Summary
لقد قمنا بتطوير سير عمل بسيطة وقابلة للتكيف لاستخراج البيانات الكمية من دراسات بيولوجية الخلية المستندة إلى تصوير fluorescence تجميع البروتين والتمويه أوتوفاجيك في الجهاز العصبي المركزي لنماذج المورفولوجية نيوروديجينيريشن.
Abstract
مع تزايد انتشار أمراض الأعصاب، من المهم فهم الفيزيولوجيا المرضية الكامنة التي تؤدي إلى الخلل في الخلايا العصبية وفقدان. تكنولوجيات وأدوات التصوير القائم على الأسفار تمكين تحليل لم يسبق لها مثيل للعمليات العصبية الحيوية سوبسيلولار، ومع ذلك لا يزال هناك حاجة إلى اتباع نهج غير متحيز، واستنساخه، وموجودا لاستخراج البيانات القابلة للقياس الكمي من التصوير الدراسات . قمنا بتطوير سير عمل بسيطة وقابلة للتكيف لاستخراج البيانات الكمية من دراسات التصوير القائم على الأسفار باستخدام نماذج المورفولوجية نيوروديجينيريشن. على وجه التحديد، يمكننا وصف نهج شبه الآلي، وسهلة لمتابعة استخدام فيجي/إيماجيج لتحليل العمليات الخلوية هما: أولاً، نحن قياس محتوى البروتين الكلي والشخصية في الفص البصري المورفولوجية استخدام المسخ معلم فلوري البروتينات هونتينجتين؛ وثانيا، نقيم التمويه يحلول أوتوفاجي في نظام البصرية المورفولوجية الكمي على أساس راتيوميتريك لمراسل الفلورسنت جنبا إلى جنب مع أوتوفاجي. الأهم من ذلك، يتضمن البروتوكول الواردة هنا خطوة تقسيم شبه الآلي لضمان يتم تحليل جميع الهياكل الفلورية إلى أدنى حد تحيز الانتقاء وزيادة دقة مقارنات دقيقة. يمكن توسيع هذا النهج لتحليل الهياكل البيولوجية الأخرى الخلية وعمليات متورطين في نيوروديجينيريشن، مثل بونكتا البروتينية (حبيبات الإجهاد ومجمعات متشابك)، كذلك غشاء ربط الأجزاء الأخرى (الميتوكوندريا و غشاء الحويصلات الاتجار بالبشر). يوفر هذا الأسلوب الموحد، بعد إشارة قابلة للتكيف نقطة لتحليل الصور والقياس الكمي، ويمكن تيسير والموثوقية وإمكانية تكرار نتائج عبر الحقل، وفي نهاية المطاف تعزيز فهم الميكانيكية نيوروديجينيريشن.
Introduction
أمراض الأعصاب تؤثر على ملايين الناس كل عام، وهو تزايد حالات الإصابة شيخوخة سكان1. بينما كل مرض الأعصاب مسببات فريدة من نوعها، يتم تجميع البروتينات تجمعات وانهيار شبكة بروتيوستاسيس بصمات المرضية الشائعة لكثير من هذه الأمراض. توضيح كيفية تعطيل هذه العمليات المترابطة والأساسية تخفق لتسهم في وفاة الخلل والخلايا العصبية أمر بالغ الأهمية لفهم أمراض الأعصاب، فضلا عن توجيه التدخلات العلاجية. تصوير المستندة إلى الأسفار يسمح للتحقيق في هذه العمليات المعقدة والديناميكية في الخلايا العصبية، وقد ساهم إلى حد كبير في فهمنا لبيولوجيا الخلايا العصبية. تحليل البروتينات فلوريسسينتلي المعلمة يمثل تحديا، لا سيما عندما يتم إجراء التجارب في فيفو، سبب الأنسجة المدمجة عالية وأنواع الخلايا المختلفة وعدم تجانس الخصائص المورفولوجية. ساعد يدوياً التقدير الكمي هو بأسعار معقولة وواضحة، ولكن في كثير من الأحيان مضيعة للوقت وعرضه للتحيز البشري. ولذلك، هناك حاجة لنهج غير متحيز، واستنساخه، وموجودا لاستخراج البيانات القابلة للقياس الكمي من التصوير الدراسات.
وقد اوجزنا سير عمل بسيطة وقابلة للتكيف باستخدام فيجي/إيماجيج، صورة قوية، ويمكن الوصول إليها بحرية تجهيز البرمجيات2،3، لاستخراج البيانات الكمية من دراسات التصوير fluorescence في نماذج تجريبية من نيوروديجينيريشن استخدام المورفولوجية. باتباع هذا البروتوكول التحديد الكمي لتجميع البروتين والتمويه أوتوفاجيك – هما الخلية السمات البيولوجية التي ذات صلة وثيقة بعلم الأمراض مرض الأعصاب-أظهرنا حساسية وإمكانية تكرار نتائج هذا النهج. وكشف تحليل البروتينات هونتينجتين متحولة المعلمة فلوريسسينتلي (Htt) في الفص البصري المورفولوجية في عدد وحجم وكثافة المجاميع البروتين. يمكننا تصور مراسل فلورسنت جنبا إلى جنب للتمويه أوتوفاجيك داخل النظام المرئي المورفولوجية ، الذي يعرض إشارات الانبعاثات المختلفة تبعاً للبيئة يغلب4. التحليل القائم على راتيوميتريك للمراسل جنبا إلى جنب يسمح لطريقة عرض الكمية وشاملة للتمويه يحلول أوتوفاجي من تشكيل أوتوفاجوسومي، والنضج، والنقل إلى تدهور في يحلول، وأبرز بالإضافة إلى ذلك ضعفا المقصورات تعطلت في ظروف الأعصاب. الأهم من ذلك، في كل التحليلات نفذنا خطوات العتبة وتجزئة شبه الآلي لدينا بروتوكول للتقليل من التحيز فاقداً للوعي وزيادة قوة أخذ العينات وتقدم معياراً تيسير إجراء المقارنات بين دراسات مماثلة. سير العمل مباشرة يهدف إلى جعل قوية الإضافات فيجي/إيماجيج (وضعها علماء الكمبيوتر على أساس خوارزميات الرياضيات) أكثر يسرا نيوروبيولوجيستس والمجتمع علوم الحياة بصفة عامة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-الاعتبارات والتحضير لتصميم التجربة تحليل الصورة
- تحدد مسبقاً الخلوية التشريحية، مناسبة، أو علامات سوبسيلولار لتكون بمثابة معالم لتوحيد منطقة الاهتمام (ROI) عبر عينات مختلفة، على سبيل المثال 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI)، علامات غشاء، فلوري مترجمة البروتين، و ما إلى ذلك
- حدد علامة نيون يمكن تحديد بونكتا منفصلة تتجاوز مستويات الخلفية للهيكل للفائدة.
ملاحظة: هذا البروتوكول هو الأمثل للهياكل البروتينية (مثلاً، المجاميع تجمعات البروتين) وربط الغشاء العضيات (مثلاً، مراسل أوتوفاجي). تصور تجميع البروتين، كان جزء بلغة الطرفي ن معلم طلب تقديم العروض للبشرية Htt البروتين مع قطعة polyQ المسببة للأمراض ليكرر 138 (RFP-hHttQ138) تستخدم5. ويشكل البروتين Htt متحولة المجاميع هيولى عندما أعرب عن إطار العصبية برامج معينة مثل elav-GAL45،6. تصور أوتوفاجوسومي-يحلول التمويه، استخدمت أكتين-GAL4 أوبيكويتوسلي محرك التعبير عن مراسل مشري-التجارة والنقل-Atg8a جنبا إلى جنب. بونكتا مشري وبروتينات فلورية خضراء إيجابية تشير إلى أوتوفاجوسوميس، وهو رصد التدفق كما هو مروي fluorescence التجارة والنقل في بيئة حامضية يحلول، حيث يبقى مشري غير متحسسة لحمض حتى البروتين هو المتدهورة7. لتحليل راتيوميتريك، قناة واحدة هو علامة متسقة للهيكل يمكن استخدامه لتجزئة، أو إذا كان ذلك مناسباً إسقاطاً لقناتين أو أكثر يمكن استخدامها لتحديد هياكل، على الرغم من عدم وضوح المبينة في هذا البروتوكول. في هذا المثال، يتم استخدام مشري لتجزئة جزيئات Atg8 إيجابية، كما أنها غير متحسسة لحمض وسيبقي في المقصورة في جميع أنحاء التمويه من خلال المسار. - قم بتحميل وتثبيت منصة مفتوحة المصدر تحليل الصورة إيماجيج أو فيجي – المجمعة المفضل توزيع إيماجيج مع الإضافات2،3.
