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Neuroscience

मात्रात्मक सेल Neurodegeneration की Drosophila में फ्लोरोसेंट टैग प्रोटीन ImageJ का उपयोग कर के निष्पक्ष विश्लेषण के माध्यम से जीवविज्ञान

Published: August 3, 2018 doi: 10.3791/58041
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Molecular and Cellular Pharmacology, University of Miami Miller School of Medicine, 2School of Pharmacy, Key Laboratory of Molecular Pharmacology and Drug Evaluation (Yantai University), Ministry of Education, Collaborative Innovation Center of Advanced Drug Delivery System and Biotech Drugs in Universities of Shandong, Yantai University

Summary

हम एक सरल और अनुकूलनीय कार्यप्रवाह विकसित किया है प्रतिदीप्ति से मात्रात्मक डेटा निकालने के लिए-इमेजिंग-आधारित सेल जैविक अध्ययन के प्रोटीन एकत्रीकरण और autophagic फ्लक्स के केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में Drosophila मॉडल के neurodegeneration ।

Abstract

neurodegenerative रोगों की बढ़ती व्यापकता के साथ, यह तेजी से महत्वपूर्ण है कि अंतर्निहित pathophysiology को समझने के लिए है कि ंयूरॉन रोग और हानि की ओर जाता है । प्रतिदीप्ति आधारित इमेजिंग उपकरण और प्रौद्योगिकियों उपसेलुलर neurobiological प्रक्रियाओं का अभूतपूर्व विश्लेषण सक्षम है, अभी तक वहां अभी भी निष्पक्ष, reproducible के लिए एक की जरूरत है, और इमेजिंग अध्ययन से quantifiable डेटा निकालने के लिए सुलभ दृष्टिकोण . हम neurodegeneration के Drosophila मॉडल का उपयोग प्रतिदीप्ति आधारित इमेजिंग अध्ययनों से मात्रात्मक डेटा को निकालने के लिए एक सरल और अनुकूलनीय कार्यप्रवाह विकसित किया है. विशेष रूप से, हम दो सेलुलर प्रक्रियाओं का विश्लेषण करने के लिए फिजी/ImageJ का उपयोग कर एक आसान पालन, अर्द्ध स्वचालित दृष्टिकोण का वर्णन: पहले, हम Drosophila ऑप्टिक पालि में फ्लोरोसेंट-टैग उत्परिवर्ती का उपयोग प्रोटीन समग्र सामग्री और प्रोफ़ाइल यों तो । huntingtin प्रोटीन; और दूसरा, हम ratiometric के साथ Drosophila दृश्य प्रणाली में autophagy-lysosome फ्लक्स-ठहराव के एक मिलकर फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के autophagy आधारित आकलन । महत्वपूर्ण बात, प्रोटोकॉल यहां उल्लिखित एक अर्द्ध स्वचालित विभाजन कदम सभी फ्लोरोसेंट संरचनाओं को सुनिश्चित करने के लिए चयन पूर्वाग्रह को कम करने और सूक्ष्म तुलना के संकल्प को बढ़ाने के विश्लेषण कर रहे है शामिल हैं । इस दृष्टिकोण के अंय सेल जैविक संरचनाओं और neurodegeneration में फंसा प्रक्रियाओं के विश्लेषण के लिए बढ़ाया जा सकता है, जैसे proteinaceous puncta (तनाव granules और synaptic परिसरों), साथ ही झिल्ली बंधे डिब्बों (mitochondria और झिल्ली ्े बुलबुले) । इस विधि छवि विश्लेषण और ठहराव के लिए एक मानकीकृत, अभी तक अनुकूलनीय संदर्भ बिंदु प्रदान करता है, और क्षेत्र भर में विश्वसनीयता और reproducibility की सुविधा सकता है, और अंततः neurodegeneration की यंत्रवत समझ में वृद्धि ।

Introduction

Neurodegenerative रोगों हर साल लाखों लोगों को प्रभावित और घटना एक उंर बढ़ने आबादी1के साथ बढ़ रही है । जबकि प्रत्येक neurodegenerative रोग एक अद्वितीय एटियलजि है, विश्लेषण प्रोटीन और proteostasis नेटवर्क के टूटने के एकत्रीकरण इन रोगों के कई रोग की पहचान आम हैं । Elucidating कैसे इन मौलिक और संबंधित प्रक्रियाओं के विघटन गड़बड़ा जाता है के लिए ंयूरॉन रोग और कोशिका मृत्यु में योगदान neurodegenerative रोगों को समझने के लिए महत्वपूर्ण है के रूप में के रूप में अच्छी तरह से उपचारात्मक हस्तक्षेप मार्गदर्शन । प्रतिदीप्ति-आधारित इमेजिंग न्यूरॉन्स में इन जटिल और गतिशील प्रक्रियाओं की जांच के लिए अनुमति देता है और बहुत न्यूरॉन्स सेल जीव विज्ञान की हमारी समझ के लिए योगदान दिया है. फ्लोरोसेंट टैग प्रोटीन का विश्लेषण चुनौतीपूर्ण है, खासकर जब प्रयोग vivo मेंकिया जाता है, अत्यधिक कॉंपैक्ट ऊतकों के कारण, विविध कोशिका प्रकार, और रूपात्मक विविधता । मैंयुअल रूप से सहायता ठहराव सस्ती और सीधा है, लेकिन अक्सर समय लेने वाली और मानव पूर्वाग्रह के अधीन है । इसलिए, वहां निष्पक्ष, reproducible, और इमेजिंग अध्ययन से quantifiable डेटा निकालने के लिए सुलभ दृष्टिकोण के लिए एक की जरूरत है ।

हम फिजी/ImageJ, एक शक्तिशाली और स्वतंत्र रूप से सुलभ छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर2,3, के प्रयोगात्मक मॉडल में प्रतिदीप्ति इमेजिंग अध्ययन से मात्रात्मक डेटा निकालने के लिए का उपयोग कर एक सरल और अनुकूलनीय कार्यप्रवाह रेखांकित किया है neurodegeneration प्रयोग Drosophila। इस प्रोटोकॉल का पालन करके प्रोटीन एकत्रीकरण और autophagic फ्लक्स-दो कोशिका जैविक विशेषताएं है कि अत्यधिक neurodegenerative रोग विकृति विज्ञान के लिए प्रासंगिक है-हम संवेदनशीलता और इस दृष्टिकोण के reproducibility का प्रदर्शन किया । Drosophila ऑप्टिक पालि में फ्लोरोसेंट टैग उत्परिवर्ती huntingtin (Htt) प्रोटीन का विश्लेषण संख्या, आकार, और प्रोटीन समुच्चय की तीव्रता का पता चला । हम Drosophila दृश्य प्रणाली है, जो अलग उत्सर्जन कंपार्टमेंट पर्यावरण4के आधार पर संकेत प्रदर्शित करता है के भीतर autophagic फ्लक्स के एक मिलकर फ्लोरोसेंट रिपोर्टर visualized । Ratiometric-मिलकर रिपोर्टर के विश्लेषण आधारित autophagosome गठन, परिपक्वता से autophagy-lysosome प्रवाह के एक मात्रात्मक और व्यापक देखने के लिए अनुमति दी, और lysosome में गिरावट के लिए परिवहन, और इसके अलावा कमजोर प्रकाश डाला neurodegenerative परिस्थितियों में डिब्बों में खलल डाला । महत्वपूर्ण बात, दोनों विश्लेषण में हम अपने प्रोटोकॉल में अर्द्ध स्वचालित थ्रेसहोल्ड और विभाजन कदम लागू करने के लिए बेहोश पूर्वाग्रह को कम करने, नमूना शक्ति में वृद्धि, और एक मानक प्रदान करने के लिए समान अध्ययन के बीच तुलना की सुविधा । सरल कार्यप्रवाह को शक्तिशाली फिजी/ImageJ plugins (कंप्यूटर वैज्ञानिकों द्वारा विकसित गणित एल्गोरिदम के आधार पर) अधिक neurobiologists और बड़े पैमाने पर जीवन विज्ञान समुदाय के लिए सुलभ बनाने का इरादा है ।

