心管, 在 RT 中孵育15分钟, 并进行轻柔的摇摆。
注: 甲醛具有天然的氧化倾向, 可产生甲酸。因此, 建议整除37% 甲醛储存, 并稀释到3.7% 新鲜之前, 每次使用。过度固定或不固定会影响组织的完整性和荧光10。 - 洗涤3次与 PBTx (PBS 与0.4% 海卫 X-100) 为15分钟每。
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执行免疫组化和装标本。
- 如果需要抗体染色, 去除 PBTx, 添加原抗体稀释在 PBTx 与5% 正常山羊血清, 并孵化在一个整除搅拌机过夜4摄氏度。
- 去除原抗体, 用 PBTx 洗3次, 每次15分钟。添加二次抗体稀释在 PBTx 与5% 正常山羊血清和孵育1小时在 RT 或隔夜在4摄氏度。用 PBTx 洗3次, 每人15分钟。
- 如果需要 DAPI 染色, 去除 PBTx, 添加 DAPI 溶液 (股票溶液: 5 毫克/毫升, 稀释到工作浓度的15µg/毫升在 PBTx), 并孵化10分钟在 RT. 每15分钟洗3次。
- 要清除组织, 请将一滴安装介质放到显微镜幻灯片的中心, 两侧有一层透明胶带的间隔。把大脑转移到安装培养基的下落上, 等到大脑变得透明时再等待。用吸管小心地取下安装介质。
- 要装入, 请将一滴新鲜的安装介质放到幻灯片上的大脑上。小心地覆盖一个盖子玻璃避免气泡。用橡胶水泥封边, 在 RT 上风干20分钟. 进行图像采集以获得最佳效果。
3. 图像采集
- 优化显微镜采集参数, 包括空间分辨率、目标、变焦、扫描速度和步长, 以最大程度地解决感兴趣的结构, 以便在图像分析过程中实现半自动化分割。
注意: 在对所有实验样本进行成像之前, 捕获一个样本图像并测试半自动分割 (在本协议的步骤5中) 可能很有用。这样, 用户就可以调整成像设置, 以便分析工具可以很容易地辨别出感兴趣的生物结构。 -
调整图像检测器控制, 捕捉最高的信噪比和最高的动态范围的标本。
- 在调整设置时, 请使用查找表 (查找表格), 指示像素饱和度 (曝光过大) 或钻井 (偏移过低) (图 3B, 红色表示由高/低的查找像素饱和度)。
- 验证增益和偏移设置适用于所有实验组, 因为实验操作可能会改变兴趣结构。
注意: 所有组都必须使用相同的设置进行量化比较。
- 图像通过组织捕获所有数据。
注意: 建议在一个映像会话期间捕获所有可用数据, 并在需要时在步骤4中的 ROI 选择过程中定义更精确的区域。 - 将图像保存为影像软件支持的文件类型, 以保留元数据 (如采集参数和空间校准)。保存图像的文件名包括实验日期、遗传学背景、荧光记者、抗体或与扫描的通道相对应的染料, 如 [实验组名称] _ [标本名] _ [实验日期] _Ch1. [荧光-目标/染料] _Ch2 [荧光靶/染料]等。
4. 斐济/ImageJ 图像导入和 ROI 选择
- 在斐济打开图像。使用 "生物格式导入选项" 对话框, 选择 "查看堆栈: Hyperstack" 并设置 "颜色模式: 灰度"。
注: 建议打开显微镜文件类型, 如空间标定等元数据可由斐济阅读。 -
从单个 z 平面或基于标记通道 (可用作跨样本的标准 roi) 的投影标识区域 (图 1, ROI 选择)。
- 使用 "C" 滚动条查看用于捕获步骤1.1 中指定的标记的通道。
- 使用 "Z" 滚动条在焦点平面中移动。选择单个切片或通过单击 "图像 |" 来创建多个切片的投影。栈 |Z 项目 "并设置" 开始切片 "和" 停止切片 "以包含 ROI。
注意: 将 " 投影类型" 设置为 "Z 项目" 对话框中的 "最大强度" 通常最适合强调5节中的细分结构, 尽管这可能不适用于所有应用程序。如果分析需要另一种类型的投影, 请注意保存并记录此文件, 以便在6和/或7节中提取特征。 - 生成包含感兴趣的信道和焦点平面的新图像, 以简化图像分析协议中的以下步骤。选择 "图像 |重复 ", 设置所需的" 通道 "(c) 和" 切片 "(z), 并更改文件名以反映所选内容 (例如, [实验组名称] _ [样本名称] _ [实验日期] _ [通道] _ [z 平面])。