- قم بتثبيت البرنامج المساعد ح-ماكسيما التفاعلية مستجمعات المياه.
ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول فيجي؛ ملحقات إضافية قد تكون مطلوبة من أجل إيماجيج. الأداة الإضافية وضعتها لومباردوت بينوا لصندوق إنقاذ الطفولة-معهد ماكس بلانك-CBG هو متاح على شبكة الإنترنت (https://imagej.net/Interactive_Watershed). - انتقل إلى "مساعدة | تحديث "، حدد" تحديث إدارة المواقع "من" التحديث إيماجيج "، اختر موقع التحديث SCF-معهد ماكس بلانك-CBG من القائمة، ثم قم بإغلاق وإعادة فيجي.
2-الدماغ التشريح وتلطيخ الفلورة
-
جعل سيليكون الاستومر مبطنة تشريح الأطباق.
- صب سيليكون الاستومر المكونات في كوب كما يتبين من الشركة المصنعة ويقلب جيدا حتى تمتزج جيدا.
- استخدام ماصة تعبئة 5 سم كامل أطباق زراعة الأنسجة الثلث إلى النصف (حوالي 10 مل مخلوط الاستومر). السماح لأي فقاعات الصعود إلى السطح وإزالة بلطف بالمناديل الورقية. تغطية الأطباق ووضعها على سطح مستوى لعلاج ح 48 – 72 في درجة حرارة الغرفة (RT).
-
تشريح الدماغ المورفولوجية ، ونظام البصرية إذا لزم الأمر.
- إجراء تشريح الدماغ المورفولوجية كما هو موضح سابقا8،9. إجراء التشريح في تشريح مبطنة الاستومر الأطباق، استخدام أسفل الاستومر على استقرار الدماغ لتجنب الأنسجة المدمرة أو الملقط.
- للحفاظ الصفيحة سليمة خلال التشريح، الشريحة الملقط اثنين تحت الشبكية ولطف المسيل للدموع خلال منتصف العين لإزالة الشبكية. سحب بعيداً أي نسيج الشبكية التي تعلق على الصفيحة مع الملقط الذي عقد موازيا لسطح الصفيحة.
ملاحظة: الصباغ المتبقية سوف يغسل في الخطوات التالية، وعادة لا تتداخل مع جسم تلطيخ والتصوير. - تمييع 37% فورمالدهيد في مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) جعل تركيز نهائي من 3.7% الطازجة قبل استخدامها في أنبوب ميكروسينتريفوجي 500 ميليلتر. نقل تشريح الدماغ إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي مع حل واحتضان لمدة 15 دقيقة في الرايت مع هزاز لطيف.
ملاحظة: قد فورمالدهايد ميلا طبيعيا إلى أن تتأكسد، تنتج حمض الفورميك. ولذلك، من المقترح إلى قاسمة 37% فورمالدهيد للتخزين وتمييع إلى 3.7% طازجة قبل كل استعمال. تثبيت الزائد أو الناقص التثبيت سوف تؤثر على سلامة الأنسجة والأسفار10. - أغسل 3 مرات مع ببتكس (برنامج تلفزيوني مع 0.4% Triton X-100) لمدة 15 دقيقة.
-
أداء إيمونوهيستوتشيميستري وجبل العينات.
- إذا كانت هناك حاجة إلى تلطيخ جسم، إزالة ببتكس وإضافة جسم الابتدائي المخفف في ببتكس بمصل الماعز العادي 5% واحتضان المعني خلاط الكوة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- إزالة الأجسام المضادة الأولية ويغسل 3 مرات مع ببتكس لمدة 15 دقيقة. إضافة الأجسام المضادة الثانوية المخفف في ببتكس بمصل الماعز العادي 5% واحتضانها ح 1 في الرايت أو بين ليلة وضحاها في 4 درجات مئوية. أغسل 3 مرات مع ببتكس لمدة 15 دقيقة.
- إذا كانت هناك حاجة إلى تلطيخ DAPI، إزالة ببتكس، إضافة حل DAPI (الأسهم الحل: 5 ملغ/مل، تمييع لتركيز عمل من 15 ميكروغرام/مل في ببتكس)، واحتضان لمدة 10 دقيقة في الرايت الغسيل 3 مرات مع ببتكس لمدة 15 دقيقة.
- لمسح الأنسجة، ضع قطره من تصاعد المتوسطة في وسط شريحة مجهرية مع فاصل طبقة واحدة من الشريط واضحة على كلا الجانبين. نقل الدماغ إلى انخفاض المتوسط المتصاعدة، والانتظار لمدة 1 – 2 دقيقة حتى الدماغ يصبح شفافاً. بعناية إزالة المتوسطة المتصاعدة مع ماصة.
- لتحميل، تطبيق قطره من تصاعد الطازجة المتوسطة على العقول على الشريحة. تراكب زجاج غطاء تجنب فقاعات بعناية. ختم الحواف مع الأسمنت المطاط، وأيردري على RT ل 20 دقيقة المضي قدما للحصول على الصور للحصول على أفضل النتائج.
3. الحصول على الصور
- تحسين المجهر اكتساب المعلمات، بما في ذلك القرار المكانية، والهدف، والتكبير، وسرعة المسح الضوئي، وخطوة الحجم، إلى أقصى حد القرار هياكل الفائدة تيسيرا لتجزئة شبه الآلي أثناء تحليل الصور.
ملاحظة: قد يكون من المفيد التقاط صورة عينة واختبار تجزئة شبه الآلي (في الخطوة 5 من هذا البروتوكول) قبل التصوير جميع العينات التجريبية. وبهذه الطريقة يمكن للمستخدم ضبط إعدادات التصوير حيث أن الأدوات التحليلية يمكن أن نستشف سهولة الهيكل البيولوجي للفائدة. -
ضبط الصورة للكشف عن ضوابط للقبض على أعلى نسبة إشارة إلى الضجيج وأعلى النطاق الديناميكي للعينة.
- استخدام طرفية (انظر الجدول) التي تشير إلى التشبع بكسل (التعرض عالية جداً) أو أونديرساتوراتيون (الإزاحة منخفضة جداً) بينما ضبط إعدادات (الشكل 3B، الأحمر يشير إلى التشبع بكسل "طرفية" مرحبا/منخفضة).
- تحقق من إعدادات مكسب والإزاحة المناسبة لجميع المجموعات التجريبية، التلاعب التجريبية المحتمل يغير هيكل الفائدة.
ملاحظة: من الضروري أن تستخدم نفس الإعدادات لكافة المجموعات لإجراء مقارنات كمية.
- الصورة عن طريق الأنسجة لالتقاط كافة البيانات.
ملاحظة: من المستحسن لالتقاط كافة البيانات المتاحة خلال جلسة التصوير وتحديد منطقة أكثر دقة أثناء تحديد العائد على الاستثمار في الخطوة 4 إذا لزم الأمر. - حفظ الصورة كنوع ملف تدعمها برامج التصوير من أجل الحفاظ على البيانات الوصفية مثل الحصول على المعلمات ومعايرة المكانية. حفظ الصورة باسم ملف بما في ذلك الأجسام المضادة التاريخ والخلفية الوراثية والصحفيين الفلورسنت، تجريبي، أو الأصباغ المقابلة للقنوات الممسوحة ضوئياً مثل _Ch1 _ [تاريخ التجربة] _ [اسم العينة] [اسم المجموعة التجريبية]. [Fluorophore-الهدف /Dye]_Ch2.[Fluorophore-target/Dye]، إلخ
4-فيجي/إيماجيج صورة الاستيراد وتحديد العائد على الاستثمار
- فتح صورة في فيجي. استخدم مربع الحوار "خيارات استيراد تنسيقات بيو"، اختر "عرض مكدس مع: هايبرستاك" وتعيين "وضع الألوان: الرمادي".
ملاحظة: من المستحسن لفتح نوع ملف المجهر، كبيانات التعريف مثل معايرة المكانية يمكن قراءته بواسطة فيجي. -
تحديد منطقة من z-طائرة واحدة أو إسقاطات تستند علامة قناة (ق) التي يمكن استخدامها كعائد موحدة عبر العينات (الشكل 1، تحديد العائد على الاستثمار).