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Protocol

1. छवि विश्लेषण प्रयोग को डिजाइन करने के लिए विचार और तैयारी

  1. विभिंन नमूनों में ब्याज (ROI) के क्षेत्र का मानकीकरण करने के लिए उपयुक्त संरचनात्मक, सेलुलर, या उपसेलुलर मार्करों का निर्धारण करना, उदाहरण के लिए 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), झिल्ली मार्कर, स्थानीयकृत फ्लोरोसेंट प्रोटीन, आदि ।
  2. एक फ्लोरोसेंट मार्कर का चयन करें कि ब्याज की संरचना के लिए पृष्ठभूमि के स्तर से परे असतत puncta सीमांकन कर सकते हैं ।
    नोट: इस प्रोटोकॉल proteinaceous संरचनाओं के लिए अनुकूलित है (उदाहरणके लिए, प्रोटीन समुच्चय) और झिल्ली बंधे organelles (जैसे, autophagy रिपोर्टर) । प्रोटीन एकत्रीकरण कल्पना करने के लिए, एक आरएफपी-टैग N-टर्मिनल टुकड़ा मानव Htt प्रोटीन का एक रोगजनक polyQ पथ के साथ १३८ दोहराने (आरएफपी-hHttQ138) का इस्तेमाल किया गया था5. उत्परिवर्ती Htt प्रोटीन रूपों cytoplasmic समुच्चय जब ऐसे elav-GAL45,6के रूप में ंयूरॉंस विशिष्ट ड्राइवरों के तहत व्यक्त की । autophagosome-lysosome फ्लक्स कल्पना करने के लिए, actin-GAL4 मिलकर बैरे की अभिव्यक्ति ड्राइव mCherry-GFP-Atg8a रिपोर्टर का इस्तेमाल किया गया था । mCherry-और GFP-पॉजिटिव puncta संकेत autophagosomes है, और प्रवाह GFP प्रतिदीप्ति के अम्लीय वातावरण में बुझती है के रूप में निगरानी की जाती है, जहां एसिड असंवेदनशील lysosome रहता है जब तक प्रोटीन7नीचा है । ratiometric विश्लेषण के लिए, एक एकल चैनल संरचना का एक सुसंगत मार्कर है कि विभाजन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, या यदि उचित दो या अधिक चैनलों के एक प्रक्षेपण चित्रित संरचनाओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, हालांकि स्पष्ट रूप से इस प्रोटोकॉल में वर्णित नहीं है । इस उदाहरण में, mCherry Atg8-सकारात्मक कणों के विभाजन के लिए प्रयोग किया जाता है, के रूप में यह एसिड असंवेदनशील है और मार्ग के माध्यम से प्रवाह भर डिब्बे में रहेगा ।
  3. डाउनलोड और स्थापित खुला स्रोत छवि विश्लेषण मंच ImageJ या फिजी-बंडल plugins के साथ ImageJ के पसंदीदा वितरण2,3।
  4. एच के लिए प्लगइन स्थापित करें-maxima इंटरएक्टिव वाटरशेड ।
    नोट: यह प्रोटोकॉल फिजी का उपयोग करता है; अतिरिक्त plugins ImageJ के लिए आवश्यक हो सकता है । एससीएफ-MPI-CBG के लिए Benoit Lombardot द्वारा विकसित प्लग-इन ऑनलाइन (https://imagej.net/Interactive_Watershed) उपलब्ध है ।
  5. नेविगेट करने के लिए "मदद । अद्यतन "," ImageJ updater "से" अद्यतन साइटों का प्रबंधन "का चयन करें, सूची से एससीएफ-MPI-CBG अद्यतन साइट चुनें, और उसके बाद बंद करें और फिजी को पुनरारंभ करें ।

2. मस्तिष्क विच्छेदन और इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला

  1. सिलिकॉन elastomer-पंक्तिबद्ध विच्छेदन व्यंजन बनाओ ।
    1. निर्माता द्वारा संकेत के रूप में एक चोंच में सिलिकॉन elastomer घटकों डालो और अच्छी तरह से जब तक अच्छी तरह से मिश्रित हलचल ।
    2. 5 सेमी टिशू कल्चर को भरने के लिए एक पिपेट का प्रयोग करें एक तिहाई से आधे पूरे (elastomer मिश्रण के बारे में 10 मिलीलीटर) । किसी भी बुलबुले सतह पर चढ़ा और धीरे से ऊतक कागज के साथ हटाने के लिए अनुमति दें । बर्तन कवर और उंहें एक स्तर की सतह पर जगह 48 के लिए इलाज के लिए-कमरे के तापमान (आरटी) में 72 घंटे ।
  2. काटना Drosophila मस्तिष्क, और दृश्य प्रणाली अगर जरूरत थी ।
    1. प्रदर्शन Drosophila मस्तिष्क विच्छेदन के रूप में पहले8,9वर्णित है । elastomer में विच्छेदन-लाइन विच्छेदन व्यंजन प्रदर्शन, एक elastomer नीचे का उपयोग करने के लिए मस्तिष्क को स्थिर करने के लिए हानिकारक ऊतक या संदंश से बचने ।
    2. विच्छेदन के दौरान बरकरार लेमिना रखने के लिए, रेटिना के नीचे दो संदंश स्लाइड और धीरे आंख के बीच के माध्यम से आंसू रेटिना को दूर करने के लिए । दूर किसी भी रेटिना लेमिना सतह के समानांतर आयोजित संदंश के साथ लेमिना से जुड़ी ऊतक खींचो ।
      नोट: अवशिष्ट वर्णक निंनलिखित चरणों में धोना होगा और आमतौर पर एंटीबॉडी धुंधला और इमेजिंग के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है ।
    3. फॉस्फेट बफर खारा में ३७% formaldehyde पतला (पंजाब) एक ५०० µ एल microcentrifuge ट्यूब में उपयोग करने से पहले ३.७% ताजा की एक अंतिम एकाग्रता बनाने के लिए. ठीक समाधान और कोमल कमाल के साथ आरटी पर 15 मिनट के लिए मशीन के साथ microcentrifuge ट्यूब के लिए विच्छेदित मस्तिष्क हस्तांतरण ।
      नोट: Formaldehyde ऑक्सीकरण होना करने के लिए एक प्राकृतिक प्रवृत्ति है, फार्मिक एसिड का उत्पादन. इसलिए, यह aliquot करने के लिए सुझाव दिया है ३७% formaldehyde भंडारण के लिए और ३.७% नए सिरे से करने के लिए प्रत्येक उपयोग से पहले पतला । अधिक निर्धारण या अंडर-निर्धारण ऊतक की अखंडता और प्रतिदीप्ति10को प्रभावित करेगा ।
    4. PBTx के साथ 3 बार धो (०.४% ट्राइटन एक्स के साथ पंजाब-१००) 15 मिनट के लिए प्रत्येक ।
  3. प्रदर्शन immunohistochemistry और नमूनों माउंट ।
    1. यदि एंटीबॉडी दाग की जरूरत है, PBTx को हटाने, 5% सामांय बकरी सीरम के साथ PBTx में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर एक aliquot मिक्सर पर मशीन ।
    2. प्राथमिक एंटीबॉडी निकालें और 15 मिनट प्रत्येक के लिए PBTx के साथ 3 बार धो लो । माध्यमिक एंटीबॉडी 5% सामांय बकरी सीरम के साथ PBTx में पतला जोड़ें और आरटी पर 1 घंटे या 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर के लिए गर्मी । 15 मिनट प्रत्येक के लिए PBTx के साथ 3 बार धो लें ।
    3. यदि DAPI धुंधला की जरूरत है, PBTx को हटाने, DAPI समाधान (शेयर समाधान: 5 मिलीग्राम/एमएल, 15 µ जी के एक काम एकाग्रता के लिए पतला/PBTx में), और 10 मिनट के लिए RT. धो 15 मिनट प्रत्येक के लिए PBTx के साथ 3 बार ।
    4. ऊतक स्पष्ट करने के लिए, दोनों पक्षों पर स्पष्ट टेप की एक परत की एक स्पेसर के साथ एक माइक्रोस्कोपी स्लाइड के केंद्र पर बढ़ते माध्यम की एक बूंद जगह है । बढ़ते माध्यम के ड्रॉप पर मस्तिष्क स्थानांतरण, और 1 के लिए प्रतीक्षा-2 मिनट तक मस्तिष्क पारदर्शी हो जाता है । ध्यान से एक पिपेट के साथ बढ़ते माध्यम को दूर ।
    5. माउंट करने के लिए, स्लाइड पर दिमाग पर ताजा बढ़ते माध्यम की एक बूंद लागू होते हैं । ध्यान से बुलबुले से बचने के एक कवर गिलास ओवरले । रबर सीमेंट के साथ किनारों को सील करें, और 20 मिनट के लिए आर टी पर शुष्क हवा । सर्वश्रेष्ठ परिणामों के लिए छवि अधिग्रहण के लिए आगे बढ़ें ।

3. छवि अधिग्रहण

  1. स्थानिक संकल्प, उद्देश्य, जूम, स्कैनिंग गति, और कदम आकार सहित माइक्रोस्कोप अधिग्रहण मापदंडों का अनुकूलन, छवि विश्लेषण के दौरान अर्द्ध स्वचालित विभाजन की सुविधा के लिए ब्याज की संरचनाओं के संकल्प को अधिकतम करने के लिए ।
    नोट: यह एक नमूना छवि और परीक्षण अर्द्ध स्वचालित विभाजन (इस प्रोटोकॉल के चरण 5 में) सभी प्रायोगिक नमूनों इमेजिंग से पहले पर कब्जा करने के लिए उपयोगी हो सकता है । इस तरह उपयोगकर्ता इमेजिंग सेटिंग्स समायोजित कर सकते है ताकि विश्लेषणात्मक उपकरण आसानी से ब्याज की जैविक संरचना को समझदार कर सकते हैं ।
  2. सबसे अधिक संकेत करने वाली शोर अनुपात और नमूना के उच्चतम गतिशील रेंज पर कब्जा करने के लिए छवि डिटेक्टर नियंत्रण को समायोजित करें ।
    1. एक LUT का प्रयोग करें (तालिका को देखो) कि पिक्सेल संतृप्ति (जोखिम बहुत अधिक) या संतृप्ति (बहुत कम ऑफसेट) इंगित करता है, जबकि सेटिंग्स समायोजित (चित्र, लाल एक हाय/
    2. पुष्टि लाभ और ऑफसेट सेटिंग्स सभी प्रयोगात्मक समूहों के लिए उपयुक्त हैं, के रूप में प्रयोगात्मक जोड़तोड़ की संभावना ब्याज की संरचना बदल जाते हैं ।
      नोट: यह आवश्यक है कि एक ही सेटिंग्स सभी समूहों के लिए मात्रात्मक तुलना करने के लिए उपयोग किया जाता है ।
  3. ऊतक के माध्यम से छवि सभी डेटा पर कब्जा करने के लिए ।
    नोट: यह एक इमेजिंग सत्र के दौरान उपलब्ध डेटा के सभी पर कब्जा करने के लिए और यदि आवश्यक हो तो चरण 4 में रॉय चयन के दौरान एक और अधिक सटीक क्षेत्र को परिभाषित करने के लिए सिफारिश की है ।
  4. छवि को इमेजिंग सॉफ़्टवेयर द्वारा समर्थित फ़ाइल प्रकार के रूप में सहेजें ताकि प्राप्ति पैरामीटर और स्थानिक अंशांकन जैसे मेटाडेटा को संरक्षित किया जा सके. प्रयोगात्मक तिथि, आनुवंशिक पृष्ठभूमि, और फ्लोरोसेंट पत्रकारों, एंटीबॉडी, या जैसे स्कैन चैनलों के लिए इसी रंजक सहित एक फ़ाइल नाम के साथ छवि सहेजें [प्रायोगिक समूह का नाम] _ [नमूना नाम] _ [प्रयोग दिनांक] _Ch1. [Fluorophore-लक्ष्य /Dye] _Ch2 [Fluorophore-target/डाई], etc.