- 使用斐济工具栏上的 "选择工具" 之一, 根据步骤4.2 中确定的选择标准手动选择标准化的 ROI。
- 单击 "分析", 将 roi 添加到 roi 管理器中。工具 |roi 管理器 ", 然后单击" roi 管理器 "菜单上的" 添加 "。单击 "更多 |", 从 "roi 管理器" 菜单中保存 roi保存 ", 然后命名该文件以反映 ROI (例如, [实验组名称] _ [样本名称] _ [实验日期] _ [频道] _ [z 面] _ [ROI 说明])。
注: 这可以在斐济重新开放, 以便以后进行分析, 也可以应用于5.3 节中的其他渠道或图像。
5. h 极大 Watershedding 的预处理与分割
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对用于捕获感兴趣结构的通道执行预处理。
- 如果图像文件由多个通道组成, 请通过单击 "图像 |" 来分隔通道。颜色 |分割渠道 ", 以隔离的渠道利益。
- 应用一个过滤器, 如中值过滤器, 以减少噪音或高斯模糊的平滑通过单击 "过程 |过滤器 |过滤器类型 "(例如," 中值滤波 "或" 高斯模糊 ")。
- 在每个实验组的图像上取样不同的过滤器和过滤器参数。从每个组中的一个典型示例开始步骤 6.2, 以检查分割性能。选择便于细分利益结构的筛选器和设置。
- 记录筛选器和设置。在实验组中应用这些参数。
- 将图像的副本另存为 tiff 文件, 包括应用的筛选器以供参考。使用详细名称, 如 [实验组名称] _ [样本名称] _ [实验日期] _ [通道] _ [z 面] _ [带参数的过滤器]。
-
在步骤5.1 中生成并保存的预处理图像上, 使用交互式的 h 极大值分水岭工具对感兴趣的结构进行分割。
- 利用在斐济的预处理图像, 通过点击 "超临界值" 来启动 h 极大交互分水岭工具;标签 |交互式 H_Watershed "。
注意: 这个插件首先计算分水岭, 然后允许用户通过一个即时更新的输出图像来探索局部极大值和门限选项对分割的影响。 - 从控制面板, 调整种子动力学 (h), 强度阈值 (T), 峰值洪水 (%), 以优化分割。
注: 在4.2 节预处理前, 请始终参考原始图像, 以手动检查感兴趣结构的细分性能。 - 当对分割结果满意时, 选择 "导出区域掩码" 并选择 "导出"。这将生成分水岭结果的二进制图像 (图 1, 分割)。
- 记录分割参数;这些参数需要在实验组中应用以进行定量比较。保存二进制结果掩码 (如果需要参考), 并在名称 (如 [实验组名称] _ [样本名称] _ [实验日期] _ [通道] _ [z 面] _ [H_Watershed 参数] _ 中详细描述了细分参数。
- 利用在斐济的预处理图像, 通过点击 "超临界值" 来启动 h 极大交互分水岭工具;标签 |交互式 H_Watershed "。
-
从分水岭结果中提取出感兴趣的结构。
- 在 ROI 管理器中打开步骤4.4 中保存的 roi。使用步骤5.2.4 活动中的二进制区域掩码, 从 roi 管理器中选择要应用于图像的 roi, 以将特征提取限制为标准化的 ROI。
- 利用 ROI 在二进制分水岭掩码上活动, 选择 "分析 |在对话框中选择 "添加到 Manager" 来分析粒子以提取特征。
注意: 这将为细分期间为 ROI 管理器划分的每个结构添加一个粒子标识符。此菜单上的选项可在需要时根据大小或循环来排除特征, 以细化分析中包含的结构。 - 通过单击 "更多 |" 来保存粒子从 ROI 管理器菜单中保存 "。确保取消选择标识符, 所有粒子都将保存在 zip 文件中。使用一个详细的名称, 如 [实验组名称] _ [样本名称] _ [实验日期] _ [通道] _ [z 面] _ [用参数过滤] _ [H_Watershed 参数] _ [结构]。
6. 数量、面积和强度的量化和分析
- 打开生成并保存在步骤4.2 中的原始映像。滚动到用于捕获感兴趣结构的通道。