- استخدم شريط التمرير "ج" لعرض قناة (ق) التي تستخدم لالتقاط marker(s) المعينة في الخطوة 1، 1.
- استخدم شريط التمرير "Z" للتحرك من خلال الطائرات المحورية. اختر شريحة واحدة أو إنشاء إسقاطاً لشرائح متعددة عن طريق النقر فوق "الصورة | مكدسات | المشروع Z "وتعيين" بدء شريحة "و" إيقاف شريحة "ليشمل العائد على الاستثمار.
ملاحظة: تعيين نوع ''الإسقاط "إلى" كثافة ماكس "في مشروع" Z "مربع الحوار هو غالباً الأنسب للتأكيد على هياكل لتجزئة في القسم 5، على الرغم من أن هذا قد لا يكون مناسباً لجميع التطبيقات. إذا كان نوع آخر من الإسقاط اللازمة للتحليل، الحرص على حفظ وتوثيق هذا الملف على هذا النحو لاستخراج ميزة في القسم 6 أو 7. - إنشاء صورة جديدة تحتوي على قناة (ق) والتنسيق plane(s) من الفائدة لتبسيط الخطوات التالية في بروتوكول تحليل الصورة. حدد "صورة | مكرر "، المطلوب" القنوات "(c) و" الشرائح "(z)، وقم بتغيير اسم الملف لعكس التحديد (مثلاً، _ _ [اسم العينة] [اسم المجموعة التجريبية] [تجربة date]_[Channel(s)]_[z-plane(s)]).
- استخدم واحدة من "أدوات التحديد" على شريط الأدوات فيجي يدوياً تحديد عائد موحدة استناداً إلى معايير الاختيار المحددة في الخطوة 4، 2.
- إضافة العائد على الاستثمار إلى إدارة العائد على الاستثمار بواسطة النقر فوق "تحليل | أدوات | إدارة العائد على الاستثمار "وانقر فوق" إضافة "في قائمة إدارة العائد على الاستثمار. حفظ دوروا من قائمة إدارة العائد على الاستثمار بواسطة النقر فوق "أكثر | حفظ "، وقم بتسمية الملف ليعكس العائد على الاستثمار (مثلاً، _ _ قناة [(ق)] _ [تاريخ التجربة] _ [اسم العينة] [اسم المجموعة التجريبية] [z-plane(s)] _ [وصف دوروا]).
ملاحظة: هذا يمكن أن يعاد في فيجي لتحليلات لاحقة، أو يمكن تطبيقها على الصور كما هو الحال في القسم 5.3 أو قنوات أخرى.
5-تجهيزها وتجزئة مع واتيرشيدينج ح-ماكسيما
-
القيام بتجهيزها على القناة المستخدمة لالتقاط الهياكل للفائدة.
- إذا كان ملف الصورة يتكون من قنوات متعددة، فصل القنوات بواسطة النقر فوق "الصورة | لون | تقسيم القنوات "لعزل القناة للفائدة.
- تطبيق عامل تصفية مثل عامل تصفية الوسطية للحد من الضوضاء أو التمويه الضبابي لتجانس بواسطة النقر فوق "عملية | مرشحات | تصفية نوع "(مثلاً،" متوسط عامل التصفية "أو" التمويه الضبابي ").
- أخذ عينة من مرشحات مختلفة وتصفية المعلمات في الصور من كل مجموعة تجريبية. المضي قدما من خلال الخطوة 6، 2 على سبيل المثال ممثل من كل فريق لفحص أداء تجزئة. حدد الإعدادات التي تسهل تجزئة الهياكل للفائدة والتصفية.
- سجل عامل التصفية، وإعدادات. وتنطبق هذه المعلمات عبر المجموعات التجريبية.
- حفظ نسخة من الصورة كملف tiff بما في ذلك عامل التصفية المطبق للرجوع إليها. استخدم اسم مفصلة مثل _ _ [قناة] _ [تاريخ التجربة] _ [اسم العينة] [اسم المجموعة التجريبية] [z-plane(s)] _ [عامل التصفية مع المعلمات].
-
إجراء تجزئة الهياكل للاهتمام باستخدام أداة تفاعلية ح-ماكسيما مستجمعات المياه في معالجة الصورة التي تم إنشاؤها وحفظها في الخطوة 5، 1.
- مع معالجة الصورة النشطة في فيجي، بدء الأداة التفاعلية لمستجمعات المياه ح-ماكسيما بواسطة النقر فوق "صندوق إنقاذ الطفولة | وسم | H_Watershed التفاعلية ".
ملاحظة: هذا البرنامج المساعد أولاً يحسب مستجمعات المياه وثم تسمح للمستخدم باستكشاف آثار ماكسيما المحلية وخيارات عتبة على تجزئة من خلال صورة إخراج على الفور محدثة. - من لوحة التحكم، ضبط ديناميات البذور (ح) وكثافة عتبة (T) وذروة الفيضان (٪) لتحسين تجزئة.
ملاحظة: دائماً الرجوع إلى الصورة الخام قبل تجهيزها من 4.2 القسم يدوياً فحص أداء تجزئة الهياكل للفائدة. - عندما راضية عن نتائج تجزئة، حدد "تصدير قناع المناطق" واختر "تصدير". سيؤدي هذا إلى إنشاء صورة ثنائي نتائج مستجمعات المياه (الشكل 1، تجزئة).
- تسجيل المعلمات تجزئة؛ تحتاج هذه المعلمات ليتم تطبيقها عبر المجموعات التجريبية للمقارنات الكمية. حفظ قناع نتائج ثنائي إذا رغبت للرجوع إليها مع معلمات تجزئة مفصلة في الاسم مثل _ _ [قنوات] _ [تاريخ التجربة] _ [اسم العينة] [اسم المجموعة التجريبية] [z-plane(s)] _ _ [عامل التصفية مع معلمات] [معلمات H_Watershed].
- مع معالجة الصورة النشطة في فيجي، بدء الأداة التفاعلية لمستجمعات المياه ح-ماكسيما بواسطة النقر فوق "صندوق إنقاذ الطفولة | وسم | H_Watershed التفاعلية ".
-
استخراج هياكل الفائدة من نتائج لمستجمعات المياه.
- فتح دوروا المحفوظة من 4.4 خطوة، في إدارة العائد على الاستثمار. مع قناع ثنائي المناطق من الخطوة 5.2.4 النشطة، وتحديد العائد على الاستثمار من المدير ROI تطبيقها على الصورة للحد من استخراج ميزة للعائد على الاستثمار الموحد.
- عائدات الاستثمار النشط في قناع ثنائي لمستجمعات المياه، اختر "تحليل | تحليل الجزيئات "مع" إضافة إلى إدارة "المحدد في مربع الحوار لاستخراج السمات.
ملاحظة: هذا سوف تضيف معرفاً جسيمات لكل بنية محددة من خلال تجزئة إلى إدارة العائد على الاستثمار. تتوفر خيارات هذه القائمة استبعاد الميزات استناداً إلى حجم أو تدوير إذا لزم الأمر لتحسين هياكل المدرجة في التحليل. - حفظ الجزيئات بواسطة النقر فوق "أكثر | حفظ "من القائمة" إدارة "العائد على الاستثمار. تأكد من أن يتم إلغاء تحديد معرفات وجميع الجزيئات سيتم حفظ كافة في ملف مضغوط. استخدم اسم مفصلة مثل _ _ [قنوات] _ [تاريخ التجربة] _ [اسم العينة] [اسم المجموعة التجريبية] [z-plane(s)] _ [عامل التصفية مع المعلمات] _ _ [H_Watershed معلمات] [البنى].
6-الكمية والمنطقة، وكثافة التقدير الكمي وتحليل
- قم بفتح الصورة الخام التي تم إنشاؤها وحفظها في الخطوة 4، 2. قم بالتمرير إلى القناة المستخدمة لالتقاط الهياكل للفائدة.
ملاحظة: من الضروري أخذ قياسات كثافة من الصورة الخام (قبل تجهيزها) كتطبيق عوامل التصفية في الخطوة 5، 1 التغييرات في قيم بكسل. - فتح الجسيمات التي تم الحصول عليها من استخراج ميزة في الخطوة 5، 3 وحدد "إظهار الكل" من إدارة العائد على الاستثمار.