4. फ़िजी/ImageJ छवि आयात और ROI चयन

  1. फिजी में एक छवि खोलें । "जैव-स्वरूप आयात विकल्प" संवाद बॉक्स का उपयोग करें, "देखें स्टैक के साथ: Hyperstack" और सेट "रंग मोड: ग्रेस्केल" चुनें ।
    ध्यान दें: यह माइक्रोस्कोप फ़ाइल प्रकार खोलने के लिए सिफारिश की है, जैसे स्थानिक अंशांकन फिजी द्वारा पढ़ा जा सकता है के रूप में मेटाडाटा ।
  2. एक z-विमान या मार्कर चैनल (ओं) है कि नमूनों भर में एक मानकीकृत रॉय के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है (चित्रा 1, रॉय चयन) के आधार पर प्रक्षेपण से एक क्षेत्र की पहचान करें ।
    1. चरण १.१ में निर्दिष्ट मार्कर (s) कैप्चर करने के लिए उपयोग किया गया चैनल (ओं) को देखने के लिए "C" स्क्रॉल पट्टी का उपयोग करें ।
    2. फोकल विमानों के माध्यम से स्थानांतरित करने के लिए "Z" स्क्रॉल पट्टी का उपयोग करें । एक स्लाइस चुनें या क्लिक करके एकाधिक स्लाइस का एक प्रक्षेपण बनाएं "छवि । पोट | Z परियोजना "और सेट" टुकड़ा शुरू "और" स्लाइस बंद करो "रॉय शामिल करने के लिए ।
      नोट: यह सभी अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है, हालांकि "" Z प्रोजेक्ट "संवाद बॉक्स में" अधिकतम तीव्रता "करने के लिए" प्रोजेक्शन प्रकार "सेटिंग अक्सर सबसे अच्छा खंड 5 में विभाजन के लिए संरचनाओं पर जोर देने के लिए अनुकूल है । यदि किसी अंय प्रकार के प्रक्षेपण के विश्लेषण के लिए आवश्यक है, ध्यान रखना बचाने के लिए और इस तरह के रूप में सुविधा निष्कर्षण के लिए इस फ़ाइल दस्तावेज़ अनुभाग 6 और/
    3. छवि विश्लेषण प्रोटोकॉल में निम्न चरणों को सरल करने के लिए ब्याज की चैनल (ओं) और फोकल विमान (s) युक्त एक नई छवि उत्पन्न करें । चुनें "छवि । डुप्लिकेट ", सेट वांछित" चैनल "(सी) और" स्लाइस "(जेड), और चयन को प्रतिबिंबित करने के लिए फ़ाइल का नाम परिवर्तित करें (उदा., [प्रायोगिक समूह का नाम] _ [नमूना नाम] _ [प्रयोग दिनांक] _ [चैनल (s)] _ [z-विमान (s)]) ।
  3. "चयन उपकरण" में से एक का प्रयोग करें फिजी टूलबार पर एक मानकीकृत रॉय चयन मानदंड ४.२ चरण में निर्धारित पर आधारित का चयन करें ।
  4. क्लिक करके रॉय प्रबंधक को रॉय जोड़ें "विश्लेषण । उपकरण । रॉय प्रबंधक "और रॉय प्रबंधक मेनू पर" जोड़ें "क्लिक करें । पर क्लिक करके रॉय प्रबंधक मेनू से रॉय सहेजें "अधिक । सहेजें ", और फिर रॉय को प्रतिबिंबित करने के लिए फ़ाइल का नाम (उदा., [प्रायोगिक समूह का नाम] _ [नमूना नाम] _ [प्रयोग दिनांक] _ [चैनल (s)] _ [z-विमान (s)] _ [ROI विवरण]) ।
    नोट: यह बाद में विश्लेषण के लिए फिजी में फिर से खोला जा सकता है या अंय चैनल या चित्र के रूप में ५.३ अनुभाग में लागू किया जा सकता है ।

5. प्रक्रिया और ज-maxima Watershedding के साथ विभाजन

  1. ब्याज की संरचनाओं पर कब्जा करने के लिए इस्तेमाल किया चैनल पर जुलूस प्रदर्शन करते हैं ।
    1. यदि छवि फ़ाइल एकाधिक चैनलों के होते हैं, क्लिक करके चैनल अलग "छवि । रंग | चैनल विभाजित करने के लिए "हित के चैनलों को अलग करने के लिए.
    2. इस तरह के एक औसत फिल्टर के रूप में लागू करने के लिए शोर या गाऊसी धुंधला को कम करने के लिए क्लिक करके "प्रक्रिया । फिल्टर । फ़िल्टर प्रकार "(उदा.," माध्य फ़िल्टर "या" गाऊसी धुंधला ").
      1. प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह से छवियों पर नमूना अलग फिल्टर और फिल्टर मापदंडों । विभाजन प्रदर्शन की जाँच करने के लिए प्रत्येक समूह से एक प्रतिनिधि उदाहरण के साथ चरण ६.२ के माध्यम से आगे बढ़ें । उन फ़िल्टर और सेटिंग का चयन करें जो ब्याज की संरचनाओं के विभाजन को सुगम बनाता है ।
    3. फ़िल्टर और सेटिंग रिकॉर्ड करें । इन पैरामीटर्स को प्रायोगिक समूहों में लागू करें ।
    4. संदर्भ के लिए लागू फ़िल्टर सहित एक tiff फ़ाइल के रूप में छवि की एक प्रतिलिपि सहेजें । किसी विस्तृत नाम का उपयोग करें जैसे [प्रायोगिक समूह का नाम] _ [नमूना नाम] _ [प्रयोग दिनांक] _ [चैनल] _ [z-विमान (s)] _ [पैरामीटर के साथ फ़िल्टर] ।
  2. जनरेट किया गया और चरण ५.१ में सहेजी गई छवि पर सहभागी h-maxima वाटरशेड उपकरण के साथ ब्याज की संरचनाओं के खंड प्रदर्शन ।
    1. फिजी में सक्रिय प्री-प्रोसेस्ड इमेज के साथ, क्लिक करके एच-maxima इंटरएक्टिव वाटरशेड टूल को आरंभ करें "एससीएफ | लेबलिंग । इंटरएक्टिव H_Watershed "।
      नोट: इस प्लगइन का सबसे पहले वाटरशेड की गणना करता है और फिर उपयोगकर्ता एक तुरन्त अद्यतन उत्पादन छवि के माध्यम से स्थानीय maxima और दहलीज पर विकल्प के प्रभाव का पता लगाने के लिए अनुमति देता है.
    2. नियंत्रण कक्ष से, बीज गतिशीलता (h), तीव्रता थ्रेशोल्ड (T), और पीक बाढ़ (%) खंड ऑप्टिमाइज़ करने के लिए समायोजित करें ।
      नोट: हमेशा के लिए खंड ४.२ से प्रक्रिया से पहले कच्चे छवि का उल्लेख करने के लिए मैंयुअल रूप से ब्याज की संरचनाओं के विभाजन के प्रदर्शन का निरीक्षण ।
    3. जब फॉल्ट परिणामों से संतुष्ट हों, तो "निर्यात क्षेत्र मास्क" चुनें और "निर्यात करें" चुनें. यह वाटरशेड परिणामों की एक बाइनरी छवि उत्पन्न करेगा (चित्रा 1, विभाजन).
    4. सेगमेंटेशन पैरामीटर्स रिकॉर्ड करना; इन मापदंडों मात्रात्मक तुलना के लिए प्रयोगात्मक समूहों में लागू किया जाना चाहिए । जैसे [प्रायोगिक समूह का नाम] _ [नमूना नाम] _ [प्रयोग दिनांक] _ [चैनल] _ [z-विमान (ओं)] _ [पैरामीटर के साथ फ़िल्टर] _ [H_Watershed पैरामीटर] _ के रूप में विस्तृत विभाजन पैरामीटर के साथ संदर्भ के लिए इच्छित बाइनरी परिणाम मास्क सहेजें ।
  3. वाटरशेड परिणामों से ब्याज की संरचनाओं निकालें ।
    1. सहेजे गए roi को चरण ४.४ से, roi प्रबंधक में खोलें. कदम से द्विआधारी क्षेत्रों मुखौटा 5.2.4 सक्रिय, के साथ रॉय प्रबंधक से लाभ के लिए छवि को लागू करने के लिए मानकीकृत रॉय के लिए सुविधा निष्कर्षण सीमा का चयन करें ।
    2. रॉय द्विआधारी वाटरशेड मास्क पर सक्रिय के साथ, चुनें "विश्लेषण । सुविधाओं को निकालने के लिए संवाद बॉक्स में चयनित "प्रबंधक में जोड़ें" के साथ कणों का विश्लेषण करें.
      नोट: यह रॉय प्रबंधक करने के लिए विभाजन के दौरान delineated प्रत्येक संरचना के लिए एक कण पहचानकर्ता जोड़ देगा । विकल्प इस मेनू पर उपलब्ध है आकार या परिपत्र के आधार पर सुविधाओं को बाहर यदि विश्लेषण में शामिल संरचनाओं को परिष्कृत करने के लिए आवश्यक हैं ।
    3. क्लिक करके कणों को बचाने "अधिक । रॉय प्रबंधक मेनू से "सहेजें. सुनिश्चित करें कि पहचानकर्ता अचयनित हैं और सभी कणों एक ज़िप फ़ाइल में सहेजा जाएगा. किसी विस्तृत नाम का उपयोग करें जैसे [प्रायोगिक समूह का नाम] _ [नमूना नाम] _ [प्रयोग दिनांक] _ [चैनल] _ [z-विमान (s)] _ [पैरामीटर के साथ फ़िल्टर] _ [H_Watershed पैरामीटर्स] _ [संरचनाएं] ।

