لقد قمنا بتطوير سير عمل بسيطة وقابلة للتكيف لاستخراج البيانات الكمية من دراسات بيولوجية الخلية المستندة إلى تصوير fluorescence تجميع البروتين والتمويه أوتوفاجيك في الجهاز العصبي المركزي لنماذج المورفولوجية نيوروديجينيريشن.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
بيولوجيا الخلية كمية من نيوروديجينيريشن في المورفولوجية من خلال تحليل غير منحازة للبروتينات فلوريسسينتلي المعلمة باستخدام إيماجيج
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
مع تزايد انتشار أمراض الأعصاب، من المهم فهم الفيزيولوجيا المرضية الكامنة التي تؤدي إلى الخلل في الخلايا العصبية وفقدان. تكنولوجيات وأدوات التصوير القائم على الأسفار تمكين تحليل لم يسبق لها مثيل للعمليات العصبية الحيوية سوبسيلولار، ومع ذلك لا يزال هناك حاجة إلى اتباع نهج غير متحيز، واستنساخه، وموجودا لاستخراج البيانات القابلة للقياس الكمي من التصوير الدراسات . قمنا بتطوير سير عمل بسيطة وقابلة للتكيف لاستخراج البيانات الكمية من دراسات التصوير القائم على الأسفار باستخدام نماذج المورفولوجية نيوروديجينيريشن. على وجه التحديد، يمكننا وصف نهج شبه الآلي، وسهلة لمتابعة استخدام فيجي/إيماجيج لتحليل العمليات الخلوية هما: أولاً، نحن قياس محتوى البروتين الكلي والشخصية في الفص البصري المورفولوجية استخدام المسخ معلم فلوري البروتينات هونتينجتين؛ وثانيا، نقيم التمويه يحلول أوتوفاجي في نظام البصرية المورفولوجية الكمي على أساس راتيوميتريك لمراسل الفلورسنت جنبا إلى جنب مع أوتوفاجي. الأهم من ذلك، يتضمن البروتوكول الواردة هنا خطوة تقسيم شبه الآلي لضمان يتم تحليل جميع الهياكل الفلورية إلى أدنى حد تحيز الانتقاء وزيادة دقة مقارنات دقيقة. يمكن توسيع هذا النهج لتحليل الهياكل البيولوجية الأخرى الخلية وعمليات متورطين في نيوروديجينيريشن، مثل بونكتا البروتينية (حبيبات الإجهاد ومجمعات متشابك)، كذلك غشاء ربط الأجزاء الأخرى (الميتوكوندريا و غشاء الحويصلات الاتجار بالبشر). يوفر هذا الأسلوب الموحد، بعد إشارة قابلة للتكيف نقطة لتحليل الصور والقياس الكمي، ويمكن تيسير والموثوقية وإمكانية تكرار نتائج عبر الحقل، وفي نهاية المطاف تعزيز فهم الميكانيكية نيوروديجينيريشن.
المقدمة
أمراض الأعصاب تؤثر على ملايين الناس كل عام، وهو تزايد حالات الإصابة شيخوخة سكان1. بينما كل مرض الأعصاب مسببات فريدة من نوعها، يتم تجميع البروتينات تجمعات وانهيار شبكة بروتيوستاسيس بصمات المرضية الشائعة لكثير من هذه الأمراض. توضيح كيفية تعطيل هذه العمليات المترابطة والأساسية تخفق لتسهم في وفاة الخلل والخلايا العصبية أمر بالغ الأهمية لفهم أمراض الأعصاب، فضلا عن توجيه التدخلات العلاجية. تصوير المستندة إلى الأسفار يسمح للتحقيق في هذه العمليات المعقدة والديناميكية في الخلايا العصبية، وقد ساهم إلى حد كبير في فهمنا لبيولوجيا الخلايا العصبية. تحليل البروتينات فلوريسسينتلي المعلمة يمثل تحديا، لا سيما عندما يتم إجراء التجارب في فيفو، سبب الأنسجة....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1-الاعتبارات والتحضير لتصميم التجربة تحليل الصورة
- تحدد مسبقاً الخلوية التشريحية، مناسبة، أو علامات سوبسيلولار لتكون بمثابة معالم لتوحيد منطقة الاهتمام (ROI) عبر عينات مختلفة، على سبيل المثال 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI)، علامات غشاء، فلوري مترجمة البروتين، و ما إلى ذلك
- حدد علامة نيون يمكن تحديد بونكتا منفصلة تتجاوز مستويات الخلفية للهيكل للفائدة.