ملاحظة: هذا الإجراء سوف تراكب مخطط تفصيلي لكل جسيم على "عائد الاستثمار مدير" على الصورة ويجب أن تطابق حواف الهياكل للفائدة (الشكل 1، استخراج ميزة). - تعيين القياسات المطلوبة بواسطة النقر فوق "تحليل | تعيين قياسات ".
ملاحظة: يمكن قياس المنطقة وكثافة وكثافة الجسيمات عن طريق اختيار "المجال" و "كثافة المتكاملة". عندما يتم تحديد كثافة المتكاملة، فيجي سوف تنتج قيمتين: 'المتكاملة الكثافة' تحسب كنتاج للمنطقة ومتوسط قيمة الرمادي و 'المتكاملة الكثافة من الخام' تقاس كمجموع قيم بكسل. ويحسب كثافة البروتينات الفلورية في الجسيمات كمجموع قيم بكسل مقسمة حسب المنطقة. عدد الجسيمات التي تم إنشاؤها في الخطوة 5، 3 يشير إلى كمية الجسيمات داخل الأنسجة عائد الاستثمار المحددة في الخطوة 4، 4. - من القائمة إدارة العائد على الاستثمار، اختر "التدبير". يتم التعبير عن النتائج في وحدات معايرة طالما يتم أخذ القياسات من ملفات المستمدة في فيجي من برامج التصوير. نسخ النتائج من إطار النتائج ولصقه في برنامج جدول بيانات لتجميع والمزيد من العمليات الحسابية.
7-راتيوميتريك الكمي وتحليل البيانات
- اتبع الخطوات 6.1 و 6.2 لفتح معرفات الجسيمات في القناة الخام الأولى من الفائدة.
- تعيين القياسات المطلوبة بواسطة النقر فوق "تحليل | تعيين قياسات ".
ملاحظة: يمكن قياس كثافة متوسط كل الجسيمات عن طريق اختيار "تعني قيمة الرمادي". - حدد من إدارة العائد على الاستثمار "التدبير". نسخ البيانات من إطار النتائج ولصقه في برنامج جداول البيانات.
- حرك شريط التمرير "ج" للقناة الثانية الخام ذات الاهتمام، والتجارة والنقل في هذا المثال (الشكل 4 أ)، وكرر الخطوات من 7.2. و 7-3.
ملاحظة: سوف الافتراضية الجسيمات بحفظه في الخطوة 5، 3 إلى القناة والشريحة التي تم إنشاؤها. الحرص على ضمان تطبيق الجسيمات للقناة الصحيحة للفائدة. - حساب نسبة الكثافة من قناة واحدة لشدة الثانية لكل الجسيمات في برنامج جدول بيانات.
-
استخدام مخطط مبعثر لتصور وتحديد كمية البيانات راتيوميتريك من فلوروفوريس الذي يحمل تغييرات فردية تعكس العمليات البيولوجية الأساسية.
- إنشاء مخطط مبعثر في برامج الرسوم البيانية.
ملاحظة: تمثل كل نقطة بيانات هيكل للاهتمام حيث كثافة فلوروفوري الأولى للاهتمام هو "القيمة x" وكثافة فلوروفوري الثاني هو "القيمة y" تقاس من كل الجسيمات. - تعيين النابضة عتبات لكل فلوروفوري لتعريف الأرباع.
- إنشاء مخطط مبعثر في برامج الرسوم البيانية.
-
استخدام خط الشخصية لتصور شدة fluorophore عبر بنية للفائدة.
- حدد عائدات الاستثمار التي تم إنشاؤها في الخطوة 5، 3 واستخدام أداة الخط المستقيم على شريط الأدوات لرسم خط مستقيم من خلال العائد على الاستثمار. أضف السطر العائد على الاستثمار إلى إدارة العائد على الاستثمار.
- لكل قناة من اهتمام، مع خط عائد الاستثمار النشط، حدد "تحليل | ارسم الشخصية ".
ملاحظة: سيقوم بإنشاء الدالة الشخصية مؤامرة مؤامرة الرسم بياني، وجدول لقيم كثافة على طول الخط. قياس نتائج نسخة من كل قناة ولصق في برنامج جداول البيانات لإنشاء قطعة عرض كل القنوات على طول الخط.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
التحديد الكمي لعدد ومجال، وكثافة للمعلمة فلوريسسينتلي المجاميع Htt المسخ في الفص البصري المورفولوجية
للتحقيق في تجميع البروتين تجمعات في الجهاز العصبي المركزي لنموذج المورفولوجية لمرض هنتنغتون، معلم RFP المسخ Htt البشرية مع غير المرضية (UAS-RFP-hHttQ15) أو توسيع المرضية ( UAS-RFP-hHttQ138)، وأعرب المشترك تحت سائق عموم العصبية elav-GAL4غشاء بروتينات فلورية خضراء (UAS-mCD8::GFP)11 . تشريح أدمغة الإناث الذباب 2 أيام بعد اكلوسيون (داي)، ثابتة، وملطخة DAPI وفقا للمادة 2 من البروتوكول. [كنفوكل] ليزر المسح المجهري أجريت مع التركيز على الفص البصري مع 40 × النفط الغمر الهدف العدسة، والفتحة العددية 1.30 (غ)، باستخدام سرعة المسح الضوئي المايكروثانيه 8.0 كل بكسل والقرار المكانية 1024 1024 بيكسل (12 بت لكل بكسل). وكان حجم الخطوة الأمثل يحدده برامج التصوير ميكرومتر 1.08 كل شريحة للهدف مع التركيبة التالية من الأطوال الموجية الإثارة/الانبعاثات: القناة 1) 488/510 للتجارة والنقل، وقناة 2) 543/581 لطلب تقديم العروض، والقناة 3) 405/461 ل DAPI. الصورة للكشف عن الإعدادات المطبقة على جميع المجموعات لالتقاط الصور المناسبة لإجراء المقارنات، استندت عينة طلب تقديم العروض-Htt-Q138، الذي يتراكم المجاميع RFP-Htt عالية الكثافة، بدلاً من عينة مراقبة RFP-Htt-Q15 غير ممرضة، الذي يحتفظ مستويات منخفضة من منتشر RFP-Htt (الشكل 2). إذا تم تعيين إعدادات اقتناء الصورة إلى أقصى حد النطاق الديناميكي للعينة طلب تقديم العروض-Htt-Q15، سوف تكون مشبعة المجاميع RFP-Htt-Q138. على سبيل مثال، تم حفظها صورة مجهرية لتجميع البروتين في الفص البصري المورفولوجية ك HttQ138_Opticlobe.01_01012018_Ch1.RFP-Htt_Ch2.GFP_Ch3.DAPI.
الفص البصري كاملة تم تصويرها أثناء الفحص المجهري وتتألف من حوالي 15 z-شرائح، ولكن بعد التصوير تبين أن تحليل z-طائرة واحدة كان أفضل حل هياكل الفردية التي سوف إلا تظهر متداخلة في إسقاط ونظرا كثافة عالية داخل الأنسجة. لتحديد عائد موحدة، استخدمت الهيئات الخلية C2 و C3 تقع بين لوحة لب ولوبولا الفص البصري12 معلما تشريحية. في فيجي، وهكذا تم تكرار لتعكس متطلبات تحليل الصورة وتم حفظه كملف tiff المسمى HttQ138_Opticlobe.01_01012018_Ch1.GFP_Ch2.RFP-Htt_Ch3.DAPI_z8، حيث يعكس z8 الشريحة الثامنة حيث كانت معظم الهيئات الخلايا العصبية C2 و C3 بارزة من DAPI تلطيخ (الشكل 1A، الحصول على الصور). استخدم أداة التحديد المضلع لتحديد يدوياً عائد الاستثمار حول الفص البصري باستخدام DAPI تلطيخ والعصبية بروتينات فلورية خضراء إشارة كدليل (الشكل 1A، التحديد العائد على الاستثمار، حيث يشير اللون الأصفر إلى العائد على الاستثمار والأحمر يعين الصورة عالية التكبير التي تظهر الوضوح في اللوحات التالية لسير العمل). المقبل، كان تطبيق عامل تصفية "التمويه الضبابي" مع تعيين إلى 1 قيمة σ للقناة Htt طلب تقديم العروض للصورة على نحو سلس وتيسير تجزئة (الشكل 1A، تجهيزها)، وأداء تجزئة المصب واستخراج ميزة مع أو بدون هذا ويتضح في الشكل 1Aخطوة تجهيزها. ح التفاعلية-مستجمعات المياه تم إجراؤها على صور قناة Htt طلب تقديم العروض مع المعلمات التالية: البذور الديناميات، 30؛ كثافة العتبة، 500؛ ذروة الفيضانات (في المائة)، 80؛ ومع 'السماح بتقسيم' و 'تصدير قناع المناطق' المحدد (الشكل 1A، تجزئة). تم حفظ قناع ثنائي المناطق الناتجة ك HttQ138_Opticlobe. 01_01012018_Ch2.RFP-Htt_z8_GuassianBlur-sigma1_HWatershed-h30_T500_80percent وتستخدم لتوليد الجسيمات باستخدام أداة تحليل الجزيئات مع استبعاد حجم أدنى 0.4 ميكرون2 لتحديد البروتين المجاميع13،14 . الجسيمات الناتجة تم حفظها من إدارة العائد على الاستثمار كما HttQ138_Opticlobe.01_01012018_Ch1.RFP-Htt_z8_GuassianBlur-sigma1_HWatershed-h30_T500_80percent_aggregates، وطبقت على القناة RFP-Htt الخام (قبل تجهيزها) لاستخراج تصوير البيانات الكمية (الشكل 1A، استخراج ميزة).
