Kwantitatieve celbiologie van neurodegeneratie in Drosophila door onbevooroordeelde analyse van Fluorescently Tagged eiwitten met behulp van ImageJ

Summary

Hebben we een eenvoudige en flexibele workflow om kwantitatieve gegevens extract van fluorescentie imaging-gebaseerde cel biologische studies van aggregatie van eiwitten en autophagic flux in het centrale zenuwstelsel van Drosophila modellen van neurodegeneratie.

Abstract

Met de stijgende prevalentie van neurodegeneratieve ziekten is het steeds belangrijker om te begrijpen van de onderliggende pathofysiologie, dat tot neuronale disfunctie en verlies leidt. Fluorescentie gebaseerde imaging tools en technologieën inschakelen ongekende analyse van subcellular neurobiologische processen, maar er nog behoefte aan een onpartijdige, reproduceerbaar zijn, en toegankelijk benaderingen is voor het extraheren van meetbare gegevens van imaging studies . We hebben een eenvoudige en flexibele workflow om kwantitatieve gegevens extract van fluorescentie gebaseerde imaging studies met behulp van Drosophila modellen van neurodegeneratie ontwikkeld. Specifiek, beschrijven we een aanpak van het gemakkelijk-aan-volg, semi-geautomatiseerde Fiji/ImageJ met twee cellulaire processen te analyseren: ten eerste, we kwantificeren totale eiwitgehalte en profiel in de Drosophila optic kwab met behulp van fluorescentie-gelabeld mutant huntingtin eiwitten; en ten tweede, wij beoordelen autophagy-lysosoom flux in het visuele systeem van de Drosophila met ratiometric gebaseerde kwantificering van een tandem fluorescerende verslaggever van autophagy. Nog belangrijker is, bevat het protocol hier geschetste een semi-automatische segmentatie stap om ervoor te zorgen dat alle TL structuren worden geanalyseerd om te minimaliseren van selectie bias en om resolutie van subtiele vergelijkingen te verhogen. Deze aanpak kan worden uitgebreid voor de analyse van andere cel biologische structuren en processen betrokken in neurodegeneratie, zoals eiwithoudende puncta (stress korrels en synaptische complexen), zo goed als membraan-gebonden afdelingen (mitochondriën en membraan mensenhandel blaasjes). Deze methode biedt een gestandaardiseerde, maar aanpasbare referentiepunt voor beeldanalyse en kwantificering, en kon vergemakkelijken van betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid over het veld, en uiteindelijk mechanistische inzicht van neurodegeneratie vergroten.

Introduction

Neurodegeneratieve ziekten miljoenen mensen elk jaar en de incidentie neemt toe met een verouderende bevolking¹. Terwijl elke neurodegeneratieve ziekte heeft een unieke etiologie, zijn aggregatie van eiwitten van de misfolded en de verdeling van het proteostasis-netwerk gemeenschappelijk pathologische kenmerken van veel van deze ziekten. Ophelderen hoe verstoring van deze fundamentele en onderling verbonden processen misgaat is om bij te dragen tot de neuronale cel en dysfunctie dood essentieel voor het begrip van neurodegeneratieve ziekten, alsmede het begeleiden van therapeutische interventies. Fluorescentie gebaseerde beeldvorming voorziet in onderzoek van deze complexe en dynamische processen in neuronen en heeft bijgedragen aan ons begrip van de neuronale celbiologie. Analyse van fluorescently tagged eiwitten is uitdagend, met name wanneer de experimenten zijn uitgevoerd in vivo, als gevolg van de zeer compacte weefsels, diverse celtypes en morfologische heterogeniteit. Handmatig geassisteerde kwantificering is betaalbaar en eenvoudig, maar is vaak tijdrovend en onder voorbehoud van menselijke bias. Daarom is er behoefte aan een onpartijdige, reproduceerbaar zijn, en toegankelijk benaderingen voor het extraheren van meetbare gegevens van imaging studies.

We hebben een eenvoudige en flexibele workflow met behulp van Fiji/ImageJ, een krachtige en vrij toegankelijke beeldverwerking software^2,3, kwantitatieve om gegevens te extraheren uit imaging fluorescentiestudies in experimentele modellen van geschetst neurodegeneratie met behulp van Drosophila. Door het volgen van dit protocol om te kwantificeren aggregatie van eiwitten en autophagic flux — twee biologische functies die zeer relevant voor neurodegeneratieve ziekte pathologie zijn cel — we de gevoeligheid en de reproduceerbaarheid van deze aanpak aangetoond. Onderzoek van fluorescently tagged mutant huntingtin (Htt) eiwitten in de Drosophila optic kwab bleek het aantal, de grootte en de intensiteit van de eiwit-aggregaten. Wij een tandem fluorescerende verslaggever van autophagic flux binnen het visuele systeem van Drosophila , waarin verschillende emissie signalen afhankelijk van de compartimentaire omgeving⁴gevisualiseerd. Ratiometric gebaseerde analyse van de tandem verslaggever toegestaan voor een kwantitatieve en compleet beeld van autophagy-lysosoom flux van autophagosome formatie, rijping en vervoer tot degradatie in het lysosoom en daarnaast gemarkeerd kwetsbaar compartimenten verstoord in neurodegeneratieve omstandigheden. Nog belangrijker is, in beide analyses uitgevoerd we semi-geautomatiseerde drempelmethode en segmentatie stappen in ons protocol aan onbewuste bias te minimaliseren, vergroten van de macht van de bemonstering en bieden een standaard om vergelijkingen tussen soortgelijke studies. De eenvoudige werkstroom is bedoeld om krachtige Fiji/ImageJ plugins (ontwikkeld door informatici die zijn gebaseerd op wiskundige algoritmen) toegankelijker voor neurobiologists en de biowetenschappen Gemeenschap in het algemeen.

Protocol

1. overwegingen en preparaten voor het ontwerpen van het beeld analyse Experiment