6. मात्रा, क्षेत्र, और तीव्रता ठहराव और विश्लेषण

  1. raw छवि जनरेट किया गया और चरण ४.२ में सहेजा गया खोलें । ब्याज की संरचनाओं पर कब्जा करने के लिए इस्तेमाल किया चैनल के लिए स्क्रॉल करें ।
    नोट: यह महत्वपूर्ण है करने के लिए raw छवि से तीव्रता माप ले (पूर्व प्रक्रिया) चरण में फ़िल्टर लागू करने के रूप में ५.१ पिक्सेल मान बदलता है ।
  2. चरण ५.३ में सुविधा निष्कर्षण से प्राप्त कणों को खोलें और रॉय प्रबंधक से "सभी दिखाएं" का चयन करें ।
    नोट: यह क्रिया "ROI प्रबंधक" पर प्रत्येक कण की बाह्यरेखा छवि पर अधिव्याप्त होगी और ब्याज की संरचनाओं के किनारों (चित्र 1, सुविधा निष्कर्षण) से मेल खाना चाहिए ।
  3. क्लिक करके इच्छित माप सेट "विश्लेषण । माप सेट करें "।
    नोट: क्षेत्र, तीव्रता, और कणों का घनत्व का चयन करके मापा जा सकता है "क्षेत्र" और "एकीकृत घनत्व". एकीकृत घनत्व का चयन किया जाता है, फिजी दो मूल्यों का उत्पादन होगा: ' एकीकृत घनत्व ' क्षेत्र के उत्पाद के रूप में गणना की और ग्रे मूल्य और ' रॉ एकीकृत घनत्व ' पिक्सेल मूल्यों का योग के रूप में मापा मतलब है । कणों में फ्लोरोसेंट प्रोटीन का घनत्व क्षेत्र द्वारा विभाजित पिक्सेल मूल्यों के योग के रूप में गणना की जाती है । चरण ५.३ में उत्पन्न कणों की संख्या ऊतक रॉय चरण ४.४ में परिभाषित के भीतर कणों की मात्रा को इंगित करता है.
  4. रॉय प्रबंधक मेनू से "उपाय" चुनें । जब तक माप के रूप में इमेजिंग सॉफ्टवेयर से फिजी में व्युत्पंन फाइलों से लिया जाता है परिणाम नपे इकाइयों में व्यक्त कर रहे हैं । परिणाम खिड़की से परिणाम की प्रतिलिपि बनाएँ और संकलन और आगे की गणना के लिए स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर में पेस्ट करें ।

7. Ratiometric ठहराव और डाटा एनालिसिस

  1. चरण ६.१ और ६.२ पहले raw ब्याज चैनल पर कण पहचानकर्ता को खोलने के लिए का पालन करें ।
  2. क्लिक करके इच्छित माप सेट "विश्लेषण । माप सेट करें "।
    नोट: प्रति कण औसत तीव्रता का चयन करके मापा जा सकता है "मतलब ग्रे मान".
  3. रॉय प्रबंधक से चुनें "उपाय" । परिणाम विंडो से डेटा की प्रतिलिपि बनाएँ और स्प्रेडशीट सॉफ़्टवेयर में चिपकाएँ ।
  4. "C" स्क्रॉल पट्टी के लिए ब्याज की दूसरी रॉ चैनल, इस उदाहरण में GFP (चित्र 4a), और कदम ७.२ दोहराएँ । और ७.३.
    नोट: ५.३ चरण में सहेजे गए कणों चैनल और स्लाइस जिससे यह उत्पन्न किया गया था करने के लिए डिफ़ॉल्ट होगा । सुनिश्चित करने के लिए ध्यान रखना कणों ब्याज की सही चैनल के लिए लागू कर रहे हैं ।
  5. एक चैनल से तीव्रता के अनुपात की गणना स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर में प्रत्येक कण के लिए दूसरे की तीव्रता के लिए ।
  6. एक तितर बितर साजिश का प्रयोग करने के लिए कल्पना और fluorophores है कि अंतर्निहित जैविक प्रक्रियाओं के प्रतिबिंबित करता है व्यक्तिगत परिवर्तन प्रदर्शन से ratiometric डेटा मात्रा ।
    1. रेखांकन सॉफ्टवेयर में एक तितर बितर साजिश उत्पंन करते हैं ।
      नोट: प्रत्येक डेटा बिंदु ब्याज की एक संरचना है जहां ब्याज की पहली fluorophore की तीव्रता "x मान" है और दूसरी fluorophore की तीव्रता "y मान" प्रत्येक कण से मापा जाता है का प्रतिनिधित्व करता है ।
    2. चक्रों को परिभाषित करने के लिए प्रत्येक fluorophore के लिए गेटिंग थ्रेसहोल्ड सेट करें ।
  7. लाइन प्रोफ़ाइल का उपयोग करने के लिए ब्याज की एक संरचना में fluorophore तीव्रता कल्पना ।
    1. चरण ५.३ में जेनरेट किए गए roi का चयन करें और roi के माध्यम से सीधी रेखा आरेखित करने के लिए टूलबार पर सीधे-लाइन उपकरण का उपयोग करे. roi प्रबंधक में लाइन roi जोड़ें.
    2. ब्याज के प्रत्येक चैनल के लिए, लाइन रॉय सक्रिय के साथ, का चयन करें "विश्लेषण । प्लॉट प्रोफ़ाइल "।
      नोट: प्लॉट प्रोफ़ाइल फ़ंक्शन हिस्टोग्राम प्लॉट और रेखा के साथ तीव्रता के मानों की तालिका जेनरेट करेगा । कॉपी परिणाम प्रत्येक चैनल से मापा और स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर में पेस्ट करने के लिए एक लाइन के साथ दोनों चैनलों दिखा भूखंड उत्पंन करते हैं ।

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Representative Results

संख्या की ठहराव, क्षेत्र, और फ्लोरोसेंट की तीव्रता टैग की Drosophila ऑप्टिक पालि में उत्परिवर्ती Htt समुच्चय

एक गैर रोग (यूएएस-आरएफपी-hHttQ15) या रोग विस्तार के साथ आरएफपी-टैग उत्परिवर्ती मानव Htt Huntington की बीमारी, के एक Drosophila मॉडल के केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में सामने आया प्रोटीन एकत्रीकरण की जांच करने के लिए ( यूएएस-आरएफपी-hHttQ138) और झिल्ली GFP (यूएएस-mCD8:: GFP)11 एक पैन-न्यूरॉन चालक elav-GAL4के तहत सह-व्यक्त किया गया । महिला के दिमाग eclosion के बाद 2 दिन मक्खियों (दाे), विच्छेदित, स्थिर और DAPI के साथ दाग प्रोटोकॉल के खंड 2 के अनुसार किया गया । फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी एक 40X तेल विसर्जन उद्देश्य लेंस, १.३० संख्यात्मक एपर्चर (ना) के साथ ऑप्टिक पालि पर ध्यान केंद्रित किया गया था, पिक्सेल और १०२४ के स्थानिक संकल्प प्रति ८.० µs के एक स्कैन की गति का उपयोग १०२४ पिक्सल (पिक्सेल प्रति 12 बिट्स) । इमेजिंग सॉफ्टवेयर द्वारा निर्धारित इष्टतम कदम आकार उत्तेजना/उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के निंनलिखित संयोजन के साथ उद्देश्य के लिए १.०८ µm प्रति स्लाइस था: चैनल 1) 488/510 GFP के लिए, चैनल 2) 543/581 आरएफपी के लिए, और चैनल 3) 405/461 के लिए DAPI । छवि डिटेक्टर की तुलना के लिए उपयुक्त छवियों पर कब्जा करने के लिए सभी समूहों के लिए आवेदन किया सेटिंग्स, एक आरएफपी-Htt-Q138 नमूना है, जो उच्च तीव्रता आरएफपी-Htt समुच्चय, बजाय एक गैर रोगजनक आरएफपी-Htt-Q15 नियंत्रण नमूना है, जो बनाए रखता है पर आधारित थे फैलाना आरएफपी-Htt (चित्रा 2) के निम्न स्तर. एक आरएफपी-Htt-Q15 नमूना की गतिशील रेंज को अधिकतम करने के लिए छवि अधिग्रहण सेटिंग्स सेट थे, तो आरएफपी-Htt-Q138 समुच्चय संतृप्त किया जाएगा । उदाहरण के तौर पर Drosophila ऑप्टिक पालि में प्रोटीन एकत्रीकरण का एक micrograph HttQ138_Opticlobe के रूप में सहेजा गया. 01_01012018_Ch1. RFP-Htt_Ch2. GFP _ch3. DAPI.