注意: 从原始图像 (预处理前) 进行强度测量非常关键, 因为在步骤5.1 中应用滤镜会更改像素值。 - 打开步骤5.3 中从特征提取获得的粒子, 然后从 ROI 管理器中选择 "显示全部"。
注意: 此操作将将 "ROI 管理器" 上每个粒子的轮廓叠加到图像上, 并应匹配感兴趣结构的边缘 (图 1, 特征提取)。 - 通过单击 "分析 |" 来设置所需的度量值设置测量 "。
注意: 粒子的面积、强度和密度可以通过选择 "区域" 和 "集成密度" 来测量。当选择集成密度时, 斐济将产生两个值: "集成密度", 计算为区域的乘积和平均值的灰度值和 "原始集成密度", 测量为像素值的总和。荧光蛋白在粒子中的密度被计算为除以区域的像素值的总和。步骤5.3 中生成的粒子数表明步骤4.4 中定义的组织 ROI 中的粒子数量。 - 从 ROI 管理器菜单中选择 "度量"。只要测量是从图像软件中从斐济获得的文件中提取的, 结果就用校准单位表示。从结果窗口复制结果并粘贴到电子表格软件中进行编译和进一步计算。
7. 比例量化和数据分析
- 按照步骤6.1 和 6.2, 打开感兴趣的第一个原始通道上的粒子标识符。
- 通过单击 "分析 |" 来设置所需的度量值设置测量 "。
注: 通过选择 "平均灰度值" 可以测量每个粒子的平均强度。 - 从 ROI 管理器中选择 "度量"。从结果窗口复制数据并粘贴到电子表格软件中。
- 将 "C" 滚动条移至感兴趣的第二个原始通道, 此示例中的 GFP (图 4A), 然后重复步骤7.2。和7.3。
注意: 在步骤5.3 中保存的粒子将默认为生成它的通道和切片。注意确保粒子被应用到正确的感兴趣的通道上。 - 计算电子表格软件中每个粒子的强度与第二个通道强度的比值。
-
使用散点图可视化和量化来自显影的比例数据, 它们反映了潜在的生物过程的个人变化。
- 在图形软件中生成散点图。
注意: 每个数据点表示一个感兴趣的结构, 其中第一个荧光的强度是 "x 值", 第二个荧光的强度是从每个粒子测量的 "y 值"。 - 为每个荧光设置浇口阈值以定义象限。
- 在图形软件中生成散点图。
-
使用线条轮廓可视化的荧光强度跨结构的兴趣。
- 选择在步骤5.3 中生成的 ROI, 并使用工具栏上的直线工具通过 roi 绘制一条直线。将行 roi 添加到 roi 管理器中。
- 对于每个感兴趣的频道, 用行 ROI 活动, 选择 "分析 |剧情简介 "。
注意: 剧情剖面函数将生成一个直方图图和一个表的强度值沿线。复制每个通道测量的结果并粘贴到电子表格软件中, 以生成显示沿线的两个通道的图。
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Representative Results
果蝇荧光标记突变 Htt 集的数量、面积和强度的量化
为了研究亨廷顿氏病果蝇模型的中枢神经系统中的错误折叠蛋白聚集, 用 RFP 标记的突变体 Htt 非病理 (UAS-RFP-hHttQ15) 或病理扩张 (UAS-RFP-hHttQ138) 和膜 GFP (UAS-mCD8::GFP)11是共同表达下一个泛神经元驱动elav-GAL4。根据《议定书》2节的规定, 羽化 (DAE) 后2天的雌性苍蝇的大脑被解剖、固定, 并沾上了 DAPI。共聚焦激光扫描显微镜进行聚焦在光学裂片与40X 油浸泡物镜, 1.30 数字孔径 (NA), 使用扫描速度每像素8.0 µs 和空间分辨率的 1024年1024像素 (12 位每像素)。通过成像软件确定的最佳步长是1.08 µm 每片目标与以下组合的励磁/发射波长: 通道 1) 488/510 为 GFP, 通道 2) 543/581 为 RFP, 通道 3) 405/461 为 DAPI。图像检测器设置适用于所有组捕捉适合比较的图像, 是基于一个 RFP-Htt-Q138 标本, 它积累了高强度的 RFP Htt 骨料, 而不是一个非致病性的 RFP-Htt-Q15 控制标本, 它保持低浓度的漫射 RFP Htt (图 2)。如果将图像采集设置设置为最大化 RFP-Htt-Q15 试样的动态范围, 则 RFP-Htt-Q138 聚合将饱和。作为一个例子, 在果蝇视神经叶中蛋白质聚集的显微图像保存为 HttQ138_Opticlobe. 01_01012018_Ch1. Htt_Ch2 GFP_Ch3 DAPI。