كشف التحديد الكمي لعدد المجاميع RFP-Htt مجزأة شبه تلقائياً من الطائرات التنسيق الموحد من خلال الفص البصري من المورفولوجية التعبير منتشر لتوسيع Htt Q15 غير ممرضة وتراكم البروتين المجاميع بتوسيع Htt Q138 المسببة للمرض (الشكل 2 أ-ج). مجموع كافة قيم بكسل في كل الجسيمات التي قدمها 'كثافة الخام المتكاملة' استخدمت لمقارنة محتوى Htt طلب تقديم العروض لكل تجميع. توضح ملفات تعريف حجم وكثافة من جميع المجاميع من طائرة تنسيق موحد لخمسة الفصوص البصرية المختلفة معربا عن Htt Q138 متانة وإمكانية تكرار نتائج سير العمل هذا (الشكل 2D، هاء). جدير بالذكر أن عندما تم تعريض المجاميع أثناء الحصول على الصور (الشكل 3 ألف، باء)، التحديد الكمي لحجم وعدد المجاميع قابلة للمقارنة للمجاميع التقاطها مع التعرض المثالي (الشكل 3 د)، ومع ذلك كثافة المجاميع تعريض يصبح دالة لحجم ما مشبعة بكسل يحمل قيمة الكثافة القصوى (3E الشكل، و). لذلك، إعداد المعلمات التعرض المسح المناسبة أمر حاسم لاستخراج مجموعة كاملة من التركيب الجزيئي الكمي للمجاميع البروتين.
راتيوميتريك-على أساس القياس الكمي للتمويه أوتوفاجي في الصفيحة البصرية المورفولوجية مراسل Atg8a نيون جنبا إلى جنب باستخدام
تقييم الجريان يحلول أوتوفاجي في النظام المرئي المورفولوجية ، أعرب مراسل مشري-التجارة والنقل-Atg8a أوبيكويتوسلي في عنصر التحكم أو الذباب المورفولوجية سبيرميني synthase (الودي) متماثل المسخ (الوديه/ه) مع سائق أكتين-GAL4 . الوديه/ه الذباب نيوروديجينيريشن المعرض الذي يقترن بالتمويه أوتوفاجيك البصر بسبب خلل الليزوزومية15. تشريح العقول مع الصفيحة المرفقة من الذباب الإناث في داي 5، ثابتة، والملون مع DAPI. تم تصويرها في الصفيحة بالليزر الفحص المجهري [كنفوكل] مع X 100 نفط غمر عدسة هدف، 1.35 الفتحة العددية (غ)، بسرعة أخذ عينات المايكروثانيه 8.0 كل بكسل، و 12 بت لكل بكسل بصري، وحجم الخطوة 1.2 ميكرومتر.
وأجرى هذا التحليل على ماكس z-إسقاطات لشرائح z سبعة من خلال الصفيحة لزيادة السلطة أخذ العينات من بنيات إيجابية Atg8 متفرق (الشكل 1B، الحصول على الصور). دوروا موحدة وضعت يدوياً باستخدام أداة التحديد المضلع حول طبقة جسم الخلية كشفت عنها DAPI واستنادا إلى تشريح تتسم جيدا ومنظمة الخلوية للأنسجة (الشكل 1B، تحديد العائد على الاستثمار، حيث يشير إلى اللون الأصفر العائد على الاستثمار والأحمر يعين الصورة عالية التكبير التي تظهر للوضوح في اللوحات التالية لسير العمل)16. مراسل جنبا إلى جنب يعتمد على خصائص الاستقرار مويتيس التجارة والنقل، ومتشيري وضع علامة على التقدم من خلال المسار يحلول أوتوفاجي، أن التجارة والنقل هو مروي حموضة يحلول حيث يبقى متشيري حتى أنها متدهورة. ولذلك، استخدم fluorophore مشري أطول عمرا لتجزئة في هذا البروتوكول. تم تطبيق عامل تصفية "التمويه الضبابي" مع قيمة σ 1 إلى قناة مشري (الشكل 1Bوتجهيزها)، وأنجز ح التفاعلية-مستجمعات المياه مع المعلمات التالية: البذور الديناميات، 0؛ عتبة كثافة، 800؛ ذروة الفيضانات (في المائة)، 90؛ ومع 'السماح بتقسيم' و 'تصدير قناع المناطق' المحدد (الشكل 1B، تجزئة). واستخدمت قناع ثنائي المناطق الناتجة لتوليد الجسيمات باستخدام أداة تحليل الجزيئات. طبقت الجسيمات الناتجة إلى مشري الخام وخام قنوات التجارة والنقل (قبل تجهيزها) لاستخراج البيانات الكمية راتيوميتريك من المقصورات يحلول أوتوفاجي (الشكل 1B، استخراج ميزة).
الفحص البصري لهياكل مشري-التجارة والنقل-Atg8-إيجابية أشارت إلى تخصيب اليورانيوم في منطقة الجسم خلية الصفيحة، تتسق مع التقارير السابقة للنقل إلى الوراء من الحويصلات أوتوفاجيك إلى جسم الخلية في الخلايا العصبية17. ارسم الشخصية استخدمت لتصور مشري وكثافة التجارة والنقل عبر العديد من الهياكل Atg8-إيجابية (انظر خط رويس في الشكل 4A والناتجة عن كثافة على طول الخط في الشكل 4B)، الكشف عن الاختلافات في المراسل فيها عالية كثافة من كلا فلوروفوريس تشير إلى أوتوفاجوسوميس (الرقم 4B3)، متشيري عالية ومنخفضة بروتينات فلورية خضراء تشير إلى الانصهار مع يحلول كما هو مروي بروتينات فلورية خضراء في هذه المقصورة الحمضية (4B1 الشكل)، وأخيراً متشيري المنخفض يعكس التدهور داخل يحلول (4B2 الشكل). مؤامرة مبعثر المتولدة من شدة فلوروفوري يعني كل الجسيمات مشري-Atg8-إيجابية شبه تلقائياً مجزأة ويوضح التمويه من خلال المسار يحلول أوتوفاجي التي فصلت ثم إلى خطوات منفصلة بتحليل رباعي ( 4 الشكل). المؤامرة كان مقسم إلى أربعة أجزاء باستخدام عتبات النابضة للتجارة والنقل = 570، مشري = 1,800. تم تعيين العتبات استناداً إلى مجموعة مراقبة استخدام المبادئ التالية: (1) تصميم المراسل الفلورسنت جنبا إلى جنب، وخصائص fluorophores اثنين، حتى أن نظرياً بروتينات فلورية خضراء ينبغي عدم فلوريس حيث يوجد لا إشارة مشري (رباعي رابعا)، و (2) توزيع الجسيمات Atg8 إيجابية تعكس توزيع يحلول أوتوفاجي المتعلقة بمسار المقصورات في البرية من نوع الخلايا العصبية حيث يتم أوتوفاجي القاعدية ذات كفاءة عالية18،19. في لاميناس لمكافحة الذباب، حوالي 25% الجسيمات Atg8 إيجابية تم إهمال أوتوفاجوسوميس (رباعي أنا)، ونصف بونكتا تجهز بعد الانصهار يحلول أوتوفاجوسومي (رباعي، الثاني والثالث)؛ لاميناس الوديه/ه قد زاد زيادة كبيرة أوتوفاجوسوميس أو lysosomes المختلة وظيفيا (رباعي أنا) وانخفض أوتوليسوسوميس (رباعي، الثاني والثالث)، وتوحي بتراكم أوتوفاجوسومي من خلال العيوب في أوتوفاجوسومي--يحلول الانصهار و/أو تدهور الليزوزومية (الشكل 4 ج، د). كما دعمت البيانات الكمية تراكم هياكل Atg8 إيجابية واضحة في الصفيحة من الذباب الوديه/ه (4E الشكل). تحليل راتيوميتريك يعني متشيري وبروتينات فلورية خضراء إشارة أبرز فرق بين فريق المراقبة و الوديه/ه (الشكل 4F) لكن لا يمكن التفصيل تأثير شامل على المسار ولا الخطوات المحددة التي كشفت عنها تحليل رباعي.