पूरे ऑप्टिक पालि माइक्रोस्कोपी के दौरान imaged और के बारे में 15 z-स्लाइस शामिल किया गया था, लेकिन इमेजिंग के बाद यह निर्धारित किया गया था कि एक भी z-विमान का विश्लेषण करने के लिए व्यक्तिगत संरचनाओं कि अंयथा एक प्रक्षेपण में ओवरलैपिंग प्रकट होता हल करने के लिए सबसे अच्छा था के कारण ऊतक के भीतर उच्च घनत्व । एक मानकीकृत रॉय का निर्धारण करने के लिए, C2 और C3 कक्ष निकायों ऑप्टिक पालि12 के मज्जा और lobula प्लेट के बीच स्थित एक संरचनात्मक मील का पत्थर के रूप में इस्तेमाल किया गया । फिजी में, छवि इस प्रकार विश्लेषण आवश्यकताओं को प्रतिबिंबित करने के लिए डुप्लिकेट किया गया था और HttQ138_Opticlobe. 01_01012018_Ch1. GFP_Ch2. आरएफपी-Htt_Ch3. DAPI_z8 नामक एक tiff फ़ाइल के रूप में सहेजा गया था, जहां z8 C2 और C3 न्यूरॉन सेल निकायों सबसे अधिक थे जहां आठवें स्लाइस को दर्शाता है DAPI धुंधला (आंकड़ा 1a, छवि अधिग्रहण) द्वारा प्रमुख । बहुभुज चयन उपकरण मैंयुअल रूप से ऑप्टिक पालि एक गाइड के रूप में DAPI धुंधला और ंयूरॉन GFP संकेत का उपयोग कर के आसपास एक रॉय का चयन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था (आंकड़ा 1a, रॉय चयन, जहां पीला रॉय और लाल इंगित करता है के लिए दिखाया उच्च आवर्धन छवि निर्दिष्ट कार्यप्रवाह के निम्नलिखित पैनलों में स्पष्टता). इसके बाद, एक गाऊसी धुंधला फ़िल्टर σ मान 1 के साथ सेट करने के लिए आरएफपी-Htt चैनल के लिए लागू किया गया था छवि चिकनी और विभाजन की सुविधा (1a आंकड़ा, प्रक्रिया), और बहाव विभाजन और सुविधा के साथ निष्कर्षण के प्रदर्शन के साथ और इस के बिना चरण प्रक्रिया में चित्र 1aसचित्र है । इंटरैक्टिव एच-वाटरशेड निम्नलिखित मापदंडों के साथ आरएफपी-Htt चैनल की छवियों पर किया गया था: बीज गतिशीलता, 30; तीव्रता थ्रेशोल्ड, ५००; पीक बाढ़ (% में), ८०; ' बंटवारे की अनुमति दें ' और ' निर्यात क्षेत्रों मुखौटा ' के साथ चयनित (आंकड़ा 1a, विभाजन) । परिणामस्वरूप बाइनरी क्षेत्र मास्क HttQ138_Opticlobe के रूप में सहेजा गया था । 01_01012018_Ch2. आरएफपी-Htt_z8_GuassianBlur-sigma1_HWatershed-h30_T500_80percent और ०.४ µm के एक न्यूनतम आकार अपवर्जन के साथ विश्लेषण कणों उपकरण के साथ कणों उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया2 प्रोटीन समुच्चय को परिभाषित करने के लिए13,14 . परिणामी कणों को HttQ138_Opticlobe. 01_01012018_Ch1. आरएफपी-Htt_z8_GuassianBlur-sigma1_HWatershed-h30_T500_80percent_aggregates के रूप में ROI प्रबंधक से सहेजा गया था और कच्चे आरएफपी-Htt चैनल (प्रक्रिया से पहले) को निकालने के लिए लागू किए गए थे मात्रात्मक इमेजिंग डेटा (आंकड़ा 1a, सुविधा निष्कर्षण).

अर्द्ध की संख्या के ठहराव स्वचालित रूप से विभाजित आरएफपी- Drosophila के ऑप्टिक पालि के माध्यम से मानकीकृत फोकल विमानों से Htt समुच्चय गैर रोगजनक Htt-Q15 विस्तार और प्रोटीन के संचय के प्रसार अभिव्यक्ति का पता चला रोग द्वारा समुच्चय-कारण Htt-Q138 विस्तार (चित्रा 2a-सी) । ' रॉ एकीकृत घनत्व ' द्वारा दिए गए प्रत्येक कण में सभी पिक्सेल मूल्यों का योग प्रत्येक समग्र की आरएफपी-Htt सामग्री की तुलना के लिए उपयोग किया गया था । आकार और Htt व्यक्त पांच अलग ऑप्टिक पालियों के एक मानकीकृत फोकल विमान से सभी समुच्चय के तीव्रता प्रोफाइल-Q138 इस कार्यप्रवाह (चित्रा 2d, ई) की मजबूती और reproducibility वर्णन करते हैं । विशेष रूप से, जब समुच्चय छवि अधिग्रहण (3 ए, बी) के दौरान उजागर किया गया, आकार और समुच्चय की संख्या के ठहराव आदर्श प्रदर्शन (आंकड़ा 3सी, डी) के साथ कब्जा समुच्चय के लिए तुलनीय हैं, लेकिन उजागर समुच्चय की तीव्रता अधिकतम तीव्रता मान (चित्रा 3E, एफ) का प्रदर्शन संतृप्त पिक्सल के रूप में आकार का एक समारोह बन जाता है । इसलिए, उचित स्कैनिंग जोखिम मापदंडों की स्थापना के लिए प्रोटीन समुच्चय की मात्रात्मक आणविक संरचना की पूरी रेंज निकालने के लिए महत्वपूर्ण है ।

Drosophila दृश्य लेमिना में autophagy फ्लक्स के Ratiometric आधारित ठहराव एक मिलकर फ्लोरोसेंट Atg8a रिपोर्टर का उपयोग

Drosophila दृश्य प्रणाली में autophagy-lysosome फ्लक्स का आकलन करने के लिए mCherry-GFP-Atg8a रिपोर्टर को नियंत्रण में व्यक्त बैरे गया था या Drosophila spermine सिंथेस (dSms) homozygous उत्परिवर्ती (dSmsई/ actin-GAL4 चालक के साथ । dSmse/e मक्खियों neurodegeneration कि बिगड़ा autophagic प्रवाह के साथ जुड़ा हुआ है lysosomal रोग के कारण15। 5 दाे पर मादा मक्खियों के संलग्न लेमिना के साथ दिमाग, विच्छेदित, स्थिर और DAPI के साथ दाग थे । लेमिना एक 100X तेल विसर्जन उद्देश्य लेंस, १.३५ संख्यात्मक एपर्चर (एनए), ८.० µs प्रति पिक्सेल के एक नमूना गति पर, और पिक्सेल ऑप्टिकल संकल्प प्रति 12 बिट्स, और १.२ µm के चरण आकार के साथ लेजर से फोकल माइक्रोस्कोप स्कैनिंग द्वारा imaged था ।

यह विश्लेषण लेमिना के माध्यम से विरल Atg8-धनात्मक संरचनाओं (आंकड़ा 1b, छवि प्राप्ति) की नमूना शक्ति को बढ़ाने के लिए सात z-स्लाइस के एक अधिकतम z-प्रक्षेपण पर किया गया था । मानकीकृत रॉय मैन्युअल कोशिका शरीर परत के आसपास बहुभुज चयन उपकरण के साथ तैयार किया गया था DAPI द्वारा पता चला और अच्छी तरह से चरित्रीय शरीर रचना विज्ञान और ऊतक के सेलुलर संगठन के आधार पर (आंकड़ा 1b, रॉय चयन, जहां पीले इंगित करता है ROI और red उच्च आवर्धन छवि को वर्कफ़्लो के निम्न पैनलों में स्पष्टता के लिए दिखाए गए निर्दिष्ट करते हैं)16. मिलकर रिपोर्टर GFP और mCherry moieties की स्थिरता के गुण पर निर्भर करता है autophagy-lysosome मार्ग के माध्यम से प्रगति के निशान, ऐसी है कि GFP lysosome की अंलता से बुझती है जहां mCherry जब तक यह नीचा है रहता है । इसलिए, अब रहने वाले mCherry fluorophore इस प्रोटोकॉल में फॉल्ट के लिए इस्तेमाल किया गया था । σ मान 1 के साथ एक गाऊसी कलंक फिल्टर mCherry चैनल (चित्रा 1b, प्रक्रिया) के लिए लागू किया गया था, और इंटरैक्टिव एच वाटरशेड निम्नलिखित मापदंडों के साथ किया गया था: बीज गतिशीलता, 0; तीव्रता थ्रेशोल्ड, ८००; पीक बाढ़ (% में), ९०; ' बंटवारे की अनुमति दें ' और ' निर्यात क्षेत्रों मुखौटा ' के साथ चयनित (आंकड़ा 1b, विभाजन) । परिणामस्वरूप द्विआधारी क्षेत्रों मुखौटा विश्लेषण कणों उपकरण के साथ कणों उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । परिणामस्वरूप कणों दोनों कच्चे mCherry और कच्चे GFP चैनलों के लिए लागू किया गया (पूर्व प्रक्रिया) autophagy-lysosome डिब्बों (आंकड़ा 1b, सुविधा निष्कर्षण) से मात्रात्मक ratiometric डेटा निकालने के लिए ।