整个光学裂片在显微镜下成像, 由大约 15 z 片组成, 但在成像后确定, 分析一个单一的 z 平面是最好的解决个别结构, 否则会出现重叠的投影, 由于组织内高密度。为了确定一个标准化的 ROI, C2 和 C3 细胞体之间的髓质和 lobula 板的视神经瓣12被用作解剖学地标。在斐济, 图像被复制以反映分析要求, 并被保存为一个名为 HttQ138_Opticlobe 的 tiff 文件 (01_01012018_Ch1 GFP_Ch2. Htt_Ch3 DAPI_z8, 其中 z8 反映了 C2 和 C3 神经元细胞体最主要的第八切片。突出的 DAPI 染色 (图 1A, 图像采集)。使用多边形选择工具, 使用 DAPI 染色和神经元 GFP 信号作为指南来手动选择光叶周围的 ROI (图 1A, roi 选择, 其中黄色表示 roi 和红色指定的高放大图像显示为工作流的以下面板中的清晰度)。其次, 将具有σ值设置为1的高斯模糊滤波器应用于 Htt 信道, 使图像平滑, 便于分割 (图 1A、预处理) 以及下游分割和特征提取的性能, 并无此预处理步骤如图 1A所示。对 Htt 信道的图像进行了交互式 H 分水岭, 其参数如下: 种子动力学, 30;强度阈值, 500;峰值洪水 (in%), 80; "允许拆分" 和 "导出区域掩码" 选定 (图 1A, 分割)。生成的二进制区域掩码保存为 HttQ138_Opticlobe。01_01012018_Ch2. RFP-Htt_z8_GuassianBlur-sigma1_HWatershed h30_T500_80percent 和用于产生粒子的分析粒子工具与最小尺寸排除0.4 µm2定义蛋白质集料13,14.产生的粒子从 ROI 管理器中保存为 HttQ138_Opticlobe. 01_01012018_Ch1 Htt_z8_GuassianBlur sigma1_HWatershed h30_T500_80percent_aggregates, 并应用于原始 RFP Htt 通道 (预处理前) 提取定量成像数据 (图 1A, 特征提取)。
从标准焦平面上的半自动分段 RFP-Htt 集的数量量化通过果蝇的光学瓣揭示非致病性 Htt-Q15 的扩散和蛋白质积累的弥散表达由致病的 Htt-Q138 膨胀引起的聚集 (图 2A-C)。用 "原始积分密度" 给出的每个粒子的所有像素值的总和用于比较各骨料的 RFP-Htt 含量。五个不同光学裂片的标准焦平面上的所有骨料的尺寸和强度剖面表示 Htt-Q138 说明了此工作流的鲁棒性和重现性 (图 2D, E)。值得注意的是, 当聚集在图像采集过程中过度曝光时 (图 3A, B), 粒度和骨料数量的量化与理想曝光的聚集物相媲美 (图 3C, D), 然而由于饱和像素显示最大强度值 (图 3E, F), 过度曝光的聚合强度成为大小的函数。因此, 建立适当的扫描曝光参数对于提取蛋白质集料的全部定量分子组成至关重要。
用串联荧光 Atg8a 比例定量测定果蝇视觉层中自噬通量的研究
为了评估果蝇视觉系统中自噬溶酶的通量, mCherry-GFP-Atg8a 报道无所不在在控制或果蝇胺合成酶(dSms) 合体突变体 (dSmse/e) 蝇中表达。与actin-GAL4司机。dSms 变性与自噬性通量障碍有关, 因为溶酶体功能障碍15。5 DAE 的雌蝇附着的脑部被解剖、固定, 并沾上 DAPI。采用激光扫描共聚焦显微镜, 用100X 油浸泡物镜、1.35 数值孔径 (NA), 采样速度为每像素8.0 µs, 每像素光学分辨率12位, 步长为1.2 µm。