1. Vooraf geschikt anatomische, mobiele of subcellular markeringen om te dienen als monumenten voor standaardisering van een regio van belang (ROI) in verschillende verschillende steekproeven, bijvoorbeeld 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), membraan markers, gelokaliseerde TL eiwit, enz.
2. Selecteer een fluorescerende markering die discrete puncta buiten achtergrondniveaus voor de structuur van belang bakenen kan.
   Opmerking: Dit protocol is geoptimaliseerd voor eiwithoudende structuren (b.v., misfolded eiwit-aggregaten) en membraan-gebonden organellen (b.v., autophagy verslaggever). Om te visualiseren aggregatie van eiwitten, was een fragment van de RFP-gelabeld N-terminal van menselijke Htt eiwit met een pathogene polyQ tract 138 herhalingen (RFP-hHttQ138) gebruikte⁵. De mutant Htt proteïne vormt cytoplasmatische aggregaten als uitgedrukt onder neuronale specifieke stuurprogramma's zoals elav-GAL4^5,6. Om te visualiseren autophagosome-lysosoom flux, werd Actine-GAL4 gebruikt om de uitdrukking van de tandem mCherry-GFP-Atg8a verslaggever overal te rijden. mCherry - en GFP-positieve puncta geven autophagosomes en de flux zoals GFP fluorescentie is uitgeblust in het zure milieu van de lysosoom, waar zuur-ongevoelig mCherry blijft totdat de proteïne aangetaste^{7 is}wordt gecontroleerd. Voor de analyse van de ratiometric, kan een enkellijns thats een consistente marker van de structuur worden gebruikt voor segmentatie of eventueel dat een projectie van twee of meer kanalen kan worden gebruikt om af te bakenen structuren, hoewel niet expliciet beschreven in dit protocol. In dit voorbeeld wordt mCherry gebruikt voor segmentatie van Atg8-positieve deeltjes, zoals het zuur-ongevoelig is en in het compartiment in de gehele flux door middel van het traject blijft.
3. Download en installeer de open beeld analyse sourceplatform ImageJ of Fiji — de gewenste verdeling van ImageJ met gebundeld plugins^2,3.
4. Installeer de plugin voor h-maxima interactieve waterscheiding.
   Opmerking: Dit protocol maakt gebruik van Fiji; extra plugins kan worden verlangd voor ImageJ. De plug-in ontwikkeld door Benoit Lombardot voor SCF-MPI-CBG is beschikbaar online (https://imagej.net/Interactive_Watershed).
5. Navigeer naar "Help | Update", selecteer"Update-sites beheren"van de"ImageJ Updater", kies de SCF-MPI-CBG update-site in de lijst, sluit de database en start opnieuw op Fiji.

2. brain dissectie en immunofluorescentie kleuring

1. Zorg silicone-elastomeer omzoomde dissectie gerechten.
   1. Giet siliconen elastomeer componenten in een bekerglas zoals aangegeven door de fabrikant en roer goed tot goed gemengd.
   2. Gebruik een pipet om te vullen van 5 cm weefselkweek gerechten, een derde tot de helft vol (ongeveer 10 mL van het mengsel van de elastomeer). Laat alle bellen opstijgen naar de oppervlakte en zachtjes verwijderen met papieren zakdoekje. Dekking van de gerechten en leg ze op een vlakke ondergrond om te genezen gedurende 48-72 uur bij kamertemperatuur (RT).
2. Ontleden Drosophila hersenen en visuele systeem indien nodig.
   1. Uitvoeren van Drosophila dissectie van de hersenen als eerder beschreven^8,9. Voer de dissectie in elastomeer omzoomde dissectie gerechten, met behulp van een elastomeer bodem te stabiliseren van de hersenen om te voorkomen dat schadelijke weefsel of pincet.
   2. De lamina intact te houden tijdens de dissectie, Schuif twee pincet onder het netvlies en zachtjes scheuren door het midden van het oog om te verwijderen van het netvlies. Trek weg een retinale weefsel gehecht aan de lamina met een tang die evenwijdig aan het oppervlak van de lamina gehouden.
      Opmerking: Resterende pigment zal afwassen in de volgende stappen en meestal niet interfereert met antilichaam kleuring en beeldvorming.
   3. Verdun 37% formaldehyde in een met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) om een eindconcentratie van 3,7% verse vóór gebruik in een 500 µL microcentrifuge buis. Breng de ontleed hersenen aan microcentrifuge buis met fix oplossing en incubeer gedurende 15 minuten op RT met zachte rockende.
      Opmerking: Formaldehyde heeft een natuurlijke neiging om te worden geoxideerd, productie van mierenzuur. Daarom is het voorgestelde aan aliquot de 37% formaldehyde voor opslag en vul aan tot 3,7% vers vóór elk gebruik. Overmatige fixatie of onder fixatie zal van invloed zijn op de integriteit van de weefsels en fluorescentie¹⁰.
   4. Wassen 3 keer met PBTx (PBS met 0,4% Triton X-100) voor elke 15 min.
3. Uitvoeren van immunohistochemistry en mount exemplaren.
   1. Als antilichaam kleuring nodig is, verwijderen van PBTx, toevoegen van primair antilichaam verdund in PBTx met 5% normale geit serum en incubeer op een aliquoot mixer's nachts bij 4 ° C.
   2. Verwijder primair antilichaam en 3 keer wassen met PBTx voor elke 15 min. Toevoegen van secundair antilichaam verdund in PBTx met 5% normale geit serum en incubeer gedurende 1 h op RT of overnacht bij 4 ° C. 3 keer wassen met PBTx voor elke 15 min.
   3. Desgewenst DAPI kleuring is verwijderen van PBTx, voeg DAPI oplossing (stockoplossing: 5 mg/mL, Verdun tot een concentratie van de werken van 15 µg/mL in PBTx), en incubeer gedurende 10 min op RT. Wash 3 keer met PBTx voor elke 15 min.
   4. Schakel het weefsel, breng een druppel van montage medium in het midden van een dia microscopie met een spacer van één laag van duidelijke tape aan beide zijden. Breng de hersenen op de daling van montage medium, en 1-2 min wachten totdat de hersenen transparant wordt. Verwijder voorzichtig het medium van de montage met een pipet.
   5. Om te monteren, een daling van verse montage medium op de hersenen van toepassing op de dia. Zorgvuldig overlay een cover glas bubbels te vermijden. Zegel van de randen met rubber-cement en luchtdroog op RT voor 20 min. doorgaan naar Beeldacquisitie voor de beste resultaten.

3. de Beeldacquisitie

1. Microscoop verwerving parameters, met inbegrip van ruimtelijke resolutie, doelstelling, zoom, scansnelheid, optimaliseren en stap grootte, resolutie van de structuren van belang om semi-automatische segmentatie tijdens beeldanalyse maximaliseren.
   Opmerking: Het kan nuttig zijn te vangen een voorbeeldafbeelding en semi-automatische segmentatie (in stap 5 van dit protocol) test voordat u alle experimentele monsters imaging. Op deze manier kan de gebruiker imaging instellingen aanpassen zodat de analytische instrumenten kunnen gemakkelijk onderscheiden van de biologische structuur van belang.
2. Afstellen afbeelding detector te vangen de hoogste signal-to-noise verhouding en de hoogste dynamisch bereik van het specimen.
   1. Gebruik een LUT (zie tabel) die aangeeft pixel verzadiging (blootstelling te hoog) of undersaturation (offset te laag) terwijl de instellingen (figuur 3B, rode geeft pixel verzadiging door een Hi/Low LUT) aan te passen.
   2. Controleer of de winst en offset instellingen zijn geschikt voor alle experimentele groepen, zoals experimentele manipulaties waarschijnlijk de structuur van belang wijzigen.
      Opmerking: Het is noodzakelijk dat dezelfde instellingen voor alle groepen worden gebruikt om kwantitatieve vergelijkingen te maken.
3. Beeld door het weefsel te vangen alle gegevens.
   Opmerking: Het wordt aangeraden om alle beschikbare gegevens te vangen tijdens één sessie van de beeldvorming en een nauwkeuriger om gebied te definiëren tijdens ROI selectie in stap 4 indien nodig.
4. Sla de afbeelding als het bestandstype, ondersteund door de denkbaar software om te bewaren van de metagegevens zoals acquisitie parameters en ruimtelijke kalibratie. Sla de afbeelding op met een bestandsnaam met inbegrip van experimentele datum, genetische achtergrond en fluorescerende verslaggevers, antilichamen en kleurstoffen die overeenkomt met de kanalen gescand zoals [de naam van de experimentele groep] [naam van het Specimen] _ _ [Experiment datum] _Ch1. [Fluorophore-target /Dye]_Ch2.[Fluorophore-target/Dye], enz.