ملاحظة: هذا البروتوكول هو الأمثل للهياكل البروتينية (مثلاً، المجاميع تجمعات البروتين) وربط الغشاء العضيات (مثلاً، مراسل أوتوفاجي). تصور تجميع البروتين، كان جزء بلغة الطرفي ن معلم طلب تقديم العروض للبشرية Htt البروتين مع قطعة polyQ المسببة للأمراض ليكرر 138 (RFP-hHttQ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
التحديد الكمي لعدد ومجال، وكثافة للمعلمة فلوريسسينتلي المجاميع Htt المسخ في الفص البصري المورفولوجية
للتحقيق في تجميع البروتين تجمعات في الجهاز العصبي المركزي لنموذج المورفولوجية لمرض هنتنغتون، معلم RFP المسخ Htt البشرية مع غير المرضية (UAS-RFP-hHttQ15) أو توسيع المرضية ( UAS-RFP-hHttQ138)، وأعرب المشترك تحت سائق عموم العصبية elav-GAL4غشاء بروتينات فلورية خضراء (UAS-mCD8::GFP)
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يمكن استخدام البروتوكول الواردة هنا قوة وتكاثر كوانتيتاتي خلية العمليات البيولوجية التي تصور بتصوير المستندة إلى الأسفار. السياق البيولوجي والقيود التقنية بحاجة إلى النظر بعناية لتوجيه تصميم تجريبي. علامات مضيئة من هياكل سوبسيلولار للفائدة، سواء المناعي، صبغي، أو أعرب وراثيا، بحاجة إلى تكون مميزة فوق الخلفية بالتشكل وكثافة. نظام UAS/GAL4 يستخدم على نطاق واسع محرك التعبير الجيني المستهدف في المورفولوجية. تستخدم الأمثلة المقدمة هنا خطوط المحورة وراثيا تحمل السائقين GAL4 لتنشيط نسخ بروتينات المعلمة فلوريسس.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
هذا العمل تدعمه شيلا، وديفيد فوينتي الأعصاب الألم برنامج الدراسات العليا زمالة بحثية (إلى J.M.B.)، وبرنامج الزملاء حياة البابا لويس (للبنود و Y.Z. و J.M.B.)، "زمالة مؤسسة" سنايدر-روبنسون بريدوكتورال (للبنود)، تي جون د. . مؤسسة ماكدونالد (للبنود)، العقود، منح من المعاهد الوطنية للصحة (المعاهد الوطنية للصحة) HHSN268201300038C و R21GM119018 و R56NS095893 (R.G.Z.)، ومشروع الباحث تايشان (مقاطعة شاندونغ، جمهورية الصين الشعبية) (إلى R.G.Z.).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| SYLGARD (R) 184 مجموعة المطاط الصناعي المصنوعة من السيليكون | Dow Corning Corporation | PF184250 | طبق تشريح |
| Falcon 35 مم غير معالج TC سهل الإمساك بأسلوب بكتريولوجي | طبق بتري Corning | 351008 | طبق تشريح |
| Dumont # 5 ملقط | أدوات العلوم الدقيقة | 11251-20 | أداة تشريح |
| محلول كلوريد الصوديوم | Sigma | S3014 | PBS |
| فوسفات الصوديوم ثنائي السمك | محلول Sigma | S5136 | PBS |
| فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة | Sigma | P5655 | PBS |
| حل Triton ؛ X-100 | Sigma | T9284 | محلول الغسيل والأجسام المضادة. |
| 37٪ الفورمالديهايد | VWR | 10790-710 | تثبيت |
| أنابيب الطرد المركزي الدقيقة التي يمكن التخلص منها (0.5 مل ، أزرق) | VWR | 89000-022 | التثبيت والغسيل وحاضنة الأجسام المضادة. |
| صغيرة عادية وبلورية (25 مرة; 75 مم) | VWR | 48312-004 | شرائح للتصوير متحد البؤر |
| نظارات الغطاء الصغير ، مستطيلة (22 مرة ؛ 40 مم) | VWR | 48393-172 | شرائح للتصوير متحد البؤر |
| المطاط الأسمنت | الوحل | 1051-A | تصاعد |
| VECTASHIELD المضاد للتلاشي تصاعد مختبرات ناقلات متوسطة | ، Inc. | H-1000 | تصاعد |
| سكوتش ماجيك 810 شريط غير مرئي (19 مم & مرات ؛ 25.4 م) | شركة 3M | 810 | تصاعد |
| مصل الماعز العادي | ثيرمو فيشر العلمي | PCN5000 | الأجسام المضادة incubaton |
| DAPI (4 '، 6-Diamidino-2-Phenylindole، Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | تلطيخ الحمض النووي. يذوب في الماء منزوع الأيونات لعمل محلول مخزون 5 مجم / مل ويخزن عند -80 درجة مئوية. جم / مل في PBTx. |
| 3.5X-90X ستيريو تكبير التفتيش المجهر الصناعي | AmScope | SM-1BNZ | نطاق التشريح. مجهزة بإضاءة مزدوجة معقوفة 6W |
| ImageJ / Fiji | NIH | v1.51u | مع SCF_MPI_CBG المكونات الإضافية (الإصدار 1.1.2) |
| FV1000-IX81 مجهر المسح الضوئي بالليزر المحوري | أوليمبوس | ||
| المؤتلف بناء | مركز مخزون بلومنجتون ذبابة الفاكهة | BL37749 |
المراجع
- Erkkinen, M. G., Kim, M. -O., Geschwind, M. D. Clinical Neurology and Epidemiology of the Major Neurodegenerative Diseases. Cold Spring Harbor perspectives in biology. , a033118(2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-imag....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