mCherry के दृश्य निरीक्षण-GFP-Atg8-सकारात्मक संरचनाओं लेमिना के कोशिका शरीर क्षेत्र में संवर्धन संकेत दिया, कोशिका शरीर में न्यूरॉन्स17में autophagic बुलबुले के प्रतिगामी परिवहन के पिछले रिपोर्टों के साथ संगत । भूखंड प्रोफ़ाइल कई Atg8-सकारात्मक संरचनाओं में mCherry और GFP तीव्रता कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था (चित्रा 4a में लाइन ROIs और चित्रा 4Bमें रेखा के साथ तीव्रता प्रोफाइल परिणामस्वरूप देखें), रिपोर्टर जहां उच्च में मतभेद का खुलासा दोनों fluorophores की तीव्रता इंगित करता है autophagosomes (चित्रा 4B3), उच्च mCherry और कम GFP lysosome के साथ फ्यूजन इस अम्लीय डिब्बे (चित्रा GFP) में बुझती है के रूप में इंगित करता है, और अंत में कम 4B1 के भीतर गिरावट को दर्शाता है lysosome (चित्रा 4B2) । एक तितर बितर साजिश प्रत्येक अर्द्ध का मतलब fluorophore तीव्रता से उत्पंन स्वचालित रूप से विभाजित mCherry-Atg8-सकारात्मक कण autophagy-lysosome मार्ग है कि तब वृत्त का चक्र विश्लेषण द्वारा असतत चरणों में अलग किया गया के माध्यम से फ्लक्स दिखाता है ( चित्र 4c) । भूखंड चार GFP = ५७०, mCherry = १,८०० के गेटिंग थ्रेसहोल्ड का उपयोग कर चक्रों में विभाजित किया गया था । थ्रेसहोल्ड निंनलिखित प्रिंसिपलों का उपयोग नियंत्रण समूह के आधार पर निर्धारित किया गया: (1) मिलकर फ्लोरोसेंट रिपोर्टर और दो fluorophores के गुणों का डिजाइन, ताकि सैद्धांतिक रूप से GFP नहीं fluoresce जहां कोई mCherry संकेत है (चक्र IV), और (2) Atg8-धनात्मक कणों का वितरण जंगली-प्रकार के न्यूरॉन्स में autophagy-lysosome मार्ग संबंधी डिब्बों के वितरण को दर्शाता है जहां बेसल autophagy अत्यधिक कुशल है18,19. नियंत्रण मक्खियों के laminas में, Atg8 के 25% के आसपास-सकारात्मक कणों autophagosomes (चक्र मैं) के रूप में बिन्नी थे, और puncta के आधे autophagosome-lysosome फ्यूजन (चक्र द्वितीय और III) से परे संसाधित कर रहे हैं; dSmse/ laminas काफी autophagosomes या बेकार lysosomes (चक्र मैं) और कम autolysosomes (चक्र द्वितीय और तृतीय), में दोषों के माध्यम से autophagosome संचय के सुझाव में वृद्धि हुई थी autophagosome-lysosome फ्यूजन और/या lysosomal क्षरण (figure 4c, D). मात्रात्मक डेटा भी dSmse/e मक्खियों (चित्रा 4E) से लेमिना में Atg8-सकारात्मक संरचनाओं के स्पष्ट संचय का समर्थन किया । मतलब mCherry और GFP संकेत के Ratiometric विश्लेषण नियंत्रण और dSmsई/ई समूह (चित्रा 4F) के बीच एक अंतर पर प्रकाश डाला लेकिन मार्ग पर समग्र प्रभाव का विस्तार नहीं कर सका और न ही विशिष्ट कदम से पता चला चक्र विश्लेषण ।

Figure 1
चित्र 1: पूर्वाग्रह के माध्यम से कार्यप्रवाह-छोटे, अर्द्ध स्वचालित Drosophila मस्तिष्क में सेलुलर संरचनाओं के विभाजन उदाहरण के साथ फिजी का उपयोग कर । (क) एक Drosophila वयस्क मस्तिष्क के ऑप्टिक पालि के माध्यम से एक फोकल विमान से प्रतिनिधि फोकल माइक्रोग्राफ पैन ंयूरॉन आरएफपी-टैग की गईं उत्परिवर्ती Htt और झिल्ली-लक्षित GFP (elav-GAL4 > यूएएस-mCD8: GFP, यूएएस-आरएफपी-hHttQ138) with DAPI धुंधलान (छवि प्राप्ति) । DAPI और GFP के लिए एक रॉय का चयन किया गया (पीला) ऑप्टिक पालि के आसपास; लाल बॉक्स इंगित करता है कि क्षेत्र स्पष्टता (रॉय चयन) के लिए कार्यप्रवाह के माध्यम से बढ़ाया । प्रक्रिया पैनल आरएफपी-HttQ138 चैनल के कच्चे छवि के उच्च आवर्धन दिखाता है (ऊपर) और एक गाऊसी कलंक फिल्टर, σ1 (नीचे) के आवेदन के बाद । इंटरएक्टिव एच-maxima वाटरशेड द्वारा फॉल्ट बीज गतिशीलता के लिए संकेत दिया पैरामीटर सेटिंग्स का उपयोग कर h-maxima (h), वैश्विक वाटरशेड रोक मापदंड द्वारा निर्धारित तीव्रता थ्रेशोल्ड (T), और क्षेत्रीय रोक मानदंड द्वारा निर्धारित पीक बाढ़ ( %) आरएफपी-HttQ138 रॉ (ऊपर) और गाऊसी धुंधला (नीचे) छवियों पर प्रदर्शन किया, और क्षेत्रों मुखौटा से वाटरशेड परिणाम वाटरशेड प्लगइन से निर्यात और स्पष्टता के लिए औंधा । आरएफपी-HttQ138 कच्चे छवियों (सुविधा निष्कर्षण) पर मढ़ा कणों का विश्लेषण (रानी) द्वारा उत्पन्न कणों. तीर एग्रीगेट और ऐरोहेडing के बिना विभाजित हैं जो इंगित करता है कि फ़िल्टरिंग के बाद अलग करने के लिए विफल संरचनाओं को इंगित करता है । (ख) एक नियंत्रण और उत्परिवर्ती के लेमिना की क्षैतिज धारा के माध्यम से 7 फोकल विमानों के अधिकतम z-प्रक्षेपण से प्रतिनिधि फोकल माइक्रोग्राफ (dSmse/ Drosophila प्रौढ व्यक्ती सर्वत्र GFP-mCherry-Atg8a ( actin-GAL4 > यूएएस-GFP-mCherry-Atg8) साथ DAPI धुंधला (छवि अधिग्रहण) । DAPI लेमिना के कोशिका शरीर परत के आसपास एक रॉय (पीला) का चयन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था; लाल बॉक्स इंगित करता है कि क्षेत्र स्पष्टता (रॉय चयन) के लिए कार्यप्रवाह के माध्यम से बढ़ाया । प्रक्रिया पैनल गाऊसी कलंक फिल्टर के साथ mCherry चैनल के उच्च आवर्धन दिखाता है, σ1 दोनों नियंत्रण और उत्परिवर्ती लेमिना के लिए लागू किया । इंटरएक्टिव एच-maxima वाटरशेड द्वारा विभाजन संकेत पैरामीटर सेटिंग्स के साथ फ़िल्टर mCherry छवियों पर प्रदर्शन किया, और वाटरशेड परिणाम स्पष्टता के लिए औंधा द्विआधारी क्षेत्रों मुखौटा के रूप में दिखाया गया है । कच्चे mCherry और GFP छवियों (सुविधा निष्कर्षण) पर मढ़ा कणों का विश्लेषण (रानी) द्वारा उत्पन्न कणों. स्केल बार्स = ५० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: ठहराव के आकार और उत्परिवर्ती आरएफपी की तीव्रता-Htt समुच्चय मजबूत और reproducible है । (A-B) आरएफपी के साथ Drosophila दिमाग-hHttQ15 (क) या आरएफपी-hHttQ138 अभिव्यक्ति (ख) एक पैन के तहत-ंयूरॉन चालक elav-GAL4 और स्थिर थे और ऑप्टिक पालियों लेजर द्वारा imaged किया गया स्कैनिंग फोकल माइक्रोस्कोप । स्केल बार = ५० µm. (ग) प्रत्येक समूह में समुच्चय की औसत संख्या ऑप्टिक पालि के आसपास एक मैंयुअल रूप से चयनित रॉय से quantified और एक मानकीकृत z-स्लाइस पर ध्यान केंद्रित (n = 5) । (डीई) आकार (घ) और कुल तीव्रता (ङ) के आरएफपी-hHttQ138 समुच्चय quantified की ऑप्टिक पालियों में मानकीकृत ROIs से ५ विभिन्ना जंतुओं का. कुल डेटा लॉग स्केल में प्लॉट किए गए हैं । समुच्चय से अधिक ०.४ µm2 ( डीमें धराशायी लाइन) वस्तुओं के रूप में परिभाषित किया गया । सांख्यिकीय विश्लेषण, एक तरह से ANOVA, एनएस: महत्वपूर्ण नहीं; a.u.: मनमाना इकाई कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: छवि जोखिम गलत तीव्रता माप की ओर जाता है. (A-B) प्रतिनिधि आदर्श प्रदर्शन के साथ एक ही ऑप्टिक पालि के फोकल micrograph (क) और अधिक जोखिम (ख) फिजी में हिलो LUT के साथ pseudocolored । बी में लाल उजागर समुच्चय इंगित करता है । स्केल बार = ५० µm। (ग) समान फॉल्ट परिणाम उत्पन्न करने के लिए एच-maxima वाटरशेड पैरामीटर्स को कार्यान्वित करने के बाद कुल आकार का ठहराव. सांख्यिकीय विश्लेषण, स्वतंत्र नमूनों टीपरीक्षण, एनएस: महत्वपूर्ण नहीं है । (घ) आदर्श और उजागर छवियों में समग्र आकार की आवृत्ति वितरण । 5 से 25 µm2 से एक आकार के साथ समुच्चय आगे 4 स्पष्ट समूहों में बिन्नी थे । (E -F) कुल आकार (ई) के एक समारोह के रूप में समुच्चय की तीव्रता का सहसंबंध विश्लेषण । जब सभी पिक्सेल ४०९५ की अधिकतम तीव्रता मान है एक संदर्भ पंक्ति (काला) आरेखित है । ग्रीन बॉक्स 10 µm2 एफमें दिखाया क्षेत्र के नीचे समुच्चय इंगित करता है । b: प्रतीपगमन गुणांक, R2: निर्धारण का गुणांक; a.u.: मनमाना इकाई कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: एक मिलकर फ्लोरोसेंट mCherry के ठहराव-GFP-Atg8a जेनेटिक रिपोर्टर autophagic में Drosophila प्रवाह के विभिंन सुविधाओं का पता चलता है । (क) Drosophila लेमिना के प्रतिनिधि फोकल माइक्रोग्राफ से नियंत्रण और dSmsई/ई उत्परिवर्ती मक्खियों बैरे व्यक्त mCherry-GFP-Atg8a (actin-GAL4 > mCherry-GFP-Atg8a) और दाग के लिए DAPI . लेमिना कोशिका शरीर परत के धराशायी बॉक्स क्षेत्रों उच्च आवर्धन (सही) में दिखाए जाते हैं । संख्याएं प्रतिनिधि Atg8a-धनात्मक संरचनाओं B और Cमें quantified में प्लॉट की गई इंगित करती हैं । (ख) मनमाने ढंग से इकाइयों में प्रतिदीप्ति तीव्रता के हिस्टोग्राम साजिश (AU) लाइन के साथ ROIs में उच्च आवर्धन छवियों में संकेत दिया (ग) mCherry-GFP-Atg8 संरचनाओं मतलब GFP तीव्रता के एक समारोह के रूप में मतलब mCherry तीव्रता से साजिश रची नियंत्रण से मापा और dSmse/e लेमिना (प्रत्येक समूह से 3 laminae से मापा कणों) । भूखंड चार चक्रों में विभाजित किया गया था GFP के गेटिंग थ्रेसहोल्ड = ५७० और mCherry = १८०० प्रत्येक चक्र में संरचनाओं के प्रतिशत के साथ जीनोटाइप द्वारा संकेत दिया । (घ) mCherry-GFP-Atg8 के माध्य प्रतिशत का ठहराव ग में प्रत्येक वृत्त चक्र में वर्गीकृत (n = 3 लेमिना). (ङ) ठहराव की संख्याओं का mCherry-GFP-Atg8 puncta प्रति लेमिना (माध्य ± S.D., n = 3 लेमिना). (च) नियंत्रण और उत्परिवर्ती मक्खी लेमिना में मनाया mCherry-GFP-Atg8 संरचनाओं के Ratiometric विश्लेषण (९५% CI, n = 3 लेमिना) के साथ मतलब है । छात्र टी-टेस्ट । *p < 0.05, * *p < 0.01 । Sscale बार्स = 2 µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल को मजबूती से इस्तेमाल किया जा सकता है और reproducibly quantitate कोशिका जैविक प्रतिदीप्ति-आधारित इमेजिंग द्वारा visualized प्रक्रियाओं । जैविक संदर्भ और तकनीकी सीमाओं को सावधानीपूर्वक प्रायोगिक डिजाइन का मार्गदर्शन करने के लिए विचार करने की आवश्यकता है । ब्याज की उपसेलुलर संरचनाओं के फ्लोरोसेंट मार्करों, चाहे immunohistochemical, डाई आधारित है, या आनुवंशिक रूप से व्यक्त, आकृति विज्ञान और तीव्रता के द्वारा पृष्ठभूमि के ऊपर भेद करने की जरूरत है । यूएएस/GAL4 प्रणाली व्यापक रूप से Drosophilaमें लक्षित जीन अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए प्रयोग किया जाता है । यहां प्रस्तुत उदाहरण ट्रांसजेनिक लाइनों GAL4 चालकों को ले जाने के लिए यूएएस बढ़ाने के नियंत्रण में फ्लोरोसेंट टैग प्रोटीन की प्रतिलिपि को सक्रिय करने के लिए प्रोटीन एकत्रीकरण और तंत्रिका तंत्र में autophagy की जांच । एक प्रयोगात्मक यूएएस transgene की एक साथ अभिव्यक्ति एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर transgene के साथ आवश्यक है, तो नियंत्रण समूह भी transgene खुराक के लिए नियंत्रण करने के लिए एक अप्रासंगिक GAL4 के सह-एक्सप्रेस शामिल होना चाहिए, उदाहरण के लिए यूएएस-GFP या यूएएस-lacZ। मानकीकृत नमूना तैयारी, के रूप में Drosophila केंद्रीय तंत्रिका तंत्र और दृश्य प्रणाली के लिए यहां उल्लिखित, विच्छेदन से, निर्धारण, एंटीबॉडी धुंधला, बढ़ते के माध्यम से इष्टतम इमेजिंग और ठहराव के लिए महत्वपूर्ण है ।