4. Fiji/ImageJ afbeelding importeren en ROI selectie

1. Een afbeelding openen in Fiji. Gebruik het dialoogvenster "Bio-formaten importopties", kies "weergave stack met: Hyperstack" en "kleurmodus: grijswaarden".
   Opmerking: Het wordt aanbevolen de Microscoop om bestandstype te openen, als metagegevens zoals ruimtelijke kalibratie kan worden gelezen door Fiji.
2. Identificeer een gebied uit een enkel z-vliegtuig of een projectie op basis van de marker zender (s) die kan worden gebruikt als een gestandaardiseerde ROI over specimens (Figuur 1, ROI selectie).
   1. Gebruik de schuifbalk "C" te bekijken van de zender (s) gebruikt voor het vastleggen van de marker(s) in stap 1.1 aangewezen.
   2. Gebruik de schuifbalk "Z" om te doorlopen van de focale vliegtuigen. Kies een enkel sneetje of een projectie van meerdere segmenten maken door te klikken op "afbeelding | Stapels | Z project"en stel"Start slice"en"Stop slice"te omvatten van de ROI.
      Opmerking: Instellen van het type " "projectie "naar"Max intensiteit"in het"Z-project"dialoogvenster vaak het best geschikt is om te benadrukken van de structuren voor segmentatie in paragraaf 5, hoewel dit misschien niet geschikt voor alle toepassingen. Als een ander type projectie vereist voor analyse is, zorg op te slaan en dit bestand als zodanig voor functie extractie in sectie 6 en/of 7 document.
   3. Genereer een nieuwe afbeelding met de zender (s) en focale plane(s) van belang zijn voor het vereenvoudigen van de volgende stappen in het beeld-analyse-protocol. Selecteer "afbeelding | Dubbele", stel de gewenste"kanalen"(c) en"Segmenten"(z), en wijzig de bestandsnaam aan van de selectie (bijv., [Experimental groepsnaam] [naam van het Specimen] _ _ [experimenteren date]_[Channel(s)]_[z-plane(s)]).
3. Gebruik een van de "selectiegereedschappen" op de Fiji-werkbalk handmatig selecteren een gestandaardiseerde ROI op basis van de selectiecriteria bepaald in stap 4.2.
4. De ROI toevoegen aan de ROI-manager door te klikken op "Analyze | Tools | ROI-Manager "en klik op"Toevoegen"in het menu van de Manager van de ROI. De ROI behoeden voor het menu ROI Manager door te klikken op "meer | Save", en geef de naam van het bestand aan de ROI (bv, [Experimental groepsnaam] [naam van het Specimen] _ _ [Experiment datum] _ [Kanalen] _ [z-plane(s)] _ [ROI description]).
   Opmerking: Dit kan worden geopend in Fiji voor latere analyses of kan worden toegepast op andere kanalen of de beelden zoals in punt 5.3.

5. voorbewerken en segmentatie met h-maxima Watershedding

1. Uitvoeren voorbewerken op het kanaal dat wordt gebruikt om vast te leggen van de structuren van belang.
   1. Als het afbeeldingsbestand uit meerdere kanalen bestaat, scheidt u de kanalen door te klikken op "afbeelding | Kleur | Kanalen splitsen"te isoleren van het kanaal van belang.
   2. Toepassen van een filter zoals een mediaan filter om ruis of Gaussiaans vervagen voor het vloeiend maken door te klikken op "proces | Filters | Filtertype"(bijvoorbeeld"Mediaan Filter"of"Gaussian Blur").
      1. Proef verschillende filters en parameters op beelden uit elke experimentele groep filteren. Doorloop stap 6.2 met een representatief voorbeeld van elke groep om te controleren van de prestaties van de segmentatie. Selecteer het filter en de instellingen die de segmentatie van de structuren van belang te vergemakkelijken.
   3. Het opnemen van het filter en de instellingen. Deze parameters gelden verschillende experimentele groepen.
   4. Een kopie van de afbeelding opslaan als een TIFF-bestand met inbegrip van het toegepaste filter voor referentie. Gebruik een gedetailleerde naam zoals [Experimental groepsnaam] [naam van het Specimen] _ _ [Experiment datum] _ [Channel] _ [z-plane(s)] _ [Filter met parameters].
2. Segmentatie van de structuren van belang met het hulpprogramma voor het stroomgebied van interactieve h-maxima op de voorverwerkte afbeelding gegenereerd en opgeslagen in stap 5.1 uitvoeren.
   1. Met de voorverwerkte beeld actief in Fiji, de h-maxima interactieve waterscheiding tool te starten door te klikken op "SCF | Labeling | Interactieve H_Watershed".
      Opmerking: Deze plugin eerst berekent de waterscheiding en vervolgens kan de gebruiker te onderzoeken van de effecten van lokale maxima en drempel opties over segmentatie door middel van een direct bijgewerkte output afbeelding.
   2. Selecteer op het bedieningspaneel zaad dynamics (h), intensiteit drempel (T) en piek overstromingen (%) voor het optimaliseren van segmentatie aanpassen.
      Nota: Verwijs altijd naar de onbewerkte afbeelding vóór het voorbewerken van punt 4.2 handmatig controleren van prestaties van de segmentatie van de structuren van belang.
   3. Wanneer tevreden met de resultaten van de segmentatie, selecteer "Export masker van de regio's" en kies "Export". Hierdoor genereert u een binaire beeld van de resultaten van de waterscheiding (Figuur 1, segmentatie).
   4. Opnemen van de segmentatie parameters; deze parameters moeten worden toegepast over experimentele groepen voor kwantitatieve vergelijkingen. Het masker van de binaire resultaten opslaan indien gewenst ter referentie met segmentatie parameters gedetailleerd in de naam zoals [de naam van de experimentele groep] [naam van het Specimen] _ _ [Experiment datum] _ [Kanalen] _ [z-plane(s)] [Filter met parameters] _ _ [H_Watershed parameters].
3. Pak de structuren van belang uit de resultaten van de waterscheiding.
   1. Open de opgeslagen ROI uit stap 4.4, in de manager van de ROI. Met de binaire gebieden masker uit stap 5.2.4 actieve, selecteer u de ROI van de manager van de ROI toe te passen op de afbeelding om te beperken functie winning tot de gestandaardiseerde ROI.
   2. Met de ROI die actief zijn op het binaire waterscheiding masker, kies "Analyze | Analyze deeltjes"met"Toevoegen aan Manager"geselecteerd in het dialoogvenster extraheren van functies.
      Opmerking: Dit zal toevoegen een deeltje-id voor elke structuur afgebakend tijdens segmentatie naar de Manager van de ROI. Opties zijn beschikbaar in dit menu om uit te sluiten van functies op basis van grootte of cirkelvormigheid indien nodig om structuren die zijn opgenomen in de analyse te verfijnen.
   3. De deeltjes opslaan door te klikken op "meer | Save"uit het menu van de manager ROI. Ervoor zorgen dat de id's zijn uitgeschakeld en alle deeltjes zal alle in een zip-bestand kunnen worden opgeslagen. Gebruik een gedetailleerde naam zoals [de naam van de experimentele groep] [naam van het Specimen] _ _ [Experiment datum] _ [Kanalen] _ [z-plane(s)] [Filter met parameters] _ _ [H_Watershed parameters] _ [structuren].