这项分析是在最大 z 投影七 z 切片通过叶片, 以增加取样功率的稀疏 Atg8-positive 结构 (图 1B, 图像采集)。标准化的 ROI 是用多边形选择工具手工绘制的, 其周围是 DAPI 所揭示的细胞体层, 并基于组织的良好特征的解剖和细胞组织 (图 1B, ROI 选择, 其中黄色表示ROI 和红色在工作流的以下面板中指定了显示为清晰的高放大图像16。串联记者依靠 gfp 和 mCherry 基团的稳定性特性, 通过自噬溶酶途径来标记进展, 这样, 在 mCherry 残留的溶酶体酸性下, gfp 就会被淬火, 直到降解。因此, 在本协议中, 使用较长的 mCherry 荧光进行分割。采用σ值1的高斯模糊滤波器对 mCherry 通道进行了应用 (图 1B、预处理), 并利用以下参数进行了交互式 H 分水岭: 种子动力学, 0;强度阈值, 800;峰值洪水 (in%), 90; "允许拆分" 和 "导出区域掩码" 选定 (图 1B, 分割)。生成的二进制区域掩码用于用分析粒子工具生成粒子。所产生的微粒被应用于原始的 mCherry 和原始的 GFP 通道 (预处理前), 从自噬溶酶体的间隔提取定量比例数据 (图 1B, 特征提取)。
对 mCherry-GFP-Atg8-positive 结构的目视检查表明, 叶片细胞体区富集, 与以前报告的自噬性囊泡向细胞体的逆行转移17。剧情剖面用于可视化 mCherry 和 GFP 强度横跨几个 Atg8-positive 结构 (参见线 ROIs 在图 4A和导致的强度概要沿线在图 4B), 显露区别在记者那里高两个显影的强度表明自噬体 (图 4B3), 高 mCherry 和低 gfp 表明融合与溶酶, 当 GFP 在这个酸性的车厢淬火 (图 4B1), 最后低 mCherry 反映降解内溶酶体 (图 4B2)。由每个半自动分段 mCherry-Atg8-positive 粒子的平均荧光强度产生的散射图, 说明了通过象限分析分离成离散步骤的自噬溶酶通路的通量 (图 4C)。剧情被划分成四个象限, 使用 GFP 的门槛 = 570, mCherry = 1800。阈值是基于控制组使用以下原则设置的: (1) 串联荧光报告器的设计和两个显影的性质, 因此理论上 GFP 不应该荧光没有 mCherry 信号 (象限IV.) 和 (2) Atg8-positive 颗粒的分布反映了自噬溶酶体通路相关舱室在基底自噬效率高18,19的野神经元中的分布。在控制蝇的叶片中, 约有25% 的 Atg8-positive 粒子被作废为自噬体 (象限 I), puncta 的一半被处理在 autophagosome-溶酶体融合 (象限 II 和 III) 之外;dSmse/e 叶片显著增加自噬体或功能失调的溶酶体 (象限 I) 和减少 autolysosomes (第二象限和 III), 暗示 autophagosome 积累通过缺陷autophagosome 溶酶体融合和/或溶酶体降解 (图 4C, D)。定量数据还支持明显积累的 Atg8-positive 结构在叶片dSmse/e 苍蝇 (图 4E)。平均 mCherry 和 GFP 信号的比例分析突出了控制和dSmse 组之间的区别 (图 4F), 但不能详细说明对通路的总体影响, 也不能详述象限分析。
图 1: 通过以斐济为例, 通过对果蝇大脑中亚细胞结构进行偏置最小化、半自动分割的工作流.(A) 从单焦平面上的代表共焦显微照片, 通过果蝇成年脑的视神经, 表达泛神经元 RFP 标记的突变体 Htt 和膜靶蛋白 GFP (elav-GAL4 > UAS-mCD8:GFP,UAS-RFP-hHttQ138) 与 DAPI 染色 (图像采集)。DAPI 和 GFP 用于选择在视神经周围的 ROI (黄色);红色框表示通过工作流放大的区域 (ROI 选择)。预处理面板显示了 RFP-HttQ138 通道 (顶部) 的原始图像的高放大率以及高斯模糊滤波器 (σ1) 后的应用。利用 h-极大值 (h) 确定的种子动力学的参数设置, 用最大洪水量 (T) 确定的全球分水岭停止判据, 以及峰值驱确定的区域停车标准, 进行交互式 h 极大分水岭分割 (%) 执行的 RFP-HttQ138 原始 (顶部) 和高斯模糊 (底部) 图像, 和分水岭结果从区域掩码从分水岭插件导出和倒置, 以明确。通过对 RFP-HttQ138 原始图像 (特征提取) 上覆盖的粒子 (洋红) 进行分析而产生的粒子。