अच्छा इमेजिंग प्रथाओं है कि संकेत को अधिकतम-शोर अनुपात और गतिशील रेंज अर्द्ध स्वचालित विश्लेषण के लिए आवश्यक है और प्रयोगात्मक समूहों के बीच सटीक तुलना के लिए सर्वोपरि हैं । छवि अधिग्रहण मानकों तो सेट किया जाना चाहिए कि रिपोर्टर इतना संतृप्त नहीं है कि प्रोटीन की तीव्रता की पूरी रेंज निकाला जा सकता है और quantified (चित्रा 3) । मात्रात्मक तुलना के लिए, इमेजिंग एक ही अधिग्रहण मापदंडों और अधिमानतः एक ही दिन के साथ किया जाना चाहिए ।

रॉय चयन, छवि प्रसंस्करण, सुविधा विभाजन, और खुले स्रोत मंच ImageJ/फिजी का उपयोग कर सुविधा निष्कर्षण आवेदन पर निर्भर हैं; प्रारंभिक मापदंडों उपयोगकर्ता द्वारा परिभाषित किया जाना चाहिए, जबकि मात्रात्मक डेटा उत्पादन को अधिकतम करते हुए नमूनों भर में उनके आवेदन पूर्वाग्रह को कम करेगा. यह सावधानीपूर्वक दस्तावेज़ कार्यप्रवाह करने के लिए महत्वपूर्ण है और फ़ाइल नाम का ब्यौरा लागू की गई प्रक्रिया के साथ प्रत्येक चरण के बाद एक tiff फ़ाइल के रूप में एक छवि सहेजने के लिए अनुशंसित है । यह विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है जब पहली बार के लिए प्रोटोकॉल मापदंडों काम कर रहे है और एक संदर्भ बिंदु के रूप में सेवा के लिए छवि प्रसंस्करण और विश्लेषण में हर कदम पर प्रयोगात्मक समूहों के बीच निरंतरता सुनिश्चित करेंगे । रॉय चयन मानदंड मार्करों या संरचनात्मक स्थलों का उपयोग कर एक नियंत्रण समूह से परिभाषित किया जाना चाहिए, लेकिन यह सुनिश्चित करने के लिए कि प्रयोगात्मक जोड़तोड़ मार्करों या स्थलों एक तरीका है कि एक के विश्वसनीय संकेत को रोकने के लिए नहीं बदल कर लिया जाना चाहिए की देखभाल मानक रॉय । एक टुकड़ा या एक z एकाधिक स्लाइस के प्रक्षेपण के लिए सबसे अच्छा विश्लेषण, जहां एक भी फोकल विमान पड़ोसी संरचनाओं के पृथक्करण में सुधार करने के लिए उपयोगी हो सकता है के उद्देश्यों का पता करने के लिए चुना जा सकता है, और एक z-प्रक्षेपण संरचनाओं का विश्लेषण करने के लिए उपयोगी हो सकता है ऊतक की मात्रा में स्थानीयकृत । विभाजन और छवि विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया z-प्रक्षेपण के प्रकार सावधानी से और स्वतंत्र रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए । एक अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण एक तेज छवि का उत्पादन होगा, क्योंकि संरचनाओं विमानों में प्रतिभाशाली हैं, जहां वे ध्यान में हैं, और आमतौर पर अच्छी तरह से विभाजन के लिए अनुकूल हैं । छवि विश्लेषण एक अधिकतम प्रक्षेपण पर स्वीकार्य हो सकता है, autophagy-lysosome विश्लेषण के उदाहरण के रूप में; Atg8-सकारात्मक संरचनाओं कदम नमूने के लिए इस्तेमाल आकार से छोटे हैं, इस प्रकार सबसे सही एकमात्र फोकल विमान से जो वे कब्जा कर लिया गया से अधिकतम तीव्रता द्वारा प्रतिनिधित्व कर रहे हैं । हालांकि, संरचना चरण आकार से बड़ा के विश्लेषण के लिए, एक योग-प्रोजेक्शन जो एक ही xy निर्देशांक के साथ सभी पिक्सेल जोड़ता है और अधिक सही रूप से प्रत्येक संरचना की गहनता जानकारी का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं । हालांकि इस प्रोटोकॉल एक टुकड़ा या एक z-2d में एकाधिक स्लाइस के प्रक्षेपण के विश्लेषण के लिए डिज़ाइन किया गया है, कार्यप्रवाह आसानी से एक जेड में 3 डी संरचनाओं का विश्लेषण-श्रृंखला एक ही उपकरण के कई का उपयोग कर अनुकूलित हो सकता है । 3 डी विश्लेषण अनियमित आकार संरचनाओं का एक छोटा सा नमूना आकार के लिए वांछनीय होगा, जहां एक z-टुकड़ा है कि परोक्ष संरचना विश्लेषण तिरछा होगा ।