6. hoeveelheid, ruimte, en kwantificering van de intensiteit en analyse

1. Open de onbewerkte afbeelding gegenereerd en opgeslagen in stap 4.2. Ga naar het kanaal dat wordt gebruikt voor het vastleggen van de structuren van belang.
   Opmerking: Het is cruciaal voor het nemen van metingen van de intensiteit van de onbewerkte afbeelding (vóór het voorbewerken) als het toepassen van filters in stap 5.1 wijzigingen de pixelwaarden.
2. Open de deeltjes verkregen functie extractie in stap 5.3 en selecteer 'Alles weergeven' van de Manager van de ROI.
   Opmerking: Deze actie zal een overzicht van elk deeltje op de "ROI Manager" op het beeld overlay en moet overeenkomen met de randen van de structuren van belang (Figuur 1, functie extractie).
3. Instellen van de gewenste afmetingen door te klikken op "Analyze | Instellen van metingen".
   Opmerking: Het gebied, de intensiteit en de dichtheid van de deeltjes kunnen worden gemeten door "ruimte" en "geïntegreerde dichtheid" te kiezen. Als geïntegreerde dichtheid is geselecteerd, Fiji zal produceren twee waarden: 'Geïntegreerde dichtheid' berekend als het product van het gebied en de gemiddelde grijswaarde en 'Raw geïntegreerde dichtheid' gemeten als de som van pixelwaarden. Dichtheid van de fluorescente proteïne in de deeltjes wordt berekend als de som van pixelwaarden gedeeld door het gebied. Het aantal deeltjes gegenereerd in stap 5.3 geeft de hoeveelheid deeltjes binnen het weefsel dat ROI gedefinieerd in stap 4.4.
4. Kies in het menu ROI Manager "Maatregel". De resultaten worden uitgedrukt in gekalibreerde eenheden, zolang de metingen zijn ontleend aan bestanden in Fiji afgeleid naar de denkbaar software. De resultaten uit het resultatenvenster kopiëren en plakken in spreadsheet-software voor de compilatie en verdere berekeningen.

7. Ratiometric kwantificering en Data-analyse

1. Voer stap 6.1 en 6.2 openen deeltje-id op de eerste ruwe kanaal van belang.
2. Instellen van de gewenste afmetingen door te klikken op "Analyze | Instellen van metingen".
   Opmerking: De gemiddelde intensiteit per deeltje kan worden gemeten door te kiezen voor "Betekenen Gray waarde".
3. Van de Manager van de ROI Selecteer "Maatregel". Gegevens uit resultatenvenster kopiëren en plakken in spreadsheet-software.
4. De "C" scrollbar naar het tweede rauwe kanaal van belang, GFP in dit voorbeeld (figuur 4A), en herhaal stap 7.2. en 7.3.
   Opmerking: De deeltjes opgeslagen in stap 5.3 standaard het kanaal en het segment waaruit het is gegenereerd. Oppassen deeltjes worden toegepast op het juiste kanaal van belang.
5. Berekenen van de verhouding van de intensiteit van een kanaal aan de intensiteit van de tweede voor elk deeltje in de spreadsheet-software.
6. Gebruik een scatterplot visualiseren en ratiometric gegevens van fluorophores die vertonen van afzonderlijke wijzigingen weerspiegelend van onderliggende biologische processen te kwantificeren.
   1. Genereer een scatterplot in de grafische software.
      Opmerking: Elk gegevenspunt vertegenwoordigt een structuur van belang waar de intensiteit van de eerste fluorophore van belang is de waarde"x" en de intensiteit van de tweede fluorophore is de "y-waarde" gemeten vanaf elk deeltje.
   2. Drempels voor elk fluorophore te definiëren van de kwadranten gating instellen
7. Lijn-profiel gebruiken om te visualiseren fluorophore intensiteit over een structuur van belang.
   1. Selecteer een ROI gegenereerd in stap 5.3 en gebruik het lineaire gereedschap op de werkbalk om te tekenen van een rechte lijn door de ROI. Voeg de regel ROI naar de Manager van de ROI.
   2. Voor elk kanaal van belang, met de regel ROI actief is, selecteert u "Analyze | Plot van profiel".
      Opmerking: De plot profiel functie genereert een histogram plot en een tabel met de waarden van de intensiteit langs de lijn. Resultaten gemeten vanaf elk kanaal en plakken in spreadsheet-software voor het genereren van een perceel met beide kanalen langs de lijn kopiëren.

Representative Results

Kwantificering van het aantal, het gebied en de intensiteit van fluorescently tagged mutant Htt aggregaten in de Drosophila optic kwab

Om te onderzoeken misfolded eiwit samenvoeging in het centrale zenuwstelsel van een Drosophila model van de ziekte van Huntington, RFP-gelabeld mutant menselijke Htt met een niet-pathologische (UAS-RFP-hHttQ15) of pathologische uitbreiding ( UAS-RFP-hHttQ138) en membraan GFP (UAS-mCD8::GFP)¹¹ waren mede uitgedrukt onder een pan-neuronale stuurprogramma elav-GAL4. Hersenen van vrouwelijke vliegen 2 dagen na eclosion (DAE) werden ontleed, vaste en gekleurd met DAPI volgens paragraaf 2 van het protocol. Confocale laser scanning microscopie werd uitgevoerd gericht op de optic kwab met een 40 X olie-immersie objectief, 1,30 numerieke diafragma (nvt), met behulp van een scan snelheid van 8.0 µs per pixel en de ruimtelijke resolutie van 1024 bij 1024 pixels (12 bits per pixel). De optimale stap-grootte bepaald door imaging software was 1,08 µm per segment voor de doelstelling met de volgende combinatie van excitatie/emissie golflengten: kanaal 1) 488/510 voor GFP, kanaal 2) 543/581 voor RFP en kanaal 3) 405/461 voor DAPI. Detector afbeeldingsinstellingen toegepast op alle groepen om te fotograferen geschikt voor vergelijkingen, waren gebaseerd op een RFP-Htt-Q138 specimen, dat zich ophoopt hoge intensiteit RFP-Htt aggregaten, in plaats van een niet-pathogene RFP-Htt-Q15 controle specimen, dat onderhoudt lage niveaus van diffuse RFP-Htt (Figuur 2). Als acquisitie afbeeldingsinstellingen werden ingesteld op het maximaliseren van het dynamisch bereik voor een RFP-Htt-Q15 specimen, zou vervolgens de RFP-Htt-Q138-aggregaten worden verzadigd. Als voorbeeld, is een opname van aggregatie van eiwitten in de Drosophila optic kwab opgeslagen als HttQ138_Opticlobe.01_01012018_Ch1.RFP-Htt_Ch2.GFP_Ch3.DAPI.