箭头指示在不进行预处理的情况下进行过分割的聚合, 箭头表示筛选后无法分离的结构。(B) 以7个焦平面的最大 z 投影为代表的共焦显微图, 通过控制和突变体 (dSmse)果蝇成虫的水平段表示无处不在的 GFP-mCherry-Atg8a (actin-GAL4 > UAS-GFP-mCherry-Atg8)与 DAPI 染色 (图像获取)。DAPI 被用来选择一个 ROI (黄色) 周围的细胞体层的叶片;红色框表示通过工作流放大的区域 (ROI 选择)。预处理面板显示了高斯模糊滤波 mCherry 信道的高放大率, σ1用于控制和变异板。通过交互式 h 极大分水岭对经过筛选的 mCherry 图像进行分段, 并以指定的参数设置进行分割, 并将分水岭结果显示为二进制区域掩码以使其清晰。在原始 mCherry 和 GFP 图像 (特征提取) 上覆盖的粒子 (洋红) 所产生的粒子。刻度条 = 50 µm.请点击这里查看这个数字的大版本.
图 2: 对突变型 Htt 骨料的大小和强度进行量化, 具有较强的鲁棒性和重现性.(A-B)用 RFP-hHttQ15 (A) 或 RFP-hHttQ138 表达 (B) 下的果蝇大脑对elav-GAL4进行了解剖和固定, 并通过激光扫描共聚焦显微镜对光学裂片进行成像。刻度条 = 50 µm. (C) 每个组中的聚合体的平均数量由人工选择的 ROI 在视神经周围进行量化, 并侧重于标准化的 z 切片 (n = 5)。(DE)RFP-hHttQ138 集料的大小 (D) 和总强度 (E) 从标准的 ROIs 在5种不同的动物的光学裂片中进行量化。聚合数据以日志比例绘制。聚合被定义为大于0.4 µm2的对象 ( D中的虚线)。统计分析, 单向变异, NS: 不显著;天文单位: 任意单位请点击这里查看这个数字的大版本.
图 3: 图像过度曝光导致不准确的强度测量.(A-B)具有理想曝光 (A) 和过度暴露 (B) 的同一个光学叶的有代表性的共焦显微图像 pseudocolored 与在斐济的希洛的查找。B中的红色表示过度曝光的聚合。刻度条 = 50 µm.(C) 在实施 h 极大分水岭参数后, 对骨料大小进行量化, 以产生类似的分割结果。统计分析, 独立样本t检验, NS: 不重要。(D) 理想和过度曝光图像中总尺寸的频率分布。从5到25µm2的骨料在4个类别组进一步作废。(E F)骨料强度的相关分析 (E)。当所有像素的最大强度值为4095时, 绘制一条参照线 (黑色)。绿色方块表示在F中显示的聚集在10µm2区域以下。b: 回归系数, R2: 测定系数;天文单位: 任意单位请点击这里查看这个数字的大版本.
图 4: 对串联荧光 mCherry-GFP-Atg8a 基因报告的量化, 揭示了果蝇自噬性通量的显著特征。(A) 控制和dSms 突变蝇无所不在表达 mCherry-GFP-Atg8a (actin-GAL4 > mCherry-GFP-Atg8a) 和染色 DAPI 的果蝇叶片的共焦显微照片.板状细胞体层的虚线盒装区域以高倍放大 (右) 显示。数字表示在B中绘制的具有代表性的 Atg8a-positive 结构, 并在C中进行量化。(B) 沿直线 ROIs 在高放大图像中显示的任意单位 (AU) 中荧光强度的直方图图. (C) mCherry-GFP-Atg8 结构以平均 mCherry 强度为函数绘制的绿色荧光光谱图测量从控制和dSms 的e/e 叶片 (粒子测量从每组3叶片)。利用 GFP = 570 和 mCherry = 1800 的浇口阈值, 将该地块分成四象限, 以基因型表示的每个象限中的结构百分比。(D) 在 C (n = 3 叶片) 中对每个象限分类的 mCherry-GFP-Atg8 的平均百分比进行量化。(E) 量化每层 mCherry-GFP-Atg8 puncta 的数量 (平均 S.D., n = 3 叶片)。(F) 比例分析在控制和突变的飞行叶片中观察到的 mCherry-GFP-Atg8 结构 (指 95% CI, n = 3 叶片)。学生t测试。*p < 0.05, **p < 0.01。Sscale 酒吧 = 2 µm.请点击这里查看这个数字的大版本.