الشكل 1: سير العمل من خلال تجزئة التقليل من التحيز، وشبه الآلي هياكل سوبسيلولار في المخ المورفولوجية استخدام فيجي مع الأمثلة. (A) ميكروجرافس [كنفوكل] الممثل من المستوى البؤري واحد من خلال الفص البصري للمخ الكبار المورفولوجية معربا عن عموم للعصبية معلم RFP المسخ Htt والمستهدفة لغشاء بروتينات فلورية خضراء (elav-GAL4 > UAS-mCD8:GFP، UAS-RFP-hHttQ138) مع DAPI تلطيخ (الحصول على الصور). واستخدمت DAPI والتجارة والنقل لتحديد عائد الاستثمار (أصفر) حول الفص البصري؛ يشير المربع الأحمر إلى تضخيم المنطقة من خلال سير العمل للوضوح (تحديد العائد على الاستثمار). تظهر لوحة تجهيزها عالية التكبير من الصورة الخام من قناة HttQ138 طلب تقديم العروض (أعلى)، وبعد تطبيق عامل تصفية "التمويه الضبابي"، σ1 (أسفل). تجزئة بمستجمعات المياه ماكسيما ح التفاعلية باستخدام إعدادات المعلمة المشار إليها لديناميات البذور التي يحددها ح-ماكسيما (ح) ومستجمعات المياه العالمية وقف معايير تحددها كثافة عتبة (T)، وتوقف الإقليمية معايير يحددها ذروة الفيضان ( تنفيذ %) على طلب تقديم العروض-HttQ138 الخام (أعلى) والصور المموهة الضبابي (أسفل)، ونتائج مستجمعات المياه من المناطق قناع تصديرها من البرنامج المساعد لمستجمعات المياه ومقلوب للوضوح. تحليل الجزيئات التي تم إنشاؤها بواسطة الجسيمات (أرجواني) مضافين على الصور الخام HttQ138 طلب تقديم العروض (استخراج ميزة). تشير الأسهم إلى المجاميع التي الإفراط مجزأة دون تجهيزها ورؤوس أسهم تشير إلى الهياكل التي تفشل لفصل بعد التصفية. (ب) ميكروجرافس [كنفوكل] الممثل من الإسقاط z كحد أقصى 7 طائرات التنسيق من خلال القسم الأفقي من الصفيحة لعنصر تحكم والمسخ (الوديه/ه) المورفولوجية الكبار معربا عن (التجارة والنقل-مشري-Atg8a في كل مكان أكتين-GAL4 > UAS-التجارة والنقل-متشيري-Atg8) مع DAPI تلطيخ (الحصول على الصور). DAPI استخدمت لتحديد عائد الاستثمار (أصفر) حول طبقة جسم الخلية الصفيحة؛ يشير المربع الأحمر إلى تضخيم المنطقة من خلال سير العمل للوضوح (تحديد العائد على الاستثمار). تظهر لوحة تجهيزها التكبير عالية من قناة متشيري مع مرشح "التمويه الضبابي"، σ1 يطبق على كل من عنصر التحكم والصفيحة المسخ. إجراء تجزئة بمستجمعات المياه ماكسيما ح التفاعلية على الصور مشري المصفاة مع إعدادات المعلمات المشار إليه، ومستجمعات المياه النتائج تظهر كقناع ثنائي المناطق المقلوب للوضوح. تحليل الجزيئات التي تم إنشاؤها بواسطة الجسيمات (أرجواني) مضافين على مشري الخام والتجارة والنقل الصور (استخراج ميزة). تغيير حجم أشرطة = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: التحديد الكمي لحجم وكثافة متحولة RFP-Htt المجاميع قوية واستنساخه. (أ-ب) تم تشريح أدمغة المورفولوجية مع طلب تقديم العروض-hHttQ15 (A) أو تعبير RFP-hHttQ138 (ب) إطار سائق عموم العصبية elav-GAL4 وثابتة وتم تصويرها الفصوص البصرية بالليزر الفحص المجهري [كنفوكل]. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (ج) متوسط عدد المجاميع في كل مجموعة كمياً من عائد يدوياً مختارة حول الفص البصري، وركز على شريحة زي موحد (n = 5). (د-ه) حجم (د) وكثافة المجموع (ﻫ) RFP-hHttQ138 المجاميع كمياً من توحيد رويس في الفصوص البصرية من الحيوانات المختلفة 5. يتم رسم البيانات التجميعية في مقياس لوغاريتمي. تم تعريف المجاميع ككائنات أكبر من 0.4 ميكرون2 (خط متقطع في د). التحليل الإحصائي، أحادي الاتجاه ANOVA، NS: لا كبيرة؛ a.u.: وحدة التعسفي الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 3: صورة التعرض المفرط يؤدي إلى قياسات الكثافة غير دقيقة. (أ-ب) صورة مجهرية [كنفوكل] الممثل optic lobe نفسه مع التعرض المثالي (A) والتعرض المفرط (ب) بسيودوكولوريد مع "حلو طرفية المستعملين المحليين" في فيجي. الأحمر في ب يشير إلى تعريض المجاميع. شريط المقياس = 50 ميكرون. (ج) التحديد الكمي للحجم الكلي بعد تنفيذ معلمات ح-ماكسيما مستجمعات المياه لتوليد نتائج تجزئة مماثلة. التحليل الإحصائي والعينات المستقلة t-اختبار، NS: ليس كبيرا. (د) توزيع الترددات من الحجم الإجمالي في الصور المثالية وتعريض. كذلك تم إهمال المجاميع مع حجم من 5 إلى 25 ميكرون2 في 4 مجموعات القاطع. (ه -و) تحليل الارتباط من كثافة المجاميع كدالة لحجم التجميعية (E). خط مرجعي رسمها (أسود) عندما يكون قيمة أقصى شدتها 4095 لكل بكسل. المربع الأخضر يشير إلى المجاميع أدناه 10 منطقة2 ميكرومتر سيظهر في واو. b: معامل الانحدار، ص2: معامل التحديد؛ a.u.: وحدة التعسفي الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: القياس الكمي لمراسل الوراثية مشري-التجارة والنقل-Atg8a نيون جنبا إلى جنب يكشف عن السمات المميزة للتمويه أوتوفاجيك في المورفولوجية. ميكروجرافس (A) [كنفوكل] الممثل الصفيحة المورفولوجية من الذباب متحولة التحكم و الوديه/ه أوبيكويتوسلي الإعراب عن مشري-التجارة والنقل-Atg8a (أكتين-GAL4 > مشري-التجارة والنقل-Atg8a) والملون ل DAPI . المناطق محاصر متقطع طبقة جسم الخلية الصفيحة تظهر في تضخم عالية (يمين). تشير الأرقام إلى هياكل تمثيلية Atg8a الإيجابية المرسومة في ب وكمياً في ج. (ب) الرسم البياني مؤامرة من شدة الأسفار في وحدات التعسفي (الاتحاد الأفريقي) على طول خط رويس المبين في الصور عالية التكبير في هياكل مشري-التجارة والنقل-Atg8 ألف (ج) المرسومة بمتوسط كثافة التجارة والنقل كدالة كثافة مشري يعني يقاس من الصفيحة التحكم و الوديه/ه (يقاس عن 3 من كل مجموعة من الجزيئات). المؤامرة كان مقسم إلى أربعة أجزاء باستخدام عتبات النابضة للتجارة والنقل = 570 ومشري = 1800 مع النسبة المئوية للهياكل في كل رباعي يحدده التركيب الوراثي. (د) القياس الكمي لمتوسط النسب المئوية لتصنيفها في كل رباعي في ج متشيري-التجارة والنقل-Atg8 (n = 3 الصفيحة). (ه) التحديد الكمي لإعداد مشري-التجارة والنقل-Atg8 بونكتا للصفيحة الواحدة (يعني ± التنمية المستدامة، n = 3 الصفيحة). (و) تحليل الهياكل مشري-التجارة والنقل-Atg8 راتيوميتريك لوحظت في مراقبة والصفيحة يطير متحولة (يعني مع 95% CI، n = 3 الصفيحة). طالب t-اختبار. ف < 0.05، * *ف < 0.01. أشرطة سكالي = 2 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يمكن استخدام البروتوكول الواردة هنا قوة وتكاثر كوانتيتاتي خلية العمليات البيولوجية التي تصور بتصوير المستندة إلى الأسفار. السياق البيولوجي والقيود التقنية بحاجة إلى النظر بعناية لتوجيه تصميم تجريبي. علامات مضيئة من هياكل سوبسيلولار للفائدة، سواء المناعي، صبغي، أو أعرب وراثيا، بحاجة إلى تكون مميزة فوق الخلفية بالتشكل وكثافة. نظام UAS/GAL4 يستخدم على نطاق واسع محرك التعبير الجيني المستهدف في المورفولوجية. تستخدم الأمثلة المقدمة هنا خطوط المحورة وراثيا تحمل السائقين GAL4 لتنشيط نسخ بروتينات المعلمة فلوريسسينتلي الخاضعة لسيطرة محسن UAS للتحقيق في تجميع البروتين وأوتوفاجي في الجهاز العصبي. إذا كان التعبير المتزامن للتحوير UAS التجريبية مطلوب جنبا إلى جنب مع التحوير مراسل فلورسنت، ثم السيطرة على المجموعة ينبغي أن تشمل أيضا أول أكسيد الكربون-overexpression من التحوير غير منطقي لعنصر التحكم لجرعة GAL4، على سبيل المثال UAS-التجارة والنقل أو لاكز UAS. إعداد نموذج موحد، كما هو مبين هنا المورفولوجية الجهاز العصبي المركزي والنظام البصري، من التشريح، والتثبيت، وجسم تلطيخ، من خلال تركيب، أمر حاسم للتصوير الأمثل والقياس الكمي.