De gehele optic kwab was beeld tijdens microscopie en bestond uit ongeveer 15 z-segmenten, maar na imaging werd vastgesteld dat het analyseren van een enkel z-vliegtuig was beste op te lossen individuele structuren die anders zou worden weergegeven in een projectie worden overlappende de met hoge dichtheid in het weefsel. Om te bepalen van een gestandaardiseerde ROI, werden de C2 en C3 cel organen gelegen tussen de medulla en lobula plaat van de optiek kwab¹² gebruikt als een anatomische landmark. In Fiji, het beeld was dus gedupliceerd zodat de analyse-eisen en is opgeslagen als een TIFF-bestand met de naam HttQ138_Opticlobe.01_01012018_Ch1.GFP_Ch2.RFP-Htt_Ch3.DAPI_z8, waar z8 weerspiegelt het achtste segment waar C2 en C3 neuronale cel lichamen de meeste werden prominente door DAPI kleuring (figuur 1A, beeldacquisitie). Het gereedschap Veelhoek gewend was een ROI rond de optic kwab met behulp van de DAPI kleuring en neuronale GFP signaal als een gids (figuur 1A, ROI-selectie, waar geel geeft de ROI en rood geeft het beeld van de hoge vergroting weergegeven voor handmatig te selecteren duidelijkheid in de volgende panelen van de werkstroom). Vervolgens werd een Gaussian Blur-filter met σ is ingesteld op 1 toegepast op de RFP-Htt kanaal naar de afbeelding vloeiend en segmentatie (figuur 1A, voorbewerken), en de prestaties van downstream segmentatie en functie extractie met en zonder dit te vergemakkelijken pre-processing stap wordt geïllustreerd in figuur 1A. Interactieve H-stroomgebied werd uitgevoerd op beelden van het RFP-Htt-kanaal met de volgende parameters: zaad van dynamiek, 30; intensiteit drempel, 500; piek van overstromingen (in %), 80; met 'toestaan splitsen' en 'export regio's mask' geselecteerd (figuur 1A, segmentatie). Het resulterende binaire gebieden masker is opgeslagen als HttQ138_Opticlobe. 01_01012018_Ch2.RFP-Htt_z8_GuassianBlur-sigma1_HWatershed-h30_T500_80percent en gebruikte voor het genereren van de deeltjes met het hulpprogramma analyseren deeltjes met een minimale grootte uitsluiting van 0.4 µm² bij het definiëren van eiwit aggregaten^13,14 . De resulterende deeltjes zijn gered van de ROI-manager als HttQ138_Opticlobe.01_01012018_Ch1.RFP-Htt_z8_GuassianBlur-sigma1_HWatershed-h30_T500_80percent_aggregates en zijn toegepast op het rauwe RFP-Htt kanaal (vóór het voorbewerken) om uit te pakken kwantitatieve imaging gegevens (figuur 1A, functie extractie).

Kwantificering van het aantal halfautomatisch gesegmenteerde RFP-Htt aggregaten van gestandaardiseerde focal vliegtuigen door de optische kwab van Drosophila geopenbaard diffuus expressie van de niet-pathogene Htt-Q15 expansie en accumulatie van eiwit aggregaten door de ziekte-veroorzakende Htt-Q138 expansie (figuur 2A-C). De som van alle pixelwaarden in elk deeltje gegeven door 'Raw geïntegreerde dichtheid' werd gebruikt voor het vergelijken van de inhoud van de RFP-Htt van elk aggregaat. Omvang en intensiteit profielen van alle aggregaten van een gestandaardiseerde brandvlak van vijf verschillende optische kwabben uiten Htt-Q138 illustreren de robuustheid en de reproduceerbaarheid van deze workflow (figuur 2D, E). Met name wanneer aggregaten zijn overbelicht tijdens Beeldacquisitie (figuur 3A, B), kwantificering van aantal en grootte van aggregaten zijn vergelijkbaar met aggregaten gevangen met ideale blootstelling (Figuur 3 c, D), maar de intensiteit van de overbelichte aggregaten wordt een functie van grootte als verzadigde pixels de waarde van de maximale intensiteit (figuur 3E, F vertonen). Instellen van de juiste scannen blootstelling parameters is daarom cruciaal voor het uitpakken van het volledige scala van kwantitatieve moleculaire samenstelling van eiwit-aggregaten.

Ratiometric gebaseerde kwantificering van autophagy flux in de Drosophila visuele lamina met behulp van een tandem fluorescerende Atg8a verslaggever

Om te beoordelen autophagy-lysosoom flux in het visuele systeem van Drosophila , mCherry-GFP-Atg8a verslaggever was overal in control of uitgedrukte Drosophila spermine synthase (DSM) homozygoot mutant (DSM's^e/e) vliegt met Actine-GAL4 bestuurder. DSM's^e/e vliegt tentoonstelling neurodegeneratie die wordt geassocieerd met verminderde autophagic flux als gevolg van lysosomale dysfunctie¹⁵. Hersenen met bijgevoegde lamina van vrouwelijke vliegen op 5 DAE werden ontleed, vaste en gekleurd met DAPI. De lamina was beeld door laser scanning confocal microscopie met een 100 X olie immersie objectief, 1,35 numerieke diafragma (nvt), bij een snelheid van de bemonstering van 8.0 µs per pixel en 12 bits per pixel optische resolutie en stap-grootte 1,2 µm.

Deze analyse werd uitgevoerd op een max z-projectie van zeven z-segmenten door de lamina om bemonstering macht van de schaarse Atg8-positieve structuren (figuur 1B, beeldacquisitie) te vergroten. De gestandaardiseerde ROI was handmatig getekend met het gereedschap Veelhoek rond de cel lichaam laag geopenbaard door DAPI en gebaseerd op de goed gekarakteriseerd anatomie en cellulaire organisatie van het weefsel (figuur 1B, ROI-selectie, waar geel geeft de ROI en rood wijst de hoge vergroting afbeelding weergegeven voor duidelijkheid in de volgende panelen van de werkstroom)¹⁶. De tandem-verslaggever, is afhankelijk van de eigenschappen van de stabiliteit van GFP en mCherry wordt ter gelegenheid van de progressie via het traject autophagy-lysosoom, zodanig dat GFP is uitgeblust door de zuurgraad van het lysosoom waar mCherry blijft totdat het wordt gedegradeerd. Daarom werd de langduriger mCherry fluorophore gebruikt voor segmentatie in dit protocol. Een Gaussian Blur-filter met σ waarde 1 werd toegepast op het mCherry kanaal (figuur 1B, voorbewerken) en interactieve H-stroomgebied werd uitgevoerd met de volgende parameters: zaad van dynamiek, 0; intensiteit drempel, 800; piek van overstromingen (in %), 90, met 'toestaan splitsen' en 'export regio's mask' geselecteerd (figuur 1B, segmentatie). Het resulterende binaire gebieden masker werd gebruikt voor het genereren van de deeltjes met het gereedschap van de deeltjes analyseren. De resulterende deeltjes werden toegepast op zowel de rauwe mCherry en de ruwe GFP kanalen (vóór het voorbewerken) om gegevens van de kwantitatieve ratiometric extract van autophagy-lysosoom compartimenten (figuur 1B, functie extractie).