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Discussion
此处概述的协议可用于重现性定量细胞生物学过程的荧光成像。必须仔细考虑生物环境和技术限制, 以指导实验设计。荧光标记的兴趣, 无论是免疫组织化学, 染料基础, 或基因表达, 需要区分以上背景的形态学和强度。UAS/GAL4系统广泛应用于果蝇的靶向基因表达。这里的例子使用了携带 GAL4 驱动程序的转基因线激活荧光标记蛋白的转录在无人驾驶增强器的控制下, 以调查蛋白质聚集和自噬在神经系统。如果需要同时表达一个实验性的无人合作者转基因与荧光报告的转基因, 那么控制组也应该包括共同过度表达的无关紧要的转基因控制 GAL4 剂量, 例如绿色荧光蛋白或无人 lacZ。标准样品准备, 如这里概述果蝇中枢神经系统和视觉系统, 从解剖, 固定, 抗体染色, 通过安装, 是关键的最佳成像和量化。
良好的成像实践, 最大限度地提高信噪比和动态范围是半自动化分析的必要条件, 是最重要的是准确的比较实验组。图像采集参数应设置, 使记者不饱和, 使整个范围的蛋白质强度可以提取和量化 (图 3)。为了进行定量比较, 成像应使用相同的采集参数, 最好在同一天进行。
利用开源平台 ImageJ/斐济的 ROI 选择、图像处理、特征分割和特征提取是应用依赖的;当初始参数必须由用户定义时, 它们在样本中的应用将最大限度地减少偏差, 同时最大化量化数据输出。仔细记录工作流是非常关键的, 建议在每个步骤后将图像保存为 tiff 文件, 详细说明应用处理。这在首次计算协议参数时尤其有用, 并将作为参考点, 以确保在图像处理和分析的每个步骤中各实验组之间的一致性。使用标记或解剖地标的 ROI 选择标准应从对照组定义, 但应注意确保实验操作不改变标记或地标, 以防止可靠地指示标准化 ROI。可以选择单个切片或多个切片的 z 投影, 以最佳地解决分析的目标, 其中单个焦平面可用于改善相邻结构的分离, 而 z 投影可用于分析结构在整个组织体积内进行局部化。用于分割和图像分析的 z 投影类型应仔细、独立地确定。最大强度投影将产生一个尖锐的图像, 因为结构是最明亮的平面上, 他们的焦点, 通常很适合分割。图像分析可以在最大投影上接受, 如自噬溶酶分析的例子;Atg8-positive 结构小于用于取样的步长大小, 因此最准确地表现为从所捕获的唯一焦平面的最大强度。但是, 对于大于步长的结构的分析, 用相同 xy 坐标添加所有像素的求和投影可以更准确地表示每个结构的强度信息。虽然此协议是为分析2D 中多个切片的单个切片或 z 投影而设计的, 但工作流可以很容易地适应使用几个相同的工具在 z 系列中分析3D 结构。3D 分析将是可取的小样本尺寸不规则形状的结构, 其中 z 切片, 斜交结构将扭曲分析。
使用过滤器进行预处理, 如本协议中建议的那样, 可以减少噪声, 同时保留边缘以帮助在分割过程中检测感兴趣的结构;背景噪声和荧光标记不均匀性没有充分的平滑将导致过度分割, 而造成太多模糊的设置将删除细节和防止精确的边缘检测。分水岭分割将图像视为具有局部极大值的水源的地形表面--荧光图像中的高亮度像素--将其淹没, 直到它遇到邻近的被淹没的区域, 其中大坝或段边界是20建成的。h 极大集分水岭使用用户定义的阈值 (CBG 插件中的 h 极值动力学) 来区分有意义的局部极值, 以避免不具有唯一局部最大21的结构的过度分割。在本协议中实现的交互式 h 极大分水岭插件允许用户调整 h 极大值动力学 (h), 由强度门限 (T) 确定的全局分水岭停止标准, 以及由峰值驱确定的区域停止标准 (%), 而在输出图像上立即查看分水岭结果, 以定性地评估分割性能。分割结果将与大多数结构边界紧密一致, 虽然在荧光标记不均匀或组织是不完全分离 (图 1A, 特征提取中的红色箭头) 可能发生密集。可以利用半自动分割和分析步骤的效率来提高采样功率和减少分割陷阱。
在分割和特征提取之后, 提取面积、尺寸和圆度等形态学信息是很简单的。此外, 如果适当收集图像以避免过度曝光, 也可以通过强度测量从图像分析中推断出分子信息。一旦神经退行性疾病病理学的方法提取和量化, 这些措施可以用来解决一些重要的问题。具体地说, 该议定书显示了利用图像分析和量化蛋白质集料的潜力, 以确定影响蛋白质聚集的因素, 并关联分布、数量、大小和蛋白质密度的聚合体。神经功能障碍和生物体健康。比例的定量可用于通知与亚细胞成分或过程中的聚合相互作用的疾病进展。生物化学和流式细胞术用于分析聚合体与其他亚细胞结构的相互作用, 细胞裂解可导致蛋白质的丢失, 改变聚集特性, 扰乱蛋白质-蛋白质相互作用22。mCherry-GFP-Atg8 已被广泛用于监测自噬通过荧光显微镜, 特别是在培养细胞23, 但无偏见和定量分析方法缺乏。此外,在体内分析使用基因编码的串联记者是具有挑战性的, 需要高度控制的遗传背景和组织准备。该协议概述了从组织准备到成像实践的验证方法, 对于量化自噬溶酶体的间隔至关重要。通过良好的遗传实践, 图像分析方法包括 Atg-正粒子强度剖面和象限分析的单独的荧光信号, 可以提供强有力的检测和比较正常和病理自噬性在体内的多种疾病模型中的通量。