حسن التصوير ممارسات تحقق أقصى نسبة الإشارة إلى الضوضاء والنطاق الديناميكي الضرورية لتحليل شبه الآلية ولها أهمية قصوى لإجراء مقارنات دقيقة بين المجموعات التجريبية. يجب تعيين المعلمات اقتناء الصورة حيث أنه ليس هو oversaturated المراسل حيث أن مجموعة كاملة من كثافة البروتين يمكن استخراجها وكمياً (الشكل 3). لإجراء مقارنات كمية، ينبغي القيام بالتصوير مع نفس المعلمات اقتناء، ويفضل أن يكون ذلك في نفس اليوم.
تحديد العائد على الاستثمار ومعالجة الصور، وتجزئة الميزة واستخراج ميزة استخدام منصة مفتوحة المصدر إيماجيج/فيجي تعتمد على التطبيق؛ بينما المعلمات الأولية يجب أن يتم تعريفها من قبل المستخدم، سيتم تصغير تطبيقها عبر العينات التحيز مع تعظيم مخرجات البيانات الكمية. وحاسمة بالنسبة لسير عمل المستند بعناية والموصى بها لحفظ صورة كملف tiff بعد كل خطوة بالتفصيل اسم الملف تطبيق المعالجة. يمكن أن يكون هذا مفيداً بشكل خاص عند العمل خارج البروتوكول معلمات للمرة الأولى وسوف تكون بمثابة نقطة مرجعية لضمان الاتساق بين المجموعات التجريبية في كل خطوة في معالجة الصور وتحليلها. ينبغي أن تحدد معايير الاختيار العائد على الاستثمار باستخدام علامات أو المعالم التشريحية من مجموعة عنصر تحكم، ولكن ينبغي الحرص لضمان أن التلاعب التجريبية لا تغير علامات أو المعالم بطريقة تحول دون دليل موثوق بها من توحيد العائد على الاستثمار. يمكن تحديد شريحة واحدة أو z إسقاطاً لشرائح متعددة لمعالجة أفضل أهداف التحليل، حيث المستوى البؤري واحد يمكن أن تكون مفيدة لتحسين فصل المجاورة للهياكل، واسقاطا z يمكن أن تكون مفيدة لتحليل الهياكل المترجمة في جميع أنحاء حجم الأنسجة. يجب أن يكون تحديد نوع z-الإسقاط المستخدمة لتجزئة وتحليل الصور بعناية وبشكل مستقل. إسقاط أقصى شدتها سينتج صورة حادة، نظراً لهياكل ألمع في الطائرات حيث هي في التركيز، وهي عادة ما تكون مناسبة تماما لتجزئة. تحليل الصورة قد يكون مقبولاً في إسقاط الحد أقصى، كما هو الحال على سبيل المثال تحليل يحلول أوتوفاجي؛ هياكل Atg8 الإيجابية هي أصغر من حجم الخطوة المستخدمة لأخذ العينات، وهكذا يتم تمثيل بواسطة أقصى شدتها أكثر دقة من الطائرة التنسيق الوحيد الذي تم القبض عليهم. لكن، لتحليل الهياكل أكبر من حجم الخطوة، قد تمثل إسقاطاً مبلغ الذي يضيف كل بكسل مع نفس إحداثيات س وص أدق كثافة المعلومات لكل بنية. بينما تم تصميم هذا البروتوكول لتحليل شريحة واحدة أو z إسقاطاً لشرائح متعددة في 2D، يمكن أن يكون سير العمل يسهل تكييفها لتحليل هياكل ثلاثية الأبعاد في سلسلة z باستخدام العديد من الأدوات نفسها. تحليل 3D سيكون من المستصوب لحجم عينة صغيرة من هياكل على شكل غير منتظم، حيث أن تحرف شريحة z منحرف يتقاطع مع البنية التحليل.
تجهيزها باستخدام عامل تصفية، مثل تلك التي اقترحت في هذا البروتوكول، يمكن الحد من الضوضاء مع الحفاظ على الحواف للمساعدة في الكشف عن هياكل للفائدة أثناء تجزئة؛ خلفية الضوضاء ونيون إينهوموجينيتي ماركر دون تجانس كافية سيؤدي إلى تجزئة المفرط، بينما سيتم إزالة التفاصيل الإعدادات التي يؤدي إلى طمس الكثير ومنع الكشف عن حافة دقيقة. تجزئة بمستجمعات المياه ويرى الصورة كسطح طبوغرافية مع مصدر مياه في ماكسيما المحلية – كثافة عالية بكسل في صورة فلورسنت – أن الفيضانات حتى تجتمع المجاورة للمناطق التي اجتاحتها الفيضانات حيث بنيت السد، أو الجزء المتعلق بالحدود،20. ح-ماكسيما مستجمعات المياه يستخدم عتبة المعرفة من قبل المستخدم (ح-ماكسيما الديناميات في البرنامج المساعد SCF-معهد ماكس بلانك-CBG) لتمييز ماكسيما المحلية ذات مغزى لتجنب تجزئة الزائد من الهياكل التي ليس لديها الحد أقصى محلية فريدة21. البرنامج المساعد مستجمعات المياه ماكسيما ح تفاعلي ينفذ في هذا البروتوكول يسمح للمستخدم بضبط ديناميات ح-ماكسيما (ح) ومستجمعات المياه العالمية وقف معايير تحددها كثافة عتبة (T)، وتوقف الإقليمية معايير يحددها ذروة الفيضان (%)، في حين على الفور عرض نتائج مستجمعات المياه في صورة مخرجات تقييم الأداء تجزئة نوعيا. النتائج تجزئة عن كثب وسوف يتفق مع معظم هيكل الحدود، على الرغم من الإفراط في تجزئة وفصل غير كامل (الشكل 1A، الأسهم الحمراء في استخراج ميزة) قد تحدث فيها العلامات الفلورية متنافرة، أو الأنسجة كثافة سكانية. يمكن أن تكون الاستدانة كفاءة خطوات تجزئة وتحليل شبه الآلي لزيادة قوة أخذ العينات والتخفيف من مطبات تجزئة.