Visueel onderzoek van de mCherry-GFP-Atg8-positieve structuren aangegeven verrijking in de regio van de cel lichaam van de lamina, overeenstemming met vorige verslagen van retrograde vervoer van autophagic blaasjes aan de cel lichaam van neuronen¹⁷. Perceel profiel werd gebruikt voor het visualiseren van mCherry en de intensiteit van de GFP over verschillende structuren van de Atg8-positieve (Zie regel ROIs in figuur 4A en resulterende intensiteit profielen langs de lijn in figuur 4B), verschillen in de verslaggever te openbaren waar hoge intensiteit van beide fluorophores geeft aan autophagosomes (figuur 4B3), hoge mCherry en lage GFP geeft aan de fusie met het lysosoom zoals GFP is uitgeblust in deze zure compartiment (figuur 4B1), en ten slotte laag mCherry weerspiegelt afbraak binnen het lysosoom (figuur 4B2). Een scatterplot gegenereerd op basis van de intensiteit van de gemiddelde fluorophore van elk semi-automatisch gesegmenteerde mCherry-Atg8-positieve deeltje illustreert flux via de autophagy-lysosoom traject dat werd vervolgens opgedeeld in discrete stappen door Kwadrant analyse ( Figuur 4C). De plot was verdeeld in vier kwadranten met behulp van gating drempels van GFP = 570, mCherry = 1800. De drempels werden ingesteld op basis van de controlegroep met behulp van de volgende beveiligings-principals: (1) het ontwerp van de tandem fluorescerende verslaggever en de eigenschappen van de twee fluorophores, dus dat theoretisch GFP niet moet lichten waar er geen mCherry-signaal (kwadrant is IV) en (2) de verdeling van de Atg8-positieve deeltjes weerspiegelt de verdeling van autophagy-lysosoom traject-gerelateerde vakken in wild-type neuronen waar basale autophagy zeer efficiënte^{18,19 is}. In de laminas van controle vliegen, ongeveer 25% van de Atg8-positieve deeltjes werden weggegooid als autophagosomes (Kwadrant I), en de helft van de puncta worden verwerkt dan autophagosome-lysosoom fusion (Kwadrant II en III); DSM's^e/e laminas had aanzienlijk verhoogd autophagosomes of disfunctionele lysosomen (Kwadrant ik) en daalden van autolysosomes (Kwadrant II en III), suggestief van accumulatie van de autophagosome door middel van de gebreken in autophagosome-lysosoom fusie en/of lysosomale afbraak (Figuur 4 C, D). Kwantitatieve gegevens ondersteund ook duidelijk accumulatie van Atg8-positieve structuren in de lamina van DSM's^e/e vliegen (figuur 4E). Ratiometric analyse van de gemiddelde mCherry en GFP signaal gemarkeerd een verschil tussen controle en DSM's^e/e groep (figuur 4F) maar kon niet in detail de algehele invloed op de weg, noch de specifieke stappen die geopenbaard door de Kwadrant analyse.

Figuur 1: Workflow via bias-geminimaliseerd, semi-automatische segmentatie van subcellular structuren in de hersenen van de Drosophila Fiji met voorbeelden. (A) representatieve confocal microfoto van één brandvlak via de optische kwab van een uiting van de volwassen hersenen van de Drosophila pan neuronale RFP-gelabeld mutant Htt en membraan-gerichte GFP (elav-GAL4 > UAS-mCD8:GFP, UAS-RFP-hHttQ138) met DAPI kleuring (beeldacquisitie). DAPI en GFP werden gebruikt voor het selecteren van een ROI (geel) rond de optic kwab; rode vak geeft aan regio vergroot via workflow voor duidelijkheid (ROI selectie). Pre-processing paneel toont hoge vergroting van raw-afbeeldingen van het RFP-HttQ138 kanaal (boven) en na toepassing van een filter Gaussiaans vervagen, σ1 (onder). Segmentatie door interactieve h-maxima waterscheiding met behulp van de aangegeven parameterinstellingen voor zaad dynamics bepaald door h-maxima (h), global waterscheiding stop criteria bepaald door intensiteit drempel (T), en regionale stop criteria bepaald door overstromingen (piek %) uitgevoerd op de ruwe RFP-HttQ138 (boven) en Gaussiaans vervagen (onder) beelden en resultaten van de waterscheiding van regio's masker uit waterscheiding plugin geëxporteerd en omgekeerd voor de duidelijkheid. Deeltjes die zijn gegenereerd door analyseren deeltjes (magenta) overlay op de raw beelden van RFP-HttQ138 (functie extractie). Pijlen geven aggregaten die overdreven gesegmenteerde zonder voorbewerken en pijlpunten geven structuren die niet scheiden na filtering. (B) vertegenwoordiger confocal microfoto van maximale z-projectie van 7 focal vliegtuigen door het horizontale gedeelte van de lamina van een controle- en mutant (DSM's^e/e) Drosophila volwassen uiting van alomtegenwoordige GFP-mCherry-Atg8a) actine-GAL4 > UAS-GFP-mCherry-Atg8) met de DAPI (beeldacquisitie) kleuring. DAPI werd gebruikt voor het selecteren van een ROI (geel) rond de laag van de cel lichaam van de lamina; rode vak geeft aan regio vergroot via workflow voor duidelijkheid (ROI selectie). Pre-processing paneel toont hoge vergroting van mCherry kanaal met Gaussian Blur filter, σ1 toegepast op zowel de controle en de mutant lamina. Segmentatie door interactieve h-maxima waterscheiding uitgevoerd op de gefilterde mCherry beelden met de aangegeven parameterinstellingen en waterscheiding resultaten weergegeven als binaire gebieden masker omgekeerd voor de duidelijkheid. Deeltjes die zijn gegenereerd door analyseren deeltjes (magenta) overlay op de rauwe mCherry en GFP afbeeldingen (functie extractie). Schaal bars = 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2: kwantificeren van de grootte en de intensiteit van mutant RFP-Htt aggregaten is robuust en reproduceerbare. (A-B) Drosophila hersenen met RFP-hHttQ15 (A) of RFP-hHttQ138 expressie (B) onder een pan-neuronale stuurprogramma elav-GAL4 werden ontleed en vaste en de optische kwabben waren beeld door laser scanning confocal microscopie. Schaal bar = 50 µm. (C) het gemiddelde aantal aggregaten in elke groep van een handmatig geselecteerde ROI rond de optic kwab gekwantificeerd en gericht op een gestandaardiseerde z-segment (n = 5). (D-E) De grootte (D) en de totale intensiteit (E) van RFP-hHttQ138 aggregaten gekwantificeerd van gestandaardiseerd ROIs in de lobben van de optiek van 5 verschillende dieren. Statistische gegevens worden uitgezet in de logschaal. Aggregaten waren gedefinieerd als objecten groter dan 0,4 µm² (gestippelde lijn in D). Statistische analyse, one-way ANOVA, NS: niet significant; a.u.: willekeurige eenheid Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3: afbeelding overbelichting leidt tot onjuiste intensiteit metingen. (A-B) Representatieve confocal opname van de zelfde optic lobe met ideale blootstelling (A) en overbelichting (B) pseudocolored met de HiLo LUT in Fiji. Red in B geeft aan overbelichte aggregaten. Schaal bar = 50 µm. (C) kwantificering van totale grootte na het uitvoeren van h-maxima waterscheiding parameters om soortgelijke segmentatie resultaten te genereren. Statistische analyse, onafhankelijke samples t -test, NS: niet significant. (D) frequentieverdeling van de totale omvang in ideale en overbelichte foto's. Aggregaten met een grootte van 5 tot 25 µm² werden verder weggegooid in 4 categorische groepen. (E -F) De analyse van de correlatie van de intensiteit van de aggregaten als functie van de totale omvang (E). Een referentielijn is getrokken (zwart) als alle pixels een waarde van de maximale intensiteit van 4095 hebben. Groene vak geeft aggregaten onder 10 µm² gebied weergegeven in F. b: regressie-coëfficiënt, R²: determinatiecoëfficiënt; a.u.: willekeurige eenheid Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 4: Kwantificeren van een tandem fluorescerende mCherry-GFP-Atg8a genetische reporter onthult verschillende functies van autophagic flux in Drosophila. (A) representatieve confocal microfoto van Drosophila lamina van controle en DSM's^e/e mutant vliegen overal uitdrukken mCherry-GFP-Atg8a (actine-GAL4 > mCherry-GFP-Atg8a) en gekleurd voor DAPI . Onderbroken boxed gebieden van de lamina cel lichaam laag worden weergegeven bij hoge vergroting (rechts). Aantallen wijzen op representatieve structuren van de Atg8a-positieve uitgezet in B en Cgekwantificeerd. (B) Histogram uitzetten van de intensiteit van de fluorescentie in willekeurige eenheden (AU) langs de lijn ROIs aangegeven in hoge vergroting beelden in A. (C) mCherry-GFP-Atg8 structuren uitgezet door gemiddelde intensiteit van de GFP als functie van de intensiteit van de gemiddelde mCherry gemeten vanaf controle en DSM's^e/e lamina (deeltjes gemeten vanaf 3 laminae uit elke groep). De plot was verdeeld in vier kwadranten met behulp van gating drempels van GFP = 570 en mCherry = 1800 met het percentage van de structuren in elk kwadrant aangegeven door genotype. (D) kwantificering van de gemiddelde percentages van mCherry-GFP-Atg8 onderverdeeld in elk kwadrant in C (n = 3 lamina). ()E) kwantificering van het aantal mCherry-GFP-Atg8 puncta per lamina (gemiddelde ± S.D., n = 3 lamina). (F) analyse van de Ratiometric van mCherry-GFP-Atg8 structuren waargenomen controle en mutant vliegen lamina (bedoel met 95% CI, n = 3 lamina). Student t-test. P < 0,05, **P < 0,01. Sscale balken = 2 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