इस प्रोटोकॉल में सुझाए गए के रूप में एक फ़िल्टर के साथ, संसाधन, खंड के दौरान ब्याज की संरचनाओं का पता लगाने सहायता के लिए किनारों को बनाए रखते हुए शोर को कम कर सकते हैं; पृष्ठभूमि शोर और पर्याप्त चिकनाई के बिना फ्लोरोसेंट मार्कर की सजातीयता से अधिक-विभाजन में परिणाम होगा, जबकि सेटिंग्स है कि बहुत धुंधला में परिणाम विस्तार से हटा देंगे और सटीक बढ़त का पता लगाने को रोकने के । वाटरशेड द्वारा विभाजन एक फ्लोरोसेंट छवि में स्थानीय maxima-उच्च तीव्रता पिक्सल में एक जल स्रोत के साथ एक स्थलाकृतिक सतह के रूप में छवि मानता है-कि बाहर बाढ़ जब तक यह पड़ोसी बाढ़ क्षेत्रों जहां एक बांध, या खंड सीमा,20बनाया है मिलता है । h-maxima वाटरशेड एक अद्वितीय स्थानीय अधिकतम21नहीं है संरचनाओं के अधिक से अधिक विभाजन से बचने के लिए सार्थक स्थानीय CBG भेद करने के लिए एक यूज़र-डिफ़ाइंड थ्रेशोल्ड (h-maxima गतिशीलता एससीएफ-MPI-maxima प्लगइन) का उपयोग करता है । इंटरैक्टिव एच-maxima वाटरशेड प्लगइन इस प्रोटोकॉल में कार्यांवित उपयोगकर्ता एच-maxima गतिशीलता (एच), वैश्विक वाटरशेड रोकने के मानदंड तीव्रता दहलीज (टी) द्वारा निर्धारित की अनुमति देता है, और क्षेत्रीय रोक मानदंड पीक बाढ़ (%), द्वारा निर्धारित तुरंत एक आउटपुट छवि पर वाटरशेड परिणाम देखने के लिए गुणात्मक विभाजन प्रदर्शन का मूल्यांकन । फॉल्ट परिणाम बारीकी से सबसे अधिक संरचना सीमाओं के साथ सहमत होंगे, हालांकि दोनों से अधिक विभाजन और अपूर्ण जुदाई (आंकड़ा 1a, सुविधा निष्कर्षण में लाल तीर) हो सकता है, जहां फ्लोरोसेंट लेबल सजातीय है या ऊतक है घनी आबादी । अर्द्ध स्वचालित विभाजन और विश्लेषण कदम की दक्षता के लिए नमूना शक्ति को बढ़ाने और फॉल्ट नुकसान को कम करने के लिए leveraged किया जा सकता है ।

विभाजन और सुविधा निष्कर्षण के बाद, यह क्षेत्र, आयाम, और परिपत्र के रूप में रूपात्मक जानकारी निकालने के लिए सीधी है । इसके अलावा, यदि छवियां उचित प्रदर्शन से बचने के लिए एकत्र कर रहे हैं, आणविक जानकारी भी तीव्रता माप द्वारा इस छवि विश्लेषण से आस्थगित किया जा सकता है । एक बार neurodegenerative रोग विकृति के उपाय निकाले जाते हैं और इस दृष्टिकोण से quantified, इन उपायों महत्वपूर्ण सवालों के एक नंबर का पता करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. विशेष रूप से, प्रोटोकॉल का उपयोग करने की क्षमता का प्रदर्शन किया है छवि विश्लेषण और प्रोटीन समुच्चय के ठहराव कारकों की पहचान करने के लिए कि प्रोटीन एकत्रीकरण और सहसंबंधी वितरण, संख्या, आकार, और समुच्चय के प्रोटीन घनत्व को प्रभावित न्यूरॉनिक रोग और जीव स्वास्थ्य के साथ. Ratiometric-आधारित ठहराव रोग प्रगति के दौरान उपसेलुलर घटकों या प्रक्रियाओं के साथ समग्र बातचीत को सूचित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । जबकि जैव रासायनिक और प्रवाह cytometry समुच्चय की बातचीत और अंय उपसेलुलर संरचनाओं के साथ विश्लेषण करने के लिए लागू किया गया है, कोशिका lysis प्रोटीन हानि के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, समग्र गुणों को बदलने, और प्रोटीन प्रोटीन बातचीत को बाधित22। mCherry-GFP-Atg8 व्यापक रूप से प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के माध्यम से autophagy की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया गया है, विशेष रूप से संस्कृति वाले कोशिकाओं में23, लेकिन निष्पक्ष और मात्रात्मक विश्लेषणात्मक तरीकों की कमी है. इसके अलावा, vivo विश्लेषण में आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग मिलकर रिपोर्टर का उपयोग चुनौतीपूर्ण है और अत्यधिक नियंत्रित आनुवंशिक पृष्ठभूमि और ऊतक तैयार करने की आवश्यकता है । इस प्रोटोकॉल को autophagy-lysosome डिब्बों को महत्वपूर्ण तरीके से इमेजिंग करने के लिए गंभीर प्रथाओं को ऊतक तैयारी से सत्यापित पद्धति रूपरेखा । अच्छी आनुवंशिक प्रथाओं के साथ, छवि विश्लेषण Atg सहित दृष्टिकोण-सकारात्मक कण तीव्रता प्रोफाइल और गेटिंग के साथ व्यक्तिगत फ्लोरोसेंट संकेतों द्वारा चक्र विश्लेषण, शक्तिशाली का पता लगाने और सामांय और रोग की तुलना बर्दाश्त कर सकते है विविध रोग मॉडल में vivo में autophagic फ्लक्स ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम शीला और डेविड Fuente Neuropathic दर्द अनुसंधान कार्यक्रम स्नातक फैलोशिप (J.M.B. के लिए), Lois पोप जीवन अध्येता कार्यक्रम (के लिए टिपू, Y.Z., और J.M.B.), स्नाइडर-रॉबिंसन फाउंडेशन डॉक्टरी फैलोशिप (को टिपू), डॉ जॉन टी द्वारा समर्थित है . मैकडोनाल्ड फाउंडेशन (टिपू करने के लिए), अनुबंध, स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों से अनुदान (NIH) HHSN268201300038C, R21GM119018, और R56NS095893 (R.G.Z. के लिए), और Taishan विद्वान परियोजना (शेडोंग प्रांत, पीपुल्स रिपब्लिक ऑफ चाइना) (to R.G.Z.) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SYLGARD(R) 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning Corporation PF184250 Dissection dish
Falcon 35 mm Not TC-Treated Easy-Grip Style Bacteriological Petri Dish Corning 351008 Dissection dish
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11251-20 Dissection tool
Sodium Chloride Sigma S3014 PBS solution
Sodium Phosphate Dibasic  Sigma S5136 PBS solution
Potassium Phosphate Monobasic Sigma P5655 PBS solution
Triton X-100 Sigma T9284 Washing and antibody incubaton solution. 
37% Formaldehyde VWR 10790-710 Fixation
Disposable Microcentrifuge Tubes (0.5mL, blue) VWR 89000-022 Fixation, washing, and antibody incubaton. 
Plain and Frosted Micro Slides (25×75mm) VWR 48312-004 Slides for confocal imaging
Micro Cover Glasses, rectangular (22×40mm) VWR 48393-172 Slides for confocal imaging
Rubber Cement Slime 1051-A Mounting
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium Vector Laboratories, Inc. H-1000 Mounting
Scotch Magic 810 Invisible Tape (19mm×25.4m) 3M Company 810 Mounting
Normal Goat Serum Thermo Fisher Scientific PCN5000 Antibody incubaton
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)  Thermo Fisher Scientific D1306 Nucleic acid staining. Dissolve in deionized water to make a 5 mg/mL stock solution and store at -80°C. Dilute to a working concentration of 10-20 μg/mL in PBTx.
3.5X-90X Stereo Zoom Inspection Industrial Microscope AmScope SM-1BNZ Dissection scope. Equipped with 6W LED Dual Gooseneck Illuminator
ImageJ/Fiji NIH v1.51u With SCF_MPI_CBG plugins (version 1.1.2)
FV1000-IX81 Confocal-laser Scanning Microscope Olympus
Recombinant Construct Bloomington Drosophila Stock Center BL37749

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक १३८ कुल autophagy ImageJ फॉल्ट ratiometric neurodegeneration Drosophila ब्रेन
मात्रात्मक सेल Neurodegeneration की <em>Drosophila</em> में फ्लोरोसेंट टैग प्रोटीन ImageJ का उपयोग कर के निष्पक्ष विश्लेषण के माध्यम से जीवविज्ञान
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Brazill, J. M., Zhu, Y., Li, C., Zhai, R. G. Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ. J. Vis. Exp. (138), e58041, doi:10.3791/58041 (2018).

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