بعد تجزئة واستخراج ميزة، أنها واضحة لاستخراج معلومات الخصائص المورفولوجية مثل المنطقة وأبعادها، والتدوير. وعلاوة على ذلك، إذا كان يتم جمع الصور على نحو مناسب لتجنب التعرض المفرط، المعلومات الجزيئية يمكن أيضا أن يستدل من هذا التحليل صورة بقياس كثافة. حالما يتم استخراج التدابير أمراض أمراض الأعصاب وكمياً بهذا النهج، يمكن استخدام هذه التدابير لمعالجة عدد من المسائل الهامة. على وجه التحديد، أثبت البروتوكول على إمكانية استخدام تحليل الصور والتحديد الكمي للمجاميع البروتين لتحديد العوامل التي تؤثر على البروتين تجميع وربط التوزيع وعدد وحجم وكثافة البروتين المجاميع مع الخلل في الخلايا العصبية والصحة العضوي. يمكن استخدام القياس الكمي على أساس راتيوميتريك أن يبلغ إجمالي التفاعل مع مكونات سوبسيلولار أو العمليات أثناء تطور المرض. بينما البيوكيميائية وطبقت التدفق الخلوي لتحليل التفاعل من المجاميع، ومع غيرها من الهياكل سوبسيلولار، وتحلل الخلية يمكن أن يؤدي إلى فقدان البروتين وتغيير الخصائص التجميعية، وتعطيل تفاعلات البروتين البروتين22. متشيري--التجارة والنقل-Atg8 قد استخدمت على نطاق واسع لرصد أوتوفاجي عن طريق الفحص المجهري الأسفار، لا سيما في الخلايا المستزرعة23، ولكنها تفتقر للطرق التحليلية الكمية وغير متحيزة. وعلاوة على ذلك، في فيفو تحليل استخدام المراسل وراثيا المرمزة جنبا إلى جنب يمثل تحديا ويتطلب إعداد الخلفية والأنسجة الوراثية العالية التي تسيطر عليها. ويحدد هذا البروتوكول منهجية التحقق من إعداد الأنسجة لتصوير الممارسات الحاسمة التحديد الكمي للمقصورات يحلول أوتوفاجي. مع الممارسات الوراثية الجيدة، تستطيع نهج تحليل الصورة بما في ذلك كثافة الجسيمات Atg-إيجابية وتحليل رباعي مع النابضة بإشارات الفلورسنت الفردية، كشف قوية والمقارنة العادية والمرضية أوتوفاجيك الجريان في فيفو في نماذج متنوعة من المرض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
هذا العمل تدعمه شيلا، وديفيد فوينتي الأعصاب الألم برنامج الدراسات العليا زمالة بحثية (إلى J.M.B.)، وبرنامج الزملاء حياة البابا لويس (للبنود و Y.Z. و J.M.B.)، "زمالة مؤسسة" سنايدر-روبنسون بريدوكتورال (للبنود)، تي جون د. . مؤسسة ماكدونالد (للبنود)، العقود، منح من المعاهد الوطنية للصحة (المعاهد الوطنية للصحة) HHSN268201300038C و R21GM119018 و R56NS095893 (R.G.Z.)، ومشروع الباحث تايشان (مقاطعة شاندونغ، جمهورية الصين الشعبية) (إلى R.G.Z.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SYLGARD(R) 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | PF184250 | Dissection dish |
| Falcon 35 mm Not TC-Treated Easy-Grip Style Bacteriological Petri Dish | Corning | 351008 | Dissection dish |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dissection tool |
| Sodium Chloride | Sigma | S3014 | PBS solution |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | S5136 | PBS solution |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma | P5655 | PBS solution |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | Washing and antibody incubaton solution. |
| 37% Formaldehyde | VWR | 10790-710 | Fixation |
| Disposable Microcentrifuge Tubes (0.5mL, blue) | VWR | 89000-022 | Fixation, washing, and antibody incubaton. |
| Plain and Frosted Micro Slides (25×75mm) | VWR | 48312-004 | Slides for confocal imaging |
| Micro Cover Glasses, rectangular (22×40mm) | VWR | 48393-172 | Slides for confocal imaging |
| Rubber Cement | Slime | 1051-A | Mounting |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | Mounting |
| Scotch Magic 810 Invisible Tape (19mm×25.4m) | 3M Company | 810 | Mounting |
| Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | Antibody incubaton |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | Nucleic acid staining. Dissolve in deionized water to make a 5 mg/mL stock solution and store at -80°C. Dilute to a working concentration of 10-20 μg/mL in PBTx. |
| 3.5X-90X Stereo Zoom Inspection Industrial Microscope | AmScope | SM-1BNZ | Dissection scope. Equipped with 6W LED Dual Gooseneck Illuminator |
| ImageJ/Fiji | NIH | v1.51u | With SCF_MPI_CBG plugins (version 1.1.2) |
| FV1000-IX81 Confocal-laser Scanning Microscope | Olympus | ||
| Recombinant Construct | Bloomington Drosophila Stock Center | BL37749 |
References
- Erkkinen, M. G., Kim, M. -O., Geschwind, M. D. Clinical Neurology and Epidemiology of the Major Neurodegenerative Diseases. Cold Spring Harbor perspectives in biology. , a033118 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature methods. 9 (7), 671 (2012).
- Mauvezin, C., Ayala, C., Braden, C. R., Kim, J., Neufeld, T. P. Assays to monitor autophagy in Drosophila. Methods. 68 (1), 134-139 (2014).
- Weiss, K. R., Kimura, Y., Lee, W. -C. M., Littleton, J. T. Huntingtin aggregation kinetics and their pathological role in a Drosophila Huntington's disease model. Genetics. 190 (2), 581-600 (2012).
- Babcock, D. T., Ganetzky, B. Transcellular spreading of huntingtin aggregates in the Drosophila brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (39), E5427-E5433 (2015).
- DeVorkin, L., Gorski, S. M. Monitoring autophagy in Drosophila using fluorescent reporters in the UAS-GAL4 system. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (9), (2014).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. Journal of visualized experiments: JoVE. (37), (2010).
- Sweeney, S. T., Hidalgo, A., de Belle, J. S., Keshishian, H. Dissection of adult Drosophila brains. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2011).
- Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde fixation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 845-853 (1985).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends in neurosciences. 24 (5), 251-254 (2001).
- Fischbach, K. -F., Dittrich, A. The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure. Cell and tissue research. 258 (3), 441-475 (1989).
- Ruan, K., Zhu, Y., Li, C., Brazill, J. M., Zhai, R. G. Alternative splicing of Drosophila Nmnat functions as a switch to enhance neuroprotection under stress. Nature Communications. 6, 10057 (2015).
- Zhai, R. G., et al. NAD synthase NMNAT acts as a chaperone to protect against neurodegeneration. Nature. 452 (7189), 887 (2008).
- Li, C., et al. Spermine synthase deficiency causes lysosomal dysfunction and oxidative stress in models of Snyder-Robinson syndrome. Nat Commun. 8 (1), 1257 (2017).
- Prokop, A., Meinertzhagen, I. A. Development and structure of synaptic contacts in Drosophila. Semin Cell Dev Biol. 17 (1), 20-30 (2006).
- Maday, S., Holzbaur, E. L. Autophagosome biogenesis in primary neurons follows an ordered and spatially regulated pathway. Dev Cell. 30 (1), 71-85 (2014).
- Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker. Molecular biology of the cell. 15 (3), 1101-1111 (2004).
- Lee, S., Sato, Y., Nixon, R. A. Primary lysosomal dysfunction causes cargo-specific deficits of axonal transport leading to Alzheimer-like neuritic dystrophy. Autophagy. 7 (12), 1562-1563 (2011).
- Vincent, L., Soille, P. Watersheds in digital spaces: an efficient algorithm based on immersion simulations. IEEE Transactions on Pattern Analysis & Machine Intelligence. (6), 583-598 (1991).
- Najman, L., Schmitt, M. Geodesic saliency of watershed contours and hierarchical segmentation. IEEE Transactions on pattern analysis and machine intelligence. 18 (12), 1163-1173 (1996).
- Shiber, A., Breuer, W., Ravid, T. Flow cytometric quantification and characterization of intracellular protein aggregates in yeast. Prion. 8 (3), 276-284 (2014).
- Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. Methods in mammalian autophagy research. Cell. 140 (3), 313-326 (2010).