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作是支持希拉和大卫恩特神经病理性疼痛研究计划研究生奖学金 (J.M.B.), 露易丝教皇生活研究员计划 (铁匠, Y.Z., 和 J.M.B.), 斯奈德-鲁滨逊基金会 Predoctoral 奖学金 (铁匠), 约翰博士 T.麦克唐纳基金会 (铁匠), 合同, 国家卫生研究院 (NIH) HHSN268201300038C, R21GM119018 和 R56NS095893 (R.G.Z.) 的赠款, 并由泰山学者项目 (山东省, 中华人民共和国) (R.G.Z.)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SYLGARD(R) 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | PF184250 | Dissection dish |
| Falcon 35 mm Not TC-Treated Easy-Grip Style Bacteriological Petri Dish | Corning | 351008 | Dissection dish |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dissection tool |
| Sodium Chloride | Sigma | S3014 | PBS solution |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | S5136 | PBS solution |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma | P5655 | PBS solution |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | Washing and antibody incubaton solution. |
| 37% Formaldehyde | VWR | 10790-710 | Fixation |
| Disposable Microcentrifuge Tubes (0.5mL, blue) | VWR | 89000-022 | Fixation, washing, and antibody incubaton. |
| Plain and Frosted Micro Slides (25×75mm) | VWR | 48312-004 | Slides for confocal imaging |
| Micro Cover Glasses, rectangular (22×40mm) | VWR | 48393-172 | Slides for confocal imaging |
| Rubber Cement | Slime | 1051-A | Mounting |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | Mounting |
| Scotch Magic 810 Invisible Tape (19mm×25.4m) | 3M Company | 810 | Mounting |
| Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | Antibody incubaton |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | Nucleic acid staining. Dissolve in deionized water to make a 5 mg/mL stock solution and store at -80°C. Dilute to a working concentration of 10-20 μg/mL in PBTx. |
| 3.5X-90X Stereo Zoom Inspection Industrial Microscope | AmScope | SM-1BNZ | Dissection scope. Equipped with 6W LED Dual Gooseneck Illuminator |
| ImageJ/Fiji | NIH | v1.51u | With SCF_MPI_CBG plugins (version 1.1.2) |
| FV1000-IX81 Confocal-laser Scanning Microscope | Olympus | ||
| Recombinant Construct | Bloomington Drosophila Stock Center | BL37749 |
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