De hier geschetste protocol kan worden gebruikt om krachtig en reproducibly kwantificeren cel biologische processen gevisualiseerd door fluorescentie gebaseerde imaging. Biologische context en technische beperkingen moeten zorgvuldig worden overwogen bij de proefopzet. Fluorescerende markers van subcellular structuren van belang, of immunohistochemische, kleurstof gebaseerde of genetisch uitgedrukt, moet worden onderscheiden boven achtergrond door morfologie en intensiteit. De UAS/GAL4 -systeem wordt veel gebruikt om te rijden gericht genexpressie in Drosophila. De voorbeelden die hier gepresenteerd tweedehands transgene lijnen uitvoering van GAL4-stuurprogramma's voor activeren transcriptie van fluorescently tagged eiwitten onder de controle van de UAS-enhancer aggregatie van eiwitten en autophagy in het zenuwstelsel te onderzoeken. Als gelijktijdige uitdrukking van een experimentele UAS transgenic vereist samen met een fluorescerende verslaggever transgenic is, dan de controlegroep moet ook bevatten co-overexpressie van een inconsequente transgenic aan besturingselement voor GAL4 dosering, bijvoorbeeld UAS-GFP of UAS-lacZ. Bereiding van de gestandaardiseerde monsters, is zoals hier geschetst voor Drosophila centraal zenuwstelsel en visuele systeem, van de dissectie, fixatie, antilichaam kleuring, door middel van montage, essentieel voor optimale beeldvorming en kwantificering.

Goede praktijken die signaal-/ ruisverhouding en dynamisch bereik maximaliseren imaging noodzakelijk zijn voor semi-geautomatiseerde analyse en staan voor nauwkeurige vergelijkingen tussen experimentele groepen. Afbeelding overname parameters moeten worden ingesteld zodat de verslaggever is niet oververzadigd, zodat het volledige scala van eiwit intensiteit kan worden geëxtraheerd en gekwantificeerd (Figuur 3). Voor de kwantitatieve vergelijkingen, moet imaging worden uitgevoerd met dezelfde overname parameters en bij voorkeur op dezelfde dag.

ROI selectie, beeldverwerking en segmentering van de functie functie extractie met behulp van de open-source platform ImageJ/Fiji zijn afhankelijk van de toepassing; terwijl de initiële parameters moeten worden gedefinieerd door de gebruiker, zal hun toepassing binnen exemplaren bias minimaliseren terwijl het maximaliseren van output van kwantitatieve gegevens. Het is cruciaal voor zorgvuldig documentworkflow en aanbevolen een afbeelding opslaan als een TIFF-bestand nadat u elke stap met bestand naam detaillering toegepast verwerking. Dit kan vooral handig zijn wanneer het uitwerken van protocol parameters voor de eerste keer en zal als een referentiepunt dienen te zorgen voor samenhang tussen experimentele groepen bij elke stap in de beeldverwerking en de analyse. ROI selectiecriteria met behulp van markeringen of anatomische monumenten uit een controlegroep moeten worden gedefinieerd, maar zorg moet worden genomen om ervoor te zorgen dat experimentele manipulaties veranderen niets aan de markeringen of de bezienswaardigheden op een wijze die voorkomen betrouwbare indicatie van dat zou een standaardiseren van ROI. Een enkel sneetje of een z-projectie van meerdere segmenten kan worden geselecteerd met beste betrekking tot de doelstellingen van de analyse, waar een enkele brandvlak kan nuttig ter verbetering van de scheiding van aangrenzende structuren, en een z-projectie kunnen nuttig zijn voor het analyseren van structuren gelokaliseerd in het volume van weefsel. Het type z-projectie gebruikt voor segmentatie en voor beeldanalyse moet worden zorgvuldig en onafhankelijk bepaald. Een projectie van maximale intensiteit zal produceren een scherp beeld, omdat de structuren zijn helderste in de vliegtuigen waar ze zijn in focus, en zijn meestal geschikt voor segmentatie. Beeldanalyse is aanvaardbaar op een maximale projectie, zoals in het voorbeeld van autophagy-lysosoom analyse; Atg8-positieve structuren zijn kleiner dan de stap-grootte gebruikt voor bemonstering, dus zijn meest nauwkeurig vertegenwoordigd door de maximumlichtsterkte van het enige brandvlak waaruit ze zijn opgenomen. Echter, voor analyse van structuren groter is dan de stap-grootte, een som-projectie die toevoegt van alle pixels met dezelfde xy-coördinaten kan nauwkeuriger vertegenwoordigen de informatie van de intensiteit van elke structuur. Hoewel dit protocol is ontworpen voor het analyseren van een enkel sneetje of een z-projectie van meerdere segmenten in 2D, de werkstroom kan gemakkelijk aangepast worden aan 3D structuren in een z-serie met behulp van een aantal dezelfde tools analyseren. 3D analyse zou wenselijk zijn dat de grootte van een kleine steekproef van onregelmatig gevormde structuren, waar een z-segment dat schuin de structuur kruist de analyse zou scheeftrekken.

Voorbewerken met een filter, zoals voorgesteld in dit protocol kan ruis verminderen met behoud van de randen om te helpen opsporen van interessante gebouwen tijdens segmentatie; achtergrond lawaai en TL marker heterogeniteit zonder voldoende demping zal resulteren in overmatige segmentatie, terwijl instellingen die leiden teveel vervagen tot detail verwijdert en nauwkeurige rand detecteren en voorkomen. Segmentatie door waterscheiding beschouwt de afbeelding als een topografische ondergrond met een waterbron op de lokale maxima — hoge intensiteit pixels in een fluorescerende afbeelding — die overstromingen uit totdat het voldoet aan naburige overstroomde gebieden waar een dam of segmentbegrenzing,²⁰is gebouwd. De h-maxima waterscheiding maakt gebruik van een door de gebruiker gedefinieerde drempel (h-maxima dynamics in SCF-MPI-CBG plugin) te onderscheiden van zinvolle lokale maxima Voorkom overmatige segmentatie van structuren die niet een unieke lokale maximale^{21 hebben}. De interactieve h-maxima waterscheiding plugin uitgevoerd in dit protocol maakt het de gebruiker aan te passen criteria voor de h-maxima dynamics (h), global waterscheiding stop bepaald door intensiteit drempel (T) en regionale stop criteria bepaald door de piek overstromingen (%), terwijl direct weergaveresultaten waterscheiding op een output afbeelding kwalitatief segmentatie om prestaties te evalueren. Segmentatie resultaten zal nauw overeen met meeste structuur grenzen, hoewel zowel overmatige segmentatie en onvolledige scheiding (figuur 1A, rode pijlen in functie extractie) optreden kunnen waar tl labeling is inhomogene of het weefsel is dichtbevolkt. De efficiëntie van de semi-automatische segmentatie en analyse stappen kan worden benut ter vergroting van de macht van de bemonstering en segmentatie valkuilen te verzachten.

Na segmentatie en extractie van de functie is het eenvoudig om morfologische informatie zoals gebied, afmetingen en cirkelvormigheid te extraheren. Bovendien, als afbeeldingen worden verzameld op de juiste manier om te voorkomen dat overmatige blootstelling, moleculaire informatie kan ook worden afgeleid uit deze beeldanalyse door intensiteit metingen. Zodra de maatregelen van neurodegeneratieve ziekte pathologie zijn geëxtraheerd en gekwantificeerd door deze aanpak, kunnen deze maatregelen worden gebruikt om aan te pakken een aantal belangrijke vragen. Met name heeft het protocol aangetoond welke met beeldanalyse en kwantificering van eiwit-aggregaten te identificeren factoren die invloed hebben op eiwit aggregatie en correleren distributie, aantal, grootte en de dichtheid van het eiwit van de aggregaten met organisch gezondheid en neuronale dysfunctie. Ratiometric gebaseerde kwantificering kan worden gebruikt om statistische interactie met subcellular onderdelen of processen tijdens de progressie van de ziekte. Terwijl biochemische en stroom cytometry zijn toegepast om te analyseren van de interactie van de aggregaten en met andere subcellular structuren, lysis van de cel kan leiden tot verlies van eiwit, statistische eigenschappen wijzigen en eiwit-eiwit interacties²²verstoren. mCherry-GFP-Atg8 is wijd verbeid gebruikt om te controleren autophagy door fluorescentie microscopie, vooral in de gekweekte cellen²³, maar onbevooroordeeld en kwantitatieve analysemethoden ontbreken. Bovendien, in vivo analyse met behulp van de genetisch gecodeerde tandem verslaggever is uitdagend en zeer gecontroleerde genetische achtergrond en weefsel voorbereiding vereist. Dit protocol beschrijft geverifieerde methodologie van weefsel voorbereiding naar imaging praktijken kritisch te kwantificeren autophagy-lysosoom compartimenten. Met goede genetische praktijken, kunt de afbeelding analyse benaderingen, met inbegrip van Atg-positieve deeltjes intensiteit profielen en Kwadrant analyse met gating door individuele fluorescerende signalen, krachtige detectie en vergelijking van de normale en pathologische veroorloven autophagic flux in vivo in uiteenlopende ziekte modellen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SYLGARD(R) 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning Corporation	PF184250	Dissection dish
Falcon 35 mm Not TC-Treated Easy-Grip Style Bacteriological Petri Dish	Corning	351008	Dissection dish
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-20	Dissection tool
Sodium Chloride	Sigma	S3014	PBS solution
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma	S5136	PBS solution
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma	P5655	PBS solution
Triton X-100	Sigma	T9284	Washing and antibody incubaton solution.
37% Formaldehyde	VWR	10790-710	Fixation
Disposable Microcentrifuge Tubes (0.5mL, blue)	VWR	89000-022	Fixation, washing, and antibody incubaton.
Plain and Frosted Micro Slides (25×75mm)	VWR	48312-004	Slides for confocal imaging
Micro Cover Glasses, rectangular (22×40mm)	VWR	48393-172	Slides for confocal imaging
Rubber Cement	Slime	1051-A	Mounting
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories, Inc.	H-1000	Mounting
Scotch Magic 810 Invisible Tape (19mm×25.4m)	3M Company	810	Mounting
Normal Goat Serum	Thermo Fisher Scientific	PCN5000	Antibody incubaton
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Thermo Fisher Scientific	D1306	Nucleic acid staining. Dissolve in deionized water to make a 5 mg/mL stock solution and store at -80°C. Dilute to a working concentration of 10-20 μg/mL in PBTx.
3.5X-90X Stereo Zoom Inspection Industrial Microscope	AmScope	SM-1BNZ	Dissection scope. Equipped with 6W LED Dual Gooseneck Illuminator
ImageJ/Fiji	NIH	v1.51u	With SCF_MPI_CBG plugins (version 1.1.2)
FV1000-IX81 Confocal-laser Scanning Microscope	Olympus
Recombinant Construct	Bloomington Drosophila Stock Center	BL37749